CN1227264A - 经过发酵生产l－丝氨酸的方法 - Google Patents

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Abstract

经过在培养基中培养其中至少一种磷酸丝氨酸磷酸酶和磷酸丝氨酸转氨酶的活性被增强的具有L－丝氨酸生产力的棒杆菌，优选进一步具有导入其中的编码其中L－丝氨酸反馈抑制被脱敏的D－3－磷酸甘油酸脱氢酶的基因的棒杆菌，使L－丝氨酸在此培养基中积累以及从该培养基中收集L－丝氨酸来生产L－丝氨酸。

Description

经过发酵生产L-丝氨酸的方法
本发明涉及生产L-丝氨酸的方法和构建棒杆菌的方法，其中，L-丝氨酸用于生产在药物，化学药品和化妆品领域中使用的氨基酸混合物。
作为通过发酵制备L-丝氨酸的常规方法，已报导这样一种方法，即其中能够将甘氨酸和糖转化成L-丝氨酸的细菌菌株在含有30g/L甘氨酸的培养基中用于生产至多14g/L的L-丝氨酸。通过该方法将甘氨酸转化成L-丝氨酸的产量达到46％(Kubota K.农业生物化学，49,7-12(1985))。用能够将甘氨酸和甲醇转换成L-丝氨酸的细菌菌株，可从100g/L的甘氨酸中生产出53g/L的L-丝氨酸(T.Yoshida等，发酵和生物工程杂志，79卷，第2期，181-183,1995)。在使用诺卡氏菌属细菌的方法中，已知可通过培养那些对氧肟酸盐、重氮丝氨酸等具有抗性的菌株而提高该细菌L-丝氨酸的生产力(日本专利公开No.57-1235)。然而，这些方法包括使用作为L-丝氨酸前体的甘氨酸并且包括复杂的操作且从费用的角度也是不利的。
作为可直接从糖发酵L-丝氨酸并且无需在培养基中添加L-丝氨酸前体的菌株，已知有谷氨酸棒杆菌，该菌对D-丝氨酸、α-甲基丝氨酸、O-甲基丝氨酸、异丝氨酸(isoserine)、丝氨酸氧肟酸盐和3-氯丙氨酸具有抗性但是L-丝氨酸的积累低达0.8g/L(Nogei Kagakukaishi,48卷第3期，p201-208,1974)。因此，有必要进一步改进菌株以用于工业规模L-丝氨酸的直接发酵。
另一方面，关于棒杆菌，已经公开了能够在细胞中自主复制并且具有药物抗性标记基因的质粒(参考美国专利4,514,502)和将基因导入该细胞中的方法(公开的日本专利申请No.2-207791)和培养产生L-苏氨酸或L-异亮氨酸细菌的可能性(美国专利4,452,890和4,442,208)。同样，有关产生L-赖氨酸细菌的培养，已知一种包括掺入参与L-赖氨酸生物合成的基因至质粒载体中并在细胞中扩增该质粒的技术(公开的日本专利申请No.56-160997)。
在大肠杆菌的情况中，参与L-丝氨酸生物合成的酶包括相对于野生型中L-丝氨酸生产而言对反馈抑制敏感的酶并且已知有这样一种实例，即其中导入突变基因从而可对反馈抑制脱敏而导致L-丝氨酸的增加(日本专利No.2584409)。作为这种基因，具体地已知有3-PGDH基因(下文，编码3-PGDH蛋白的基因也将称为“SerA”)。
此外，在棒杆菌的情况中，已知有这样的实例，即其中3-PGDH基因的扩增影响了L-色氨酸的生产力(公开的日本专利申请No.3-7591)。
本发明的目的是提供将糖转变为L-丝氨酸的微生物并且提供了利用微生物将糖转变为L-丝氨酸的能力在培养基中积累L-丝氨酸的方法，即在工业规模的实践中优越的生产L-丝氨酸的方法。
为实现上述目的而进行了深入研究，作为其结果，现在本发明人已发现从具有L-丝氨酸生产力的棒杆菌，优选从L-丝氨酸分解活性缺陷型细菌或其具有对L-丝氨酸类似物抗性的突变体筛选至少一种磷酸丝氨酸磷酸酶和磷酸丝氨酸转氨酶的活性增强的菌株并使用所筛选的菌株进行L-丝氨酸发酵将大幅度增强L-丝氨酸的积累。基于这一发现完成了本发明。
即，本发明涉及具有L-丝氨酸生产力的棒杆菌，其中至少一种磷酸丝氨酸磷酸酶和磷酸丝氨酸转氨酶的活性增强。
另外，本发明涉及上文所述的磷酸丝氨酸磷酸酶和磷酸丝氨酸转氨酶的活性均增强的棒杆菌；上文所述的由于L-丝氨酸分解活性有缺陷而具有L-丝氨酸生产力的棒杆菌；上文所述的由于其具有对L-丝氨酸类似物的抗性而具有L-丝氨酸生产力的棒杆菌；上文所述的经过在其细胞中增加上述棒杆菌编码磷酸丝氨酸磷酸酶的基因和编码磷酸丝氨酸转氨酶的基因的拷贝数而增强了磷酸丝氨酸磷酸酶和磷酸丝氨酸转氨酶的活性的棒杆菌；以及上文所述的具有导入其中的编码D-3-磷酸甘油酸脱氢酶基因且其中L-丝氨酸的反馈抑制被脱敏的棒杆菌。
另外，本发明涉及生产L-丝氨酸的方法，包括在培养基中培养上文所述的棒杆菌以便在培养基中积累L-丝氨酸并从培养基中收集L-丝氨酸。
图1显示L-丝氨酸对各种菌株3-PGDH的反馈抑制方式。水平轴表示在该酶溶液中L-丝氨酸的浓度。纵轴表示L-丝氨酸存在时3-PGDH活性对L-丝氨酸不存在时的百分比。符号◆显示L-丝氨酸对ATCC14067菌株3-PGDH的反馈抑制方式。符号■显示L-丝氨酸对AJ13377菌株3-PGDH的反馈抑制方式。符号▲显示L-丝氨酸对AJ13324菌株3-PGDH的反馈抑制方式。符号×显示L-丝氨酸对AJ13325菌株3-PGDH的反馈抑制方式。符号*显示L-丝氨酸对AJ13327菌株3-PGDH的反馈抑制方式。
图2显示质粒pVK7和pVK6的构建。
图3说明了携带serB的质粒pSB的构建。
图4说明了携带serC的质粒pSC的构建。
图5说明了携带serB和serC的质粒pBC8和pBC14的构建。
本发明中提及的棒杆菌为伯杰氏细菌鉴定手册，第8版，第599页(1974)中定义的一组微生物，它们是不具有酸抗性并且无孢子形成能力的需氧格兰氏阳性杆菌。这些棒杆菌包括棒杆菌属的细菌、属于迄今分类进短杆菌属但目前统一到棒杆菌属中的短杆菌属细菌以及与棒杆菌属和微杆菌属细菌密切相关的短杆菌属的细菌。
本发明的棒杆菌是具有L-丝氨酸生产力的且其中磷酸丝氨酸磷酸酶或磷酸丝氨酸转氨酶的活性被增强的棒杆菌。例如，经过在具有L-丝氨酸生产力的棒杆菌细胞中增加编码磷酸丝氨酸磷酸酶的基因(下文称为“serB”)或编码磷酸丝氨酸转氨酶的基因(下文称为“serC”)的拷贝数可获得该细菌。
另外，本发明的棒杆菌可经过赋予增强了磷酸丝氨酸磷酸酶和磷酸丝氨酸转氨酶活性的棒杆菌以L-丝氨酸生产力来获得。
作为具有L-丝氨酸生产力的棒杆菌，可提到的有，例如，L-丝氨酸分解活性缺陷型棒杆菌，对L-丝氨酸类似物有抗性的棒杆菌，以及L-丝氨酸分解活性缺陷型且对L-丝氨酸类似物有抗性的棒杆菌。
在本发明中，L-丝氨酸类似物包括重氮丝氨酸或β-(2-噻吩)-DL-丙氨酸。
对L-丝氨酸类似物有抗性且具有L-丝氨酸生产力的棒杆菌，更优选其中的L-丝氨酸分解活性缺陷型棒杆菌可使用野生型或具有L-丝氨酸生产力的棒杆菌作为亲本菌株进行人工突变或诱导。
对L-丝氨酸类似物有抗性，L-丝氨酸分解活性缺陷型且具有L-丝氨酸生产力的棒杆菌可按，例如，如下方式收集。以常规方法(与N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍接触，等)对黄色短杆菌ATCC14067进行突变处理以获得L-丝氨酸分解活性缺陷型突变株，然后从作为亲本菌株的突变株收集对诸如重氮丝氨酸或β-(2-噻吩)-DL-丙氨酸的L-丝氨酸类似物有抗性的细菌。另外，在获得L-丝氨酸类似物抗性细菌后，可获得L-丝氨酸分解活性缺陷型突变株。在以上述方法获得的突变株中，存在以高浓度积累L-丝氨酸的菌株。
经过将下文所述突变的SerA导入亲本菌株或L-丝氨酸分解活性缺陷型突变株中可获得L-丝氨酸类似物抗性细菌。
术语“L-丝氨酸类似物抗性”是指细菌在含L-丝氨酸类似物的培养基中比野生型生长更快的特性。
更具体地说，例如，术语“重氮丝氨酸抗性”指细菌在含有重氮丝氨酸的培养基中较野生型细菌生长更快的特性。例如，在含有0.25g/L重氮丝氨酸的固体培养基上30℃在4-5天内形成菌落的菌株称为具有重氮丝氨酸抗性。
类似地，术语“β-(2-噻吩)-DL-丙氨酸抗性”指细菌在含有β-(2-噻吩)-DL-丙氨酸的培养基中较野生型细菌生长更快的特性。例如，在含有0.25g/Lβ-(2-噻吩)-DL-丙氨酸的固体培养基上30℃在4-5天内形成菌落的菌株称为具有β-(2-噻吩)-DL-丙氨酸抗性。
下文将描述磷酸丝氨酸磷酸酶和磷酸丝氨酸转氨酶活性的增强。
经过将serB或serC分别以可表达的形式导入棒杆菌可实现磷酸丝氨酸磷酸酶活性或磷酸丝氨酸转氨酶活性的增强。经过借助于分开的启动子增强编码各自的酶的基因的表达或者增强在单个启动子控制下的两个基因的表达可做到这一点。不论这些基因是在质粒上还是在染色体上，可经过增强诸如基因启动子的表达控制序列，或者提高翻译效率来增强表达。另外，可经过扩增染色体上的基因数来增强酶活性。而且可使用以使得所编码的修饰酶比活增强的方式修饰的编码磷酸丝氨酸磷酸酶或磷酸丝氨酸转氨酶的修饰的基因实现这些酶活性的增强。
为了将SerB或SerC导入棒杆菌，可将含有SerB或SerC的DNA片断与在棒杆菌中具有功能的载体连接以产生重组DNA，随后将它导入具有L-丝氨酸生产力的棒杆菌宿主以转化它。由于在转化菌株的细胞中SerB或SerC的拷贝数增加，结果扩增了其磷酸丝氨酸磷酸酶活性或磷酸丝氨酸转氨酶活性。将含有SerB及SerC两者的重组DNA或者含有SerB的重组DNA以及含有SerC的重组DNA两者导入棒杆菌将同时扩增磷酸丝氨酸磷酸酶活性和磷酸丝氨酸转氨酶活性。
SerB和SerC的碱基序列是已知的(SerB:GenBank；XO3046M30784,SerC;GenBank；D90728)。可合成以其碱基序列为基础的引物并使用大肠杆菌，黄色短杆菌或其它微生物的染色体DNA作模板经PCR方法收集这些微生物的SerB基因或SerC基因。至于该引物，司提到的是具有序列鉴定号15至18所示的碱基序列的引物。
优选的是将SerB基因或SerC基因与能够在大肠杆菌和/或棒杆菌细胞中自主复制的载体DNA连接以制备重组DNA，并且将此重组DNA导入前述的大肠杆菌细胞中。这种前提使下面的操作变得容易。能够在大肠杆菌细胞中自主复制的载体优选为能够在包括，例如pUC19,pUC18,pBR322,pHSG299,pHSG399,pHSG398和RSF1010的宿主细胞中自主复制的质粒载体。
当SerB基因和SerC基因位于分开的载体上以导入棒杆菌时，优选使用两个具有互不相同的各自的标记基因的载体。
可利用转座子(国际公开号WO02/02627，国际公开号WO93/18151，公开的欧洲专利申请No.0445385，公开的日本专利申请No.6-46867,Vertes,A.A.分子微生物学.,11,739-746(1994),Bonamy,C.，等.，分子微生物学.,14,571-581(1994)Vertes,A.A.等分子普通遗传学.,245,397-405(1994)Jagar,W.等，FEMS微生物学通讯126,1-6(1995)，公开的日本专利申请No.7-107976，公开的日本专利申请No.7-327680，等)、噬菌体载体、染色体重组(分子遗传学实验冷泉港实验室出版社(1972)；Matsuyama,S.和Mizushima,S.细菌学杂志，162,1196(1985))等制备重组DNA。
当将具有使质粒可在棒杆菌中自主复制的能力的DNA片段插入到这些载体中时，它们可用作在大肠杆菌和棒杆菌中均能自主复制的所谓的穿梭载体。
这样的穿梭载体包括以下载体。带有各载体的微生物和国际保藏机构的保藏号显示于括弧中。
pHC4：大肠杆菌AJ12617(FERM BP-3532)
pAJ655：大肠杆菌AJ11882(FERMBP-136)
        谷氨酸棒杆菌SR8201(ATCC39135)
pAJ1844：大肠杆菌AJ11883(FERM BP-137)
        谷氨酸棒杆菌SR8202(ATCC39136)
pAJ611：大肠杆菌AJ11884(FERM BP-138)
pAJ3148：谷氨酸棒杆菌SR8203(ATCC39137)
pAJ440：枯草芽孢杆菌AJ11901(FERM BP-140)
这些载体可按如下方法从保藏的微生物中得到。于对数生长期收集的细胞用溶菌酶和SDS加以裂解，然后于30,000×g离心对裂解液进行分离以获得上清并向其中加入聚乙二醇，然后通过氯化铯-溴化乙锭平衡密度梯度离心方法对其进行分级分离和纯化。
可根据，例如D.M.Morrison方法(酶学方法，68,326(1979))或其中的受体细胞以氯化钙处理以增加DNA通透性的方法(Mandel,M.和Higa,A.,分子生物学杂志.,53.159(1970))导入质粒而转化大肠杆菌。
质粒向棒杆菌中的导入以引起转化可通过电脉冲方法(Sugimoto等.，公开的日本专利申请No.2-207791)进行。
用于导入上述DNA的棒杆菌的实例包括，例如，下面的野生型菌株：
嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC13870；
醋谷棒杆菌ATCC15806；
美棒杆菌ATCC15991；
谷氨酸棒杆菌ATCC13032；
(扩展短杆菌)ATCC14020；
(乳发酵短杆菌)ATCC13869；
(百合棒状杆菌)ATCC15990；
(黄色短杆菌)ATCC14067；
Corynebacterium melassecola ATCC17965；
解糖短杆菌ATCC14066；
Brevibacterium immariophilum ATCC14068；
玫瑰色短杆菌ATCC13825
生硫短杆菌ATCC19240；
嗜氨微杆菌ATCC15354；
Corynebacterium thermoaminogenes AJ12340(FERM BP-1539)。
经过将多拷贝的serB基因或serC基因导入上述宿主菌株的染色体DNA也可实现磷酸丝氨酸磷酸酶活性或磷酸丝氨酸转氨酶活性的增强。为了将多拷贝的serB基因或serC基因导入棒杆菌的染色体DNA，使用在染色体DNA中存在多个拷贝的序列作为靶序列进行同源重组。至于在染色体DNA中存在多个拷贝的序列，可使用在可转座元件末端存在的重复DNA颠倒重复序列。另外，正如在公开的日本专利申请号2-109985中所公开的，可将SerB基因或SerC基因掺入转座子，并使其被转移以便将多拷贝的SerB基因或SerC基因导入染色体DNA。以任何一种方法可增加转化菌株细胞内的SerB基因或SerC基因的拷贝数，结果，增强了磷酸丝氨酸磷酸酶活性或磷酸丝氨酸转氨酶活性。
除了上述基因扩增外，也可经过构建诸如带有多个有效启动子的SerB基因或SerC基因启动子的表达调控序列来实现增强磷酸丝氨酸磷酸酶活性或磷酸丝氨酸转氨酶活性。例如，lac启动子，trp启动子，trc启动子，tac启动子和λ噬菌体的PR启动子及PL启动子称为有效启动子。经过构建在带有这些启动子的SerB基因或SerC基因中固有的启动子可增强SerB基因或SerC基因的表达，从而增强磷酸丝氨酸磷酸酶活性或磷酸丝氨酸转氨酶活性。
在优选的实施方案中，本发明的棒杆菌是经过将其中L-丝氨酸反馈抑制被脱敏的编码D-3-磷酸甘油酸脱氢酶的基因(下文也称为“3-PGDH”)导入具有L-丝氨酸生产力且增强了磷酸丝氨酸磷酸酶或磷酸丝氨酸转氨酶活性的棒杆菌而获得的菌株。
3-PGDH催化这样的反应，即在烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)作为辅酶存在时将3-磷酸甘油酸氧化成3-磷酸羟基丙酮酸。
来自野生型棒杆菌的3-PGDH对L-丝氨酸的反馈抑制敏感并且其活性几乎完全受10mML-丝氨酸存在的抑制。术语“其中L-丝氨酸的反馈抑制被脱敏的3-PGDH”意为即使在10mML-丝氨酸存在下3-PGDH具有无L-丝氨酸存在时活性的20％或更多，优选40％或更多，更为优选地是90％或更多。来自下面实施例中描述的黄色短杆菌AJ13327的3-PGDH在80mML-丝氨酸存在下基本上保留100％的活性且因此为最优选的3-PGDHs之一。
编码其中L-丝氨酸反馈抑制被脱敏的D-3-PGDH的基因可从L-丝氨酸类似物抗性棒杆菌，例如，在下述实施例中获得的黄色短杆菌重氮丝氨酸抗性菌株AJ13327，的染色体DNA制备。
来自野生型棒杆菌的3-PGDH(下面，编码该酶的DNA也称为“野生型serA”)具有序列表中的SEQ ID NO:12中列出的氨基酸序列。其中L-丝氨酸的反馈抑制被脱敏的3-PGDH的具体实例(下面，编码该酶的DNA也称为“突变型serA”)包括这样的D-3-磷酸甘油酸脱氢酶，其特征在于该D-3-磷酸甘油酸脱氢酶具有序列表中的SEQ ID NO:12中列出的氨基酸序列或与上述相同但具有一个或更多个氨基酸替代、添加或缺失且相应于SEQ ID NO.12中氨基酸序列的第325个谷氨酸残基的氨基酸残基被其它氨基酸所替代的氨基酸序列。最为优选的是该其它氨基酸为赖氨酸残基。
例如，可根据Saito和Miura的方法(H.Saito和K.Miura，生化.生物物理学报，72,619(1963))等制备染色体DNA并且然后通过聚合酶链式反应方法(PCR:聚合酶链式反应；参考White,T.J.等.，遗传学进展，5,185(1989))扩增serA基因从棒杆菌中分离含有serA基因的DNA片段。例如，为了扩增含有序列表中的SEQ ID NO:110RF(172至1705)的DNA片段，从SEQ IN NO:11中第一个碱基至紧邻ATG前面的碱基之间的区域选择任意20至30个碱基以获得一条引物。此外，从紧邻终止密码子后面的碱基至SEQ IN NO:11中最后一个碱基之间的区域选择任意20至30个碱基以获得另一条引物。
当从3-PGDH的野生型菌株分离serA时，获得野生型serA并且从带有其中L-丝氨酸的反馈抑制被脱敏的3-PGDH的突变体中(3-PGDH突变体)分离serA得到突变的serA。具体地说，野生型serA具有序列表中的SEQ ID NO:11中列出的序列，并且突变体serA具有序列表中的SEQ ID NO:13中列出的序列。
经过与导入serB或serC相同的方式用含有突变型serA的重组载体转化棒杆菌可将突变型serA导入棒杆菌。突变型serA优选以多拷贝导入。突变型serA与serB或serC可位于单个载体上或分别位于分开的两个或三个载体上。
对于用本发明的菌株进行L-丝氨酸的生产，可使用下面的方法。作为待用的培养基，可使用含有碳源、氮源、无机盐和如果必要的话，任选的诸如氨基酸、维生素等有机痕量营养成分的常规液体培养基。
作为碳源，可使用如葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖；糖化的淀粉溶液、甜土豆糖浆、糖甜菜糖浆和包括上述糖的最高糖浆；有机酸如乙酸；醇如乙醇；甘油等。
作为氮源，可使用氨气、水溶性氨、铵盐、尿素、硝酸盐等。此外，可使用有机氮源用于补充使用，例如，油性蛋糕、大豆水解液、分解的酪蛋白、其它氨基酸、玉米浆、酵母或酵母提取物、肽如蛋白胨等。
作为无机离子，可任选加入磷酸离子、镁离子、钙离子、铁离子和锰离子等。
当使用需要营养物如氨基酸用于其生长的本发明微生物时，应该补充所需的营养物。
通常在pH5到8并且25到40℃的温度范围的有氧条件下孵育微生物。根据无机或有机酸、碱性物质、尿素、碳酸钙、氨气等的存在与否将培养基的pH控制在上述预定的范围内。
例如，可通过分离和去除细胞、进行离子交换树脂处理、浓缩冷却结晶、膜分离和其它已知的方法以任何适当的组合从发酵液中收集L-丝氨酸。为了去除杂质，可以用活性碳吸附和重结晶进行纯化。
本发明提供了一种从糖合成L-丝氨酸的棒杆菌。该棒杆菌可用于工业上优越的生产L-丝氨酸的方法中。
(实施例1)产L-丝氨酸的黄色短杆菌AJ13324和AJ13327的构建从L-丝氨酸分解活性缺陷的获自野生型黄色短杆菌ATCC14067的黄色短杆菌AJ13377构建黄色短杆菌AJ13324和AJ13327。
为了获得突变体将在肉汤培养基(在1升水中含有1g鱼肉提取物，1g聚胨0.5g酵母提取物，和0.5g氯化钠，调至pH7.0的培养基)中扩增24小时的细胞悬浮于100mM的磷酸缓冲液(pH7.0)(含有109至1010个细胞/ml)中。将NG(N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍)加入到悬液中至200μg/ml的浓度并且于30℃放置30分钟。将这样处理的细胞用上述缓冲液充分洗涤。
为了从NG处理的细胞中筛选具有无L-丝氨酸分解活性的菌株，将洗涤后以NG处理的黄色短杆菌ATCC14067细胞涂布在肉汤琼脂培养基上并且于30℃培养24小时以使菌落形成。然后，将肉汤琼脂培养基上的菌落用作阴性菌落并且于基本培养基和用于筛选的基本培养基上进行复制子形成。然后，筛选生长于基本培养基上但不生长于用于筛选的基本培养基上的菌株。该基本培养基为每升蒸馏水中含有以下成份的培养基，包括20g葡萄糖，1g硫酸铵，1g磷酸二氢钾，2.5g尿素，0.4g7水硫酸镁，0.01g7水硫酸铁(Ⅱ)，0.01g4-至5水硫酸锰，50μg生物素，200μg盐酸硫胺素，200ug烟酰胺和2.0g琼脂。用于筛选的基本培养基为每升蒸馏水中含有以下成份的培养基包括1g硫酸铵，1g磷酸二氢钾，2.5g尿素，0.4g7水硫酸镁，0.01g7水硫酸铁(Ⅱ)，0.01g4-至5水硫酸锰50μg生物素，200μg盐酸硫胺素，200μg烟酰胺，0.5gL-丝氨酸和2.0g琼脂。通过此方法获得的突变体中发现许多具有无L-丝氨酸分解活性的菌株并且获得黄色短杆菌AJ13377作为一个这样的菌株。
为了用黄色短杆菌AJ13377作为亲本菌株从NG处理的菌株中筛选重氮丝氨酸抗性的菌株，将洗涤后的NG处理的黄色短杆菌AJ13377细胞接种于用于筛选的基本培养基上。该用于筛选的基本培养基上为每升蒸馏水中含有以下成份的培养基包括20g葡萄糖，1g硫酸铵，1g磷酸二氢钾，2.5g尿素，0.4g7水硫酸镁，0.01g7水硫酸铁(Ⅱ)，0.01g4-至5水硫酸锰50μg生物素，200μg盐酸硫胺素，200μg烟酰胺和250mg重氮丝氨酸。将NG处理的突变体于30℃在上述培养基中培养5至10天。将这样获得的细胞培养物涂布在肉汤琼脂培养基上并且于30℃培养24小时用于菌落形成。从形成菌落的菌株中获得重氮丝氨酸抗性菌株。这样获得的突变体包括许多以高产量大量积累L-丝氨酸的菌株。从这些菌株中获得2个菌株，即，黄色短杆菌AJ13324和AJ13327。已证实这些菌株能够在0.25g/L重氮丝氨酸存在下生长。
(实施例2)新的产L-丝氨酸黄色短杆菌AJ13325的构建从L-丝氨酸分解性缺陷的获自野生型黄色短杆菌ATCC14067的黄色短杆菌AJ13377构建黄色短杆菌AJ13325。
为了从用黄色短杆菌AJ13377作为亲本菌株的NG处理的菌株中筛选对β-(2-噻吩)-DL-丙氨酸具有抗性的菌株，将黄色短杆菌AJ13377细胞在接种于用于筛选的基本培养基上之前以NG处理并且洗涤。该用于筛选的基本培养基上为每升蒸馏水中含有以下成份的培养基，包括20g葡萄糖，1g硫酸铵，1g磷酸二氢钾，2.5g尿素，0.4g7水硫酸镁，0.01g7水硫酸铁(Ⅱ)，0.01g4-至5水硫酸锰，50μg生物素，200μg盐酸硫胺素，200μg烟酰胺和250mgβ-(2-噻吩)-DL-丙氨酸。将NG处理的突变体于30℃在上述培养基中培养5至10天。将这样获得的细胞培养物涂布在肉汤琼脂培养基上并且于30℃培养24小时用于菌落形成。从形成菌落的这些菌株中获得对β-(2-噻吩)-DL-丙氨酸具有抗性的菌株。这样获得的突变体包括许多以高产量大量积累L-丝氮酸的菌株。作为一个这样的菌株获得了黄色短杆菌AJ13325。已证实这些菌株能够在0.25g/Lβ-(2-噻吩)-DL-丙氨酸存在下生长。
(实施例3)通过产L-丝氨酸的黄色短杆菌AJ13324,AJ13325和AJ13327生产L-丝氨酸
将黄色短杆菌AJ13324,AJ13325和AJ13327分别于30C在肉汤培养基上培养24小时并且将1菌环量的每种微生物接种于500ml的摇瓶中，其中该摇瓶含有20ml具有表1所示组分的发酵培养基。作为对照，按上述相同的方式接种亲本菌株黄色短杆菌ATCC14067和AJ13377。以氢氧化钾调节培养基至pH7.0并且于115℃高压灭菌15分钟。灭菌和冷却后，加入5g/L量的于180℃干热灭菌的碳酸钙。
                         表1
成份                                  含量/升
葡萄糖                                 110.0g
磷酸二氢钾                             0.4g
7水硫酸镁                              0.4g
7水硫酸铁(Ⅱ)                          0.01g
4-至5水硫酸锰                          0.01g
硫酸铵                                 25.0g
盐酸硫胺素                             100μg
生物素                                 100μg
大豆蛋白盐酸裂解物(“Mieki”(注册商标))40ml
pH                                     7.0
用高效液相色谱(日立L-8500氨基酸分析仪)对L-丝氨酸的测定显示黄色短杆菌AJ13324,AJ13325和AJ13327分别以15.2g/L、14.3g/L和15.4g/L的量在培养基中积累L-丝氨酸。另一方面，作为对照培养的黄色短杆菌菌株ATCC1406和AJ13377分别以0g/L和5.0g/L的量积累L-丝氨酸。
离心黄色短杆菌AJ13324的培养基并且用阳离子交换树脂对此上清进行脱盐处理，随后用阴离子交换树脂和阴离子交换树脂进行色谱分离以去除副产品并且通过结晶纯化以从55％的培养基产量中获得至少99％纯度的L-丝氨酸结晶。
(实施例4)3-PGDH活性的测定
将黄色短杆菌AJ13324,AJ13325和AJ13327分别于30℃在肉汤琼脂培养基上培养24小时并且将1菌环量的每种微生物接种于500ml的摇瓶中，其中该摇瓶含有50ml具有表2所示组分的发酵培养基。作为对照，按上述相同的方式接种亲本菌株黄色短杆菌ATCC14067和AJ13377。以氢氧化钠调节用于接种的培养基至pH5.5并且于115℃高压灭菌15分钟。
                         表2
成份                                  含量/升
葡萄糖                                 30.0g
磷酸二氢钾                             1.0g
7水硫酸镁                              0.4g
7水硫酸铁(Ⅱ)                          0.01g
4-至5水硫酸锰                          0.01g
硫酸铵                                 3.0g
大豆蛋白盐酸裂解物(“Mieki”(注册商标))3.0ml
盐酸硫胺素                             200μg
生物素                                 50μg
尿素                                   3.0g
酵母提取物                             2.0g
pH                                     5.5
从每种菌株的培养基中收集细胞以后，用生理盐水洗涤细胞2次并且悬浮于含有2mM二硫苏糖醇的50mM的磷酸钠缓冲液(pH7.0)中。冰冷以后，将悬液用超声仪破碎细胞并且超速离心所得的液体。超速离心在45,000rpm进行1小时以获得粗酶溶液。
用Salach H.J.等的方法(酶学方法，9卷，216-220(1966))测定3-PGDH的酶活性。
更具体电说，加入0.4ml0.015M NAD,0.12ml0.25M EDTA(pH 9,NaOH),0.1ml0.05M谷光甘肽(pH6,KOH),0.5ml1M肼(pH9，乙酸盐)，0.6ml1M Tris(pH9,Hcl)，适当浓度的L-丝氨酸(0-40mM)和水以制成2.3ml，预先加热至25℃。然后，加入0.2ml的粗酶溶液并且维持恒温5分钟。之后，加入0.5ml0.1M 3-PGA(3-磷酸甘油酸二钠盐，pH7,NaOH)。搅拌后，于340nm处测定反应混合物的吸光率30秒。反应于25℃进行。
为了进行活性测定，使用日立U-2000A分光光度计。
图1显示得到的结果。与野生型菌株ATCC14067相比，AJ13377菌株的L-丝氨酸敏感性降低。AJ13324菌株的L-丝氨酸敏感性降低得更多并且AJ13325菌株与AJ13324菌株在这方面的水平相同。AJ13327菌株大大地降低了L-丝氨酸的敏感性。并且甚至在80mM L-丝氨酸的存在下抑制被完全脱敏。
尽管已报导大肠杆菌中L-丝氨酸对3-PGDH抑制脱敏的一些实例(Tosa和Pizer，细菌学杂志.106:972-982(1971)或公开的日本专利申请No.6-510911)，但是已知还没有在如此高浓度L-丝氨酸存在下对此抑制完全脱敏的实例。
(实施例5)来自棒杆菌野生型和突变型serA的克隆
如实施例4中所示，在AJ13327菌株中L-丝氨酸的反馈抑制被完全脱敏。因此，为了弄清什么样的变异并且证实3-PGDH的扩增效果，试图克隆编码来自ATCC14067菌株野生型3-PGDH和来自AJ13327菌株突变型3-PGDH的serA基因。
为了用PCR方法从黄色短杆菌染色体中扩增serA，生产相应的引物是必要的。由于没有有关黄色短杆菌serA克隆和核苷酸序列的报导，使用了来自棒杆菌的serA序列。从谷氨酸棒杆菌K82(参考FERM BP-2444和公开的日本专利申请No.3-7591)中提取质粒，其中的来自棒杆菌的serA片段用Wizard Minipreps DNA纯化系统(Promega生产)克隆并且以限制酶BamHⅠ(Takara Shuzo有限公司生产)切割含有serA的约1.4kb的DNA片段。
作为用于克隆基因片段的载体用新近构建的克隆载体pVK7用于棒杆菌。
通过以下述方式连接(大肠杆菌克隆载体)pHSG299(Kmr；Takeshita,S.等，基因，61,63-74(1987)，公开的日本专利申请No.10-215883)至pAM330,一种乳酸发酵短杆菌的隐蔽性质粒而构建pVK7。以单特异性限制酶AvaⅡ(TakaraShuzo有限公司生产)切割pHSG299并且以T4 DNA聚合酶末端补平。将它与已经用HindⅢ(Takara Shuzo有限公司生产)切割并且以T4 DNA聚合酶补平末端的pAM330连接。根据pAM330相对于pHSG299的插入方向将得到的这2种质粒命名为pVK6和pVK7。pVK7用于下面的实验。pVK7可以在大肠杆菌和乳酸发酵短杆菌中自主复制并且保留来自pHSG299的多克隆位点和lacZ’。图2显示pVK6和pVK7的构建过程。
向这样构建的穿梭载体pVK7上连接一个含有serA的约1.4kb的DNA片段。pDTS9901以限制酶BamHⅠ(Takara Shuzo有限公司生产)切割并且连接至同样以限制酶BamHⅠ切割的pVK7上。根据前述方法用DNA连接试剂盒(Takara Shuzo有限公司生产)进行DNA的连接。
对于测序反应，使用PCR热循环仪MP型(Takara Shuzo有限公司生产)和染色终止循环测序FS即用反应试剂盒(珀金-埃尔默公司生产)。作为DNA引物，使用M13(-21)，RV引物(TakaraShuzo有限公司生产)。序列表中的SEQ ID NO:1显示了这样得到的序列。SEQ ID NO:2显示了可由该序列编码的氨基酸序列。
根据这样测定的碱基序列合成引物并且用突变型黄色短杆菌AJ13327的染色体DNA作为模板通过PCR方法扩增serA。序列表中的SEQ ID NO:3和4分别显示合成用于基因扩增的DNA引物的N-末端和C-末端序列。
在黄色短杆菌染色体DNA制备中，使用了基因组DNA纯化试剂盒(细菌性的)(先驱遗传学技术公司生产)并且制备方法根据其所附的方案进行。
对于PCR反应，使用了PCR热循环仪MP型(Takara Shuzo有限公司生产)和TaKaRa Taq(Takara Shuzo有限公司生产)。
PCR产物用Original TA克隆试剂盒(Invitrogen生产)直接连接至质粒pCR2.1载体上并且用INVαF’的感受态细胞进行转化。将转化的细胞涂布在进一步含有40μg/ml X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)和25μg/ml卡那霉素的L培养基(10g/L细菌用胰蛋白胨，5g/L细菌用酵母提取物，15g/L NaCl，和15g/L琼脂)并且培养过夜。收集出现的白色菌落并且分离至单菌落以获得转化的菌株。
从转化的菌株中提取质粒并且以限制酶EcoRⅠ处理经PCR方法证实有serA片段插入的那些质粒并且连接至穿梭载体pVK中。对此产物的碱基序列测定表明C-末端不含有全长序列。这样得到的序列相应于序列表中SEQ ID NO:13中5’端上游277碱基至SEQ ID NO:13中3’端1134碱基之间的区域。
为了获得含有全长serA基因的片段，黄色短杆菌AJ13327菌株染色体DNA缺失部分的克隆用TaKaRa LA PCR体外克隆试剂盒(Takara Shuzo有限公司生产)根据所附的方案进行。
首先，将这样制备的染色体DNA以各种限制酶完全消化并且与其中具有相应限制酶位点的连接盒连接。用盒式引物(C1)(序列表中的SEQ ID NO:5)和与已知的DNA(S1)区域(序列表中的SEQ ID NO:6)互补的引物进行第1轮PCR。用该反应混合物的一部分，用内部引物C2(序列表中的SEQ ID NO:7)和S2(序列表中的SEQ ID NO:8)进行第2轮PCR以仅仅扩增目的DNA。
当EcoRⅠ(Takara Shuzo有限公司生产)用作限制酶时，证实该目的DNA的扩增并且直接测定该PCR产物的碱基序列。根据这样获得的碱基序列，生产编码C-末端一侧的引物并且从作为野生型菌株的黄色短杆菌ATCC14067和作为突变菌株的黄色短杆菌AJ13327中收集含有全长serA的片段。序列表中的SEQ ID NOS:9和10分别显示N-末端和C-末端侧链DNA引物的序列。
用Original TA克隆试剂盒(Invitrogen生产)将分别含有全长野生型serA和突变型serA的基因片段连接至EcoRⅠ-切割的穿梭载体pVK7中。分别生产带有相应基因片段的质粒并且测定其碱基序列。SEQ ID NOS:11和13分别表示野生型和突变型的序列。SEQ ID NOS:12和14分别表示这些序列可编码的氨基酸序列。比较这样测定的碱基序列，证实在突变型serA中，第1087个碱基G突变成A并且因此第325个氨基酸谷氨酸变成赖氨酸。
(实施例6)将含有3-PGDH基因的质粒导入黄色短杆菌中将带有野生型serA或突变型serA的质粒分别导入黄色短杆菌AJ13377中。这些质粒通过电脉冲方法(Sugimoto等，公开的日本质粒申请No.2-207791)导入。在含有25μg/ml卡那霉素的完全培养基中筛选转化的细胞。
(实施例7)通过转化的细胞生产L-丝氨酸
其中分别导入了具有含全长野生型serA或突变型serA基因片段的质粒的转化细胞在根据实施例3的500ml摇瓶中培养，并且测定产生的L-丝氨酸。作为对照，类似地培养作为宿主的AJ13377菌株。
观察到其中导入野生型serA的转化细胞其L-丝氨酸生产力没有影响而证实其中导入了突变型serA的转化细胞L-丝氨酸生产力增加(表3)
黄色短杆菌AJ13377已于1997年10月15日保藏于通商产业省工业科学和技术院生物科学和人类技术研究所(邮政编码：305-8566，日本茨城县筑波市东1丁目1番3号)，保藏号为FERM P-16471，并且根据布达佩斯条约于1998年11月20日由原始保藏转化为国际保藏，且保藏号为FERM BP-6567。
此外，含有突变型serA的质粒包含在黄色短杆菌ATCC14067中。带有此质粒的菌株命名为黄色短杆菌AJ1338并且已于1997年10月15日保藏于通商产业省工业科学和技术院生物科学和人类技术研究所(邮政编码：305-8566，日本茨城县筑波市东1丁目1番3号)，保藏号为FERM P-16472，并且根据布达佩斯条约于1998年11月20日由原始保藏转化为国际保藏且保藏号为FERM BP-6577。(实施例8)在黄色短杆菌产L-丝氨酸的菌株中
扩增serB和/或serC
(1)构建表达serB或serC的质粒
按图3和4所示构建表达serB的质粒pSB和表达serC的质粒pSC。
对于serB基因，根据已知的碱基序列(GenBank；X03046,M30784)制备引物(序列表中的SEQ ID NOS:15和16分别表示N-末端和C-末端)。另一方面，对于serC基因，根据已知的碱基序列(GenBank；D90728)制备引物(序列表中的SEQ IDNOS:17和18分别表示N-末端和C-末端)并使用大肠杆菌JM109染色体DNA作模板进行PCR以获得含有编码serB的ORF的基因片断(1197bp)和含有编码serC的ORF的基因片断(1380bp)。
SEQ ID NOS:15和16的碱基序列相应于序列GenBank；X03046,M30784中碱基号1197至1175和碱基号1至23的区域且SEQ ID NOS:17和18的碱基序列相应于序列GenBank；D90728中碱基号13205至13227和碱基号14584至14562的区域。
serB片断在钝端化后插入高拷贝型载体pHSG399的SmaⅠ位点以获得p399B。为了使该质粒能在棒状杆菌属细菌中自主复制，从来自pHM1519的保留有复制因子的pBK4裂解复制因子(下文称为“Brev.-ori”)并插入p399B以获得pSB(图3)。pBK4制备如下。即，含有Brev.-ori的质粒pHC4从含有该质粒的大肠杆菌AJ12617菌株(FERM BP-3532)制备并用KpnⅠ(Takara Shuzo有限公司生产)和BamHⅠ(TakaraShuzo有限公司生产)裂解以提取Brev.-ori片断，然后将其钝端化。根据前述方法使用DNA钝端化试剂盒(Takara Shuzo有限公司生产)进行钝端化。随后，将产物连接到已磷酸化的BamHⅠ连接子上并用BamHⅠ再次裂解。将它连接到也用BamHⅠ裂解的pHSG298上以获得pBK4。pBK4可用于以BamHⅠ裂解Brev.-ori片断。
另外，将serC片断插入pPCR-Script SK(+)的SrfⅠ位点以获得pScript-serC。向所得质粒的SacⅠ位点插入一个PstⅠ连接子。然后，用PstⅠ裂解serC片断并插入pHS6399的PstⅠ位点以获得p399C。从保留有来自pHM1519的复制因子的pBK4裂解复制因子并插入p399C以获得pSC(图4)。
(2)构建表达serB和serC的质粒
随后，制备分别表达serB和serC的质粒pBC8和pBC14(图5)。向存在于上述pScript-serC的serC片断外侧的SacⅠ位点插入一个PstⅠ连接子以导入一个PstⅠ位点。用PstⅠ处理该质粒以裂解serC片断，然后将它插入含有serB的质粒pSB的PstⅠ位点。证实其碱基序列且serC片断反向插入lacz的质粒命名为pBC8，其正向插入lacz的质粒命名为pBC14。
(3)以serB和serC扩增的菌株生产L-丝氨酸
使用上述制备的质粒pSB,pSC和pBC8转化黄色短杆菌野生型菌株ATCC14067并从转化细胞中提取质粒。将质粒用于转化具有L-丝氨酸生产力的黄色短杆菌AJ13377和AJ13327。另外用黄色短杆菌AJ13378(FERM P-16472)中携带的含有突变型serA的质粒转化携带pBC8的黄色短杆菌AJ13377和AJ13327。在含10mg/L氯霉素的琼脂培养基上培养各转化的菌株并按与实施例3相同的方式分别培养形成的菌落，接着测量培养基中积累的L-丝氨酸。经过向培养基中加入25mg/L卡那霉素培养含有突变serA的转化菌株。表3显示了所得的结果。
                          表3菌株扩增的基因积累的L-丝氨酸的量(g/L)AJ13377-                5.0
serA                5.0
serA*               12.0
serB                19.3
serC                8.3
serB,serC           19.5
serA※,serB,serC   24.8AJ13327-               15.4
serB                24.2
serC                19.8
serB,serC           26.4
serA※,serB,serC   35.2
serA*：突变型serA基因
如上所述，serB或serC的扩增增加了积累的L-丝氨酸的量。另外，serB和serC基因同时扩增进一步增加了积累的L-丝氨酸的量。此外，基因与突变型serA基因一起扩增使积累的L-丝氨酸量增加得更多。使用pBC14代替pBC8获得了相似的结果。
在本实施例中，尽管黄色短杆菌的L-丝氨酸分解活性缺陷型菌株(AJ13377)或L-丝氨酸分解活性缺陷型，重氮丝氨酸抗性菌株(AJ13327)用作具有L-丝氨酸生产力的棒杆菌宿主以扩增各基因，但也可使用其它的重氮丝氨酸抗性菌株(AJ13324)或L-丝氨酸分解活性缺陷型，β-(2-噻吩)-DL-丙氨酸抗性菌株(AJ13325)。
                        序列表<110>Ajinomoto有限公司<120>通过发酵生产L-丝氨酸的方法<130>OP813<150>JP10-3751<151>1998-01-12<150>JP10-353521<151>1998-12-11<160>18<170>专利2.0版<210>1<211>1432<212>DNA<213>谷氨酸棒杆菌<220><221>CDS<222>(398)..(1432)<400>1ggatccggac acacgtgaca aaattgtaga aaattggatg attttgtcac gcctgtctgg 60tttagctctg gttcgggacg ggcgtggaat ggaggtagcg caccgagacc ttgacccgcg 120gcccgacaag ccaaaagtcc ccaaaacaaa cccacctcgc cggagacgtg aataaaattc 180gcagctcatt ccatcagcgt aaacgcagct ttttgcatgg tgagacacct ttgggggtaa 240atctcacagc atgaatctct gggttagatg actttctggg tgggggaggg tttagaatgt 300ttctagtcgc acgccaaaac ccggcgtgga cacgtctgca gccgacgcgg tcgtgcctgt 360tgtaggcgga cattcctagt ttttccagga gtaactt gtg agc cag aat ggc cgt  415
                                     Val Ser Gln Asn Gly Arg
                                       1               5ccg gta gtc ctc atc gcc gat aag ctt gcg cag tcc act gtt gac gcg    463Pro Val Val Leu Ile Ala Asp Lys Leu Ala Gln Ser Thr Val Asp Ala
         10                  15                  20ctt gga gat gca gta gaa gtc cgt tgg gtt gac gga cct aac cgc cca    511Leu Gly Asp Ala Val Glu Val Arg Trp Val Asp Gly Pro Asn Arg Pro
     25                  30                  35gaa ctg ctt gat gca gtt aag gaa gcg gac gca ctg ctc gtg cgt tct    559Glu Leu Leu Asp Ala Val Lys Glu Ala Asp Ala Leu Leu Val Arg Ser
 40                  45                  50gct acc act gtc gat gct gaa gtc atc gcc gct gcc cct aac ttg aag    607Ala Thr Thr Val Asp Ala Glu Val Ila Ala Ala Ala Pro Asn Leu Lys55                  60                  65                  70atc gtc ggt cgt gcc ggc gtg ggc ttg gac aac gtt gac atc cct gct    655Ile Val Gly Arg Ala Gly Val Gly Leu Asp Asn Val Asp Ile Pro Ala
             75                  80                  85gcc act gaa gct ggc gtc atg gtt gct aac gca ccg acc tct aac atc    703Ala Thr Glu Ala Gly Val Met Val Ala Asn Ala Pro Thr Ser Asn Ile
         90                  95                 100cac tct gct tgt gag cac gca att tct ttg ctg ctg tct act gct cgc    751His Ser Ala Cys Glu His Ala Ile Ser Leu Leu Leu Ser Thr Ala Arg
    105                 110                 115cag atc cct gct gct gat gcg acg ctg cgt gag ggc gag tgg aag cgg    799Gln Ile Pro Ala Ala Asp Ala Thr Leu Arg Glu Gly Glu Trp Lys Arg
120                 125                 130tct tct ttc aac ggt gtg gaa att ttc gga aaa act gtc ggt atc gtc    847Ser Ser Phe Asn Gly Val Glu Ile Phe Gly Lys Thr Val Gly Ile Val135                 140                 145                 150ggt ttt ggc cac att ggt cag ttg ttt gct cag cgt ctt gct gcg ttt    895Gly Phe Gly His Ile Gly Gln Leu Phe Ala Gln Arg Leu Ala Ala Phe
            155                 160                 165gag acc acc att gtt gct tac gat cct tac gcc aac cct gct cgt gca    943Glu Thr Thr Ile Val Ala Tyr Asp Pro Tyr Ala Asn Pro Ala Arg Ala
        170                 175                 180gct cag ctg aac gtt gag ttg gtt gag ttg gat gag ctg atg agc cgt    991Ala Gln Leu Asn Val Glu Leu Val Glu Leu Asp Glu Leu Met Ser Arg
    185                 190                 195tct gac ttt gtc acc att cac ctt cct aag acc aag gaa act gct ggc    1039Ser Asp Phe Val Thr Ile His Leu Pro Lys Thr Lys Glu Thr Ala Gly
200                 205                 210atg ttt gat gcg cag ctc ctt gct aag tcc aag aag ggc cag atc atc    1087Met Phe Asp Ala Gln Leu Leu Ala Lys Ser Lys Lys Gly Gln Ile Ile215                 220                 225                 230atc aac gct gct cgt ggt ggc ctt gtt gat gag cag gct ttg gct gat    1135Ile Asn Ala Ala Arg Gly Gly Leu Val Asp Glu Gln Ala Leu Ala Asp
            235                 240                 245gcg att gag tcc ggt cac att cgt ggc gct ggt ttc gat gtg tac tcc    1183Ala Ile Glu Ser Gly His Ile Arg Gly Ala Gly Phe Asp Val Tyr Ser
        250                 255                 260acc gag cct tgc act gat tct cct ttg ttc aag ttg cct cag gtt gtt    1231Thr Glu Pro Cys Thr Asp Ser Pro Leu Phe Lys Leu Pro Gln Val Val
    265                 270                 275gtg act cct cac ttg ggt gct tct act gaa gag gct cag gat cgt gcg    1279Val Thr Pro His Leu Gly Ala Ser Thr Glu Glu Ala Gln Asp Arg Ala
280                 285                 290ggt act gac gtt gct gat tct gtg ctc aag gcg ctg gct ggc gag ttc    1327Gly Thr Asp Val Ala Asp Ser Val Leu Lys Ala Leu Ala Gly Glu Phe295                 300                 305                 310gtg gcg gat gct gtg aac gtt tcc ggt ggt cgc gtg ggc gaa gag gtt    1375Val Ala Asp Ala Val Asn Val Ser Gly Gly Arg Val Gly Glu Glu Val
            315                 320             325gct gtg tgg atg gat ctg gct cgc aag ctt ggt ctt ctt gct ggc aag    1423Ala Val Trp Met Asp Leu Ala Arg Lys Leu Gly Leu Leu Ala Gly Lys
        330                 335                 340ctt gtc gac                                                        1432Leu Val Asp
    345<210>2<211>345<212>PRT<213>谷氨酸棒杆菌<400>2Val Ser Gln Asn Gly Arg Pro Val Val Leu Ile Ala Asp Lys Leu Ala1               5                 10                  15Gln Ser Thr Val Asp Ala Leu Gly Asp Ala Val Glu Val Arg Trp Val
         20                  25                  30Asp Gly Pro Asn Arg Pro Glu Leu Leu Asp Ala Val Lys Glu Ala Asp
     35                      40              45Ala Leu Leu Val Arg Ser Ala Thr Thr Val Asp Ala Glu Val Ile Ala
 50                  55                  60Ala Ala Pro Asn Leu Lys Ile Val Gly Arg Ala Gly Val Gly Leu Asp65                  70                  75                  80Asn Val Asp Ile Pro Ala Ala Thr Glu Ala Gly Val Met Val Ala Asn
             85                  90                  95Ala Pro Thr Ser Asn Ile His Ser Ala Cys Glu His Ala Ile Ser Leu
        100                 105                 110Leu Leu Ser Thr Ala Arg Gln Ile Pro Ala Ala Asp Ala Thr Leu Arg
    115                 120                 125Glu Gly Glu Trp Lys Arg Ser Ser Phe Asn Gly Val Glu Ile Phe Gly
130                 135                 140Lys Thr Val Gly Ile Val Gly Phe Gly His Ile Gly Gln Leu Phe Ala145                 150                 155                 160Gln Arg Leu Ala Alu Phe Glu Thr Thr Ile Val Ala Tyr Asp Pro Tyr
        165                     170                 175Ala Asn Pro Ala Arg Ala Ala Gln Leu Asn Val Glu Leu Val Glu Leu
        180                 185                 190Asp Glu Leu Met Ser Arg Ser Asp Phe Val Thr Ile His Leu Pro Lys
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290                 295                 300Ala Leu Ala Gly Glu Phe Val Ala Asp Ala Val Asn Val Ser Gly Gly305                 310                 315                 320Arg Val Gly Glu Glu Val Ala Val Trp Met Asp Leu Ala Arg Lys Leu
            325                 330                 335Gly Leu Leu Ala Gly Lys Leu Val Asp
        340                 345<210>3<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物<400>3ggacacacgt gacaaaattg tag<210>4<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物<400>4gccagcaaga agaccaagct tgc<210>5<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物<400>5gtacatattg tcgttagaac gcgtaatacg actca<210>6<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物<400>6tcatcaacgc tgctcgtggt ggc<210>7<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物<400>7cgttagaacg cgtaatacga ctcactatag ggaga<210>8<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物<400>8gacgttgctg attctgtgct caa<210>9<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物<400>9gggagggttt agaatgtttc tag<210>10<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物<400>10ggttcaagca aatggatctc taa<210>11<211>1730<212>DNA<213>黄色短杆菌<220><221>CDS<222>(115)..(1704)<400>11gggagggttt agaatgtttc tagtcgcacg ccaaaacccg gcgtggacac gtctgcagcc  60gacgcggtcg tgcctgttgt aggcggacat tcctagtttt tccaggagta actt gtg    117
                                                        Val
                                                          1agc cag aat ggc cgt ccg gta gtc ctc atc gcc gat aag ctt gcg cag    165Ser Gln Asn Gly Arg Pro Val Val Leu Ile Ala Asp Lys Leu Ala Gln
          5                  10                  15tcc act gtt gac gcg ctt gga gat gca gta gaa gtc cgt tgg gtt gac    213Ser Thr Val Asp Ala Leu Gly Asp Ala Val Glu Val Arg Trp Val Asp
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 35                  40                  45ctg ctc gtg cgt tct gct acc act gtc gat gct gaa gtc atc gcc gct    309Leu Leu Val Arg Ser Ala Thr Thr Val Asp Ala Glu Val Ile Ala Ala50                  55                  60                  65gcc cct aac ttg aag atc gtc ggt cgt gcc ggc gtg ggc ttg gac aac    357Ala Pro Asn Leu Lys Ile Val Gly Arg Ala Gly Val Gly Leu Asp Asn
             70                  75                  80gtt gac atc cct gct gcc act gaa gct ggc gtc atg gtt gct aac gca    605Val Asp Ile Pro Ala Ala Thr Glu Ala Gly Val Met Val Ala Asn Ala
         85                  90                  95ccg acc tct aac att cac tct gct tgt gag cac gca att tct ttg ctg    453Pro Thr Ser Asn Ile His Ser Ala Cys Glu His Ala Ile Ser Leu Leu
    100                 105                 110ctg tct act gct cgc cag atc cct gct gct gat gcg acg ctg cgt gag    501Leu Ser Thr Ala Arg Gln Ile Pro Ala Ala Asp Ala Thr Leu Arg Glu
115                 120                 125ggc gag tgg aag cgg tct tct ttc aac ggt gtg gaa att ttc gga aaa    549Gly Glu Trp Lys Arg Ser Ser Phe Asn Gly Val Glu Ile Phe Gly Lys130                 135                 140                 145act gtc ggt atc gtc ggt ttt ggc cac att ggt cag ttg ttt gct cag    597Thr Val Gly Ile Val Gly Phe Gly His Ile Gly Gln Leu Phe Ala Gln
            150                 155                 160cgt ctt gct gcg ttt gag acc acc att gtt gct tac gat cct tac gct    645Arg Leu Ala Ala Phe Glu Thr Thr Ile Val Ala Tyr Asp Pro Tyr Ala
        165                 170                 175aac cct gct cgt gcg gct cag ctg aac gtt gag ttg gtt gag ttg gat    693Asn Pro Ala Arg Ala Ala Gln Leu Asn Val Glu Lsu Val Glu Leu Asp
    180                 185                 190gag ctg atg agc cgt tct gac ttt gtc acc att cac ctt cct aag acc    741Glu Leu Met Ser Arg Ser Asp Phe Val Thr Ile His Leu Pro Lys Thr
195                 200                 205aag gaa act gct ggc atg ttt gat gcg cag ctc ctt gct aag tcc aag    789Lys Glu Thr Ala Gly Met Phe Asp Ala Gln Leu Leu Ala Lys Ser Lys210                 215                 220                 225aag ggc cag atc atu atc aac gct gct cgt ggt ggc ctt gtt gat gaa    837Lys Gly Gln Ile Ile Ile Asn Ala Ala Arg Gly Gly Leu Val Asp Glu
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    420                 425                 430act ggt ctt gag cgc gtt gag aag atc acc cgc atc aat ggc cgt ggc    1461Thr Gly Leu Glu Arg Val Glu Lys Ile Thr Arg Ile Asn Gly Arg Gly
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    115                 120                 125Glu Gly Glu Trp Lys Arg Ser Ser Phe Asn Gly Val Glu Ile Phe Gly
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    195                 200                 205Thr Lys Glu Thr Ala Gly Met Phe Asp Ala Gln Leu Leu Ala Lys Ser
210                 215                 220Lys Lys Gly Gln Ils Ile Ile Asn Ala Ala Arg Gly Gly Leu Val Asp225                 230                 235                 240Glu Gln Ala Leu Ala Asp Ala Ile Glu Ser Gly His Ile Arg Gly Ala
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    275                 280                 285Glu Ala Gln Asp Arg Ala Gly Thr Asp Val Ala Asp Ser Val Leu Lys
290                 295                 300Ala Leu Ala Gly Glu Phe Val Ala Asp Ala Val Asn Val Ser Gly Gly305                 310                 315                 320Arg Val Gly Glu Glu Val Ala Val Trp Met Asp Leu Ala Arg Lys Leu
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        340                 345                 350Val Glu Ala Arg Gly Glu Leu Ser Ser Glu Gln Val Asp Ala Leu Gly
    355                     360             365Leu Ser Ala Val Arg Gly Leu Phe Ser Gly Ile Ile Glu Glu Ser Val
370                 375                 380Thr Phe Val Asn Ala Pro Arg Ile Ala Glu Glu Arg Gly Leu Asp Ile385                 390                 395                 400Ser Val Lys Thr Asn Ser Glu Ser Val Thr His Arg Ser Val Leu Gln
            405                 410                 415Val Lys Val Ile Thr Gly Ser Gly Ala Ser Ala Thr Val Val Gly Ala
        420                 425                 430Leu Thr Gly Leu Glu Arg Val Glu Lys Ile Thr Arg Ile Asn Gly Arg
    435                 440                 445Gly Leu Asp Leu Arg Ala Glu Gly Leu Asn Leu Phe Leu Gln Tyr Thr
450                 455                 460Asp Ala Pro Gly Ala Leu Gly Thr Val Gly Thr Lys Leu Gly Ala Ala465                 470                 475                 480Gly Ile Asn Ile Glu Ala Ala Ala Leu Thr Gln Ala Glu Lys Gly Asp
            485                 490                 495Gly Ala Val Leu Ile Leu Arg Val Glu Ser Ala Val Ser Glu Glu Leu
        500                 505                 510Glu Ala Glu Ile Asn Ala Glu Leu Gly Ala Thr Ser Phe Gln Val Asp
    515                 520                 525Leu Asp
530<210>13<211>1730<212>DNA<213>黄色短杆菌<220><221>CDS<222>(115)..(1704)<400>13gggagggttt agaatgtttc tagtcgcacg ccaaaacccg gcgtggacac gtctgcagcc 60gacgcggtcg tgcctgttgt aggcggacat tcctagtttt tccaggagta actt gtg   117
                                                        Val
                                                          1agc cag aat ggc cgt ccg gta gtc ctc atc gcc gat aag ctt gcg cag    165Ser Gln Asn Gly Arg Pro Val Val Leu Ile Ala Asp Lys Leu Ala Gln
          5                  10                  15tcc act gtt gac gcg ctt gga gat gca gta gaa gtc cgt tgg gtt gac    213Ser Thr Val Asp Ala Leu Gly Asp Ala Val Glu Val Arg Trp Val Asp
     20                  25                  30gga cct aac cgc cca gaa ctg ctt gat aca gtt aag gaa gcg gac gca    261Gly Pro Asn Arg Pro Glu Leu Leu Asp Thr Val Lys Glu Ala Asp Ala
 35                  40                  45ctg ctc gtg cgt tct gct acc act gtc gat gct gaa gtc atc gcc gct    309Leu Leu Val Arg Ser Ala Thr Thr Val Asp Ala Glu Val Ile Ala Ala50                  55                  60                  65gcc cct aac ttg aag atc gtc ggt cgt gcc ggc gtg ggc ttg gac aac    357Ala Pro Asn Leu Lys Ile Val Gly Arg Ala Gly Val Gly Leu Asp Asn
             70                  75                  80gtt gac atc cct gct gcc act gaa gct ggc gtc atg gtt gct aac gca    405Val Asp Ile Pro Ala Ala Thr Glu Ala Gly Val Met Val Ala Ash Ala
         85                  90                  95ccg acc tct aac att cac tct gct tgt gag cac gca att tct ttg ctg    453Pro Thr Ser Asn Ile His Ser Ala Cys Glu His Ala Ile Ser Leu Leu
    100                 105                 110ctg tct act gct cgc cag atc cct gct gct gat gcg acg ctg cgt gag    501Leu Ser Thr Ala Arg Gln Ile Pro Ala Ala Asp Ala Thr Leu Arg Glu
115                 120                 125ggc gag tgg aag cgg tct tct ttc aac ggt gtg gaa att ttc gga aaa    549Gly Glu Trp Lys Arg Ser Ser Phe Asn Gly Val Glu Ile Phe Gly Lys130                 135                 140                 145act gtc ggt atc gtc ggt ttt ggc cac att ggt cag ttg ttt gct cag    597Thr Val Gly Ile Val Gly Phe Gly His Ile Gly Gln Leu Phe Ala Gln
            150                 155                 160cgt ctt gct gcg ttt gag acc acc att gtt gct tac gat cct tac gct    645Arg Leu Ala Ala Phe Glu Thr Thr Ile Val Ala Tyr Asp Pro Tyr Ala
        165                 170                 175aac cct gct cgt gcg gct cag ctg aac gtt gag ttg gtt gag ttg gat    693Asn Pro Ala Arg Ala Ala Gln Leu Asn Val Glu Leu Val Glu Leu Asp
    180                 185                 190gag ctg atg agc cgt tct gac ttt gtc acc att cac ctt cct aag acc    741Glu Leu Met Ser Arg Ser Asp Phe Val Thr Ile His Leu Pro Lys Thr
195                 200                 205aag gaa act gct ggc atg ttt gat gcg cag ctc ctt gct aag tcc aag    789Lys Glu Thr Ala Gly Met Phe Asp Ala Gln Leu Leu Ala Lys Ser Lys210                 215                 220                 225aag ggc cag atc atc atc aac gct gct cgt ggt ggc ctt gtt gat gaa    837
                             30Lys Gly Gln Ile Ile Ile Asn Ala Ala Arg Gly Gly Leu Val Asp Glu
            230                 235                 240cag gct ttg gct gat gcg att gag tcc ggt cac att cgt ggc gct ggt    885Gln Ala Leu Ala Asp Ala Ile Glu Ser Gly His Ile Arg Gly Ala Gly
        245                 250                 255ttc gat gtg tac tcc acc gag cct tgc act gat tct cct ttg ttc aag    933Phe Asp Val Tyr Ser Thr Glu Pro Cys Thr Asp Ser Pro Leu Phe Lys
    260                 265                 270ttg cct cag gtt gtt gtg act cct cac ttg ggt gct tct act gaa gag    981Leu Pro Gln Val Val Val Thr Pro His Leu Gly Ala Ser Thr Glu Glu
275                 280                 285gct cag get cgt gcg ggt act gac gtt gct gat tct gtg ctc aag gcg    1029Ala Gln Asp Arg Ala Gly Thr Asp Val Ala Asp Ser Val Leu Lys Ala290                 295                 300                 305ctg gct ggc gag ttc gtg gcg gat gct gtg aac gtt tcc ggt ggt cgc    1077Leu Ala Gly Glu Phe Val Ala Asp Ala Val Asn Val Ser Gly Gly Arg
            310                 315                 320gtg ggc gaa aag gtt gct gtg tgg atg gat ctg gct cgc aag ctt ggt    1125Val Gly Glu Lys Val Ala Val Trp Met Asp Leu Ala Arg Lys Leu Gly
        325                 330                 335ctt ctt gct ggc aag ctt gtc gac gcc gcc cca gtc tcc att gag gtt    1173Leu Leu Ala Gly Lys Leu Val Asp Ala Ala Pro Val Ser Ile Glu Val
    340                 345                 350gag gct cga ggc gag ctt tct tcc gag cag gtc gat gca ctt ggt ttg    1221Glu Ala Arg Gly Glu Leu Ser Ser Glu Gln Val Asp Ala Leu Gly Leu
355                 360                 365tcc gct gtt cgt ggt ttg ttc tcc gga att atc gaa gag tcc gtt act    1269Ser Ala Val Arg Gly Leu Phe Ssr Gly Ile Ile Glu Glu Ser Val Thr370                 375                 380                 385ttc gtc aac gct cct cgc att gct gaa gag cgt ggc ctg gac atc tcc    1317Phe Val Ash Ala Pro Arg Ile Ala Glu Glu Arg Gly Leu Asp Ile Ser
            390                 395                 400gtg aag acc aac tct gag tct gtt act cac cgt tcc gtc ctg cag gtc    1365Val Lys Thr Asn Ser Glu Ser Val Thr His Arg Ser Val Leu Gln Val
        405                 410                 415aag gtc att act ggc agc ggc gcg agc gca act gtt gtt ggt gcc ctg    1413Lys Val Ile Thr Gly Ser Gly Ala Ser Ala Thr Val Val Gly Ala Leu
    420                 425                 430act ggt ctt gag cgc gtt gag aag atc acc cgc atc aat ggc cgt ggc    1461Thr Gly Leu Glu Arg Val Glu Lys Ile Thr Arg Ile Asn Gly Arg Gly
435                 440                 445ctg gat ctg cgc gca gag ggt ctg aac ctc ttc ctg cag tac act gac    1509Leu Asp Leu Arg Ala Glu Gly Leu Asn Leu Phe Leu Gln Tyr Thr Asp450                 455                 460                 465gct cct ggt gca ctg ggt acc gtt ggt acc aag ctg ggt gct gct ggc    1557Ala Pro Gly Ala Leu Gly Thr Val Gly Thr Lys Leu Gly Ala Ala Gly
            470                 475                 480atc aac atc gag gct gct gcg ttg act cag gct gag aag ggt gac ggc    1605Ile Asn Ile Glu Ala Ala Ala Leu Thr Gln Ala Glu Lys Gly Asp Gly
        485                 490                 495gct gtc ctg atc ctg cgt gtt gag tcc gct gtc tcc gaa gag ctg gaa    1653Ala Val Leu Ile Leu Arg Val Glu Ser Ala Val Ser Glu Glu Leu Glu
    500                 505                 510gct gaa atc aac gct gag ttg ggt gct act tcc ttc cag gtt gat ctt    1701Ala Glu Ile Asn Ala Glu Leu Gly Ala Thr Ser Phe Gln Val Asp Leu
515                 520                 525gac taattagaga tccattttct agaacc                                   1730Asp530<210>14<211>530<212>PRT<213>黄色短杆菌<400>14Val Ser Gln Asn Gly Arg Pro Val Val Leu Ile Ala Asp Lys Leu Ala1               5                  10                  15Gln Ser Thr Val Asp Ala Leu Gly Asp Ala Val Glu Val Arg Trp Val
         20                  25                  30Asp Gly Pro Asn Arg Pro Glu Leu Leu Asp Thr Val Lys Glu Ala Asp
     35                  40                  45Ala Leu Leu Val Arg Ser Ala Thr Thr Val Asp Ala Glu Val Ile Ala
 50                  55                  60Ala Ala Pro Asn Leu Lys Ile Val Gly Arg Ala Gly Val Gly Leu Asp65                  70                  75                  80Asn Val Asp Ile Pro Ala Ala Thr Glu Ala Gly Val Met Val Ala Asn
             85                  90                  95Ala Pro Thr Ser Asn Ile His Ser Ala Cys Glu His Ala Ile Ser Leu
        100                 105                 110Leu Leu Ser Thr Ala Arg Gln Ile Pro Ala Ala Asp Alu Thr Leu Arg
    115                 120                 125Glu Gly Glu Trp Lys Arg Ser Ser Phe Asn Gly Val Glu Ile Phe Gly
130                 135                 140Lys Thr Val Gly Ile Val Gly Phe Gly His Ile Gly Gln Leu Phe Ala145                 150                 155                 160Gln Arg Leu Ala Ala Phe Glu Thr Thr Ile Val Ala Tyr Asp Pro Tyr
            165                 170                 175Ala Asn Pro Ala Arg Ala Ala Gln Leu Asn Val Glu Leu Val Glu Leu
        180                 185                 190Asp Glu Leu Met Ser Arg Ser Asp Phe Val Thr Ile His Leu Pro Lys
    195                 200                 205Thr Lys Glu Thr Ala Gly Met Phe Asp Ala Gln Leu Leu Ala Lys Ser
210                 215                 220Lys Lys Gly Gln Ile Ile Ile Asn Ala Ala Arg Gly Gly Leu Val Asp225                 230                 235                 240Glu Gln Ala Leu Ala Asp Ala Ile Glu Ser Gly His Ile Arg Gly Ala
            245                 250                 255Gly Phe Asp Val Tyr Ser Thr Glu Pro Cys Thr Asp Ser Pro Leu Phe
        260                 265                 270Lys Leu Pro Gln Val Val Val Thr Pro His Leu Gly Ala Ser Thr Glu
    275                 280                 285Glu Ala Gln Asp Arg Ala Gly Thr Asp Val Ala Asp Ser Val Leu Lys
290                 295                 300Ala Leu Ala Gly Glu Phe Val Ala Asp Ala Val Asn Val Ser Gly Gly305                 310                 315                 320Arg Val Gly Glu Lys Val Ala Val Trp Met Asp Leu Ala Arg Lys Leu
            325                 330                 335Gly Leu Leu Ala Gly Lys Leu Val Asp Ala Ala Pro Val Ser Ile Glu
        340                 345                 350Val GLu Ala Arg Gly Glu Leu Ser Ser GLu Gln Val Asp Ala Leu Gly
    355                 360                 365Leu Ser Ala Val Arg Gly Leu Phe Ser Gly Ile Ile Glu Glu Ser Val
370                 375                 380Thr Phe Val Asn Ala Pro Arg Ile Ala Glu Glu Arg Gly Leu Asp Ile385                 390                 395                 400Ser Val Lys Thr Asn Ser Glu Ser Val Thr His Arg Ser Val Leu Gln
            405                 410                 415Val Lys Val Ile Thr Gly Ser Gly Ala Ser Ala Thr Val Val Gly Ala
        420                 425             430Leu Thr Gly Leu Glu Arg Val Glu Lys Ile Thr Arg Ile Asn Gly Arg
    435                 440                 445Gly Leu Asp Leu Arg Ala Glu Gly Leu Asn Leu Phe Leu Gln Tyr Thr
450                 455                 460Asp Ala Pro Gly Ala Leu Gly Thr Val Gly Thr Lys Leu Gly Ala Ala465                 470                 475                 480Gly Ile Asn Ile Glu Ala Ala Ala Leu Thr Gln Ala Glu Lys Gly Asp
            485                 490                 495Gly Ala Val Leu Ile Leu Arg Val Glu Ser Ala Val Ser Glu Glu Leu
        500                 505                 510Glu Ala Glu Ile Asn Ala Glu Leu Gly Ala Thr Ser Phe Gln Val Asp
    515                 520                 525Leu Asp
530<210>15<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物<400>15ggcaagacag aacaggacaa tca<210>16<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物<400>16agcttttgcc acggtgtacc tcg<210>17<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物<400>17ccacattttt gccctcaacg gtt<210>18<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物<400>18cggttagaaa cgctcttgga acc

Claims (7)

1．具有L-丝氨酸生产力的棒杆菌，其中磷酸丝氨酸磷酸酶和磷酸丝氨酸转氨酶中至少一种的活性被增强。
2．权利要求1所要求的棒杆菌，其中所述细菌的磷酸丝氨酸磷酸酶和磷酸丝氨酸转氨酶的活性均被增强。
3．权利要求1所要求的棒杆菌，其中所述细菌由于缺乏L-丝氨酸分解活性而具有L-丝氨酸生产力。
4．权利要求1或3所要求的棒杆菌，其中所述细菌由于其具有对L-丝氨酸类似物的抗性而具有L-丝氨酸生产力。
5．权利要求1所要求的棒杆菌，其中经过在其细胞中增加所述棒杆菌的编码磷酸丝氨酸磷酸酶的基因或编码磷酸丝氨酸转氨酶的基因的拷贝数而增强磷酸丝氨酸磷酸酶和磷酸丝氨酸转氨酶的活性。
6．权利要求1至5中任意一项所要求的棒杆菌，其中所述细菌导入了编码其中L-丝氨酸反馈抑制被脱敏的D3-磷酸甘油酸脱氢酶的基因。
7．生产L-丝氨酸的方法，包括在培养基中培养上述权利要求1至6中任意一项所要求的棒杆菌从而使L-丝氨酸在此培养基中积累以及从该培养基中收集L-丝氨酸的步骤。
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