CN1110560C

CN1110560C - 发酵生产l－氨基酸的方法

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Publication number: CN1110560C
Application number: CN97122854A
Authority: CN
Inventors: 菊池庆实; 中西一夫; 児岛宏之
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1996-10-15
Filing date: 1997-10-15
Publication date: 2003-06-04
Anticipated expiration: 2017-10-15
Also published as: KR100430168B1; BR9705038A; HU9701652D0; KR19980032831A; CN1182133A; MY138770A; EP0837134A3; PL322611A1; CZ327297A3; CA2214498A1; JP4088982B2; AU725935B2; ZA979229B; CA2214498C; EP0837134A2; HUP9701652A3; PL192391B1; US5932453A; HUP9701652A2; RU2204604C2

Abstract

提供一种高效发酵生产L-氨基酸的方法。一种来自埃希氏菌属细菌的编码天冬氨酸激酶III的DNA，该DNA有能够消除L-氨酸反馈抑制的突变，将该DNA导入埃希氏菌属细胞中形成转化菌株，并在适宜的培养基中培养。培养基中一种L-氨基酸的产生并积累，以及从培养基中收集L-氨基酸。

Description

发酵生产L-氨基酸的方法

对本发明的详细描述

发明所属技术领域

本发明是有关微生物工业的发明。更确切地说，本发明涉及通过发酵生产L-氨基酸的方法，以及在该方法中所使用的一种DNA及微生物体。

现有技术：

当通过发酵生产L-赖氨酸时，已经从自然界及合成菌株中分离出了一些用来提高产量的菌株。已知大量产赖氨酸的合成突变体，其中大部分为具氨乙基半胱氨酸(AEC)抗性且属于短杆菌属，棒状杆菌属，芽孢杆菌属或埃希氏杆菌属的菌株。而且，也使用了由重组DNA得到的转化子(如美国专利No.4,278,765)。这样，许多用来提高氨基酸产量的技术已被公开。

例如，在日本公开文本(Kokai)No.18,596/1981，美国公开文本No.4,346,170及应用微生物和生物技术15，227(1982)两期刊中公开了一种涉及埃希氏菌属的方法，该方法通过增加二羟二吡啶二羧酸合成酶(下文有时简称为“DDPS”的作用来生产L-赖氨酸。

这种酶(DDPS)能够催化天冬氨酸半醛和丙酮酸脱水缩合形成二羟二吡啶二羧酸。这一反应是生物合成天冬氨酸类的氨基酸反应中进入L-赖氨酸生物合成系统中的起始反应。已知在埃希氏菌属的细菌中进行L-赖氨酸生物合成时，该酶和天冬氨酸激酶共同起着重要的调节位点的作用。

DDPS由E.coli中 dapA因编码。 dapA已被克隆，碱基序列已被确定[Richaud，F.等人，细菌学杂志，297(1986)]

同时，天冬氨酸激酶(下文有时简称“AK”)催化天冬氨酸转化为β-磷酸天冬氨酸，且在天冬氨酸类氨基酸的生物合成系统中是一个重要的调节酶。E.coli的AK有三种类型(AKI，AKII，AKIII)，其中两种分别是与高丝氨酸脱水酶(以下有时简称“HD”)构成的结合酶。其中一种结合酶为AKI-HDI，由thrA基因编码；另一种是AKII-HDII，由 metLM基因编码。AKI被苏氨酸所抑制且被苏氨酸和异亮氨酸协同抑制，AKII被甲硫氨酸所抑制。

同时，AKIII是一种具有单一功能的酶，它是由 LysC基因编码产生的。已知L-赖氨酶对它有抑制和反馈抑制作用。这三种酶在细胞中的活性比约为：AKI∶AKII∶AKIII≈5∶1∶4。

E.coli的 Lyc基因已被克隆，且碱基序例已被确定出来[Cassan，M，Parsof，C.，Cohen，G.N.，和Patte，J.C.，生物化学杂志 261 1052(1986)]。

国际专利号为WO 95/16042的公开文本公开了一种生产L-赖氨酸的方法，该方法是使E.coli含有发生突变的dapA和Lysc基因，这种突变能够消除赖氨酸的反馈抑制效应。

用发酵法生产L-苏氨酸时，所用的微生物是从自然界分离出来的菌株或其突变株。已知大量的生产L-苏氨酸的合成突变体，其中大部分对α-氨基-β-羟基咸酸具有抗性，属于埃希氏菌属，沙雷氏菌属，短杆菌属或棒状杆菌属。在日本公开文本(Kokai)Nos.131,397/1980,31,691/1984及15,696/1981及日本专利公告(No.501,682/1991)中描述了一种涉及埃希氏菌属的生产L-苏氨酸的方法，该方法用含有苏氨酸启动子的重组质粒转化埃希氏菌属的菌株生产L-苏氨酸。

而且，国际专利号为WO94/11517的专利公开了一种用含有LYsC基因的E.coli来生产L-苏氨酸的方法，该突变能消除赖氨酸的反馈抑制。

本发明所要解决的问题：

本发明的目的是要从那些将L-赖氨酸反馈抑制作用消除得较好的埃希氏菌属中获得AKIII，并提供一种比现有技术更好的发酵生产L-氨基酸的方法。解决存在问题的方法：

发明人经过努力研究分析了上述问题，并最终成功地从那些将L-赖氨酸反馈抑制作用消除得较好的埃希氏菌属中获得了编码AKII的DNA。在本发明中，将这种从埃希氏菌属中获得的编码AKIII的DNA在本发明中有时称为突变 LysC基因或突变AKIII基因。

从那些将L-赖氨酸反馈抑制作用消除得较好的E.coli中获得的编码DDPS的DNA在本发明中有时被叫做突变 dapA基因或突变DDPS基因。

发明人进一步获得了细胞中含有突变 lysC基因的埃希氏菌属的细菌，并且发现L-赖氨酸和L-苏氨酸能够在培养基中大量产生并积累。

这样，本发明涉及编码埃希氏菌属细菌的天冬氨酸激酶的DNA特征是该编码区的突变能够消除赖氨酸对天冬氨酸激酶III的反馈抑制作用，所述突变为：

天冬氨酸基酶III的318位甲硫氨酸残基被另一氨基酸残基取代且323位甘氨酸残基被另一氨基酸残基所取代的突变，

第325位亮氨酸残基被另一氨基酸残基所取代且347位缬氨酸残基被另一氨基酸残基所取代的突变，

323位甘氨酸残基被另一氨基酸残基所取代且347位缬氨酸残基被另一氨基酸残基所取代的突变，

325位亮氨酸残基被另一氨基酸残基所取代且345位丝氨酸残基被另一氨基酸残基所取代的突变，

323位甘氨酸残基被另一氨基酸残基所取代和358位丝氨酸残基被另一氨基酸残基所取代的突变，

344位苏氨酸被另一氨基酸残基所取代的突变，

250位谷氨酸残基被另一氨基酸残基所取代的突变，

346位谷氨酸残基和374位亮氨酸残基被其它氨基酸残基所取代的突变，

250位谷氨酸残基和364位苏氨酸残基被其它氨基酸残基所取代的突变，

202位天冬氨酸残基和321位丝氨酸残基被其它氨基酸残基所取代的突变，

283位精氨酸残基，333位丙氨酸残基，338位丝氨酸残基，346位谷氨酸残基及414位天冬氨酸残基被其它氨基酸残基所取代的突变，或者是

318位甲硫氨酸残基，321位丝氨酸残基，328位缬氨酸残基，349位缬氨酸残基及405位谷氨酸残基被其它氨基酸残基所取代的突变。

本发明涉及编码埃希氏菌属细菌的天冬氨酸激酶的DNA，特征是该编码区突变能够消除赖氨酸对天冬氨酸激酶的反馈抑制作用，所述突变为如下突变时效果更好：

天冬氨酸激酶III的318位甲硫氨酸残基被异亮氨酸残基取代且323位甘氨酸残基被天冬氨酸残基取代，

325位亮氨酸残基被苯丙氨酸残基取代且347位缬氨酸残基被甲硫氨酸残基取代，

323位甘氨酸残基被天冬氨酸残基取代且347位缬氨酸残基被甲硫氨酸残基取代，

325位亮氨酸残基被苯氨酸残基取代且345位丝氨酸残基被亮氨酸残基取代，

323位甘氨酸残基被天冬氨酸残基取代且358位丝氨酸残基被亮氨酸残基取代，

344位苏氨酸残基被甲硫氨酸残基取代，

250位谷氨酸残基被赖氨酸残基取代，

346位谷氨酸残基被赖氨酸残基取代且374位亮氨酸残基被苯丙氨酸残基取代，250位谷氨酸残基被赖氨酸残基取代且364位苏氨酸残基被甲硫氨酸残基所取代，

202位天冬氨酸残基被甘氨酸残基取代且321位丝氨酸被脯氨酸残基所取代，283位精氨酸残基被丝氨酸残基所取代，333位丙氨酸残基被苏氨酸残基取代，338位丝氨酸残基被苏氨酸残基取代，346位谷氨酸残基被天冬氨酸残基取代且414位精氨酸残基被丝氨酸残基取代，或者

318位甲硫氨酸残基被赖氨酸残基取代，321位丝氨酸残基被脯氨酸残基取代，328位缬氨酸残基被苯丙氨酸残基取代，349位缬氨酸被甘氨酸残残取代且405位谷氨酸残基被缬氨酸残基取代。

本发明涉及上述重组DNA，该重组DNA通过将权利要求1所述的DNA联接到埃希氏菌属中细菌细胞内具有自我复制能力的载体DNA上获得，也可以是含有这种载体DNA的埃希氏菌属的微生物中。

本发明涉及一种生产L-氨基酸的方法，包括在发酵培养基中培养上述具有产生L-氨基酸能力的微生物，在培养基中生产、积累一种L-氨基酸以及从培养基中收集L-氨基酸。

在本说明书，编码DDPS或AKIII的DNA或含有这一区段及启动子的DNA有时被称为“DDPS基因”或“AKIII基因”。而且，被消除了反馈抑制作用的突变酶有时被简单地称作“一种突变酶”，而且编码这一功能或含有相同功能区段及启动子的DNA被叫做“一个突变基因”。进一步说，“消除L-赖氨酸的反馈抑制”应理解为大部分清除，并且并不需要完全消除。

以下是对本发明的详细描述。

<1>本发中编码突变天冬氨酸激酶(AKIII)的DNA

本发明中编码突变天冬氨酸激酶(AKIII)的DNA是编码野生型AKIII的DNA发生突变，该突变使L-赖氨酸对AKIII的反馈抑制被消除。本发明提到了由埃希氏菌属的细菌中获得的AKIII，特别提到由E.coli中获得AKIII。消除L-赖氨酸对AKIII的反馈抑制的突变氨基酸序列范围是如序列表中1号序列所示的AKIII序列，从AKIII的N-末端开起算起。

(a)天冬氨酸激酶的突变位点是318位的甲硫氨酸残基被另一个氨基酸残基所取代，最好是异亮氨酸残基而且323位甘氨酸残基被另一氨基酸残基取代，最好是天冬氨酸残基，

(b)突变是325位的亮氨酸残基被另一氨基酸残基取代，最好是苯丙氨酸残基，而且347位缬氨酸残基被另一氨基酸残基取代，最好是甲硫氨酸残基，

(c)突变是323位甘氨酸残基被另一氨基酸残基取代，最好是天冬氨酸残基，而且347位缬氨酸残基被另一氨基酸残基取代，最好是甲硫氨酸残基，

(d)突变是325位亮氨酸残基被另一氨基酸残基取代，最好是苯丙氨酸残基，而且345位丝氨酸残基被另一氨基酸残基取代，最好是亮氨酸残基，

(e)突变是323位甘氨酸残基被另一氨基酸残基取代，最好是天冬氨酸残基，并且358位丝氨酸残基被另一氨基酸残基取代，最好是亮氨酸残基，

(f)突变是344位苏氨酸残基被另一氨基酸残基取代，最好是甲硫氨酸残基，

(g)突变是250位谷氨酸残基被另一氨基酸残基取代，最好是赖氨酸残基，

(h)突变是346位谷氨酸残基被另一氨基酸残基取代，最好是赖氨酸残基，并且374位亮氨酸残基被另一氨基酸残基取代，最好是苯丙氨酸残基，

(i)突变是250位谷氨酸残基被另一氨基酸残基取代，最好是赖氨酸残基，并且364位苏氨酸残基被另一氨基酸残基取代，最好用甲硫氨酸残基，

(j)突变是202位天冬氨酸残基被另一氨基酸残基取代，最好是甘氨酸残基，并且321位丝氨酸残基被另一氨基酸残基所取代，最好用脯氨酸残基，

(k)突变是283位的精氨酸残基被另一氨基酸残基取代，最好是丝氨酸残基，333位丙氨酸残基被另一氨基酸残基取代，最好是苏氨酸残基，338位丝氨酸残基被另一氨基酸残基取代，最好是苏氨酸残基，346位谷氨酸残基被另一氨基酸残基取代，最好用天冬氨酸残基，并且414位天冬氨酸残基被另一氨基酸残基取代，最好用丝氨酸残基，或者

(l)突变是318位苏氨酸残基被另一氨基酸残基取代，最好用赖氨酸残基，321位丝氨酸残基被另一氨基酸残基取代，最好用脯氨酸，328位缬氨酸残基被另一氨基酸残基取代，最好用苯丙氨酸，349位缬氨酸残基被另一氨基酸残基取代，最好用甘氨酸残基，405位谷氨酸残基被另一氨基酸残基取代，最好用缬氨酸残基。

编码野生型AKIII的DNA并非十分有限。已经提到过从埃希氏菌属一例如大肠杆菌(E.coli)中得到了编码AKIII的DNA。特别提到的是，由编码如序列No.1所示的氨基酸序列的DNA，进一步说即在序列No.1中所学的碱基序列的碱基Nos.584到1930。E.coli的AKIII由 lysC基因编码。

上边提到的序列中，含有引起氨基酸残基被取代的突变碱基序列的就是编码本发明的突变AKIII的序列。一种编码相应氨基酸残基的密码子并不仅限于编码那一种氨基酸残基。野生型AKIII的氨基酸序列随细菌或菌株的差异而略有不同。即使序列中不影响酶活性的氨基酸残基位点发生了取代，失活、插入等变化，也应视为属于本发明的突变AKIII基因中。

例如，在例1中得到的野生型 lysC基因的碱基序列(序列No.1)与公知的E.coli K-12JC411菌株的序列(Cassan，M.，Parsot.C.，Cohen.G、N.，和Patte，J、C.，生物化学杂志、 261，1052(1986)]相比较，有6个位点不相同。编码的氨基酸残基在6位点中有两个位点是不同的(在JC411菌株的LysC中，由序列No.1表示的lysC氨基的序列从N-末端开始的第58个甘氨酸残基由半胱氨酸残基取代且401个甘氨酸残基由一丙氨酸残基所取代。如果将上述(a)到(l)的突变引入E.coli K-12 JC411菌株的相同lysC序列中，可预期得到消除L-氨酸反馈抑制的突变lysC。

编码消除赖氨酸反馈抑制的突变AKIII的DNA是通过如下方法获得的。首先，在体外对含有野生型AKIII因或有其它突变的AKIII基因进行诱变处理，将被诱变的基因连接到适于某种宿主的载体DNA上从而形成重组DNA。将重组DNA导入一种微生物宿主中从而得到转化子。当选择出表达突变AKIII的转化子时，表明该转化子含有该突变基因。然后，将含有野生型AKIII基因或有其他位点突变的AKIII基因的DNA连接到适于某种宿主细胞的载体DNA上，从而形成重组DNA。在体外诱变该重组DNA，把诱变后的DNA导入宿主微生物中从而得到转化子。当选择出表达突变AKIII的转化子时，意味着该转化也含有这一突变基因。另外一种可能是将一种产野生型酶的微生物诱变后形成生产突变酶的菌株，这样从突变株中可得到突变基因。

提到过羟胺及类似物可用作直接诱变DNA的试剂。羟胺是一种化学诱变剂，它通过使胞嘧啶变为N⁴-羟基胞嘧啶而引起胞嘧啶转化为胸腺嘧啶。而且，紫外光辐射或人工诱变时经常使用的诱变剂-如N-甲基-N硝基-N-亚硝基胍(NTG)就用来诱变微生物。

由于供体菌DNA含有野生型AKIII基因或有其它突变的基因，可以使用埃希氏菌属的任何微生物。特别是一些在F、C、Neidhardt等人的文章中描述过的(参见Neidhardt，F、C、等人所著大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌，美国微生物学会，华盛顿特区，1208页，表I)那些菌均可使用。例如E.coli JM109菌株及E.coli MC1061菌株。

(1)野生型AKIII基因的获取：

下表介绍得到含有AKIII基因的DNA的实施例。例如，首先培养含有lysC基因的E.coli MC1061菌株从而获得培养物。上述微生物可用通常的固体培养基进行培养。考虑到细胞收集的效果，最好使用液体培养基。在这种情况下，培养基中可加入一种或几种无机盐；例如：在单碳或多碳源培养基中加入磷酸一氢钾，磷酸二氢钾，硫化镁，氯化钠，氯化镁，氯化铁，硫化铁及硫化锰等无机盐，该一碳多碳培养是酵母提取物，蛋白胨，肉汁提取物，玉米浆和黄豆浆或小麦汁，再根据需要加入适量的促进发酵的糖类物质及维生素等。培养基的起始pH值最好调到6～8。温度温度应在30～42℃间，最好在37℃下深层通气搅拌培养、摇床培养或静培养4到24小时。

例如，可在3000转/分转速下用5分钟时间从培养物中分离得到E.coliMC1061菌株。可用Saito和Miura法[生物化学、生物物理学报、 72，619，(1963)]或K.S.Kirby法[生物化学杂志、 64 405(1956)]来得到该菌株的染色体DNA。

为了从得到的染色体DNA中分离AKIII基因，需要制备染色体DNA文库。首先，用合适限制性内切酶将染色体DNA部分切割得到不同大小片段混合物。如果通过控制切割时间等因素来控制切割程度，可以得到不同的片段混合物。例如，在大于30℃时，最好在37℃，用内切酶浓度为1～10单位/毫升使染色体DNA同Sau 3Al分别在1分钟至2小时的范围内进行反应。

这样，染色体DNA片段就同埃希氏菌属的细菌细胞内有自我复制能力的载体DNA连接形成重组DNA。具体来讲，用某种限制性内切酶与载体DNA进行反应，得到的切割后的末端碱基序列应与限制性内切酶 Sau 3Al切割染色体DNA所得的末端碱基序列一致，例如，在30℃或大于30℃时用浓度为1～100单位/毫升的Bam HI切割1小时以上的时间，最好是1到3小时，对染色体DNA进行完全消化，则染色体DNA裂解。然后，把上述得到的染色体DNA片段混合物同裂解的载体DNA混和。混合物中加入DNA连接酶，最好用浓度为1～100单位/毫升的T4 DNA连接酶在4到116℃条件下反应1小时以上，最好6～24小时，从而形成重组DNA。

可转化埃希氏菌属的微生物，例如E.coli K-12菌株，最好是转化完全缺失AKI，AKII，AKIII的菌株，例如，E.coli GT3菌株(可从美国田纳西州的大肠杆菌遗传保藏中心获得该菌株)从而制备染色体DNA文库。可用D、M、Morrison的方法进行转化[见酶学方法 68，326，(1979)]或用氯化钙处理受体菌细胞从而提高其对DNA通透性的方法进行转化[见Mandel，Mand Higa，A.，分子生物学杂志 53，159(1970)]

从提高了AKIII活性的菌株或是从由染色体DNA文库补偿了AKIII基因缺失导致的营养缺陷型菌株中得到含有AKIII基因的重组DNA菌株。例如，当用一个完全缺失AK基因的突变体作宿主时，从在不含有L-赖氨酸，L-苏氨酸，L-甲硫氨酸及二氨基庚二酸或不含有高丝氨酸和二氨基庚二酸的培养基上能够生长的重组体菌株中可找到重组DNA，这就使获得含有AKIII基因的DNA片段成为可能。从被选菌株中制备细胞提取物，再由此提取物中形成粗酶提取液。然后，可确定AKIII的污性。测定AKIII酶活的方法可使用E.R.Stadman法(Statman，E.R.，Cohen，G、N.，LeBras，G.，和Robichon-Szulmajster，H.，生物化学杂志， 236，2033(1961)]。

将含有AKIII基因的DNA片段插入截体DNA所得到的重组DNA可通过，P.Guerry等人所提出的方法来分离(细菌学杂志 116，1064，(1973)]或用D、B、Clewell方法来分离(细菌学杂志110，667，(1972)]。

野生型AKIII基因可用Saito及Miura方法获得，即通过制备某种染色体DNA获得，该染色体DNA是得自于有AKIII基因的菌株，该基因在菌株的染色体上，而且AKIII基因的扩增是通过聚合酶链式反应法获得的[PCR，White，T.J.et al，遗传学动态 5185(1989)]。在扩增反应中使用的DNA引物是同含有全部或部分AKIII基因区的DNA双链3’-末端互补的。当只有部分AKIII基因区被扩增时，需要从用含有AKIII基因区作为引物的染色体DNA文库中筛选出含有全部区域的DNA片段。当全部AKIII基因被扩增时，把含有DNA片段的PCR溶液-(该DNA片段上有扩增的AKIII基因)进行凝脉电泳，从而可提取出所需DNA片段，即又重新获得了含有AKIII基因的DNA片段。

例如，根据已知的E.coli序列[参见Cassan，M.，Parsot，C.，Cohen，G.N.和Patte，J.C.生物化学杂志 261，1052(1986)]可以获得合适的DNA引物。一种能够扩增含有1347个碱基的编码lysC基因的区域的引物是合适的。例如，序例Nos.2和3中所示的引物DNA是合适的。可使用常规方法来合成引物DNA，例如Phosphoamidide法[Tetrahedron Letters.1895(1981)]用市场上销售的DNA合成仪(例如，由Applied Biosystems公司生产的380B型号合成仪)。然后，由供应商用市售的PCR仪(即Takaro Shuzo有限公司生产的型号为PJ2000的DNA热循环仪)及Tag DNA聚合酶来实现PCR反应。

把通过PCR扩增的AKIII基因连接到属于埃希氏菌属的细菌细胞中具有自我复制能力的载体DNA上，如此可容易地将突变引入AKIII基因。载体DNA，及对AKIII基因的检出方法同上文描述的相同。

(2)将突变引入AKIII基因

上述AKIII基因需要用重组PCR方法[Higuchi，R.61，在《PCR技术》一书中(Erlich，H.A.Eds.，Stockton出版社出版)]，一个位点特殊突变法[Kramer，W.和Frits，H.J.，酶学方法 154，350(1987)；Kunkel，T.A.等，酶学方法154，367(1987)]，或类似方法来进行氨基酸残基的取代，插入或消除方法来引发突变的产生。这些方法能在目的位点引起所需突变。

在所需位点可通过化学合成基因引入突变或随机突变。

而且，有一种方法是直接用羟胺处理染色体或质粒上的AKIII基因[Hashimoto，T.和Sekiguchi，M，细菌学杂志。 159，1039(1984)]。还有，可用紫外线辐射或化学试剂一如N-甲基-N’-亚硝基胍或亚硝酸对含有AKIII基因的埃希氏菌属的细菌进行处理的方法。通过这些方法可随机引发突变。

下面描述筛选突变AKIII基因的方法。首先，将诱变处理的含有AKIII基因的重组DNA引入AK完全缺失的菌株，例如E.coli GT3菌株中。然后在基本培养基(如M9培养基)中培养转化株，该培养基中含大量L-赖氨酸。由于在含有野生型AKIII基因的重组DNA菌株的单独AK受L-赖氨酸抑制，无法合成L-苏氨酸，L-异亮氨酸，L-甲硫氨酸及二氨基庚二酸(DAP)，这样控制了菌株的生长。同时，由于含有突变AKIII基因的重组菌株的L-赖氨酸抑制被消除，所以该菌株应能够在含有大量L-赖氨酸的基本培养基上生长。利用这种现象，可以筛选出对L-赖氨酸或S-2-氨基半胱氨酸(AEC)具有抗性的菌株细菌生长中，AE(起L-赖氨酸类似物的作用)，即选择出了消除了反馈抑制的含有突变AKIII基因的菌株。

如此获得的重组DNA基因即重组DNA被引入合适的微生物(即宿主)中，通过反馈抑制被消除的现象来获得含有AKIII的微生物。

应优选属于埃希氏菌属的微生物作为宿主。例如，提到的大肠杆菌(E.coli)。

而且，可用把从重组DNA上得到的突变型AKIII基因插入其它载体DNA上获得一种物质的方法。在本发明使用的载体DNA中，建议最好使用质粒载体DNA。举例说包括pUC19，pUC18，pUC322，pHSG299，pHSG298，pHSG399，pHSG398，RSF1010，pMW119，pMW118，pMW219及pMW218。可供使用的还有噬菌体DNA载体和转座子载体。

为了高效表达突变型AKIII基因，可在编码突变型AKIII DNA的上游区段连接上可在宿主中起作用的启动子，如 lac， trp及PL。或者，使用扩增的AKIII基因中的启动子。

如上所述，通过将突变基因插入具有自我复制能力的载体DNA，并导入某一宿主中，这样在宿主中得到了类似质粒的外源染色体DNA。或者，用转座子通过转导的方法将突变型基因插入微生物宿主的染色体中(Berg，D.E.和Berg.C.M，生物/技术。 1,417(1983)]，或用Mu噬菌体[日本公开文本(Kokai)No.109，985/1990)]或通过互补重组[分子遗传学实验，冷泉港实验室(1972)]的方法。

<3>按照本发明生产L-氨基酸

将上述突变型AKIII基因通过转化导入埃希氏菌属的细菌中，并在适宜的培养基中培养该菌，就能够产生L-氨基酸，在培养物中产生并积累L-氨基酸，从培养物中收集L-氨基酸。

埃希氏菌属中含有AK从而消除了L-赖氨酸反馈抑制的细菌包括通过将突变的编码AKIII基因插入染色体DNA中从而消除L-赖氨酸反馈抑制的转化细菌，以及将上述DNA连到具有自我复制能力的载体DNA后形成的重组DNA导入埃希氏菌属中的细菌中形成的转化细菌。而且，还有通过诱变埃希氏菌属细菌细胞而导致允许突变AKIII产生的突变型埃希氏菌属细菌。

涉及到埃希氏菌属的细菌在转化中用作宿主的问题，任何细胞中有突变型AKIII基因启动子或在该细胞中能够用来表达AKIII基因的启动子的细菌均可使用。或者是，当把突变型AKIII基因作为外源染色体引入质粒后，如果用作介导的载体DNA的复制区能够在细胞内起作用并能复制的活，那么该细菌就可以选用。

本发明中用于培养含有突变基因的微生物的培养基是一种普通培养基，含有所需碳源、氮源、无机盐及其它有机物质。

碳源的例子包括葡萄糖，乳糖，半乳糖，果糖及淀粉水解物糖类；甘油及山梨醇的醇，及有机酸中的延胡索酸，柠檬酸及琥珀酸。

氮源的例子包括无机胺盐硫化氨，氯化氨及磷酸氨；黄豆水解物；氨气及液氨。

至于无机微量营养元素，建议加入适量所需的物质，例如维生素B1或L-异亮氨酸，或酵母提取物。而且，磷酸钾，硫化镁，铁离子及锰离子也可根据需要少量加入。

培养是在有氧状况下进行16至72小时。培养温度在25℃到45℃之间。在培养过程中pH值要调到5到8之间。可以用无机或有机，酸性或碱性物质甚至用氨气调节pH值。

可用离子交换树脂法，沉淀法及其它已知方法来从发酵液中提取L-氨基酸。

实施例

下面通过实施例进一步详细阐述本发明。

实施例1

突变型AKIII基因的获取(1)

<1>野生型AKIII基因的克隆

E.coli的AKIII基因的碱基序列已经有报导[Cassan，M.，Parsot，C.，Cohen，G.N.，和Patte，J.C.，生物化学杂志， 261，1052(1986)]。已知开放阅读框架(ORF)含有1347个碱基对，编码449个氨基酸残基。该基因含有操纵子，受L-赖氨酸的抑制。因此，为了去掉其操纵区，需通过PCR方法扩增SD序例及仅含有ORF的区域并克隆。

E.coli K12 MC1061菌株的全部染色体组DNA已用Saito和Miura的方法制得[生物化学、生物物理、Acta. 72，619(1963)]，并且制成了含有如Nos.2和3所示的序例的引物。使用H.A.Erlich等人的方法进行PCR反应。(PCR技术，Stocklon出版社(1989)]，用相同的方法扩增基因。将所得的DNA用 BamHI和 AseI消化，然后，得到平末端，插入低挎备载体pMW119的SMaI位点中，从而构建pMLYSC2。SMaI位于载体DNA的 lacZ启动子的下游。当把由DNA片段插入 pMW119的SmaI位点而获得的重组DNA导入E.coli时，可重过控制lacZ启动子而使插入的DNA片段转录(如图1)。

<2>突变AKIII基因的克隆

用EcoRI和HindIII来切割如国际公开WO94/11517和WO95/16042中所描述的突变型AKIII基因，即pLYSC*180，pLYSC1*117和pLYSC1*126，将含有突变型AKIII基因的DNA片段切掉。所得到的片段插入pMW119的 EcoRI- HindIII切割位点中从而得到构建质粒，分别为pMLYSC 2*80，pMLYSC2*117和pMLYSC2*126。

根据国际公开文本WO94/11517所描述的方法，可由pLLC*8制备质粒pLYSC*80。把pLLC*80导入E.coli HB101后所得的菌株记做AJ12750。该菌株保藏在工业科学部国家生物和人类技术研究所(No.1～3，Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaragiken，305)保藏号为No.FERM P13136，保藏时间为1992年9月1日。按照布达佩斯条约的要求，该菌株于1993年11月4日提交国际保藏单位，在那里得到新的保藏号为BP-4462。pLYSC2*117和pLYSC2*126还未提交保藏。但是，由于在国际公开文本WO94/11517中公开了该菌株的突变特征，所以可容易地由pLYS1*80制得。

<3>对选择新的突变AKIII基因条件的研究

将pMLYSC1导入AK完全缺失的菌株，获得的转化菌株E.coliGT3(thrA1016b，metLM 1005，lysC1004)被标作GT3/pMLYSC2。类似的，可得到GT3/pMLYSCZ*80，GT3/pMLYSC2*117和GT3/pMLYSC2*126。GT3/pMLYSC2菌株的质粒上有野生型 lysC，该质粒的 lysC编码的AKIII仅有AK。由于仅含有AK的野生型AKIII菌株在含有大量L-赖氨酸菌株的基本培养基中被L-赖氨酸所抑制，不能合成L-苏氨酸，L-异亮氨酸，L-甲硫氨酸及二氨基丁二酸(DAP)，从而使生长受到抑制。希望获得一种含有突变型 lgsC基因的质质的菌株，该突变能消除L-赖氨酸抑制，从而能使菌株在含有大量L-赖氨酸的基本培养基上发生，从而需要选择出具有L-赖氨酸抗性的菌株，这样，选择出含有一种质粒的菌株，该质粒上含有突变型 lysC能够消除L-赖氨酸抑制。

在含不同浓度的L-赖氨酸的基本琼脂培养基上培养GT3/pMLYSC2，GT3/pMLYSC*80，GT3/pMLYSC2*117菌株，从而研究生长抑制浓度和含有质粒的菌株的筛选条件。在含有不同浓度的L-赖氨酸的基本琼脂培养基中转化菌株的生长情况如表1所示。在表1中，十代表有转化菌株生长，土表示转化菌株微弱生长，一表示没有转化菌株生长。

表1

L-赖氨酸的浓度及菌株生长情况

	0 0.2 0.4 0.6 0.8 (M)
	0 0.2 0.4 0.6 0.8 (M)	GT3/pMLYSC2GT3/pMLYSC280GTD/pMLYSC2117GT3/pMLYSC2*126	± - - - -+ + ± - -+ ± - - -+ ± - - -

在赖氨酸浓度达到0.2M后，含有野生型lysC的GT3/pMLYSCZ菌株的生长被完全抑制。而且，在L-赖氨酸的浓度达到0.4M后，含有突变LysC的公知的GT3/pMLYSC2*80菌株，GT3/pMLYSCZ*117菌株及GT3/pMLYSC2*126菌株的生长也几乎被完全抑制。结果表明，能够比目前为止知道的突变型lysC基因产生更好的消除抑制效果的突变株看起来应在L-赖氨酸浓度达0.4M以上的培养条件中选出。也证明即使同时加入高丝氨酸和二氨基庚二酸，这种生长抑制也能被消除。

在检测引入的突变时，用含有浓度为0.4-ML-赖氨酸的基本琼脂培养基M9来筛选含有带 LysC突变质粒的菌株。在实施例1中，这种培养基被称作选择性培养基。

<4>AKIII基因的诱变及突变型AKIII基因的获得

将突变引入pMLYSC1质粒中使用了两种方法，一种是用羟胺直接处理质粒的体内诱变法，另一种是PCR诱变法，该方法能根据希望产生各种突变而仅仅导致由胞嘧啶到胸腺嘧啶的突变。

用0.4M的羟胺[溶液中含有由0.1M KH₂PO₄，1-mMEDTA(pH值为6.0)的混合物100μl及1-M羟胺和1-mM EPTA(pH值为6.0)和2-Mg DNA的混合物，加水调至总体积为200μl]在75℃下反应1到4小时。这样处理后得到的DNA用玻璃粉纯化，然后引入AK完全缺失的E.coli GT3菌株中。所得到的转化菌株在完全培养基(含有1％L-肉汤，0.5％酵母提取物，0.5％氯化钠50mg/l的氨苄西林及1.5％的琼脂糖)中涂布培养形成菌落。将菌落影印到选择培养基上，筛选出在选择培养基上能生长的菌落作为候选菌株。

通过PCR进行随机诱变处理是用C.Cadwell等人的方法实施的。(Cadwell，C.和G、F、Joyce，PCR方法应用 2，28，(1982)]。即按上述方法用pMLYSC2和M13通用引物对 lysC片段进行扩增。用 EcoRI和 HindIII对该片段进行消化，然后插入pMW119的 EcoRI- HindIII切割位点之间，并将重组DNA引入完全缺失AK的E.coli GT3菌株中。在完全培养基中(含1％L-肉汁，0.5％的细菌培养用蛋白胨，0.5％酵母提取液，0.5％氯化钠，50mg/l的氨苄西林及1.5％的琼脂糖)。涂布培养转化菌株形成菌落。将菌落影印到选择培养基上，筛选出在选择培养基上能生长的菌落作为候选菌株。

可从上述47株候选菌株中回收质粒，44个菌株是用羟胺诱变得到的，另3株是通过PCR方法随机诱变获得的。突变型 lgsC碱基序例已被确定，并且证实了突变位点。碱基序列的确定是用ABL 373A型DNA序列分析仪(由ABI公司提供)按常规方法进行的。结果是，可从用羟胺诱变的菌株中获得有4种突变位点(Nos.1，6，14和21)的突变型AKIII菌株，从用PCR方法进行随机诱变的菌株中可获得有3种突变位点(Nos，28，29和30)的突变型AKIII菌株(见表2)。

表2

突变 lysC	诱变方法	突变位点(氨基酸)
突变 lysC	诱变方法	突变位点(氨基酸)	No.1	羟胺	ACG→ATG(344Thr→Met)
No.6	羟胺	GAG→AAG(250Glu→Lys)	No.1	羟胺	ACG→ATG(344Thr→Met)
No.6	羟胺	GAG→AAG(250Glu→Lys)	No.14	羟胺	GAA→AAA(346Glu→Lys)CTT→TTT(374Leu→Phe)
No.21	羟胺	GAG→AAG(250Glu→Lys)ACG→ATG(364Thr→Met)	No.14	羟胺	GAA→AAA(346Glu→Lys)CTT→TTT(374Leu→Phe)
No.21	羟胺	GAG→AAG(250Glu→Lys)ACG→ATG(364Thr→Met)	No.28	PCR	GAT→GGT(202Asp→Gly)TCT→CCT(321Ser→Pro)
No.29	PCR	CGC→AGC(283Arg-Ser)GCG→ACG(333Ala→Thr)TCG→ACG(338Ser→Thr)GAA→GAT(346Glu→Asp)AAC→AGC(414Asn→Ser)	No.28	PCR	GAT→GGT(202Asp→Gly)TCT→CCT(321Ser→Pro)
No.29	PCR		No.30	PCR	ATG→AAG(318Met→Lys)TCT→CCT(321Ser→Pro)GTT→TTT(328Val→Phe)GTG→GGG(349Val→GlyGAG→GTG(405Glu→Val)

七种质粒(pMLYSC2^*Y1，pMLYSC2-Y6，pMLYSC2^*Y14，pMLYSC2^*Y21，pMLYSC2^*Y28，pMLYSC2^*Y29和pMLYSC2^*Y30)均导入了AK完全缺失的GT3菌株中，由这些转化菌株中制备不含菌体细胞的提取液。用同样的方法可测定AKIII的酶活力。制备无菌体细胞提取液和测量AKIII活性所用的是E.R.Stadtman等人的方法(Stadtman，E.R.，Cohen，G.N.，LeBras，G.，和Robichon-Szulmajster，H.，生物化学杂志， 236，2033(1961)]。而且，测量AKIII的酶活力大小时，需在酶反应液中加入不同浓度的L-赖氨酶来测定消除L-赖氨酸抑制的程度。结果如表3所示。消除抑制的程度系指AK残基在存在0.4ML-赖氨酸时的活性与不存在L-赖酸时的活性的比值。

表3

菌株	消除反馈抑制程度
菌株	消除反馈抑制程度	GT3/pMLYSC2^80CT3/pMLYSC2^117	75(％)76
GT3/pMLYSC2^Y1GT3/pMLYSC2^Y6GT3/pMLYSC2^Y14GT3/pMLYSC2^Y21GT3/pMLYSC2^Y28GT3/pMLYSC2^Y29GT3/pMLYSC2^*Y30	561278711711499116	GT3/pMLYSC2^80CT3/pMLYSC2^117	75(％)76

从上述结果可清楚地看出，与传统的典型突变型AKIII(在pMLYSC2^*80和pMLYSC2^*117中编码的突变型AKIII)相比，突变型AKIII的消除抑制的效果更好，同时又可从所用筛选方法中获得突变型AKIII。由全蛋白所决定的专一活性通常受到细胞生长条件或制备样品的影响。其专一活性同野生型菌株和传统突变株相同，引入突变后几乎未观察到活性的增加。相应地，可推测其AKIII的活性中心和L-赖氨酸的控制位点是相互独立的。实施例2

突变型AKIII基因的获取(2)

用LAPCR在体外诱变试剂盒(由Takara Shuzo有限公司提供)引入特异位点突变从而制备能使358位丝氨酸被亮氨酸取代的 LysC基因。这次，分别用在国际公开文本WO94/11517和WO95/16042中描述的PLYSC工作母体，以及在序例表No.4中所描述的引物作为引物束引入突变。用 EcoRI和 HindIII来切割PCR扩增片段的22末端，将所得到的裂解片断同用 EcoRI和 HindIII裂解的pllC19片段连接起来得到pLYSC358L。除了用序列表No.5或6中的引物作为引物外，其它均按上述方法来制备354位丝氨酸被诱变为异亮氨酸或缬氨酸的突变型AKIII基因。把该基因同用 EcoRI和 HindIII裂解后的pLLC19片段联接起来。如此得到了pLYSC 345I和pLYSC 354V。

把含有用EcoRI和HindIII裂解pLYSC1*48，pLYSC1*117，pLYSC1*126，pLYSC1*150和pLYSC1*158得到的 LysC片段插入pUC19的Eco-HindIII裂解位点中，所得的片段分别记作pLYSC2*48，pLYSC2*117，pLYSC2*126，pLYSC2*150和pLYSC2*158。国际公开文本WO94/11517和WO95/16042公开了pLYSC1的结构及pLYSC1*48，pLYSC2*117，pLYSC1*126，pLYSC2*150和pLYSC2*158的突变位点。因此，可以用上述pLYSC1*80来制备这些质粒。

然后，可制备含两种突变类型的突变型， LysC基因，即用所得到的单基突变型 LysC的突变中心附近的 SspI裂解位点，及pUC19的lysC下游的 SspI裂解位点。即，将含有pLYSC2*48 lysC基因上游SspI片段同含有pLYSC2*158 lysC基因的下游 SspI片段连接起来；从而制备pU2547M；把含有pLYSC2*126的 lysC基因上游区的Ssp1片段同含有pLYSC2*158的 lysC基因下游区的Ssp1片段连接起来，从而制备pU2347M；把含有pLYSC2*48 lysC基因上游区的 Ssp1片段同含有pLYSC2*117lysC基因下游区的Ssp1片段连接起来，可得到pU2545L；把含有pLYSC2*126的 lysC基因上游区的 Ssp1片段同含有pLYSC358L的 lysC基因下游区的 Ssp1片段连接起来，可得到pU2358L；把含有pLYSC2*126的LysC基因上游区的Ssp1片段同含有pLYSC 345V LysC基因下游区的Ssp1片段连接起来，从而得到pU 2345V；把含有PLYSC2*126的LysC基因上游区的 SspI片段同含有pLYSC 345I的LysC基因下游区的 SspI片段连接起来，从而得到pU2345I；由于pLYSC2*150和pLYSC2*126的突变位点比 SpsI裂解位点处于更上游区，有两个突变位点的双位点突变型lysC的制备方法如下。首先，用pLYSC2*126作模板扩增含有两个突变位点的DNA片段，将序列表No.7所示的寡核苷酸作为引物及上边提到的试剂盒。然后，用 EcoRI和 HindIII将所得到的DNA双末端裂解，并将片段连接到用 EcoRI和 HindIII裂解pUC19后所得的片段上。由此所得到的产物记作pU1823D。

如此获得的双位点突变 lysC基因产物(AKIII)消除赖氨酸抑制的程序在实施例1中作了描述，然后，任何双位点突变AKIII消除抑制的程度均比单位点突变AKIII要高(表4)。另外，pLYSC582L，pLYSC 345I和pLYSC 345V的突变lysC是一个新的突变基因。

每种基因产品均消除了赖氨酸的反馈抑制，与其它突变基因连接后进一步增强了抑制程度。该基因产品亦可用作构建双位点突变型AKIII的中间物。

表4

菌株	突变位点(氨基酸)	消除反馈抑制的程度(％)
菌株	突变位点(氨基酸)	消除反馈抑制的程度(％)	GT3/pLYSC2^48GT3/pLYSC2^117GT3/pLYSC2^126GT3/pLYSC2^150GT3/pLYSC2^*158	325Leu→Phe345Ser→Leu323Gly→Asp318Met→lie347Val→Met	1275583
GT3/pU345IGT3/pU 345VGT3/pU358L	345Ser→lie345Ser→Val358Ser→Leu	108983		325Leu→Phe345Ser→Leu323Gly→Asp318Met→lie347Val→Met	1275583
GT3/pU345IGT3/pU 345VGT3/pU358L	345Ser→lie345Ser→Val358Ser→Leu	108983	GT3/pU2547MGT3/pU2347MGT3/pU2545LGT3/pU2358LGT3/pU2345VGT3/pU2345IGT3/pU1823D	325Leu→Phe，347Val→Met323Gly→Asp，347Val→Met325Leu→Phe，345Ser→Leu323Gly→Asp，358Ser→Leu323Gly→Asp，345Ser→Val323Gly→Asp，345Ser→lie318Met→Ile，323Gly→Asp	90941721810915291

实施例3

用含有导入突变型DDPS基因和突变AKIII基因的菌株发酵生产L-赖氨酸。

在国际公开文本WO 95/16042中描述了突变型DDPS基因和突变型AKIII基因对生产L-赖氨酸产生的效果。为了增强这种效果，要把实施例1中得到的突变型AKIII基因与突变型DDPS基因联合起来。

在国际公开文本WO95/16042中描述了一种将含有突变型DDPS基因的质粒RSF 24P导入E.coli.JM109所得的菌株，即AJ 12395。它保藏在工业科学与技术部的国家生物科学与人类技术研究所(No.1-3，Higashi 1-chome，Tsukubashi，Ibargi-Ken，305)，保藏号为No.FERM p-3935，保藏日为1993年0月28日。按照布达佩斯条约，该菌株于1994年11月1日提交了国际保藏，新分配的保藏号是No.FERM BP-4845。

如图2所示，由含有突变型AKIII基团，pMLYSC2*Y1，pMLYSC2*Y6，pMLYSC2*Y14，pMLYSC2*Y21，pMLYSC2*Y28，pMLYSC2*Y9，pMLYSC2*Y30，pU2547M，pU2347M，pU2545L，pU2358L，pU2545V，pU2345I和pU1823D中选出一种类型用来制备质粒RSFDY1，RSFDY6，RSFDY14，RSFDY21，RSFDY28，RSFDY29，RSFDY30，RSFD2547M，RSFD2347M，RSFD2545L，RSFD2358L，RSFD2345V，RSFD2345I和RSFD1823D。

将在国际公开文本中描述的质粒RSFD80用来作为对照。将质粒RSFD80引入E.coli JM109菌株后所得的菌株记作AJ 12396。它被保藏在工业科学与技术部的国家生物科技与人类技术研究所中(No.1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaragi-ken，305)保藏号为No.FERM p-13936，保藏日为1993年10月28日。按照布达佩斯条约，该菌株于1994年11月1日提交了国际保藏，新分配的保藏号为No.FERM BP-4859。

按照常规方法将上述获得的质粒RSFDY1，RSFDY6，RSFDY14，RSFD21，RSFD28，RSFD29，RSFD30，RSFD2547M，RSFD2347M，RSFD2545L，RSFD2358L，RSFD2345V，RSFD2345I和RSFD1823D导入B-399菌株，从而获得生产L-赖氨酸的菌株。对上述菌株的赖氨酸的生产能力作了评价，评价时仍使用B-399/RSFD80作为对照。在国际公开文本WO95/16042中公开了获得B-399菌株的方法。

按照国际公开文本WO95/16042描述的方法，在生产L-赖氨酸培养基中，37℃F，搅拌培养48小时，搅拌速度为114～116rmp。结果如表5所示。

表5

菌株	形成的L-赖氨酸盐酸盐的量
菌株	形成的L-赖氨酸盐酸盐的量	B-399/RSFD80	9.2g/L
B-399/RSFDY1B-399/RSFDY6B-399/RSFDY14B-399/RSFDY21B-399/RSFDY28B-399/RSFDY29B-399/RSFDY30	9.4g/L9.6g/L9.6g/L9.5g/L9.6g/L9.5g/L9.3g/L	B-399/RSFD80	9.2g/L
	9.4g/L9.6g/L9.6g/L9.5g/L9.6g/L9.5g/L9.3g/L	B-399/RSFD2547MB-399/RSFD2347MB-399/RSFD2545LB-399/RSFD2358LB-399/RSFD2345VB-399/RSFD2345IB-399/RSFD1823D	9.6g/L9.5g/L9.6g/L9.3g/L9.4g/L9.3g/L9.6g/L

实施例4

用含有导入的突变型DDPS基因和突变型AKIII基因的菌株发酵生产L-赖氨酸(3)

实施例3证明，使埃希氏菌属中的一种细菌拥有了突变型DDPS基因和突变型AKIII基因后，可提高L-赖氨酸的产量。本实施例用来检测在宿主变化后能否保持这种效果。

用E.coli W3110( tyrA)菌株作为宿主。在欧洲专利公开文本No.488,424/1992中对该菌株作了描述。该文本中描述了大量将质粒导入W3110(tyrA)菌株后得到的菌株。例如，将质粒pHATerm引入后的菌株记作E.coli W3110(tyrA)/pHATerm菌株。该菌株按布达佩斯条约于1991年11月18日在工业科学与技术部国家生物科学与人类技术研究所(No.1-3，Higashi 1-chome，Tsukubashi，Ibaragi-ken，305)提交了国际保藏。分配的保藏号为No.FERM BP-3653。W3110(tyrA)菌株也可通过消除E.coli W3110(tgrA)/pHATerm菌株中的质粒而获得。质粒的消除可用常规方法实施。

由实施例3中获得的含有突变DDPS基因和突变型AKIII基因的质粒，即RSFDY1，RSFDY6，RSFDY14，RSFDY21，RSFDY28，RSFDY29，RSFDY30，RSFD2547M，RSFD2347M，RSFD2545L，RSF2358L，RSFD2345V，RSFD2345l和RSFD1823D均被导入上述W3110(tyrA)菌株中，如同实施例3中一样，对L-赖氨酸的生产能力进行了评价。把W3110(tyrA)/RSFD80菌株作为对照，该菌株把RSFD80导入W3110(tgrA)菌株中获得的，对该菌株的生产L-赖氨酸的能力也作了评价。结果如表6所示。

表6

菌株	形成的L-赖氨酸盐酸盐量
菌株	形成的L-赖氨酸盐酸盐量	W3110( tyrA)/RSFD80	8.9g/L
W3110( tyrA)/RSFDY1W3110( tyrA)/RSFDY6W3110( tyrA)/RSFDY14W3110( tyrA)/RSFDY21W3110( tyrA)/RSFDY28W3110( tyrA)/RSFDY29W3110( tyrA)/RSFDY30	9.1g/L9.3g/L9.3g/L9.2g/L9.3g/L9.2g/L9.0g/L	W3110( tyrA)/RSFD80	8.9g/L
	9.1g/L9.3g/L9.3g/L9.2g/L9.3g/L9.2g/L9.0g/L	W3110( tyrA)/RSFD2547MW3110( tyrA)/RSFD2347MW3110( tyrA)/RSFD2545LW3110( tyrA)/RSFD2358LW3110( tyrA)/RSFD2345VW3110( tyrA)/RSFD2345IW3110( tyrA)/RSFD1823D	9.3g/L9.2g/L9.3g/L9.0g/L9.1g/L9.0g/L9.3g/L

实施例5

用导入了突变型AKIII基因的菌株发酵生产L-苏氨酸

作为生产苏氨酸的E.coli菌株，B-3996菌株是目前已知的产量最高的菌株。因此，在评价突变型AKIII时，将B-3996菌株作为宿主。在美国专利5,175,107中对该菌株作了描述。并说明该菌株保藏在遗传学及工业微生物杂交研究所，保藏号为No.BKIIM B-3996。而且，为评价AKIII基因，选出实施例4中具有高L-赖氨酸生产能力的突变基因中的三种(RSFDY6，RSFE 254M和RSFD 1823D的突变型AKIII基因)，进行检测。首先，为了提高突变型AKIII基因的表达量，需将PMLYSC2*Y6的突变型AKIII基因连接到pUC19(由Takara Shuzo有限公司提供)的lacZ启动子的下游区。所得到的新的质粒被记作pLLC*Y6(图3)。由于在pU2547M和pU1823D中，突变AKIII基因最初位于pUc19(由Takara Shuzo有限公司提供)的lacz启动子下游，所以这样用。

按常规方法将这些质粒导入B-3996菌株中，进行评价。用在国际公开文本WO94/11517中公开的培养方法进行培养。

将pLLC*Y6，pU2547M和pU1823D转入B-3996菌株，在含有或不含有1克/升的赖氨酸的情况下进行培养。将国际公开文本WO94/11517中所描述的宿主B-3996菌株及B-3996/PLLC*80作为对照。

结果如表7所示。表7中赖氨酸敏感性指的是(含有赖氨酸时糖类的消耗量)和(不含赖氨酸时糖消耗量)的比率。对于B-3996菌株中，含有赖氨酸的培养条件下，培养时糖消耗量与不含赖氨酸条件时相比较减少了约0.74；对于带有质粒的B-3996/pLLC*80菌株，含有赖氨酸的培养条件下，培养时糖消耗量与不含赖氨酸的条件时相比较减少了约0.90。这减得到的新的突变AKIII基因在生产苏氨酸和对赖氨酸敏感性上仅略有优势。

表7

菌株	加入的L-氨酸量(克/升)	糖消耗量(％)	赖氨酸敏感性
菌株	加入的L-氨酸量(克/升)	糖消耗量(％)	赖氨酸敏感性	B-3996	01	30.722.6	0.74
B-3996/pLLC*80	01	39.735.6	0.90	B-3996	01	30.722.6	0.74
B-3996/pLLC*80	01	39.735.6	0.90	B-3996/pLLC*Y6	01	40.539.2	0.97
B-3996/pU2547M	01	40.739.5	0.97	B-3996/pLLC*Y6	01	40.539.2	0.97
B-3996/pU2547M	01	40.739.5	0.97	B-3996/pU1823D	01	41.440.5	0.98

发明效果

本发明使从L-赖氨酸反馈抑制被消除的较好的埃希氏菌属细菌得到突变型AKIII基因成为可能。将上述基因导入埃希氏菌属细菌中可得到改善较多的生产L-氨基酸的菌株。并且提供用这种菌株发酵生产L-氨基酸的优于传统生产方法的方法。

关键特征：-10信号肽

位点：265..273

测定方法：S

关键特征：引物连接

位点：536..555

测定方法：E

关键特征引物连接

位点：2128..2147

测定方法：E

关键特征：RBS

位点：575..578

测定方法：S

关键特征：CDS

位点：584..1933

测定方法：S

关键特征：末端

位点：1941..1968

测定方法：STCGAAGTGTT TCTGTAGTGC CTGCCAGGCA GCGGTCTGCG TTGGATTGAT GTTTTTCATT 60AGCAATACTC TTCTGATTTT GAGAATTGTG ACTTTGGAAG ATTGTAGCGC CAGTCACAGA 120AAAATGTGAT GGTTTTAGTG CCGTTAGCGT AATGTTGAGT GTAAACCCTT AGCGCAGTGA 180AGCATTTATT AGCTGAACTA CTGACCGCCA GGAGTGGATG AAAAATCCGC ATGACCCCAT 240CGTTGACAAC CGCCCCGCTC ACCCTTTATT TATAAATGTA CTACCTGCGC TAGCGCAGGC 300CAGAAGAGGC GCGTTGCCCA AGTAACGGTG TTGGAGGAGC CAGTCCTGTG ATAACACCTG 360AGGGGGTGCA TCGCCGAGGT GATTGAACGG CTGGCCACGT TCATCATCGG CTAAGGGGGC 420TGAATCCCCT GGGTTGTCAC CAGAAGCGTT CGCAGTCGGG CGTTTCGCAA GTGGTGGAGC 480ACTTCTGGGT GAAAATAGTA GCGAAGTATC GCTCTGCGCC CACCCGTCTT CCGCTCTTCC 540CTTGTGCCAA GGCTGAAAAT GGATCCCCTG ACACGAGGTA GTT ATG TCT GAA ATT 595

Met Ser Glu Ile

1GTT GTC TCC AAA TTT GGC GGT ACC AGC GTA GCT GAT TTT GAC GCC ATG 643Val Val Ser Lys Phe Gly Gly Thr Ser Val Ala Asp Phe Asp Ala Met5 10 15 20AAC CGC AGC GCT GAT ATT GTG CTT TCT GAT GCC AAC GTG CGT TTA GTT 691Asn Arg Ser Ala Asp Ile Val Leu Ser Asp Ala Asn Val Arg Leu Val

25 30 35GTC CTC TCG GCT TCT GCT GGT ATC ACT AAT CTG CTG GTC GCT TTA GCT 739Val Leu Ser Ala Ser Ala Gly Ile Thr Asn Leu Leu Val Ala Leu Ala

40 45 50GAA GGA CTG GAA CCT GGC GAG CGA TTC GAA AAA CTC GAC GCT ATC CGC 787Glu Gly Leu Glu Pro Gly Glu Arg Phe Glu Lys Leu Asp Ala Ile Arg

55 60 65AAC ATC CAG TTT GCC ATT CTG GAA CGT CTG CGT TAC CCG AAC GTT ATC 835Asn Ile Gln Phe Ala Ile Leu Glu Arg Leu Arg Tyr Pro Asn Val Ile

70 75 80CGT GAA GAG ATT GAA CGT CTG CTG GAG AAC ATT ACT GTT CTG GCA GAA 883Arg Glu Glu Ile Glu Arg Leu Leu Glu Asn Ile Thr Val Leu Ala Glu85 90 95 100GCG GCG GCG CTG GCA ACG TCT CCG GCG CTG ACA GAT GAG CTG GTC AGC 931Ala Ala Ala Leu Ala Thr Ser Pro Ala Leu Thr Asp Glu Leu Val Ser

105 110 115CAC GGC GAG CTG ATG TCG ACC CTG CTG TTT GTT GAG ATC CTG CGC GAA 979His Gly Glu Leu Met Ser Thr Leu Leu Phe Val Glu Ile Leu Arg Glu

120 125 130CGC GAT GTT CAG GCA CAG TGG TTT GAT GTA CGT AAA GTG ATG CGT ACC 1027Arg Asp Val Gln Ala Gln Trp Phe Asp Val Arg Lys Val Met Arg Thr

135 140 145AAC GAC CGA TTT GGT CGT GCA GAG CCA GAT ATA GCC GCG CTG GCG GAA 1075Asn Asp Arg Phe Gly Arg Ala Glu Pro Asp Ile Ala Ala Leu Ala Glu

150 155 160CTG GCC GCG CTG CAG CTG CTC CCA CGT CTC AAT GAA GGC TTA GTG ATC 1123Leu Ala Ala Leu Gln Leu Leu Pro Arg Leu Asn Glu Gly Leu Val Ile165 170 175 180ACC CAG GGA TTT ATC GGT AGC GAA AAT AAA GGT CGT ACA ACG ACG CTT 1171Thr Gln Gly Phe Ile Gly Ser Glu Asn Lys Gly Arg Thr Thr Thr Leu

185 190 195GGC CGT GGA GGC AGC GAT TAT ACG GCA GCC TTG CTG GCG GAG GCT TTA 1219Gly Arg Gly Gly Ser Asp Tyr Thr Ala Ala Leu Leu Ala Glu Ala Leu

200 205 210CAC GCA TCT CGT GTT GAT ATC TGG ACC GAC GTC CCG GGC ATC TAC ACC 1267His Ala Ser Arg Val Asp Ile Trp Thr Asp Val Pro Gly Ile Tyr Thr

215 220 225ACC GAT CCA CGC GTA GTT TCC GCA GCA AAA CGC ATT GAT GAA ATC GCG 1315Thr Asp Pro Arg Val Val Ser Ala Ala Lys Arg Ile Asp Glu Ile Ala

230 235 240TTT GCC GAA GCG GCA GAG ATG GCA ACT TTT GGT GCA AAA GTA CTG CAT 1363Phe Ala Glu Ala Ala Glu Met Ala Thr Phe Gly Ala Lys Val Leu His245 250 255 260CCG GCA ACG TTG CTA CCC GCA GTA CGC AGC GAT ATC CCG GTC TTT GTC 1411Pro Ala Thr Leu Leu Pro Ala Val Arg Ser Asp Ile Pro Val Phe Val

265 270 275GGC TCC AGC AAA GAC CCA CGC GCA GGT GGT ACG CTG GTG TGC AAT AAA 1459Gly Ser Ser Lys Asp Pro Arg Ala Gly Gly Thr Leu Val Cys Asn Lys

280 285 290ACT GAA AAT CCG CCG CTG TTC CGC GCT CTG GCG CTT CGT CGC AAT CAG 1507Thr Glu Asn Pro Pro Leu Phe Arg Ala Leu Ala Leu Arg Arg Asn Gln

295 300 305ACT CTG CTC ACT TTG CAC AGC CTG AAT ATG CTG CAT TCT CGC GGT TTC 1555Thr Leu Leu Thr Leu His Ser Leu Asn Met Leu His Ser Arg Gly Phe

310 315 320CTC GCG GAA GTT TTC GGC ATC CTC GCG CGG CAT AAT ATT TCG GTA GAC 1603Leu Ala Glu Val Phe Gly Ile Leu Ala Arg His Asn Ile Ser Val Asp325 330 335 340TTA ATC ACC ACG TCA GAA GTG AGC GTG GCA TTA ACC CTT GAT ACC ACC 1651Leu Ile Thr Thr Ser Glu Val Ser Val Ala Leu Thr Leu Asp Thr Thr

345 350 355GGT TCA ACC TCC ACT GGC GAT ACG TTG CTG ACG CAA TCT CTG CTG ATG 1699Gly Ser Thr Ser Thr Gly Asp Thr Leu Leu Thr Gln Ser Leu Leu Met

360 365 370GAG CTT TCC GCA CTG TGT CGG GTG GAG GTG GAA GAA GGT CTG GCG CTG 1747Glu Leu Ser Ala Leu Cys Arg Val Glu Val Glu Glu Gly Leu Ala Leu

375 380 385GTC GCG TTG ATT GGC AAT GAC CTG TCA AAA GCC TGC GGC GTT GGC AAA 1795Val Ala Leu Ile Gly Asn Asp Leu Ser Lys Ala Cys Gly Val Gly Lys

390 395 400GAG GTA TTC GGC GTA CTG GAA CCG TTC AAC ATT CGC ATG ATT TGT TAT 1843Glu Val Phe Gly Val Leu Glu Pro Phe Asn Ile Arg Met Ile Cys Tyr405 410 415 420GGC GCA TCC AGC CAT AAC CTG TGC TTC CTG GTG CCC GGC GAA GAT GCC 1891Gly Ala Ser Ser His Asn Leu Cys Phe Leu Val Pro Gly Glu Asp Ala

425 430 435GAG CAG GTG GTG CAA AAA CTG CAT AGT AAT TTG TTT GAG TAAATACTGT 1940Glu Gln Val Val Gln Lys Leu Hi5 Ser Asn Leu Phe Glu

440 445ATGGCCTGGA AGCTATATTT CGGGCCGTAT TGATTTTCTT GTCACTATGC TCATCAATAA 2000ACGAGCCTGT ACTCTGTTAA CCAGCGTCTT TATCGGAGAA TAATTGCCTT TAATTTTTTT 2060ATCTGCATCT CTAATTAATT ATCGAAAGAG ATAAATAGTT AAGAGAAGGC AAAATGAATA 2120TTATCAGTTC TGCTCGCAAA GGAATTC 2147序列描述：

序列长度：20

序列类型：核苷酸

链型：单链

拓朴结构：线状

分子类型：其它DNA

序列描述

CTTGCCTTGT GCGAAGGCTG 20

序列长度：18

序列类型：核苷酸

链型：单链

拓朴结构：线状

分子类型：其它DNA

序列描述

GAATTCCTTT GCGAGGAG 18

SEQ ID NO：4

序列长度：32

序列类型：核苷酸

链类型：单链

拓朴结构：线型

分子类型：其它DNA

序列描述

GAGGTCAGAC CGGTGGTATC AAGGGTTAAT GC

32

SEQ ID NO：5

序列长度：51

序类类型：核苷酸

链类型：单链

拓朴结构：线型

分子类型：其它DNA

序列描述

GGTATCAAGG GTTAATGCCA CGCTCACTTC GATCGTGGTGATTAAGTCTA C51

SEQ ID NO：6

序列长度：51

序列类型：核苷酸

链类型：单链

拓朴结构：线状

分子类型：其它DNA

序列描述

GGTATCAAGG GTTAATGCCA CGCTCACTTC AACCGTGGTGATTAAGTCTA C51

SEQ ID NO：7

序列长度：30

序列类型：核苷酸

链类型：单链

拓朴结构：线状

分子类型：其它DNA

序列描述

TGCAGTATAT TCAGGCTGTG CAAAGTGAGC 30

简要附图说明：图1：制备pMLYSC2的方法说明图2：制备RSFD系列质粒的方法说明图3：制备pLLC^*Y6的方法说明

Claims

1、一种编码埃希氏杆菌属细菌天冬氨酸激酶III的DNA，该DNA含有编码区的突变以消除所述天冬氨酸激酶的赖氨酸反馈抑制，

所述突变是：

天冬氨酸激酶III的318位甲硫氨酸残基由另一个氨基酸取代且第323位甘氨酸残基由另一个氨基酸取代的突变，

所述酶的第325位亮氨酸残基由另一个氨基酸取代且第347位缬氨酸残基由另一个氨基酸取代的突变，

所述酶的第323位甘氨酸残基由另一个氨基酸取代且第347位缬氨酸残基被另一个氨基酸残基取代的突变，

所述酶的第325位亮氨酸残基由另一个氨基酸残基取代且第345位丝氨酸残基被另一个氨基酸残基取代的突变，

第323位甘氨酸残基被另一个氨基酸残基取代且第358位丝氨酸残基被另一个氨基酸残基取代的突变，

第344位苏氨酸残基被另一氨基酸残基取代的突变，

第250位谷氨酸残基被另一氨基酸残基取代的突变，

第346位谷氨酸残基被另一氨基酸残基取代且第374位亮氨酸残基被另一个氨基酸残基取代的突变，

第250位谷氨酸残基被另一氨基酸残基取代且第364位苏氨酸被另一氨基酸残基取代的突变，

第202位天冬氨酸残基被另一氨基酸残基取代且第321位丝氨酸残基被另一氨基酸残基取代的突变，

第283位精氨酸残基被另一氨基酸残基取代，第333位丙氨酸残基被另一氨基酸残基取代，第338位丝氨酸残基被另一氨基酸残基取代，第346位谷氨酸残基被另一氨基酸残基取代且第414位天冬氨酸残基被另一氨基酸残基取代的突变，或者是第318位甲硫氨酸残基被另一氨基酸残基取代，第321位丝氨酸残基被另一氨基酸残基取代，第328位缬氨酸残基被另一氨基酸残基取代，第349位缬氨酸残基被另一氨基酸残基取代且第405位谷氨酸残基被另一氨基酸残基所取代。

2、权利要求1所述DNA，其中所述的突变位点是天冬氨酸激酶的318位甲硫氨酸的残基被异亮氨酸残基所取代且第323位甘氨酸残基被天冬氨酸残基所取代，

第325位亮氨酸残基被苯丙氨酸残基所取代且第347位缬氨酸残基被甲硫氨酸残基所取代的突变，

第323位甘氨酸残基被天冬氨酸残基取代且第347位缬氨酸残基被甲硫氨酸残基所取代的突变，

第325位亮氨酸残基被苯丙氨酸残基所取代且第345位丝氨酸残基被亮氨酸残基所取代的突变，

第323位甘氨酸残基被天冬氨酸残基所取代且第358位丝氨酸残基被亮氨酸残基所取代的突变，

第344位苏氨酸残基被甲硫氨酸残基所取代的突变，

第250位谷氨酸残基被赖氨酸残基所取代的突变，

突变由346位谷氨酸残基被赖氨酸残基取代，且374位亮氨酸残基被苯丙氨酸残基取代所造成，

突变由250位谷氨酸残基被赖氨酸残基取代，且364位苏氨酸残基被甲硫氨酸残基取代造成，

突变由202位天冬氨酸残基被甘氨酸残基取代且第321位丝氨酸残基被脯氨酸残基取代造成，

突变是第283位精氨酸残基被丝氨酸残基取代，第333位丙氨酸残基被苏氨酸残基取代，

第338位丝氨酸残基被苏氨酸残基取代，

第346位谷氨酸残基被天冬氨酸残基取代，

第414位天冬氨酸残基被丝氨酸残基取代，

或者，突变是第318位甲硫氨酸残基被赖氨酸残基取代，第321位丝氨酸残基被脯氨酸残基取代，第328位缬氨酸残基被苯丙氨酸残基取代，第349位缬氨酸残基被甘氨酸残基取代且第405位谷氨酸残基被缬氨酸残基取代。

3、一种重组DNA，该重组DNA通过将权利要求1的DNA连接到可以在埃希氏杆菌属细菌细胞内自我复制的载体上而制得。

4、一种含有权利要求1的DNA的埃希氏菌属微生物。

5、一种生产L-氨基酸的方法，该方法包括在培养基中培养能够在发酵培养基中生产L-氨基酸的权利要求4所述的微生物，在所述的所述培养物中产生并积累L-氨基酸，并从培养物中收集L-氨基酸。

6、权利要求5所述的方法，所述L-氨基酸为L-赖氨酸或L-苏氨酸。