DE69928845T2

DE69928845T2 - Methode zur Herstellung von L-Serin mittels Fermentation

Info

Publication number: DE69928845T2
Application number: DE69928845T
Authority: DE
Inventors: Mikiko Kawasaki-shi Suga; Masakazu Kawasaki-shi Sugimoto; Tsuyoshi Osumi; Tsuyoshi Kawasaki-shi Nakamatsu; Wataru Kawasaki-shi Hibino; Mika Yokkaichi-shi Ito
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1998-01-12
Filing date: 1999-01-12
Publication date: 2006-08-10
Anticipated expiration: 2019-01-13
Also published as: EP0931833B1; JP4066543B2; CA2256758C; EP0931833A3; EP0931833A2; CN1227264A; JPH11253187A; CA2256758A1; US6037154A; DE69928845D1; CN1198919C; US20030175912A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft koryneforme Bakterien, die L-Serin erzeugen zur Verwendung bei der Herstellung von Aminosäuremischungen, die auf dem Gebiet der Pharmazie, der Chemie und der Kosmetik verwendbar sind.
Hintergrund der Erfindung
Als konventionelles Verfahren zur Erzeugung von L-Serin durch Fermentation wurde über ein Verfahren berichtet, worin ein bakterieller Stamm, der Glycin und Zucker zu L-Serin umwandeln kann, in einem Medium verwendet wird, das 30 g/l Glycin enthält, um höchstens 14 g/l L-Serin zu erzeugen. Der Umwandlungsertrag von Glycin zu L-Serin durch dieses Verfahren ergab 46% (Kubota K. Agricultural Biological Chemistry, 49, 7–12 (1985)). Unter Verwendung eines Bakterienstamms, der Glycin und Methanol zu L-Serin umwandeln kann, können 53 g/l L-Serin aus 100 g/l Glycin erzeugt werden (T. Yoshida et al., Journal of Fermentation and Bioengineering, Band 79, Nr. 2, 181–183, 1995). Bei einem Verfahren unter Verwendung eines Bakteriums, das zur Gattung Nocardia gehört, war bekannt, dass die L-Serin-Produktivität des Bakteriums durch Züchtung derjenigen Stämme verbessert werden kann, die gegenüber Serinhydroxamat, Azaserin oder ähnlichem resistent sind (japanische Patentveröffentlichung Nr. 57-1235). Diese Verfahren involvieren jedoch die Verwendung von Glycin, wobei es sich um einen Vorläufer von L-Serin handelt und beinhalten komplizierte Arbeitsschritte und sind im Hinblick auf die Kosten nachteilig.
Als Stämme, die L-Serin direkt aus einem Zucker fermentieren können und keine Zugabe eines Vorläufers von L-Serin zum Medium benötigen, war Corynebacterium glutamicum bekannt, das gegenüber D-Serin, α-Methylserin, o-Methylserin, Isoserin, Serinhydroxamat und 3-Chloralanin resistent ist, jedoch ist die Anhäufung von L-Serin so niedrig wie 0,8 g/l (Nogei Kagakukaishi, Band 48, Nr. 3, Seiten 201–208, 1974). Daher bedarf es weiterer Stammverbesserungen für eine direkte Fermentation von L-Serin im industriellen Umfang.
Andererseits wurde im Hinblick auf koryneforme Bakterium ein Vektorplasmid offenbart, das zur autonomen Replikation in der Zelle fähig ist und ein Arzneimittelresistenz-Markergen aufweist (siehe US-Patent 4,514,502) wie auch ein Verfahren zur Einführung eines Gens in die Zelle (japanische Patentveröffentlichung Nr. 2-207791) und die Möglichkeit zum Anzüchten von L-Threonin oder L-Isoleucin erzeugenden Bakterien (US-Patente 4,452,890 und 4,442,208). Ebenfalls war im Hinblick auf das Wachstum von L-Lysin erzeugenden Bakterien eine Technologie bekannt, die den Einbau eines Gens involviert, das an der Biosynthese von L-Lysin teilnimmt, und zwar in ein Vektorplasmid und die Amplifikation des Plasmids in der Zelle (japanische Patentanmeldung, Veröffentlichung Nr. 56-160997).
Im Fall von Escherichia coli beinhalten die Enzyme, die an der Biosynthese von L-Serin teilnehmen, ein Enzym, das gegenüber einer Feedback-Inhibition relativ zu der L-Serin-Produktion im Wildtyp empfänglich ist und es war ein Beispiel bekannt, worin die Einführung eines mutierten Gens, das so mutiert war, dass die Feedback-Inhibition desensibilisiert war, zu einer Vermehrung des L-Serins führte (japanisches Patent Nr. 2584409). Als solches Gen war insbesondere das 3-PGDH-Gen bekannt (hiernach wird das Gen, das das 3-PGDH-Protein kodiert, auch als "serA" bezeichnet).
Weiterhin war im Fall von koryneformen Bakterien ein Beispiel bekannt, worin die Amplifikation des 3-PGDH-Gens die Produktivität von L-Tryptophan beeinflusst (japanische Patentanmeldung, Veröffentlichungsnummer 3-7591).
EP A 0 487 333 offenbart koryneforme Bakterien mit L-Serin-Produktivität; sie sind mit einem Plasmid transformiert, das das Gen des L-Serin-Stoffwechselweges exprimiert, das in der Zelle nicht funktional ist.
EP 0 943 687 offenbart koryneforme Bakterien, die L-Serin nicht abbauen können und gegenüber Azaserin oder (3-(2-Thienyl)-DL-Alanin resistent sind mit erhöhter Produktivität von L-Serin, erzeugt aus Zucker. Es werden die beiden selben Prioritäten wie in der gegenwärtigen Anmeldung beansprucht.
Zusammenfassung der Erfindung
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen Mikroorganismus bereitstellen, der einen Zucker in L-Serin umwandelt, und L-Serin in einem Kulturmedium dadurch anhäuft unter Verwendung der Fähigkeit des Mikroorganismus, den Zucker in L-Serin umzuwandeln, d.h. ein Herstellungsverfahren für L-Serin, das für die Durchführung im industriellen Umfang vorteilhaft ist.
Als Ergebnis intensiver Untersuchungen im Hinblick auf die obige Aufgabe wurde nun von den vorliegenden Erfindern entdeckt, dass durch Screening eines Stamms, worin eine Aktivität von mindestens einem von Phosphoserin-Phosphatase und Phosphoserin-Transaminase erhöht ist, aus koryneformen Bakterien mit L-Serin-Produktivität, vorzugsweise den Bakterien, die im Hinblick auf die L-Serin-Abbauaktivität defizient sind oder Mutanten davon mit einer Resistenz gegenüber einem L-Serin-Analog und L-Serin-Fermentation unter Verwendung des durch Screening entdeckten Stammes die Anhäufung von L-Serin drastisch erhöht werden kann. Die vorliegende Erfindung wurde basierend auf dieser Entdeckung vervollständigt.
Daher betrifft die vorliegende Erfindung ein koryneformes Bakterium, das im Hinblick auf seine L-Serin-Abbauaktivität defizient ist, wodurch L-Serin im Medium angehäuft wird, wobei eine Aktivität der Phosphoserin-Phosphatase und/oder Phosphoserin-Transaminase durch Erhöhung einer Kopiezahl eines Gens erhöht ist, codierend für Phosphoserin-Phosphatase und/oder eines Gens, codierend für Phosphoserin-Transaminase in dem koryneformen Bakterium.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiter das oben beschriebene koryneforme Bakterium, das sowohl im Hinblick auf die Aktivitäten von Phosphoserin-Phosphatase als auch Phosphoserin-Transaminase erhöht ist und ein koryneformes Bakterium wie oben beschrieben, das ein Gen eingeführt aufweist, kodierend für D-3-Phosphoglycerat-Dehydrogenase, worin die Feedback-Inhibition durch L-Serin desensibilisiert ist.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 illustriert eine Weise einer Feedback-Inhibition von 3-PGDH, abgeleitet von verschiedenen Stämmen durch L-Serin. Die horizontale Achse zeigt die Konzentration von L-Serin in der Enzymlösung. Die vertikale Achse zeigt die Prozentzahl der 3-PGDH-Aktivität in Gegenwart von L-Serin zu derjenigen in Abwesenheit von L-Serin. Das Symbol ♦ illustriert eine Weise einer Feedback-Inhibition von 3-PGDH, abgeleitet von ATCC14067 durch L-Serin. Das Symbol
illustriert eine Weise einer Feedback-Inhibition von 3-PGDH, abgeleitet von dem AJ13377-Stamm durch L-Serin. Das Symbol
illustriert eine Weise einer Feedback-Inhibition von 3-PGDH, abgeleitet von dem AJ13324 Stamm durch L-Serin. Das Symbol X illustriert eine Weise einer Feedback-Inhibition von 3-PGDH, abgeleitet von dem AJ13325-Stamm durch L-Serin. Das Symbol * illustriert eine Weise einer Feedback-Inhibition von 3-PGDH, abgeleitet von dem AJ13327-Stamm durch L-Serin.
2 illustriert die Konstruktion der Plasmide pVK7 und pVK6.
3 illustriert die Konstruktion des Plasmids pSB, worauf serB getragen wird.
4 illustriert die Konstruktion des Plasmids pSC, worauf serC getragen wird.
5 illustriert die Konstruktion des Plasmids pBC8 und pBC14, worauf serB und serC getragen werden.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die koryneformen Bakterien, auf die in der gegenwärtigen Erfindung Bezug genommen wird, sind eine Gruppe von Mikroorganismen, die im Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Ausgabe, Seite 599 (1974) definiert sind, wobei es sich um aerobe grampositive Stäbchen ohne Säureresistenz und ohne Sporenbildungseigenschaft handelt. Die koryneformen Bakterien beinhalten Bakterien, die zur Gattung Corynebacterium gehören, Bakterien, die zur Gattung Brevibacterium gehören, die bis jetzt in die Gattung Brevibacterium klassifiziert wurden, jedoch nun als Bakterium, die zur Gattung Corynebacterium gehören, damit vereinigt wurden und Bakterien, die zur Gattung Brevibacterium gehören und eng mit Bakterien verwandt sind, die zur Gattung Corynebacterium gehören und Bakterien, die zur Gattung Microbakterium gehören.
Die erfindungsgemäßen koryneformen Bakterien sind koryneforme Bakterien, die eine L-Serin-Produktivität aufweisen, worin die Aktivität der Phosphoserin-Phosphatase oder Phosphoserin-Transaminase erhöht ist. Solche Bakterien werden durch Erhöhung der Kopiezahl eines Gens erhalten, das für die Phosphoserin-Phosphatase (hiernach bezeichnet als "serB") kodiert oder eines Gens, das für die Phosphoserin-Transaminase kodiert (hiernach bezeichnet als "serC") in einer koryneformen Bakterienzelle mit L-Serin-Produktivität.
Als koryneformes Bakterium mit L-Serin-Produktivität wird ein koryneformes Bakterium zitiert, das im Hinblick auf die L-Serin-Abbauaktivität defizient ist.
Die koryneformen Bakterien mit L-Serin-Produktivität, nämlich die im Hinblick auf die L-Serin-Abbauaktivität defizienten koryneformen Bakterien unter ihnen können unter Verwendung des Wildtyps oder koryneformer Bakterien mit L-Serin-Produktivität als Elternstamm künstlich mutiert oder induziert werden.
Die koryneformen Bakterien, die im Hinblick auf die L-Serin-Abbaufähigkeit defizient sind und eine L-Serin-Produktivität aufweisen, können z.B. wie folgt gesammelt werden.
Brevibacterium flavum ATCC14067 wird durch ein konventionelles Verfahren einer Mutationsbehandlung unterzogen (Kontakt mit N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin usw.), um einen mutanten Stamm zu erhalten, der im Hinblick auf die L-Serin-Abbauaktivität defizient ist und dann wird ein Bakterium, das gegenüber einem L-Serin-Analog, wie z.B. Azaserin oder (3-(2-Thienyl)-DL-Alanin resistent ist, von den Mutanten als Elternstamm gesammelt. Ebenfalls kann, nachdem ein L-Serin-Analog-resistentes Bakterium erhalten wurde, ein Mutant erhalten werden, der im Hinblick auf die L-Serin-Abbauaktivität defizient ist. Unter den durch die oben beschriebenen Verfahren erhaltenen Mutanten gibt es Stämme, die L-Serin in hohen Konzentrationen anhäufen.
Die L-Serin-Analog-resistenten Bakterien können durch Einführung des Mutanten serA, wie später beschrieben, in einen Elternstamm oder einen L-Serin Abbauaktivitäts-defizienten Mutanten erhalten werden.
Unter der Bezeichnung "L-Serin-Analog-Resistenz" wird die Eigenschaft verstanden, dass das Bakterium schneller als der Wildtyp in einem Medium wächst, das ein L-Serin-Analog enthält.
Spezifischer gesagt bezieht sich z.B. die Bezeichnung "Azaserin-Resistenz" auf die Eigenschaft, dass ein Bakterium schneller als ein Wildtyp in einem Medium wächst, das Azaserin enthält. Diejenigen Stämme, die innerhalb von 4 bis 5 Tagen Kolonien auf einem festen Medium bilden, enthaltend 0,25 g/l Azaserin bei 30°C werden z.B. als Azaserin-resistent angesehen.
Ähnlich bezeichnet die Bezeichnung "β-(2-Thienyl)-DL-Alanin-Resistenz" die Eigenschaft, dass ein Bakterium schneller als der Wildtyp in einem Medium wächst, das β-(2-Thienyl)-DL-Alanin enthält. Zum Beispiel werden diejenigen Stämme, die innerhalb von 4 bis 5 Tagen Kolonien auf einem festen Medium bilden, enthaltend 0,25 g/l β-(2-Thienyl)-DL-Alanin bei 30°C als β-(2-Thienyl)-DL-Alanin-resistent bezeichnet.
Als nächstes wird die Verstärkung der Phosphoserin-Phosphatase-Aktivität oder Phosphoserin-Transaminase-Aktivität beschrieben.
Die Verstärkung der Phosphoserin-Phosphatase-Aktivität oder Phosphoserin-Transaminase-Aktivität kann durch Amplifikation der Zahl von Genen auf einem Chromosom durchgeführt werden.
Aus Referenzgründen wird die folgende Verfahrensweise erklärt.
Um serB oder serC in ein koryneformes Bakterium einzuführen, kann ein DNA-Fragment, enthaltend serB oder serC, mit einem Vektor ligiert werden, der in koryneformen Bakterien wirkt, um eine rekombinante DNA zu erzeugen, gefolgt von Einführung in einen koryneformen Bakterium-Wirt mit L-Serin-Produktivität, um diesen zu transformieren. Als Ergebnis eines Anstiegs der Kopiezahl von serB oder serC in der Zelle des transformierten Stamms wird die Phosphoserin-Phosphatase-Aktivität oder Phosphoserin-Transaminase-Aktivität amplifiziert. Die Einführung einer rekombinanten DNA, enthaltend sowohl serB als auch serC oder sowohl einer rekombinanten DNA, enthaltend serB als auch einer rekombinanten DNA, enthaltend serC in ein koryneformes Bakterium wird sowohl die Phosphoserin-Phosphatase-Aktivität als auch die Phosphoserin-Transaminase-Aktivität vervielfältigen.
Die Basensequenzen von serB und serC sind bekannt (serB: GenBank; X03046 M30784, serC: GenBank; D90728). Es ist möglich, Primer, basierend auf diesen Basensequenzen zu synthetisieren und das serB- oder serC-Gen dieser Mikroorganismen durch das PCR-Verfahren unter Verwendung der chromosomalen DNA von Escherichia coli, Brevibacterium flavum oder anderen Mikroorganismen als Matrize zu sammeln. Als ein solcher Primer kann der Primer zitiert werden, der die in SEQ ID NO: 15 bis 18 dargestellte Basensequenz aufweist.
Es wird bevorzugt, dass das serB-Gen oder serC-Gen mit Vektor-DNA ligiert wird, die in Zellen von Escherichia coli und/oder koryneformen Bakterien autonom replizierbar ist, um eine rekombinante DNA herzustellen und die rekombinante DNA wird zunächst in Zellen von Escherichia coli eingeführt. Solche Maßnahmen machen die folgenden Arbeitsschritte einfach. Der in Zellen von Escherichia coli autonom replizierbare Vektor ist vorzugsweise ein Plasmid-Vektor, der vorzugsweise autonom in Zellen eines Wirts replizierbar ist, beinhaltend z.B. pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG399, pHSG398 und RSF1010.
In dem Fall, in dem das serB-Gen und serC-Gen auf getrennten Vektoren zu Einführung in ein koryneformes Bakterium enthalten sind wird es bevorzugt, zwei Vektoren mit jeweiligen Markergenen zu verwenden, die sich voneinander unterscheiden.
Rekombinante DNA kann durch Verwendung eines Transposons (WO 02/02627 internationale Veröffentlichung, WO 93/18151 internationale Veröffentlichung, europäische offengelegte Patentanmeldung Nr. 0445385, japanische offengelegte Patentanmeldung Nr. 6-46867, Vertes, A. A. et al., Mol. Microbiol., 11, 739–746 (1994), Bonamy, C., et al., Mol. Microbiol., 14, 571–581 (1994), Vertes, A. A. et al., Mol. Gen. Genet., 245, 397–405 (1994), Jagar, W. et al., FEMS Microbiology Letters, 126, 1–6 (1995), japanische offengelegte Patentanmeldung Nr. 7-107976, japanische offengelegte Patentanmeldung Nr. 7-327680, usw.), Phagen-Vektoren, durch Rekombination von Chromosomen (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1972); Matsuyama, S. und Mizushima, S., J. Bacteriol., 162, 1196 (1985)) und ähnliches hergestellt werden.
Wenn ein DNA-Fragment mit einer Fähigkeit, die es einem Plasmid ermöglicht, autonom in koryneformen Bakterien replizierbar zu sein, in diese Vektoren inseriert wird, können sie als sogenannte Shuttle-Vektoren verwendet werden, die sowohl in Escherichia coli als auch koryneformen Bakterien replizierbar sind.

Ein solcher Shuttle-Vektor beinhaltet die folgenden. Mikroorganismen, die diese Vektoren jeweils beherbergen und Hinterlegungsnummern in inernationalen Hinterlegungseinrichtungen sind in Klammern angegeben.

pHC4:	Escherichia coli AJ12617 (FERM BP-3532)
pAJ655:	Escherichia coli AJ11882 (FERM BP-136) Corynebacterium glutamicum SR8201 (ATCC 39135)
pAJ1844:	Escherichia coli AJ11883 (FERM BP-137) Corynebacterium glutamicum SR8202 (ATCC 39136)
pAJ611:	Escherichia coli AJ11884 (FERM BP-138)
pAJ3148:	Corynebacterium glutamicum SR8203 (ATCC 39137)
pAJ440:	Bacillus subtilis AJ11901 (FERM BP-140).

Diese Vektoren sind von den hinterlegten Mikroorganismen wie folgt erhältlich. Zellen, die in der logarithmischen Wachstumsphase gesammelt wurden, wurden unter Verwendung von Lysozym und SDS lysiert, gefolgt von einer Auftrennung von einem Lysat durch Zentrifugation bei 30.000 × g zum Erhalt eines Überstandes, wozu Polyethylenglykol zugefügt wird, gefolgt von Fraktionierung und Reinigung durch Cäsiumchlorid-Ethidiumbromid-Gleichgewichtsdichtegradienten-Zentrifugation.
Escherichia coli kann durch Einführung eines Plasmids gemäß z.B. einem Verfahren von D. M. Morrison (Methods in Enzymology, 68, 326 (1979)) oder einem Verfahren, worin Empfängerzellen mit Calciumchlorid zur Erhöhung der Permeabilität für DNA behandelt werden (Mandel, M. und Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)), transformiert werden.
Die Einführung von Plasmiden in koryneforme Bakterien, um eine Transformation zu bewirken, kann durch das elektrische Pulsverfahren durchgeführt werden (Sugimoto et al., japanische Patentanmeldungsveröffentlichungs-Nr. 2-207791).
Beispiele für für die Einführung der oben beschriebenen DNA verwendete koryneforme Bakterien beinhalten z.B. die folgenden Wildtypstämme:
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870;
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806;
Corynebacterium callunae ATCC 15991;
Corynebacterium glutamicum ATCC 13032;
(Brevibacterium divaricatum) ATCC 14020;
(Brevibacterium lactofermentum) ATCC 13869;
(Corynebacterium lilium) ATCC 15990;
(Brevibacterium flavum) ATCC 14067;
Corynebacterium melassecola ATCC 17965;
Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066;
Brevibacterium immariophilum ATCC 14068;
Brevibacterium roseum ATCC 13825;
Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240;
Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354;
Corynebacterium thermoaminogenes AJ12340 (FERM BP-1539).
Die Verstärkung der Phosphoserin-Phosphatase-Aktivität oder Phosphoserin-Transaminase-Aktivität wird tatsächlich durch Einführung von multiplen Kopien des serB-Gens oder serC-Gens in die chromosomale DNA der oben beschriebenen Wirtsstämme erreicht. Um multiple Kopien des serB-Gens oder serC-Gens in die chromosomale DNA von koryneformen Bakterien einzuführen, wird die homologe Rekombination unter Verwendung einer Sequenz durchgeführt, deren multiple Kopien in der chromosomalen DNA als Ziele existieren. Als Sequenzen, deren multiple Kopien in der chromosomalen DNA existieren, können repetitive DNAs, inverse Repeats, die am Ende eines transponierbaren Elements existieren, verwendet werden. Es ist auch möglich, wie offenbart in der japanischen Patentveröffentlichung Nr. 2-109985, das serB-Gen oder serC-Gen in das Transposon zu inkorporieren und es zur Einführung multipler Kopien des serB-Gens oder serC-Gens in die chromosomale DNA transferieren zu lassen. Durch jedes Verfahren steigt die Zahl der Kopien des serB-Gens oder serC-Gens in den Zellen des transformierten Stamms und im Ergebnis wird die Phosphoserin-Phosphatase-Aktivität oder Phosphoserin-Transaminase-Aktivität erhöht.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das koryneforme Bakterium der vorliegenden Erfindung ein Stamm, der durch Einführung eines Gens, kodierend die D-3-Phosphoglycerat-Dehydrogenase (hiernach auch als "3-PGDH" bezeichnet) erhalten wird, worin die Feedback-Inhibierung durch L-Serin desensibilisiert ist, in ein koryneformes Bakterium mit L-Serin-Produktivität und einer erhöhten Aktivität der Phosphoserin-Phosphatase oder Phosphoserin-Transaminase.
3-PGDH katalysiert eine Reaktion, worin 3-Phosphoglycerat zu 3-Phosphohydroxylbrenztraubensäure in Gegenwart von Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (NAD) als Coenzym oxidiert wird.
3-PGDH, das von einem Wildtyp-koryneformen Bakterium abstammt, ist gegenüber einer Feedback-Inhibition durch L-Serin empfänglich und seine Aktivität wird fast vollständig in Gegenwart von 10 mM L-Serin inhibiert. Unter der Bezeichnung "3-PGDH, worin die Feedback-Inhibition durch L-Serin desensibilisiert ist" wird ein 3-PGDH mit 20% oder mehr, vorzugsweise 40% oder mehr, noch bevorzugter 90% oder mehr der Aktivität in Abwesenheit von L-Serin selbst in Gegenwart von 10 mM L-Serin verstanden. Von Brevibacterium flavum AJ13327, wie in den Beispielen hiernach beschrieben, abstammendes 3-PGDH erhielt sich im wesentlichen 100% seiner Aktivität in Gegenwart von 80 mM L-Serin und ist daher eines der besonders bevorzugten 3-PGDHs.
Das 3-PGDH kodierende Gen, worin die Feedback-Inhibition durch L-Serin desensibilisiert ist, kann aus der chromosomalen DNA eines L-Serin-Analog-resistenten koryneformen Bakteriums hergestellt werden, z.B. dem Azaserin-resistenten Stamm AJ13327 von Brevibacterium flavum, erhalten in den unten beschriebenen Beispielen.
3-PGDH, das von einem Wildtyp-koryneformen Bakterium abstammt (hiernach wird auch die DNA, die dies kodiert, als "Wildtyp-serA" bezeichnet) weist die in SEQ ID NO: 12 im Sequenzprotokoll beschriebene Aminosäuresequenz auf.
Spezifische Beispiele für 3-PGDH, worin die Feedback-Inhibition von L-Serin desensibilisiert ist (hiernach wird diese kodierende DNA auch als "mutiertes serA" bezeichnet) beinhaltet eine D-3-Phosphoglycerat-Dehydrogenase, die dadurch gekennzeichnet ist, dass in der D-3-Phosphoglycerat-Dehydrogenase, die die in SEQ ID NO: 12 im Sequenzprotokoll beschriebene Aminosäuresequenz aufweist oder dieselbe Aminosäuresequenz wie oben, jedoch Substitutionen, Additionen oder Deletionen von ein oder mehr Aminosäuren aufweist, wobei der Aminosäurerest, der zum 325. Glutaminsäurerest der Aminosäuresequenzen SEQ ID NO: 12 korrespondiert, durch eine andere Aminosäure ersetzt wurde. Besonders bevorzugt als andere Aminosäure ist der Lysinrest.
Das DNA-Fragment, das das serA-Gen von einem koryneformen Bakterium enthält, kann z.B. durch Herstellung chromosomaler DNA gemäß dem Verfahren von Saito und Miura (H. Saito und K. Miura, Biochem. Biophys. Acta, 72, 619 (1963)) oder ähnliches isoliert werden und dann durch Amplifikation des serA-Gens durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR: Polymerase-Kettenreaktion; siehe White, T. J. et al.; Trends Genet. 5, 185 (1989)). Um ein DNA-Fragment, enthaltend den ORF (172 bis 1705) der SEQ ID NO: 11 im Sequenzprotokoll zu vervielfältigen, werden z.B. irgendwelche 20 bis 30 Basen aus der Region selektiert, von der ersten Base in SEQ ID NO: 11 bis zu der Base, direkt vor ATG zum Erhalt eines Primers. Weiterhin werden irgendwelche 20 bis 30 Basen aus der Region selektiert, von der Base direkt nach dem Stopkodon bis zur letzten Base in SEQ ID NO: 11 zum Erhalt eines anderen Primers.
Wenn serA von einem Wildtyp-Stamm von 3-PGDH isoliert wird, wird Wildtyp serA erhalten und die Isolation von serA von einem Mutanten, der 3-PGDH enthält, worin die Feedback-Inhibition durch L-Serin desensibilisiert ist (3-PGDH-Mutant) ergibt mutiertes serA. Spezifisch hat Wildtyp serA die Sequenz, wie beschrieben in SEQ ID NO: 11 im Sequenzprotokoll und mutiertes serA hat die in SEQ ID NO: 13 im Sequenzprotokoll beschriebene Sequenz.
Das mutierte serA kann in ein koryneformes Bakterium durch Transformation des koryneformen Bakteriums mit einem mutierten serA-haltigen rekombinanten Vektor auf dieselbe Weise wie bei der Einführung von serB oder serC eingeführt werden. Das mutierte serA wird vorzugsweise in multiplen Kopien eingeführt. Das mutierte serA und serB oder serC können auf einen einzelnen Vektor bzw. auf getrennte zwei oder drei Vektoren geladen werden.
Für die L-Serin-Produktion unter Verwendung des Stamms der vorliegenden Erfindung können die folgenden Verfahren verwendet werden. Als Medium, das verwendet wird, können konventionelle Flüssigmedien, enthaltend Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Salze und optional organische Spurenelemente wie Aminosäuren, Vitamine usw., falls gewünscht, verwendet werden.
Als Kohlenstoffquelle ist es möglich, Zucker wie Glukose, Saccharose, Fructose, Galactose; mit Saccharose versehene Stärkelösungen, Süßkartoffelmelassen, Zuckerrübenmelasse und Hochmelassen zu verwenden, die die oben beschriebenen Zucker enthalten; organische Säuren wie z.B. Essigsäure; Alkohole, wie z.B. Ethanol; Glycerin und ähnliche.
Als Stickstoffquellen ist es möglich, Ammoniakgas, wässrigen Ammoniak, Ammoniumsalze, Harnstoff, Nitrate und ähnliche zu verwenden. Weiterhin können organische Stickstoffquellen für die Zusatzverwendung verwendet werden, z.B. Ölkuchen (oil cakes), Sojahydrolysatflüssigkeiten, abgebautes Casein, andere Aminosäuren, Maiseinweichflüssigkeit, Hefe oder Hefeextrakt, Peptide wie z.B. Pepton und ähnliche.
Als anorganische Ionen können optional Phosphorionen, Magnesiumionen, Calciumionen, Eisenionen, Manganionen und ähnliche zugefügt werden.
Im Fall einer Verwendung der Mikroorganismen der vorliegenden Erfindung, die Nährstoffe wie z.B. Aminosäuren für ihr Wachstum benötigen, sollten die benötigten Nährstoffe zugesetzt werden.
Die Mikroorganismen werden in der Regel unter aeroben Bedingungen bei pH 5 bis 8 und einer Temperatur von 25 bis 40°C inkubiert. Der pH des Kulturmediums wird in einem bestimmten Bereich kontrolliert, innerhalb der oben beschriebenen Bereiche, abhängig von der Gegenwart oder Abwesenheit anorganischer oder organischer Säuren, alkalischer Substanzen, Harnstoff, Calciumcarbonat, Ammoniakgas, und ähnlichen.
L-Serin kann aus der Fermentationsflüssigkeit z.B. durch Abtrennung und Entfernung der Zellen, Ionenaustauschharzbehandlung, Konzentrationskühlungskristallisation, Membranabtrennung und andere bekannte Verfahren in jeder geeigneten Kombination gesammelt werden. Um Unreinheiten zu entfernen, können eine Aktivkohleadsorption und Umkristallisierung für die Reinigung verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung stellt ein koryneformes Bakterium bereit, das L-Serin aus einem Zucker synthetisiert. Das koryneforme Bakterium kann in einem Verfahren zur Erzeugung von L-Serin verwendet werden, das industriell vorteilhaft ist.
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
(Beispiel 1) Kontruktion des L-Serin erzeugenden Bakteriums Brevibacterium flavum AJ13324 und AJ13327
Brevibacterium flavum AJ13324 und AJ13327 wurden aus Brevibacterium flavum AJ13377 konstruiert, das im Hinblick auf die L-Serin-Abbauaktivität defizient ist, erhalten von dem Wildtyp-Stamm Brevibacterium flavum ATCC 14067.
Um einen Mutanten zu erhalten, proliferierten die Zellen 24 Stunden in einem Bouillonmedium (ein Medium, enthaltend 1 g Fischextrakt, 1 g Polypepton, 0,5 g Hefeextrakt und 0,5 g Natriumchlorid in 1 Liter Wasser, eingestellt auf pH 7,0) und wurden in 100 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) (enthaltend 109 bis 1010 Zellen/ml) suspendiert. NG (N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin) wurde der Suspension auf eine Konzentration von 200 μg/ml zugefügt und man ließ dies bei 30°C 30 Minuten stehen. Die so NG-behandelten Zellen wurden gut mit dem oben beschriebenen Puffer gewaschen.
Um Stämme aus NG-behandelten Zellen zu selektieren, die keine L-Serin-Abbauaktivität aufweisen, wurden die NG-behandelten Zellen von Brevibacterium flavum ATCC 14067 nach einem Waschen auf einem Bouillon-Agar-Medium verteilt und bei 30°C 24 Stunden inkubiert, um eine Koloniebildung zu ermöglichen. Dann wurden die Kolonien auf dem Bouillon-Agar-Medium als Negativ verwendet und eine Replikabildung wurde auf Minimalmedium und einem Minimalmedium zur Selektion durchgeführt. Dann wurden die Stämme einem Screening unterzogen, die auf dem Minimalmedium wuchsen, jedoch nicht auf dem Minimalmedium für die Selektion. Das Minimalmedium war ein Medium, das 20 g Glukose, 1 g Ammoniumsulfat, 1 g Kaliumdihydrogenphosphat, 2,5 g Harnstoff, 0,4 g Magnesiumsulfatheptahydrat, 0,01 g Eisen(II)sulfatheptahydrat, 0,01 g Mangansulfat-tetra- bis pentahydrat, 50 μg Biotin, 200 μg Thiaminhydrochlorid, 200 μg Nicotinsäureamid und 2,0 g Agar pro Liter destilliertem Wasser enthielt. Das Minimalmedium zur Selektion war ein Medium, das 1 g Ammoniumsulfat, 1 g Kaliumdihydrogenphosphat, 2,5 g Harnstoff, 0,4 g Magnesiumsulfatheptahydrat, 0,01 g Eisen(II)sulfatheptahydrat, 0,01 g Mangansulfat-tetra- bis pentahydrat, 50 μg Biotin, 200 μg Thiaminhydrochlorid, 200 μg Nicotinsäureamid, 0,5 g L-Serin und 2,0 g Agar pro Liter destilliertem Wasser enthielt. Unter den durch dieses Verfahren erhaltenen Mutanten wurden viele Stämme gefunden, die keine L-Serin-Abbauaktivität aufwiesen und Brevibacterium flavum AJ13377 wurde als einer von diesen Stämmen erhalten.
Um Azaserin-resistente Stämme von NG-behandelten Stämmen unter Verwendung von Brevibacterium flavum AJ13377 als Elternstamm zu selektieren, wurden NG-behandelte Brevibacterium flavum AJ13377-Zellen nach einem Waschen auf ein Minimalmedium zur Selektion inokuliert. Das Minimalmedium zur Selektion war ein Medium, das 20 g Glukose, 1 g Ammoniumsulfat, 1 g Kaliumdihydrogenphosphat, 2,5 g Harnstoff, 0,4 g Magnesiumsulfatheptahydrat, 0,01 g Eisen(II)sulfatheptahydrat, 0,01 g Mangansulfat-tetra- bis pentahydrat, 50 μg Biotin, 200 μg Thiaminhydrochlorid, 200 μg Nicotinsäureamid und 250 mg Azaserin pro Liter destilliertem Wasser enthielt. Der NG-behandelte Mutant wurde in dem oben beschriebenen Medium bei 30°C 5 bis 10 Tage inkubiert. Die so erhaltene Zellkultur wurde auf einem Bouillon-Agar-Medium verteilt und bei 30°C 24 Stunden für eine Koloniebildung inkubiert. Azaserin-resistente Stämme wurden von den Stämmen erhalten, die Kolonien bildeten. Die so erhaltenen Mutanten beinhalteten viele Stämme, die L-Serin in beträchtlichen Mengen in hohen Erträgen anhäuften. Von den Stämmen wurden zwei Stämme erhalten, d.h. Brevibacterium flavum AJ13324 und AJ13327. Es wurde bestätigt, dass diese Stämme dazu in der Lage waren, in Gegenwart von 0,25 g/l Azaserin zu wachsen.
(Beispiel 2) Konstruktion eines neuen L-Serin erzeugenden Bakteriums Brevibacterium flavum AJ13325
Brevibacterium flavum AJ13325 wurde aus Brevibacterium flavum AJ13377 konstruiert, dem eine L-Serin-Abbauaktivität fehlte, und der von dem Wildtyp-Stamm Brevibacterium flavum ATCC 14067 erhalten wurde.
Um β-(2-Thienyl)-DL-Alanin-resistente Stämme von NG-behandelten Stämmen unter Verwendung von Brevibacterium flavum AJ13377 als Elternstamm zu selektieren, wurden Brevibacterium flavum AJ13377-Zellen NG-behandelt und gewaschen, vor ihrer Inokulation auf ein Minimalmedium zur Selektion. Das Minimalmedium zur Selektion war ein Medium, das 20 g Glukose, 1 g Ammoniumsulfat, 1 g Kaliumdihydrogenphosphat, 2,5 g Harnstoff, 0,4 g Magnesiumsulfatheptahydrat, 0,01 g Eisen(II)sulfatheptahydrat, 0,01 g Mangansulfat-tetra- bis pentahydrat, 50 μg Biotin, 200 μg Thiaminhydrochlorid, 200 μg Nicotinsäureamid und 250 mg β-(2-Thienyl)-DL-Alanin pro Liter destilliertem Wasser enthielt. Der NG-behandelte Mutant wurde in dem oben beschriebenen Medium bei 30°C 5 bis 10 Tage inkubiert. Die so erhaltene Zellkultur wurde auf einem Bouillon-Agar-Medium verteilt und bei 30°C 24 Stunden für eine Koloniebildung inkubiert. β-(2-Thienyl)-DL-Alanin-resistente Stämme wurden von den Stämmen erhalten, die Kolonien bildeten. Die so erhaltenen Mutanten beinhalteten viele Stämme, die L-Serin in beträchtlichen Mengen mit hohem Ertrag anhäuften. Brevibacterium flavum AJ13325 wurde als einer dieser Stämme erhalten. Es wurde bestätigt, dass diese Stämme zu einem Wachstum in Gegenwart von 0,25 g/l β-(2-Thienyl)-DL-Alanin in der Lage waren.
(Beispiel 3) Erzeugung von L-Serin durch L-Serin erzeugende Bakterien Brevibacterium flavum AJ13324, AJ13325 und AJ13327
Brevibacterium flavum AJ13324, AJ13325 und AJ13327 wurden jeweils auf einem Bouillon-Agar-Medium bei 30°C 24 Stunden inkubiert und eine Schlaufe von jedem Mikroorganismus wurde in einen 500 ml Schüttelkolben, enthaltend 20 ml eines Fermentationsmediums mit der in Tabelle 1 dargestellten Zusammensetzung, inokuliert. Als Kontrolle wurden die Elternstämme Brevibacterium flavum ATCC 14067 und AJ13377 auf dieselbe Weise wie oben beschrieben, inokuliert. Das Medium wurde mit Kaliumhydroxid auf einen pH von 7,0 eingestellt und bei 115°C 15 Minuten autoklaviert. Nach der Sterilisierung und einem Abkühlen wurde Calciumcarbonat, das 3 Stunden bei 180°C mit Trockenluft sterilisiert worden war, in einer Menge von 5 g/l zugefügt.
Tabelle 1
Eine Bestimmung von L-Serin unter Verwendung von Hochleistungsflüssigchromatographie (Hitachi L-8500 Aminosäure-Autoanalysator) ergab, dass Brevibacterium flavum AJ13324, AJ13325 und AJ13327 L-Serin in dem Medium in Mengen von 15,2 g/l, 14,3 g/l bzw. 15,4 g/l anhäuften. Andererseits häuften die Brevibacterium flavum-Stämme ATCC 14067 und AJ13377 als Kontrolle L-Serin in Mengen von 0 g/l bzw. 5,0 g/l an.
Die Kulturbrühe von Brevibacterium flavum AJ13324 wurde zentrifugiert und der Überstand einer Entsalzungsbehandlung unter Verwendung eines Kationenaustauschharzes, gefolgt von einer chromatographischen Auftrennung mit einem Kationenaustauschharz und einem Anionenaustauschharz zur Entfernung von Nebenprodukten und einer Reinigung durch Kristallisierung zum Erhalt von L-Serin-Kristallen mit einer Reinheit von mindestens 99% bei einem Ertrag aus der Brühe von 55% unterzogen.
(Beispiel 4) Messung der 3-PGDH-Aktivität
Brevibacterium flavum AJ13324, AJ13325 und AJ13327 wurden jeweils auf einem Bouillon-Agar-Medium 24 Stunden bei 30°C inkubiert und eine Schlaufe von jedem Mikroorganismus wurde in einen 500 ml-Schüttelkolben, enthaltend 50 ml eines Fermentationsmediums mit der in Tabelle 2 dargestellten Zusammensetzung inokuliert. Als Kontrolle wurden die Elternstämme Brevibacterium flavum ATCC 14067 und AJ13377 auf dieselbe Weise wie oben beschrieben inokuliert. Das Medium für die Inokulation wurde mit Natriumhydroxid auf einen pH von 5,5 eingestellt und 15 Minuten bei 115°C autoklaviert.
Tabelle 2
Nach einem Sammeln der Zellen aus der Kulturbrühe von jedem Stamm wurden die Zellen zweimal mit physiologischer Salzlösung gewaschen und in 50 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,0), enthaltend 2 mM Dithiothreitol, suspendiert. Nach einem Kühlen auf Eis wurde die Suspension einer Ultraschallbehandlung unterzogen, um die Zellen zu fragmentieren und die resultierende Flüssigkeit wurde ultrazentrifugiert. Die Ultrazentrifugation wurde mit 45.000 Upm 1 Stunde durchgeführt, um eine Rohenzymlösung zu erhalten.
Die Enzymaktivität von 3-PGDH wurde durch das Verfahren von Salach H. J. et al. (Method in Enzymology, Band 9, 216–220 (1966)) gemessen.
Genauer ausgedrückt wurden 0,4 ml 0,015 M NAD, 0,12 ml 0,25 M EDTA (pH 9, NaOH), 0,1 ml 0,05 M Glutathion (pH 6, KOH), 0,5 ml 1 M Hydrazin (pH 9, Acetat), 0,6 ml 1 M Tris (pH 9, HCl), eine geeignete Konzentration L-Serin (0 bis 40 mM) und Wasser zum Auffüllen auf 2,3 ml, vorher auf 25°C erwärmt, zugefügt. Dann wurden 0,2 ml der Rohenzymlösung zugefügt und die Temperatur wurde für 5 Minuten auf demselben Niveau gehalten. Danach wurden 0,5 ml 0,1 M 3-PGA (3-Phosphoglyceratdinatriumsalz, pH 7, NaOH) zugefügt. Nach einem Rühren wurde die Absorption der Reaktionsmischung bei 340 nm für 30 Sekunden gemessen. Die Reaktion wurde bei 25°C durchgeführt.
Für die Messung der Aktivität wurde ein Hitachi U-2000A-Spektrophotometer verwendet.
1 illustriert die erhaltenen Ergebnisse. Der AJ13377-Stamm war von L-Serin-Empfindlichkeit im Vergleich mit dem Wildtyp-Stamm ATCC 14067 befreit. Der AJ13324-Stamm war noch mehr im Hinblick auf seine L-Serin-Empfindlichkeit befreit und der AJ13325-Stamm befand sich in diesem Hinblick auf demselben Niveau wie der AJ13324-Stamm. Der AJ13327-Stamm war sehr stark im Hinblick auf seine L-Serin-Empfindlichkeit befreit. Die Inhibition war selbst in Gegenwart von 80 mM L-Serin vollständig desensibilisiert.
Obwohl über einige Beispiele einer Desensibilisierung der Inhibition von 3-PGDH durch L-Serin bei Escherichia coli berichtet wurde (Tosa und Pizer, J. Bacteriol. 106: 972–982 (1971) oder japanische Patentveröffentlichung Nr. 6-510911), gab es kein bekanntes Beispiel einer vollständigen Desensibilisierung der Inhibition in Gegenwart einer solch hohen Konzentration von L-Serin.
(Beispiel 5) Klonieren von von koryneformen Bakterien abgeleitetem Wildtyp und Mutanten serA
Wie in Beispiel 4 dargestellt, war die Feedback-Inhibition durch L-Serin bei dem AJ13327-Stamm vollständig desensibilisiert. Dementsprechend wurde eine Klonierung des serA-Gens, kodierend Wildtyp-3-PGDH, abgeleitet von dem ATCC 14067-Stamm und mutiertes 3-PGDH, abgeleitet von dem AJ13327-Stamm versucht, um zu klären, wie die Variation aussah und den Amplifikationseffekt von 3-PGDH zu bestätigen.
Um serA von dem Chromosom von Brevibacterium flavum unter Verwendung eines PCR-Verfahrens zu amplifizieren ist es notwendig, einen korrespondierenden Primer herzustellen. Da es keine Berichte im Hinblick auf eine Klonierung und eine Nukleotidsequenz von serA von Brevibacterium flavum gibt, wurde die Sequenz von serA, abgeleitet von Corynebacterium verwendet. Das Plasmid pDTS9901 wurde von dem Stamm Corynebacterium glutamicum K82 (siehe FERM BP-2444 und japanische Patentanmeldungsveröffentlichung Nr. 3-7591) extrahiert, worin das serA-Fragment, abgeleitet von Corynebacterium, unter Verwendung des Wizard Minipreps DNA Purification System (hergestellt von Promega) kloniert wurde und ein DNA-Fragment mit ungefähr 1,4 kb, enthaltend serA, wurde mit dem Restriktionsenzym BamHI (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) abgespalten.
Als Vektor zur Klonierung des Gen-Fragments wurde ein neu konstruierter Klonierungsvektor pVK7 für koryneforme Bakterien verwendet.
pVK7 wurde durch Ligation (ein Klonierungsvektor für Escherichia coli) von pHSG299 (Kmr; Takeshita, S. et al., Gene, 61, 63–74 (1987), japanische Patentveröffentlichung Nr. 10-215883) an pAM330 konstruiert, einem kryptischen Plasmid von Brevibacterium lactofermentum, und zwar auf die unten beschriebene Weise. pHSG299 wurde mit dem monospezifischen Restriktionsenzym AvaII gespalten (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) und mit T4-DNA-Polymerase mit glatten Enden versehen. Dieses wurde mit pAM330 ligiert, das mit HindIII (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) gespalten worden war und mit T4-DNA-Polymerase mit glatten Enden versehen. Die beiden Arten der erhaltenen Plasmide wurden als pVK6 und pVK7, abhängig von der Richtung der pAM330-Insertion relativ zu pHSG299 bezeichnet und pVK7 wurde in den folgenden Experimenten verwendet. pVK7 war zu einer autonomen Replikation in Escherichia coli und Brevibacterium lactofermentum fähig und erhält sich die multiple Klonierungsstelle und lacZ', abgeleitet von pHSG299. 2 illustriert das Verfahren der Konstruktion von pVK6 und pVK7.
Mit dem so konstruierten Shuttle-Vektor pVK7 wurde ein DNA-Fragment mit ungefähr 1,4 kb, enthaltend serA, ligiert. pDTS9901 wurde mit dem Restriktionsenzym BamHI (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) gespalten und an pVK7, das ebenfalls mit dem Restriktionsenzym BamHI gespalten worden war, ligiert. Die Ligation der DNA wurde unter Verwendung des DNA-Ligation-Kits (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) gemäß dem vorgeschriebenen Verfahren hergestellt.
Für die Sequenzierungsreaktion bediente man sich des PCR-Thermal Cycler MP-Typs (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) und des Dye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kits (hergestellt von Perkin Elmer). Als DNA-Primer wurden M13(-21), der RV-Primer (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) verwendet. Die SEQ ID NO: 1 im Sequenzprotokoll zeigt die so erhaltene Sequenz. SEQ ID NO: 2 zeigt eine Aminosäuresequenz, die durch diese Sequenz kodiert werden kann.
Ein Primer wurde basierend auf der so bestimmten Basensequenz synthetisiert und serA wurde durch das PCR-Verfahren unter Verwendung der chromosomalen DNA des Mutanten Brevibacterium flavum AJ13327 als Matrize amplifiziert. Die SEQ ID NO: 3 und 4 im Sequenzprotokoll zeigen die N-terminalen bzw. C-terminalen Sequenzen des DNA-Primers, die für die Genamplifikation synthetisiert wurden.
Bei der Herstellung der chromosomalen DNA von Brevibacterium flavum bedient man sich des genomischen DNA Purification Kits (Bakterien) (hergestellt von Advanced Genetic Technologies Corp.) und des Herstellungsverfahrens gemäß dem beigefügten Protokoll.
Für die PCR-Reaktion bediente man sich des PCR Thermal Cycler MP-Typs (Takara Shuzo Co., Ltd.) und TaKaRa Taq (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.).
Das PCR-Produkt wurde direkt an den Plasmid pCR2.1-Vektor unter Verwendung des Original TA Cloning Kits (hergestellt von Invitrogen) ligiert und eine Transformation wurde unter Verwendung von kompetenten Zellen von INVαF' durchgeführt. Die transformierten Zellen wurden auf einem L-Medium (10 g/l Bactotrypton, 5 g/l Bacto-Hefeextrakt, 15 g/l NaCl und 15 g/l Agar), weiterhin enthaltend 40 μg/ml X-Gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galaktosid) und 25 μg/ml Kanamycin verteilt und über Nacht inkubiert. Die weißen Kolonien, die auftraten, wurden gesammelt und abgetrennt, um einzelne Kolonien zu erhalten, um einen transformierten Stamm zu erhalten.
Plasmide wurden von dem transformierten Stamm extrahiert und die Plasmide, deren Insertion des serA-Fragments durch ein PCR-Verfahren bestätigt wurde, wurden mit dem Restriktionsenzym EcoRI behandelt und in den Shuttle-Vektor pVK ligiert. Die Bestimmung der Basensequenz des Produkts legte nahe, dass keine Gesamtlängensequenz auf der C-terminalen Seite enthalten war. Die so erhaltene Sequenz korrespondiert zu dem Bereich von den 277 Basen stromaufwärts der SEQ ID NO: 13 auf der 5'-Seite bis zur 1134ten Base von SEQ ID NO: 13 im Sequenzprotokoll auf der 3'-Seite.
Um ein Fragment zu erhalten, das das Gesamlängen-serA-Gen enthielt, wurde eine Klonierung eines deletierten Teils der chromosomalen DNA von Brevibacterium flavum AJ13327 gemäß dem beigefügten Protokoll unter Verwendung des TaKaRa LA PCR in vitro Cloning Kits (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) durchgeführt.
Zunächst wurde die so hergestellte chromosomale DNA vollständig mit verschiedenen Restriktionsenzymen verdaut und mit Kassetten ligiert, die die jeweiligen Restriktionsenzymstellen, die dazu korrespondierten, aufwiesen. Der Kassettenprimer (C1) (SEQ ID NO: 5 im Sequenzprotokoll) und ein Primer, der zu einer bekannten Region der DNA komplementär war (S1) (SEQ ID NO: 6 im Sequenzprotokoll) wurden verwendet, um eine erste PCR durchzuführen. Unter Verwendung eines Teils der Reaktionsmischung wurde eine zweite PCR mit einem inneren Primer C2 durchgeführt (SEQ ID NO: 7 im Sequenzprotokoll) wie auch S2 (SEQ ID NO: 8 im Sequenzprotokoll), um nur die Ziel-DNA zu amplifizieren.
Wenn EcoRI (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) als Restriktionsenzym verwendet wurde, wurde die Amplifikation der Ziel-DNA bestätigt und die Basensequenz des PCR-Produkts direkt bestimmt. Basierend auf der so erhaltenen Basensequenz wurde ein Primer, kodierend die C-terminale Seite, hergestellt und die Fragmente, enthaltend Gesamtlängen-serA, wurden von Brevibacterium flavum ATCC 14067 als Wildtyp-Stamm und Brevibacterium flavum AJ13327 als mutierter Stamm gesammelt. Die SEQ ID NO: 9 und 10 im Sequenzprotokoll zeigen die Sequenzen der N-terminalen bzw. C-terminalen DNA-Primer.
Die Genfragmente, enthaltend Wildtyp-serA bzw. mutiertes serA in ihrer gesamten Länge, wurden in den EcoRI-gespaltenen Shuttle-Vektor pVK7 unter Verwendung des Original TA Cloning Kits (hergestellt von Invitrogen) ligiert. Plasmide, die die jeweiligen Genfragmente beherbergten, wurden separat hergestellt und ihre Basensequenz wurde bestimmt. SEQ ID NO: 11 und 13 zeigen die Sequenzen des Wildtyps bzw. des Mutanten. SEQ ID NO: 12 und 14 zeigen die Aminosäuresequenzen, für die diese Sequenzen kodieren können. Bei einem Vergleich der so bestimmten Basensequenzen wurde bestätigt, dass in dem mutierten serA die 1087te Base, G zu A mutiert war und im Ergebnis die 325te Aminosäure, Glutaminsäure zu Lysin wechselte.
(Beispiel 6) Einführung eines Plasmids, enthaltend das 3-PGDH-Gen in Brevibacterium flavum
Plasmide die Wildtyp-serA oder mutiertes serA beherbergten, wurden jeweils in Brevibacterium flavum AJ13377 eingeführt. Die Plasmide wurden durch das elektrische Pulsverfahren eingeführt (Sugimoto et al., japanische Patentveröffentlichung Nr. 2-207791). Transformierte Zellen wurden in einem kompletten Medium selektiert, enthaltend 25 μg/ml Kanamycin.
(Beispiel 7) Herstellung von L-Serin durch transformierte Zellen
Transformierte Zellen, die jeweils Plasmide aufwiesen, die Genfragmente beherbergten, die Wildtyp-serA oder mutiertes serA in Gesamtlänge enthielten, wurden in einem 500 ml-Schüttelkolben gemäß Beispiel 3 inkubiert und das erzeugte L-Serin wurde bestimmt. Als Kontrolle wurde der AJ13377-Stamm als Wirt entsprechend inkubiert.
In den transformierten Zellen, die Wildtyp-serA aufwiesen, wurde kein Einfluss auf die L-Serin-Produktivität beobachtet, während bei den transformierten Zellen, die das mutierte serA aufwiesen, ein Anstieg der L-Serin-Produktivität bestätigt wurde (Tabelle 3).
Brevibacterium flavum AJ13377 ist seit dem 15. Oktober 1997 beim National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of International Trade and Industry (PLZ: 305-8566, 1-3 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan) mit der Hinterlegungsnummer FERM P-16471 hinterlegt und wurde von der Ursprungshinterlegung zu einer internationalen Hinterlegung gemäß dem Budapester Vertrag am 20. November 1998 übertragen und als Hinterlegungsnummer FERM BP-6576 hinterlegt.
Weiterhin wurde das Plasmid, enthaltend mutiertes serA in Brevibacterium flavum ATCC 14067 erhalten. Der Plasmid-erhaltene Stamm wurde Brevibacterium flavum AJ13378 und ist seit dem 15. Oktober 1997 bei dem National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of International Trade and Industry (PLZ: 305-8566, 1-3 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan) hinterlegt, mit der Hinterlegungsnummer FERM P-16472 und wurde von der Ursprungshinterlegung zu einer internationalen Hinterlegung übertragen, und gemäß Budapester Vertrag, am 20. November 1998 und mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-6577 hinterlegt.
(Beispiel 8) Amplifikation von serB und/oder serC in Brevibacterium flavum L-Serin-erzeugenden Stämmen
(1) Konstruktion eines Plasmids, das serB oder serC exprimiert.
Plasmide pSB, die serB exprimieren und Plasmiden pSC, die serC exprimieren, wurden wie in 3 und 4 illustriert, konstruiert.
Für das serB-Gen wurde ein Primer (SEQ ID NO: 15 und 16 im Sequenzprotokoll, die die N-terminalen bzw. C-terminalen Seiten zeigen), basierend auf der bekannten Basensequenz (GenBank; X03046, M30784) hergestellt. Andererseits wurde für das serC-Gen ein Primer (SEQ ID NO: 17 und 18 im Sequenzprotokoll, die die N-terminalen bzw. C-terminalen Seiten zeigen) basierend auf der bekannten Basensequenz (GenBank; D90728) hergestellt und eine PCR wurde unter Verwendung der chromosomalen DNA von Escherichia coli JM109 als Matrize zum Erhalt eines Genfragments (1197 bp) durchgeführt, enthaltend einen ORF, der für serB kodierte und ein Genfragment (1380 bp), enthaltend einen ORF, der für serC kodierte.
Die Basensequenzen der SEQ ID NO: 15 und 16 korrespondieren zu den Regionen der Basen Nrn. 1197 bis 1175 und der Basen Nrn. 1 bis 23 in der Sequenz-GenBank; X03046, M30784 und die Basensequenzen der SEQ ID NO: 17 und 18 korrespondieren zu den Regionen der Basen Nrn. 13205 bis 13227 und der Basen Nrn. 14584 bis 14562 in der Sequenz-GenBank; D90728.
Das serB-Fragment wurde, nachdem es mit glatten Enden versehen worden war, in die SmaI-Stelle von pHSG399 inseriert, einem Hochkopie-Typ-Vektor, um p399B zu erhalten. Um dieses Plasmid zu einer autonomen Replikation in Bakterien zu befähigen, die zu der Gattung Korynebakterium gehören, wurde ein Replikator (hiernach bezeichnet als "Brev.-ori") von pBK4 gespalten, enthaltend den Replikator, abgeleitet von pHM1519 und in p399B zum Erhalt von pSB inseriert (3). pBK4 wurde wie folgt hergestellt. Das heißt, ein Plasmid pHC4, enthaltend Brev.-ori wurde von dem Escherichia coli AJ12617-Stamm hergestellt, enthaltend dieses Plasmid (FERM BP-3532) und mit KpnI (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) und BamHI (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) zur Extraktion des Brev.-ori-Fragments gespalten, das dann mit glatten Enden versehen wurde. Das Versehen mit glatten Enden wurde unter Verwendung des DNA-Blunting-Kits (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) gemäß dem vorgeschriebenen Verfahren durchgeführt. Danach wurde das Produkt in einen bereits phosphorylierten BamHI-Linker ligiert und wiederum mit BamHI gespalten. Dieses wurde mit pHSG298 ligiert, das ebenfalls mit BamHI gespalten wurde, um pBK4 zu erhalten. pBK4 wurde für eine Spaltung des Brev.-ori-Fragments mit BamHI verwendet.
Weiterhin wurde ein serC-Fragment in die SrfI-Stelle des pPCR-Script SK(+) inseriert, um pScript-serC zu erhalten. Zu der SacI-Stelle des resultierenden Plasmids wurde ein PstI-Linker inseriert. Dann wurde das serC-Fragment mit PstI gespalten und in die PstI-Stelle von pHSG399 inseriert, um p399C zu erhalten. Ein Replikator wurde von pBK4 gespalten, erhaltend den Replikator, abgeleitet von pHM1519 und in p399C inseriert, um pSC zu erhalten (4).
(2) Konstruktion des Plasmids, das serB und serC exprimiert
Als nächstes wurden die Plasmide pBC8 und pBC14, die serB bzw. serC exprimieren, hergestellt (5). Zu der SacI-Stelle, die außerhalb des serC-Fragments des oben beschriebenen pScript-serC existierte, wurde ein PstI-Linker inseriert, um eine PstI-Stelle einzuführen. Dieses Plasmid wurde mit PstI zum Abspalten eines serC-Fragments behandelt, das dann in die PstI-Stelle des serB-haltigen Plasmids pSB inseriert wurde. Die Basensequenz wurde bestätigt und das Plasmid, worin das serC-Fragment in umgekehrter Richtung zu lacZ inseriert war, wurde als pBC8 bezeichnet und das Plasmid, worin es in Vorwärtsrichtung zu lacZ inseriert war, wurde als pBC14 bezeichnet.
(3) L-Serin-Produktion durch serB- und serC-amplifizierte Stämme
Unter Verwendung der Plasmide pSB, pSC und pBC8, hergestellt wie oben beschrieben, wurde der Wildtyp-Stamm von Brevibacterium flavum ATCC 14067 transformiert und die Plasmide wurden aus den transformierten Zellen extrahiert. Die Plasmide wurden zur Transformation von Brevibacterium flavum AJ13377 und AJ13327 mit L-Serin-Produktivität verwendet. Außerdem wurden Brevibacterium flavum AJ13377 und AJ13327-Stämme, die pBC8 enthielten, mit einem Plasmid transformiert, enthaltend das mutierte serA, das Brevibacterium flavum AJ13378 (FERM P-16472) erhielt.
Jeder der transformierten Stämme wurde auf einem Agar-Medium, enthaltend 10 mg/l Chloramphenicol inkubiert und die gebildeten Kolonien wurden jeweils auf dieselbe Weise wie in Beispiel 3 inkubiert, gefolgt von einer Messung von L-Serin, das sich im Medium anhäufte. Die transformierten Stämme, die mutiertes serA enthielten, wurden durch Zugabe von 25 mg/l Kanamycin zum Medium inkubiert. Tabelle 3 zeigt die erhaltenen Ergebnisse. Tabelle 3

serA*:: mutiertes serA-Gen

Wie oben beschrieben, erhöhte die Amplifikation von serB oder serC die Menge von L-Serin, die sich anhäufte. Ebenfalls erhöhte die Amplifikation von beiden serB- und serC-Genen weiter die angehäufte L-Serin-Menge. Zusätzlich erhöhte die Amplifikation der Gene zusammen mit dem mutierten serA-Gen die angehäufte L-Serin-Menge noch mehr. Ähnliche Ergebnisse wurden unter Verwendung von pBC14 anstelle von pBC8 erhalten.
In dem gegenwärtigen Beispiel können, obwohl L-Serin abbauaktivitätsdefiziente Stämme (AJ13377) oder L-Serin abbauaktivitätsdefiziente Azaserin-resistente Stämme (AJ13327) von Brevibacterium flavum als koryneformer bakterieller Wirt mit L-Serin-Produktivität zur Amplifikation von jedem Gen verwendet wurden, andere Azaserin-resistente Stämme (AJ13324) oder L-Serin-Abbauaktivitäts-defiziente, β-(2-Thienyl)-DL-Alanin-resistente Stämme (AJ13325) ebenfalls verwendet werden.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Koryneformes Bakterium, das im Hinblick auf seine L-Serin-Abbauaktivität defizient ist, wodurch L-Serin im Medium angehäuft wird, wobei eine Aktivität der Phosphoserin-Phosphatase und/oder Phosphoserin-Transaminase durch Erhöhung einer Kopiezahl eines Gens erhöht ist, codierend für Phosphoserin-Phosphatase und/oder eines Gens, codierend für Phosphoserin-Transaminase in dem koryneformen Bakterium.
Koryneformes Bakterium gemäß Anspruch 1, wobei das Bakterium ein Bakterium ist, das nicht auf einem Minimalmedium wächst, enthaltend 0,5 g L-Serin.
Koryneformes Bakterium gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei das Bakterium in den Aktivitäten von sowohl der Phosphoserin-Phosphatase als auch der Phosphoserin-Transaminase erhöht ist.
Koryneformes Bakterium gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Bakterium das Gen für D-3-Phosphoglyceratdehydrogenaseeingeführt aufweist, dargestellt durch SEQ ID NO: 13.