KR19980032831A - 발효를 통한 ｌ-아미노산의 생산 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 발효를 통해 우수한 효율로 L-아미노산을 생산하는 방법을 제공한다.
에스케리키아 속의 세균으로부터 기원한 아스파르토키나제 III를 암호화하며L-라이신에 의한 피이드백 억제(feedback inhibition)가 해제된 돌연변이를 갖는 DNA를 세포내로 도입시켜 에스케리키아 속의 형질전환체 세균을 형성시키고, 이 세균을 적절한 배양 배지중에서 배양한다. L-아미노산이 생산되어 배양물중에 축적되면, 배양물로부터 이를 수집한다.

Description

발효를 통한 Ｌ-아미노산의 생산 방법
본 발명은 미생물 산업에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 발효를 통해 L-아미노산을 생산하는 방법 및 이러한 방법중에 사용된 DNA와 미생물에 관한 것이다.
L-라이신이 발효를 통해 생산되는 경우, 천연 환경으로부터 분리된 균주 또는 이의 합성 균주가 생산성을 향상시키는데 사용된다. 다수의 L-라이신 생산 합성 돌연변이체가 공지되어 있으며, 이들중 많은 균주가 브레비박테리움(Brevibacterium), 코리네박테리움(Corynebacterium), 바실러스(Bacillus) 또는 에스케리키아(Escherichia) 속에 속한다. 또한, 재조합 DNA를 사용하여 수득된 형질전환체가 사용된다(미국 특허 제4,278,765호). 따라서, 아미노산의 생산성을 증가시키기 위한 각종 기술이 공지되어 있다.
예를 들어, 에스케리키아 속과 관련하여, 디하이드로디피콜린산 신테타제(이후 DDPS로 약술)를 향상시킴에 의해 L-라이신을 생산하는 방법은 일본 공개 공보 제18,596/1981호, 미국 특허 제4,346,170호 및 문헌[참조: Applied Microbiology and Biotechnology 15, 227(1982)]에 기술되어 있다.
디하이드로디피콜린산 신테타제(DDPS)는 아스파르토세미알데하이드와 피루브산의 데하이드로-축합을 촉매하여 디하이드로디피콜린산을 형성시키는 효소이다. 이 반응은 아스파르트산-유형 아미노산의 생합성에 있어서 L-라이신 생합성 시스템의 도입 단계이다. 이 효소는 아스파르토키나제와 함께 에스케리키아 속의 세균에 있어서 L-라이신 생합성의 중요한 조절 요소로서 제공되는 것으로 알려져 있다.
DDPS는 에스케리키아 콜라이[Escherichia coli(E. coli)]내 dapA라 불리는 유전자내에 암호화되어 있으며 이의 염기 서열은 결정되어 있다[참조: Richaud, F. et al., J. Bacteriol. 297(1986)].
한편, 아스파르토키나제(이후 AK로 약술)는 아스파르트산을 β-포스포아스파르트산으로 전환시키는 반응을 촉매하는 효소이며, 아스파르트산-유형 아미노산의 생합성 시스템에 있어 주요한 조절 효소이다. 이. 콜라이의 AK는 3개의 유형(AKI, AKII, AKIII)을 포함하며, 이들중 2개는 호모세린 데하이드로게나제(이후 HD로 약술)와 접합된 효소이다. 이들 접합된 효소중 하나는 thrA 유전자내에 암호화된 AKI-HDI이며, 다른 것은 metLM 유전자내에 암호화된 AKII-HDII이다. AKI는 트레오닌과 이소루이신에 의해 저해되고 트레오닌에 의해 억제되며, AKII는 메티오닌에 의해 저해된다.
한편, AKIII만이 단일 작용의 효소이며, lysC라 불리는 유전자의 산물이다. 이는 L-라이신에 의해 저해되고 피이드 백(feedback inhibition) 억제되는 것으로 공지되어 있다. 세포내에서 이의 활성비는 AKI:AKII:AKIII = 대략 5:1:4이다.
이.콜라이의 lysC는 이미 클론되어 있으며, 이의 염기 서열도 측정되어 있다[참조: Cassan, M., Parsot, C., Cohen, G. N., and Patte, J. C., J. Biol. Chem. 261, 1052(1986)].
라이신에 의한 피이드백 억제를 해제하는 dapA와 라이신에 의한 피이드 백 억제를 해제하는 돌연변이를 갖는 lysC를 포함하는 이. 콜라이를 사용한 L-라이신의 생산 방법은 국제 공개 공보 팜플렛 제WO95/16042호에 개재되어 있다.
L-트레오닌이 발효에 의해 생산되는 경우, 천연 환경으로부터 분리된 균주 또는 이의 합성 균주가 미생물로써 사용된다. 다수의 L-트레오닌-생산 합성 돌연변이체가 공지되어 있으며, 이들중 대부분이 α-아미노-β-하이드록시발레르산에 대해 내성이며, 에스케리키아, 세라티아(Serratia), 브레비박테리움(Brevibacterium) 또는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속에 속한다. 에스케리키아 속과 관련하여, 트레오닌 오페론을 포함하는 재조합 플라스미드로 형질전환된 균주를 사용하여 L-트레오닌을 생산하는 방법은 일복 공개 공보 제131,397호, 제31,691/1984호 및 제15,696/1981호와 일본 특허 공보 제501,682/1991호에 기술되어 있다.
또한, 라이신에 의한 피이드 백 억제를 해제시키는 돌연변이를 갖는 lysC를 포함하는 이. 콜라이를 사용하여 L-트레오닌을 생산하는 방법은 국제 공개 공보 팜플렛 제WO94/11517호에 개재되어 있다.
본 발명은 L-라이신에 의한 피이드 백 억제를 우수하게 해제시키는 에스케리키아 속의 세균으로부터 기원한 AKIII를 수득하고, 이전보다 더욱 개선된, 발효를 통한 L-아미노산의 생산 방법을 제공하는 것을 목표로 한다.
도 1은 pMLYSC2의 제조방법을 도시한 것이다.
도 2는 RSFD 계열의 플라스미드의 제조방법을 도시한 것이다.
도 3은 pLLC*Y6의 제조방법을 도시한 것이다.
본 발명자는 상술한 문제를 해결하기 위하여 집중적으로 연구한 결과 L-라이신에 의한 피이드 백 억제가 잘 해제되는 에스케리키아 속의 세균으로부터 기원한 AKII를 암호화하는 DNA를 수득하는데 성공하였다. L-라이신에 의한 피이드 백 억제를 잘 해제시키는 에스케리키아 속의 세균으로부터 기원한 AKIII를 암호화하는 DNA를 본 명세서에서는 lysC 유전자 또는 돌연변이 AKIII 유전자라고 칭한다.
L-라이신에 의한 피이드 백 억제를 잘 해제시키는 이. 콜라이로부터 기원한 DDPS를 암호화하는 DNA는 본 명세서에서 돌연변이 dapA 유전자 또는 돌연변이 DDPS 유전자라고 한다.
또한, 본 발명자들은 세포내에서 돌연변이 lysC를 포함하는 에스케리키아 속의 세균을 제조하였으며 상당한 양의 L-라이신 또는 L-트레오닌이 배양물중에서 생산 및 축적될 수 있음을 발견하였다.
즉, 본 발명은 아스파르토키나제 III의 318번 메티오닌 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되고 323번 글라이신 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 돌연변이, 325번 루이신 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되고 347번 발린 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 돌연변이, 323번 글라이신 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되고 347번 발린 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 돌연변이, 325번 루이신 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되고 345번 세린 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 돌연변이, 323번 글라이신 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되고 358번 세린 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 돌연변이, 344번 트레오닌 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 돌연변이, 250번 글루탐산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 돌연변이, 346번 글루탐산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되고 347번 루이신 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 돌연변이, 250번 글루탐산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되고 364번 트레오닌 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 돌연변이, 202번 아스파르트산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되고 321번 세린 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 돌연변이, 283번 아르기닌 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되고 333번 알라닌 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되며, 338번 세린 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되고 346번 글루탐산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되고 414번 아스파라긴 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 돌연변이 또는 318번 메티오닌 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되고 321번 세린 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되며 328번 발린 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되고 349번 발린 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되고 405번 글루탐산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 돌연변이인, 에스케리키아 속에 속하는 세균의 아스파르토키나제 III의 라이신에 의한 피이드 백 억제를 해제시키는 돌연변이를 암호화 영역내에 가지며 상기 에스케리키아 속에 속하는 세균의 아스파르토키나제 III를 암호화하는 DNA에 관한 것이다.
바람직하게는, 본 발명은 아스파르토키나제 III의 318번 메티오닌 잔기가 이소루이신 잔기로 치환되고 323번 글라이신 잔기가 아스파르트산 잔기로 치환된 돌연변이, 325번 루이신 잔기가 페닐알라닌 잔기로 치환되고 347번 발린 잔기가 메티오닌 잔기로 치환된 돌연변이, 323번 글라이신 잔기가 아스파르트산 잔기로 치환되고 347번 발린 잔기가 메티오닌 잔기로 치환된 돌연변이, 325번 루이신 잔기가 페닐알라닌 잔기로 치환되고 345번 세린 잔기가 루이신 잔기로 치환된 돌연변이, 323번 글라이신 잔기가 아스파르트산 잔기로 치환되고 358번 세린 잔기가 루이신 잔기로 치환된 돌연변이, 344번 트레오닌 잔기가 메티오닌 잔기로 치환된 돌연변이, 250번 글루탐산 잔기가 라이신 잔기로 치환된 돌연변이, 346번 글루탐산 잔기가 라이신 잔기로 치환되고 347번 루이신 잔기가 페닐알라닌 잔기로 치환된 돌연변이, 250번 글루탐산 잔기가 라이신 잔기로 치환되고 364번 트레오닌 잔기가 메티오닌 잔기로 치환된 돌연변이, 202번 아스파르트산 잔기가 글라이신 잔기로 치환되고 321번 세린 잔기가 프롤린 잔기로 치환된 돌연변이, 283번 아르기닌 잔기가 세린 잔기로 치환되고 333번 알라닌 잔기가 트레오닌 잔기로 치환되며, 338번 세린 잔기가 트레오닌 잔기로 치환되고 346번 글루탐산 잔기가 아스파르트산 잔기로 치환되고 414번 아스파라긴 잔기가 세린 잔기로 치환된 돌연변이 또는 318번 메티오닌 잔기가 라이신 잔기로 치환되고 321번 세린 잔기가 프롤린 잔기로 치환되며, 328번 발린 잔기가 페닐알라닌 잔기로 치환되고 349번 발린 잔기가 글라이신 잔기로 치환되고 405번 글루탐산 잔기가 발린 잔기로 치환된 돌연변이인, 에스케리키아 속에 속하는 세균의 아스파르토키나제 III의 라이신에 의한 피이드 백 억제를 해제시키는 돌연변이를 암호화 영역내에 가지며 상기 에스케리키아 속에 속하는 세균의 아스파르토키나제 III를 암호화하는 DNA에 관한 것이다.
본 발명은 제 1항에서 청구한 DNA와 에스케리키아 속의 세균 세포내에서 자가 복제할 수 있는 벡터 DNA를 연결시킴에 의해 생산된 상술한 재조합 DNA 및 이러한 DNA를 갖는 에스케리키아 속의 미생물에 관한 것이다.
본 발명은 발효 배지중에서 L-아미노산을 생산하는 능력을 지닌 상술한 미생물을 배양하는 단계, 배양물중에서 L-아미노산을 생산 및 축적시키는 단계 및 배양물로부터 L-아미노산을 수집하는 단계를 포함하는, L-아미노산의 생산 방법에 관한 것이다.
본 명세서에서, DDPS 또는 AKIII를 암호화하는 DNA 또는 DDPS 또는 AKIII와 프로모터를 포함하는 DNA를 DDPS 유전자 또는 AKIII 유전자라고 한다. 또한, L-라이신에 의한 피이드 백 억제를 해제시키는 돌연변이 효소를 단순히 돌연변이 효소라고 하며 DDPS 또는 AKIII를 암호화하는 DNA 또는 이들과 프로모터를 포함하는 DNA를 돌연변이 유전자라고 한다. 또한, L-라이신에 의한 피이드 백 억제를 해제시키는은 억제가 실질적으로 해제되며 필수적으로 반드시 완전하게 해제되지 않음을 의미한다.
본 발명을 하기에서 상세히 기술한다.
(1) 본 발명의 돌연변이 아스파르토키나제(AKIII)를 암호화하는 DNA
본 발명의 돌연변이 아스파르토키나제(AKIII)를 암호화하는 DNA는 암호화될 AKIII의 L-라이신에 의한 피이드 백 억제를 해제시키는 돌연변이를 갖는 야생형 AKIII를 암호화하는 DNA이다. AKIII로서, 에스케리키아 속의 세균으로부터 기원한 AKIII, 특히 이. 콜라이로부터 기원한 AKIII가 언급된다. AKIII의 L-라이신에 의한 피이드 백 억제를 해제시키는 돌연변이는 AKIII의 N-말단으로부터 계수한 것으로써, 서열 목록의 서열 1의 AKIII의 아미노산내에 존재하며,
(a) 아스파르토키나제 III의 318번 메티오닌 잔기가 다른 아미노산 잔기, 바람직하게는 이소루이신 잔기로 치환되고 323번 글라이신 잔기가 다른 아미노산 잔기, 바람직하게는 아스파르트산 잔기로 치환된 돌연변이,
(b) 325번 루이신 잔기가 다른 아미노산 잔기, 바람직하게는 페닐알라닌 잔기로 치환되고 347번 발린 잔기가 다른 아미노산 잔기, 바람직하게는 메티오닌 잔기로 치환된 돌연변이,
(c) 323번 글라이신 잔기가 다른 아미노산 잔기, 바람직하게는 아스파르트산 잔기로 치환되고 347번 발린 잔기가 다른 아미노산 잔기, 바람직하게는 메티오닌 잔기로 치환된 돌연변이,
(d) 325번 루이신 잔기가 다른 아미노산 잔기, 바람직하게는 페닐알라닌 잔기로 치환되고 345번 세린 잔기가 다른 아미노산 잔기, 바람직하게는 루이신 잔기로 치환된 돌연변이,
(e) 323번 글라이신 잔기가 다른 아미노산 잔기, 바람직하게는 아스파르트산 잔기로 치환되고 358번 세린 잔기가 다른 아미노산 잔기, 바람직하게는 루이신 잔기로 치환된 돌연변이,
(f) 344번 트레오닌 잔기가 다른 아미노산 잔기, 바람직하게는 메티오닌 잔기로 치환된 돌연변이,
(g) 250번 글루탐산 잔기가 다른 아미노산 잔기, 바람직하게는 라이신 잔기로 치환된 돌연변이,
(h) 346번 글루탐산 잔기가 다른 아미노산 잔기, 바람직하게는 라이신 잔기로 치환되고 347번 루이신 잔기가 다른 아미노산 잔기, 바람직하게는 페닐알라닌 잔기로 치환된 돌연변이,
(i) 250번 글루탐산 잔기가 다른 아미노산 잔기, 바람직하게는 라이신 잔기로 치환되고 364번 트레오닌 잔기가 다른 아미노산 잔기, 바람직하게는 메티오닌 잔기로 치환된 돌연변이,
(j) 202번 아스파르트산 잔기가 다른 아미노산 잔기, 바람직하게는 글라이신 잔기로 치환되고 321번 세린 잔기가 다른 아미노산 잔기, 바람직하게는 프롤린 잔기로 치환된 돌연변이,
(k) 283번 아르기닌 잔기가 다른 아미노산 잔기, 바람직하게는 세린 잔기로 치환되고 333번 알라닌 잔기가 다른 아미노산 잔기, 바람직하게는 트레오닌 잔기로 치환되며, 338번 세린 잔기가 다른 아미노산 잔기, 바람직하게는 트레오닌 잔기로 치환되고, 346번 글루탐산 잔기가 다른 아미노산 잔기, 바람직하게는 아스파르트산 잔기로 치환되고, 414번 아스파라긴 잔기가 다른 아미노산 잔기, 바람직하게는 세린 잔기로 치환된 돌연변이 또는
(l) 318번 메티오닌 잔기가 다른 아미노산 잔기, 바람직하게는 라이신 잔기로 치환되고 321번 세린 잔기가 다른 아미노산 잔기, 바람직하게는 프롤린 잔기로 치환되며 328번 발린 잔기가 다른 아미노산 잔기, 바람직하게는 페닐알라닌 잔기로 치환되고 349번 발린 잔기가 다른 아미노산 잔기, 바람직하게는 글라이신 잔기로 치환되고 405번 글루탐산 잔기가 다른 아미노산 잔기, 바람직하게는 발린 잔기로 치환된 돌연변이를 포함한다.
야생형 AKIII를 암호화하는 DNA는 특히 제한되지 않는다. AKIII를 암호화하는 DNA는 에스케리키아 속의 세균으로부터 기원하며, 예를 들면, 이. 콜라이가 언급된다. 특히, 서열 1로 나타낸 아미노산 및 또한 서열 1로 나타낸 염기 서열중 584번 내지 1930번 염기로 나타낸 서열을 암호화하는 DNA가 언급된다. 이. 콜라이의 AKIII는 lysC 유전자내에 암호화되어 있다.
상술한 서열중에서, 아미노산 잔기를 치환시키는 염기 서열의 돌연변이를 갖는 서열은 본 발명의 돌연변이 AKIII를 암호화하는 DNA이다. 치환된 아미노산 잔기에 상응하는 코돈 유형은, 이것이 아미노산 잔기를 암호화하는 한, 특히 제한되지 않는다. 야생형 AKIII의 아미노산 서열은 세균 또는 균주에 따라서 약간 변한다. 효소 활성에 기여하지 않는 위치내 아미노산의 치환, 결실 또는 삽입을 갖는 서열이 또한 본 발명의 돌연변이 AKIII 유전자내에 포함된다.
예를 들어, 실시예 1에서 수득된 야생형 lysC 유전자의 염기 서열(서열 1)은 이미 공지되어 있는 이. 콜라이 K-12 JC411 균주[참조: Cassan, M., Parsot. C., Cohen, G. N., 및 Patte, J. C., J. Biol. Chem. 261, 1052(1986)]의 lysC의 염기 서열과는 6개 위치에서 상이하다. 암호화될 아미노산 잔기는 6개 부위중 2개의 부위에서 상이하다(JC411 균주의 lysC에 있어, N-말단으로부터 계수하여 58번 글라이신 잔기는 시스테인 잔기로 치환되어 있고 401번 글라이신 잔기는 서열 1로 나타낸 lysC의 아미노산 서열내에서 알라닌으로 치환되어 있다). 상술한 돌연변이 a) 내지 l)중 어느것이 이. 콜라이 K-12 JC411 균주의 lysC의 동일한 서열내로 도입되는 경우, L-라이신에 의한 피이드 백 억제를 해제시키는 돌연변이를 갖는 lysC가 수득되는 것으로 기대된다.
L-라이신에 의한 피이드 백 억제를 해제시키는 돌연변이 AKIII를 암호화하는 DNA는 하기와 같이 수득된다. 우선, 야생형 AKIII 유전자 또는 다른 돌연변이를 갖는 AKIII 유전자를 포함하는 DNA를 실험관내에서 돌연변이유발시키고 돌연변이유발된 DNA를 숙주에 적합한 벡터 DNA와 연결시켜 재조합 DNA를 형성시킨다. 재조합 DNA를 숙주 미생물내로 도입시켜 형질전환체를 수득한다. 돌연변이 AKIII를 발현하게 된 형질전환체를 선별하는 경우, 이 형질전환체는 돌연변이 유전자를 보유한다. 또한 야생형 AKIII 유전자 또는 다른 돌연변이를 갖는 AKIII 유전자를 포함하는 DNA를 숙주에 적합한 벡터 DNA와 연결시켜 재조합 DNA를 형성시킨다. 다음 재조합 DNA를 실험관내에서 돌연변이유발시키고, 돌연변이유발된 DNA를 숙주 미생물내로 도입시켜 형질전환체를 수득한다. 돌연변이 AKIII를 발현하게 되는 형질전환체를 선별하는 경우, 이 형질전환체는 또한 돌연변이 유전자를 보유한다. 달리는, 야생형 효소를 생산하는 미생물을 돌연변이유발시켜 돌연변이 효소를 생산하는 돌연변이 균주를 형성시킨 다음 이 돌연변이 균주로부터 돌연변이 유전자를 수득하는 것도 가능하다.
DNA를 직접 돌연변이유발시키는 제제로서는, 하이드록실아민 등이 언급된다. 하이드록실아민은 사이토신을 N4-하이드록시사이토신으로 변화시킴에 의해 사이토신에서 티민으로 돌연변이유발시키는 화학적 돌연변이유발제이다. 또한, 미생물 자체가 돌연변이유발되는 경우, 자외선에 의한 조사 또는 N-매틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(NTG)와 같은 돌연변이유발제의 처리가 수행된다.
야생형 AKIII 유전자 또는 다른 돌연변이를 갖는 AKIII 유전자를 포함하는 DNA의 공여 세균으로서는, 에스케리키아 속에 속하는 어떠한 미생물도 사용가능하다. 특히, 문헌(참조: F. C. Neidhardt et al., Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D. C., p. 1208, Table 1)에 기술된 것들이 유용하다. 이의 예로는 이. 콜라이 JM109 균주 및 이. 콜라이 MC1061 균주가 있다.
(1) 야생형 AKIII 유전자의 획득
AKIII 유전자를 포함하는 DNA를 제조하는 예는 다음에 기술한다. 우선, 예를 들면 lysC를 갖는 야생형 이. 콜라이 MC1061 균주를 배양하여 배양물을 수득한다. 상술한 미생물은 일반적인 고체 배양을 통해 배양할 수 있다. 세포 수집의 효능면에 있어, 액체 배양을 사용하는 것이 바람직하다. 이 경우에, 배양 배지는 예를 들면, 인산일수소칼륨, 인산이수소칼륨, 황산마그네슘, 염화나트륨, 염화마드네슘, 염화제1철, 황산제1철 및 황산망간중에서 선택된 무기 염의 하나이상의 유형을 효모 추출물, 펩톤, 육류 추출물, 옥수수대 액 및 대두나 밀의 유출액에 가하고, 추가로 필요할 경우 여기에 적합한 양의 사카라이드 출발 물질, 비타민 등을 가함에 의해 수득된 것이다. 배양 배지의 초기 pH는 6 내지 8로 조정하는 것이 적합하다. 배양은 30 내지 42℃, 바람직하게는 대략 37℃에서 4 내지 24시간 동안 잠수된 통기 교반 배양, 진탕 배양 또는 정체 배양을 통해 수행된다.
이렇게 수득한 배양물은 예를 들면, 3,000rpm에서 5분간 분리하여 이. 콜라이 MC1061 균주를 수득한다. 염색체 DNA를 이 균주로부터 예를 들면, 사이토(Saito) 및 미우라(Miura)의 방법[참조: Biochem. Biophys. Acta. 72, 619, (1963)] 또는 커비 케이 에스(Kirby, K. S.)의 방법[참조: Biochem. J. 64, 405, (1956)]에 의해 수득할 수 있다.
수득되는 염색체 DNA로부터 AKIII 유전자를 분리하기 위하여, 염색체 DNA 라이브러리를 제조한다. 우선, 염색체 DNA를 적절한 제한 엔도뉴클레아제로 부분 절단하여 각종 단편의 혼합물을 수득한다. 분해 시간 등으로 절단을 조절함으로써 절단 정도를 조절하는 경우, 광범위하게 다양한 단편 혼합물이 형성된다. 예를 들면, 염색체 DNA를 1 내지 10 단위/ml의 효소 농도에서 30℃ 이상, 바람직하게는 37℃의 온도에서 1분 내지 2시간의 시간 동안 Sau 3AI와 반응시켜 각종 단편으로 절단한다.
다음, 절단된 염색체 DNA 단편을 에스케리키아 속의 세균 세포내에서 자가 복제할 수 있는 벡터 DNA와 연결시켜 재조합 DNA를 형성시킨다. 특이하게는, 벡터 DNA를 염색체 DNA의 절단중에 사용된 제한 엔도뉴클레아제 Sau 3AI로서 동일한 말단 염기 서열을 형성시키는 제한 엔도뉴클레아제, 예를 들면 1 내지 100 단위/분의 효소 농도의 Bam HI와 30℃ 이상의 온도에서 1시간 이상, 바람직하게는 1 내지 3시간 동안 반응시켜 이를 완전히 분해하여 절단한다. 연속해서, 상기 수득한 염색체 DNA 단편 혼합물을 절단된 벡터 DNA와 혼합한다. 이 혼합물을 DNA 리가제, 바람직하게는 1 내지 100단위/분의 효소 농도의 T4 DNA 리가제와 4 내지 116℃의 온도에서 1시간 이상, 바람직하게는 6 내지 24시간 동안 반응시켜 재조합 DNA를 형성시킨다.
에스케리키아 속의 미생물, 예를 들면, 이. 콜라이 K-12 균주, 바람직하게는 AKI, AKII 및 AKIII이 완전히 결손된 균주, 예를 들면, 이. 콜라이 GT3 균주[이는 이. 콜라이 게네틱 스톡 센터(Genetic Stock Center, Connecticut, U.S.A. 소재)로부터 입수할 수 있다]를 형질전환시켜 염색체 DNA 라이브러리를 제조한다. 형질전환은 모리슨 디 엠(Morrison D. M.)의 방법[참조: Methods in Enzymology 68, 326,(1979)] 또는 DNA의 투과성이 수용체 세균 세포를 염화칼슘으로 처리함에 의해 증가되는 방법[참조: Mandel, M. and Giga, A., J. Mol. Biol. 53, 159(1970)]으로 수행한다.
AKIII 유전자의 재조합 DNA를 갖는 균주는 AKIII 유전자의 결손에 의해 유발된 영양요구성이 수득되는 염색체 DNA 라이브러리내에 상쇄되어 있는 균주로부터 수득된다. 예를 들어, AK가 완전히 결손된 돌연변이가 숙주로 사용되는 경우, L-라이신, L-트레오닌, L-메티오닌 및 디아미노피멜산이 없는 배지 또는 호모세린 및 디아미노피메르산이 없는 배양 배지상에서 성장할 수 있는 재조합 균주 및 재조합 DNA를 이 균주로부터 회수함으로써 AKIII 유전자를 포함하는 DNA 단편을 수득할 수 있다. 세포 추출물을 후보 균주로부터 제조하고, 조 효소 용액을 세포 추출물로부터 형성시킨다. 다음, AKIII 활성을 확인한다. AKIII의 효소 활성은 스타트맨 이 알의 방법[참조: Stadtman, E. R., Cohen, G. N., LeBras, G., and Robichon-Szulmajster, H., J. Biol. Chem. 236, 2033(1961)]으로 측정할 수 있다.
AKIII 유전자를 포함하는 DNA를 벡터 DNA내로 삽입함에 의해 수득한 재조합 DNA을 예를 들면, 게리 피(Guerry P.) 등의 방법[참조: J. Bacteriol. 116, 1064(1973)] 또는 클레웰 디 비(Clewell D. B.)의 방법[참조: J. Bacteriol. 110, 667, (1972)]으로 분리할 수 있다.
야생형 AKIII 유전자는 또한 염색체상에 AKIII 유전자를 갖는 균주로부터 사이토 및 미우라의 방법에 의해 염색체 DNA를 제조하고, 폴리머라제 쇄 반응[참조: polymerase chain reaction, PCR, White, T. J. et al, Trends Genet. 5, 185(1989)]을 통해 AKIII 유전자를 증폭시켜 수득한다. 증폭에 사용된 DNA 프라이머는 AKIII 유전자의 전체 영역 또는 이의 일부를 포함하는 DNA 이본쇄의 3'-말단 모두에 대해 상보성인 프라이머이다. 단지 AKIII 유전자의 영역 일부만이 증폭되는 경우, 프라이머로서 AKIII의 영역 일부를 갖는 DNA 단편을 사용하여 염색체 DNA 라이브러리로부터 전체 영역을 포함하는 DNA 단편을 스크리닝하는 것이 필요하다. AKIII 유전자의 전체 영역이 증폭된 경우, 증폭된 AKIII 유전자를 갖는 DNA 단편을 함유하는 PCR 용액을 아가로즈 겔 전기영동에 적용시킨 후, 목적한 DNA 단편을 추출함으로써, AKIII 유전자를 포함하는 DNA 단편을 회수할 수 있다.
DNA 프라이머는 예를 들면, 이. 콜라이의 공지된 서열[참조: Cassan, M. Parsot, C., Cohen, G. N. and Patte, J. C., J. Biol. Chem. 261, 1052(1986)]을 기본으로하여 적절하게 형성시킬 수 있다. lysC 유전자를 암호화하는 1,347 염기로 구성된 영역을 증폭시킬 수 있는 프라이머가 적절하다. 예를 들면, 서열 2 및 서열 3으로 나타낸 2개 유형의 프라이머가 적절하다. 프라이머 DNA는 일반적인 방법, 예를 들면, 포스포아미다이드 방법[참조: Tetrahedron Letters 22, 1859 (1981)]에 의해 시판되는 DNA 합성기(예를 들면, DNA 합성기 모델 380B, Applied Biosystems사 제조)를 사용하여 합성할 수 있다.
또한, PCR은 시판되는 PCR 장치(DNA Thermal Cycler Model PJ2000, Takara Shuzo Co., Ltd. 제조) 및 TaqDNA 폴리머라제(Takara Shuzo Co., Ltd. 제조)를 사용하여 공급업자가 지시한 방법으로 수행할 수 있다.
PCR을 통해 증폭된 AKIII 유전자를 에스케리키아 속에 속하는 세균의 세포내에서 자가 복제할 수 있는 벡터 DNA와 연결시키고, 에스케리키아 속의 세균 세포내로 도입시킴에 의해 AKIII 유전자내로 돌연변이를 용이하게 도입시킬 수 있다. 벡터 DNA, 형질전환 및 AKIII 유전자 존재의 확인은 상술한 바와 동일하다.
(2) AKIII 유전자내로 돌연변이의 도입
상기 수득한 AKIII 유전자를 재조합 PCR 방법[참조: Higuchi, R. 61, in PCR Technology (Erlich, H. A. Eds., Stockton Press (1989)], 부위 특이적 돌연변이 방법[참조: Kramer, W. and Frits, H. J., Methods in Enzymology 154, 350(1987); Kunkel T. A. et al., Methods in Enzymology 154, 367(1987)] 등에 의해 아미노산 잔기의 치환, 삽입 또는 결실과 같은 돌연변이에 적용시킨다. 이들 방법은 목적한 부위내 바람직한 돌연변이를 유발시킬 수 있다.
돌연변이 또는 랜덤 돌연변이는 목적한 유전자를 화학적으로 합성하는 방법에 의해 목적한 부위내로 도입시킬 수 있다.
또한, 염색체 또는 플라스미드상의 AKIII 유전자를 하이드록실아민으로 직접 처리하는 방법이 있다[참조: Hashimoto, T. and Sekiguchi, M., J. Bacteriol. 159, 1039(1984)]. 또한, AKIII 유전자를 포함하는 에스케리키아 속의 세균을 자외선으로 조사하는 방법 또는 N-메틸-N'-니트로소구아니딘 또는 아질산과 같은 화학제를 사용하는 방법이 사용될 수 있다. 돌연변이는 이들 방법에 의해 무작위적으로 도입시킬 수 있다.
돌연변이 AKIII 유전자를 선별하는 방법은 하기에 기술되어 있다. 우선, 돌연변이유발된 AKIII 유전자를 포함하는 DNA를 완전하게 AK가 결손된 균주, 예를 들면 이. 콜라이 GT3 균주내로 형질전환시킨다. 다음, 이 형질전환체를 최소 배지, 예를 들면, 고려할 만한 양의 L-라이신을 함유하는 M9 배지상에서 배양한다. 단독의 AK는 야생형 AKIII 유전자를 포함하며 이의 성장을 조절하는 재조합 DNA를 갖는 균주내에서 L-라이신에 의해 억제되므로, L-트레오닌, L-이소루이신, L-메티오닌 및 디아미노피메린산(DAP)이 합성될 수 없다. 한편, L-라이신에 의한 억제를 유발시키는 돌연변이 AKIII 유전자를 포함하는 재조합 DNA를 갖는 균주는 고려할 만한 양의 L-라이신을 함유하는 최소 배지상에서 성장하여야만 한다. 이러한 현상을 이용하는 경우, L-라이신 또는 L-라이신의 동족체인 S-2-아미노에틸·시스테인(AEC)에 대해 내성인 균주, 즉 억제를 유발시키는 돌연변이 AKIII 유전자를 포함하는 재조합 DNA를 갖는 균주를 선별할 수 있다.
재조합 DNA로서 이렇게 수득된 재조합 유전자를 적합한 미생물(숙주)내로 도입하여, 발현시킴으로써 피이드 백 억제가 해제된 AKIII를 포함하는 미생물을 수득할 수 있다.
숙주로서는, 에스케리키아 속에 속하는 미생물이 바람직하다. 예를 들면, 에스케리키아 콜라이(이. 콜라이)가 언급된다.
또한, 재조합 DNA로부터 돌연변이 AKIII 유전자 단편을 취하고 이를 다른 벡터내로 삽입시킴으로써 수득된 물질을 사용할 수 있다. 본 발명중에 사용할 수 있는 벡터 DNA로서는, 플라스미드 벡터 DNA가 바람직하다. 이의 예는 pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pMW119, pMW118, pMW219 및 pMW218을 포함한다. 파아지 DNA 벡터 및 트랜스포존 벡터(transposon vector) 또한 유용하다.
돌연변이 AKIII 유전자를 효율적으로 발현시키기 위하여, lac, trp 및 PL과 같이 미생물내에서 작용하는 다른 프로모터를 돌연변이 AKIII를 암호화하는 DNA의 상부 영역과 연결시킬 수 있다. 또한, AKIII 유전자를 포함하는 프로모터를 증폭시킴에 의해 그 자체로써 사용된다.
상술한 바와 같이, 돌연변이 유전자를 자가 복제할 수 있는 벡터 DNA내로 삽입시킴에 의해 수득한 물질은 숙주내로 도입될 수 있으며, 숙주내에서 플라스미드와 같은 염색체외 DNA로서 존재한다. 또한, 돌연변이 유전자를 형질 유도를 통해 트랜스포존을 사용하여[참조: Berg, D. E. and Berg, C. M., Bio/Technol. 1, 417 (1983)], Mu 파아지를 사용하여[참조: 일본 공개 공보 제109,985/1990호] 또는 상보성 재조합을 통해[참조: Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Habor Lab. (1972)] 숙주 미생물의 염색체내로 삽입시킬 수 있다.
(3) 본 발명에 따른 L-아미노산의 생산
L-아미노산은 상기 수득한 돌연변이 AKIII 유전자를 도입시켜 형질전환된 에스케리키아 속의 세균을 적절한 배양 배지내에서 배양하고, 배지중에서 L-아미노산을 생산 및 축적시키고, 배양물로부터 L-아미노산을 수집함으로써 우수한 효율로 생산할 수 있다.
L-라이신에 의한 피이드백 억제를 해제시키는 AK를 포함하는 에스케리키아 속의 세균은 L-라이신에 의한 피이드 백 억제를 해제시키는 돌연변이를 갖는 AKIII를 암호화하는 DNA를 염색체 DNA 내로 삽입시킴에 의해 형질전환된 에스케리키아 속의 세균 및 상술한 DNA를 에스케리키아 속의 세균 세포내에서 자가 복제할 수 있는 벡터 DNA와 연결시 형성된 재조합 DNA를 세포내로 도입시킴에 의해 형질전환된 에스케리키아 속의 세균을 포함한다. 또한, 에스케리키아 속의 세균 세포를 돌연변이유발시킴에 의해 돌연변이 AKIII를 생산하도록 하는 에스케리키아 속의 세균의 돌연변이체도 유용하다.
형질전환용 숙주로써 사용되는 에스케리키아 속의 세균과 관련하여, 돌연변이 AKIII 유전자의 프로모터 또는 이러한 유전자를 발현하는 다른 프로모터가 세포내에서 작용하는 경우, 어떠한 세균도 사용할 수 있다. 또한, 돌연변이 AKIII 유전자가 염색체외 DNA로써 플라스미드내로 도입되는 경우, 도입에 사용된 벡터 DNA의 복제 오리진이 이의 세포내에서 작용할 수 있고 이것이 복제되는 한, 어떠한 세균도 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 돌연변이 유전자를 갖는 미생물을 배양하는데 사용된 배양 배지는 탄소원, 질소원, 무기 이온 및 필요할 경우 기타 유기 물질을 함유하는 일반적인 배양 배지이다.
탄소원의 예는 글루코즈, 락토즈, 갈락토즈, 프럭토즈 및 전분 가수분해물과같은 사카라이드; 글리세롤 및 소르비톨과 같은 알콜과 푸마르산, 시트르산 및 석신산과 같은 유기산을 포함한다.
탄소원의 예는 황산암모늄, 염화암모늄 및 인산암모늄과 같은 무기 암모늄 염; 대두 가수분해물; 암모니아 가스 및 수성 암모니아를 포함한다.
유기 미세영양원으로서는, 적합한 양의 비타민 B1또는 L-이소루이신과 같은 요구 물질 또는 효소 추출물을 함유하는 것이 바람직하다. 또한, 인산칼륨, 황산마그네슘, 철 이온 및 망간 이온을 필요할 경우 소량 가한다.
배양은 16 내지 72시간 동안 통기적으로 수행한다. 배양 온도는 25℃ 내지 45℃이다. pH는 배양동안 5 내지 8로 조정한다. 무기 또는 유기의, 산성 또는 알칼리성 물질과 추가로 암모니아 가스를 사용하여 pH를 조정할 수 있다.
L-아미노산은 일반적으로 이온-교환 수지 방법, 침전 및 기타 공지된 방법을 연결함에 의해 발효액으로부터 수집할 수 있다.
실시예
본 발명을 하기 실시예를 참조로하여 더욱 상세히 나열한다.
실시예 1
돌연변이 AKIII 유전자의 획득
(1) 야생형 AKIII 유전자의 클로닝
이. 콜라이 AKIII 유전자(lysC)의 염기 서열은 이미 보고되어 있다[참조: Cassan, M., Parsot, C., Cohen, G. N., and Patte, J. C., J. Biol. Chem. 261, 1052(1986)]. 개방 판독 프레임(ORF)은 449개 아미노산 잔기로 구성된 단백질을 암호화하는 1,347 염기쌍으로 구성된다. 이 유전자는 오퍼레이터를 가지며, L-라이신에 의해 저해된다. 따라서, 오퍼레이터 영역을 제거하기 위해서는, SD 서열 및 ORF만을 포함하는 영역을 PCR을 통해 증폭시키고 클론시킨다.
이. 콜라이 K-12 MC1061 균주의 전체 게놈 DNA를 사이토 및 미우라의 방법[참조: Biochem. Biophys. Acta. 72, 619(1963)]에 의해 제조하고, 서열 2 및 서열 3으로 나타내는 서열을 갖는 2개 유형의 프라이머를 형성시킨다. PCR은 에를리히 에이치 에이(Erlich H. A.) 등의 방법[참조: PCR Technology, Stockton Press (1989)]에 의해 상기 프라이머를 사용하여 수행함으로써 AKIII 유전자를 증폭시킨다. 수득되는 DNA를 Bam HI 및 Ase I로 분해한 후, 평활 말단화하여, 저 카피수의 벡터 pMW119의 Sma I부위내로 삽입시켜 pMLYSC2를 작제한다. 이 SMa I 부위는 벡터내에 존재하는 lacZ 프로모터의 하부에 위치한다. DNA 단편을 pMW119의 Sma I 부위내로 삽입시킴에 의해 수득한 재조합 DNA를 이. 콜라이 내로 도입시키는 경우, 삽입된 DNA 단편은 lacZ 프로모터를 조절함에 의한 전사를 통해 전사된다(도 1).
(2) 돌연변이 AKIII 유전자의 클로닝
국제 공개 공보 팜플렛 제WO94/11517호 및 제WO95/16042호에 기술된 바와 같은, 돌연변이 AKIII 유전자를 갖는 플라스미드, 즉 pLYSC1*80, pLYSC1*117 및 pLYSC1*126을 Eco RI 및 Hind III로 분해하여 돌연변이 AKIII 유전자를 포함하는 DNA 단편을 절단한다. 이 단편을 pMW119의 Eco RI-Hind III 부위내로 삽입하여 pMLYSC2*80, pMLYSC2*117 및 pMLYSC2*126 각각을 작제한다.
플라스미드 pLYSC*80은 국제 공개 공보 팜플렛 제WO94/11517호의 기술에 따라 pLLC*8로부터 제조할 수 있다. 이. 콜라이 HB101내로 pLLC*80을 도입시킴에 의해 수득된 균주를 AJ12750으로 지명한다. 이것은 기탁기관[National Institute of Bioscience and Human Technology of the Agency of Industrial Science and Technology (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaragiken, 305)]에 기탁번호 제FERM P-13136호로 1992년 9월 1일 기탁되었다. 이 균주는 1993년 11월 4일 부다페스트 조약하에 국제 기탁물로 이전되었으며 기탁 번호 제FERM BP-4462호를 새로이 부여받았다. pLYSC2*117 및 pLYSC2*126은 아직 기탁되지 않았다. 그러나, 이의 돌연변이 부위는 국제 공개공보 팜플렛 제WO94/11517호에 기술되어 있으므로, 이들은 출발물질로서 pLYSC1*80을 사용하여 용이하게 제조할 수 있다.
(3) 신규한 돌연변이 AKIII 유전자의 선별의 조건에 대한 연구
완전한 AK-결손 균주내로 pMLYSC1을 도입시킴에 의해 수득된 형질전환체인 이. 콜라이 GT3(thrA1016b, metLM1005, lysC1004)를 GT3/pMLYSC2로 지명한다. 유사하게 pMLYSC2*80, pMLYSC2*117 및 pMLYSC2*126을 수득한다. GT3/pMLYSC2 균주는 야생형 lysC를 포함하는 플라스미드를 가지며 이 플라스미드의 lysC중에 암호화된 AKIII는 단독 AK이다. 최소 배지중에서 고려할만한 양의 L-라이신의 존재하에서 단독 AK인 야생형 AKIII는 L-라이신, L-트레오닌, L-이소루이신에 의해 억제되므로, 이의 성장을 저해하는 L-메티오닌 및 디아미노피메린산(DAP)은 합성될 수 없다. L-라이신에 의한 억제를 유발시키는 돌연변이 lysC를 갖는 플라스미드를 포함하는 균주가 고려할만한 양의 L-라이신을 함유하는 최소 배지상에서 성장할 수 있다고 예상할 때, 성장시 L-라이신 내성을 갖는 균주가 선별되며 따라서 L-라이신에 의한 억제를 유발시키는 돌연변이 lysC를 포함하는 플라스미드를 갖는 균주가 수득된다. GT3/pMLYSC2 균주, GR/pMLYSC2*80 균주, GT3/pMLYSC2*117 균주 및 GR3/pMLYSC2*126 균주를 각종 농도의 L-라이신을 함유하는 최소 아가 플레이트 배지상에서 배양하여 성장 억제 농도와 플라스미드-포함 균주를 선별하는 조건을 시험한다. 각종 농도의 L-라이신을 함유하는 최소 아가 플레이트 배지상에서의 형질전환체의 성장은 표 1에 나타낸다. 표 1에서, +는 형질전환체가 성정함을, ±는 형질전환체가 약간 성장함을, 및 -는 형질전환체가 성장하지 않음을 나타낸다.
L-라이신의 농도 및 성장
0M 0.2M 0.4M 0.6M 0.8M
GT3/pMLYSC2 ± - - - -
GT3/pMLYSC2*80 + + ± - -
GT3/pMLYSC2*117 + ± - - -
GT3/pMLYSC2*126 + ± - - -
야생형 lysC를 갖는 GT3/pMLYSC2 균주의 성장은 0.2M 라이신을 함유하는 첨가 영역내에서 완전히 저해된다. 또한, 잘 공지되어 있는 돌연변이 lysC를 갖는GT3/pMLYSC2*80 균주, pMLYSC2*117 균주 및 pMLYSC2*126 균주의 성장은 또한 0.4M L-라이신을 함유하는 첨가 영역내에서 완전히 저해된다. 결과적으로, 여전히 돌연변이 lysC보다 높은 억제 유발도를 갖는 돌연변이는 0.4M L-라이신을 함유하는 첨가 영역 내에서의 선별을 통하여 수득될 수 있음을 알수 있다. 이러한 성장 억제는 호모세린 및 디아미노피레린산의 동시 첨가를 통해 제거될 수 있음이 확인되었다.
돌연변이를 도입하는 시험에서, 0.4M L-라이신을 함유하는 최소 아가 배지 M9를 돌연변이 lysC를 갖는 플라스미드-포함 균주의 선별시 사용한다. 이 배지를 실시예 1에서는 선택 배지라 칭한다.
(4) AKIII 유전자의 돌연변이유발 및 돌연변이 AKIII 유전자의 획득
2개의 방법, 즉, 플라스미드를 하이드록실아민으로 직접 처리하는 실험관내 돌연변이유발 방법 및 하이드록실아민을 사용하여 사이토신으로부터 티미딘으로의 돌연변이이외의 돌연변이 예상에 있어 각종 돌연변이를 제공하는 PCR 돌연변이유발 방법을 pMLYSC1 플라스미드내로의 돌연변이 도입에 사용한다.
pMLYSC2의 미생물을 0.4M 하이드록실아민[0.1M KH2PO4및 1mM EDTA(pH 6.0)의 혼합물 및 1M 하이드록실아민 및 1mM EDTA(pH 6.0)의 혼합물 100㎕과 DNA 2㎍을 함유하는 용액을 물을 첨가하여 총 200㎕로 조정한다]으로 75℃에서 1 내지 4시간 동안 처리한다. 이렇게 처리한 DNA를 유리 분말로 정제한 후, 완전히 AK가 결손된 이. 콜라이 GT3 균주내로 도입시킨다. 수득되는 형질전환체를 0% L-브로쓰, 0.5% 효모 추출물, 0.5% NaCl, 50mg/ℓ의 암피실린 및 1.5% 아가를 함유하는 완전 배지상에 도말하여 콜로니를 형성시킨다. 이 콜로니들을 선택 배지상에서 복제시키고, 선택 배지상에서 성장하는 콜로니를 후보 균주로써 선택한다.
PCR을 통한 랜덤 돌연변이유발을 카드웰 씨(Cadwell C.)의 방법[참조: Cadwell, C. and G. F. Joyce, PCR methods Applic. 2, 28 (1982)]으로 수행한다. 즉, lysC 단편을 상술한 방법에 의해 pMLYSC2 및 M13 공통의 프라이머를 사용하여 증폭시킨다. 이 단편을 Eco RI 및 Hind III로 분해한 후 pMW119의 Eco RI-Hind III 부위내로 삽입시켜 완전히 AK가 결손된 이. 콜라이 GT3내로 도입한다. 형질전환체를 완전 배지(0% L-브로쓰, 0.5% 박토 트립톤,0.5% 효모 추출물, 0.5% NaCl, 50mg/ℓ의 암피실린 및 1.5% 아가를 함유)상에 도말하여 콜로니를 형성시킨다. 이 콜로니들을 선택 배지상에서 복제시키고, 선택 배지상에서 성장할 수 있는 균주를 후보 균주로써 선택한다.
플라스미드를 상기 수득한 총 47개의 후보 균주, 즉 하이드록실아민을 사용한 돌연변이유발로부터 수득된 44개의 균주, PCR을 통한 랜덤 돌연변이유발로부터 수득한 3개의 균주로부터 회수한다. 돌연변이 lysC 염기 서열을 측정하고, 돌연변이 지점을 확인한다. 염기 서열은 DNA sequencer ABI Model 373A(ABI사 공급)를 사용한 통상의 방법으로 측정한다. 그 결과, 4개 유형의 돌연변이 지점을 갖는 돌연변이 AKIII 균주(제1번, 제6번, 제14번 및 제21번)를 하이드록실아민을 사용한 돌연변이유발로부터 수득되는 균주에서 수득될 수 있으며, 3개 유형의 돌연변이 지점을 갖는 돌연변이 AKIII 균주(제28번, 제29번 및 제30번)가 PCR을 통한 랜덤 돌연변이해제로부터 수득되는 균주에서 수득될 수 있다(표 2).
돌연변이체 lysC 돌연변이해제 방법 돌연변이 지점(아미노산)
번호 1 하이드록실아민 ACG→ATG(344Thr→Met)
번호 6 하이드록실아민 GAG→AAG(250Glu→Lys)
번호 14 하이드록실아민 GAA→AAA(346Glu→Lys)GTT→TTT(374Leu→Phe)
번호 21 하이드록실아민 GAG→AAG(250Glu→Lys)ACG→ATG(364Thr→Met)
번호 28 PCR GAT→GGT(202Asp→Gly)TCT→CCT(321Ser→Pro)
번호 29 PCR CGC→AGC(283Arg→Ser)GCG→ACG(333Ala→Thr)TCG→ACG(338Ser→Thr)GAA→GAT(346Glu→Asp)AAC→AGC(414Asn→Ser)
번호 30 PCR ATG→AAG(318Met→Lys)TCT→CCT(321Ser→Pro)GTT→TTT(328Val→Phe)GTG→GGG(349Val→Gly)GAG→GTG(405Glu→Val
이들 7개의 플라스미드(pMLYSC2*Y1, pMLYSC2*Y6, pMLYSC2*Y14, pMLYSC2*Y21, pMLYSC2*Y28, pMLYSC2*Y29 및 pMLYSC2*Y30)를 완전히 AK가 결손된 GT3 균주내로 도입시키고, 세포-유리된 추출물을 형질전환체로부터 제조한다. 이를 사용하여 AKIII의 효소 활성을 측정한다. 세포 유리된 추출물의 제조 및 AKIII의 효소 활성의 측정을 문헌의 방법[참조: Stadtman E. R., Cohen, G. N., LiBras, G., and Robichon-Szulmajster, H., J. Biol. Chem. 236, 2033(1961)]으로 수행한다. 또한, AKIII 효소 활성의 측정시, 각종 농도의 L-라이신을 효소 반응 용액에 가하여 L-라이신의 억제 유발 정도를 시험한다. 이 결과는 표 3에 나타낸다. 억제 해소 정도는 L-라이신의 부재하에서의 AK 활성에 대한 0.4M L-라이신의 존재하에서의 AK 잔기 활성의 비로 언급한다.
균주 피이드백 억제 해제도
GT3/pMLYSC2*80GT3/pMLYSC2*117 75(%)76
GT3/pMLYSC2*Y1GT3/pMLYSC2*Y6GT3/pMLYSC2*Y14GT3/pMLYSC2*Y21GT3/pMLYSC2*Y28GT3/pMLYSC2*Y29GT3/pMLYSC2*Y30 561278711711499116
상술한 결과로부터 명백해지는 바와 같이, 통상의 돌연변이 AKIII(pMLYSC2*80 및 pMLYSC2*117내에 암호화된 돌연변이 AKIII)보다 억제 해제도가 높은 돌연변이 AKIII가 본 실시예에서 사용된 선별 방법에 의해 수득될 수 있다. 총 단백질을 기준으로한 특이적 활성은 샘플 제제 또는 세포의 성장 조건에 의해 영향받는다. 이의 특이적인 활성은 야생형 및 통상의 돌연변이체의 것과 동등하며, 돌연변이의 도입에 의한 활성에 있어서의 감소는 거의 관측되지 않는다. 따라서, AKIII의 활성 중심 및 이의 L-라이신을 갖는 조절 부위는 서로 독립적인 것으로 예상된다.
실시예 2
돌연변이 AKIII 유전자의 획득(2)
358번 Ser이 Leu로 치환된 lysC 유전자를 실험관내 Mutagenesis Kit(Takara Shuzo Co., Ltd 제조)내 LA PCR을 사용하여 부위 특이적인 돌연변이를 도입시킴에 의해 제조한다. 이 경우, 국제 공개 공보 팜플렛 제WO94/11517호 및 제WO95/16042호에 기술된 pLYSC1을 주형으로서 사용하며 서열 4의 프라이머를 돌연변이 도입용 프라이머로써 사용한다. PCR 증폭 단편의 말단들을 Eco RI 및 Hind III로 분해하고, 분해된 단편은 pUC19를 pUC19의 Eco RI 및 Hind III로 분해함으로써 수득한 단편과 연결하여 pLYSC358L을 형성시킨다. 354번 Ser이 Ile 또는 Val로 돌연변이유발된 돌연변이 AKIII 유전자를, 프라이머로써 서열 5 또는 서열 6의 프라이머를 사용하는 것외에는 상술한 방법으로 제조한다. 이 유전자는 pUC19를 Eco RI 및 Hind III로 분해함에 의해 수득한 단편과 연결시킨다. 이렇게 하여, pLYSC345I 및 pLYSC354V가 형성된다.
pLYSC1*48, pLYSC1*117, pLYSC1*126, pLYSC1*150 및 pLYSC1*158을 Eco I 및 Hind III로 분해함으로써 수득한 lysC를 포함하는 단편을 pUC19의 Eco-Hind III 절단 부위내로 삽입시키고, 수득되는 단편을 각각 pLYSC2*48, pLYSC2*117, pLYSC2*126, pLYSC2*150 및 pLYSC2*158로 지명한다. 국제 공개 공보 팜플렛 제WO94/11517호 및 제WO95/16042호는 pLYSC1의 구조와 pLYSC1*48, pLYSC2*117, pLYSC1*126, pLYSC2*150 및 pLYSC2*158의 돌연변위 지점의 부위를 기술하고 있다. 따라서, 이들 플라스미드는 상술한 pLYSC1*80으로부터 제조할 수 있다.
연속해서, 2개 유형의 돌연변이를 갖는 돌연변이 lysC 유전자를 pUC19내 lysC의 하부에 위치하는 SspI 분해 위치와 이렇게 수득한 일염기성 돌연변이 lysC의 돌연변이 지점의 중심과 인접하게 위치하는 Ssp I 분해 부위를 사용하여 제조한다. 즉, pU2547M은 pLYSC2*48 의 상부 영역의 lysC 유전자를 포함하는 Ssp I 단편을 pLYSC2*158의 하부 영역 lysC 유전자를 포함하는 SspI 단편과 연결함으로써 제조하며; pU2347M은 pLYSC2*126의 상부 영역 lysC 유전자를 pLYSC2*158의 하부 영역 lysC 유전자를 포함하는 SspI 단편과 연결함으로써 제조하고; pU2545L은 pLYSC2*48의 하부 영역의 lysC 유전자를 포함하는 Ssp I 단편을 pLYSC2*117의 하부 영역의 lysC 유전자를 포함하는 SspI 단편과 연결함으로써 제조하며; pU2358L은 pLYSC2*126의 하부 영역의 lysC 유전자를 포함하는 Ssp I 단편을 pLYSC358L의 하부 영역의 lysC 유전자를 포함하는 SspI 단편과 연결함으로써 제조하고; pU2345V는 pLYSC2*126 하부 영역의 lysC 유전자를 포함하는 Ssp I 단편을 pLYSC345V의 하부 영역의 lysC 유전자를 포함하는 SspI 단편과 연결함으로써 제조하며; pU2345I는 pLYSC2*126의 하부 영역의 lysC 유전자를 포함하는 Ssp I 단편을 pLYSC345I의 하부 영역의 lysC 유전자를 포함하는 SspI 단편과 연결함으로써 제조한다. pLYSC2*150 및 pLYSC2*126의 돌연변이 지점은 Sps I 분해 부위보다 더 하부에 위치하므로, 이들 2개의 돌연변이 지점을 갖는 이염기성 돌연변이 lysC는 하기와 같이 제조된다. 우선, 2개의 돌연변이 지점을 갖는 DNA 단편을 주형으로서의 pLYSC2*126, 프라이머로서의 서열 7의 올리고뉴클레오타이드 및 상술한 키트를 사용하여 증폭시킨다. 계속해서, 수득되는 DNA 단편의 양쪽 말단을 Eco RI 및 Hind III로 분해하여, pUC19를 Eco RI 및 Hind III로 절단하여 수득한 단편과 연결시킨다. 이렇게 수득한 생성물을 pU1823D라고 지명한다.
이렇게 수득한 이염기성 돌연변이 lysC 유전자 산물(AKIII)의 Lys에 대한 억제의 해제 정도를 실시예 1에 기술한 바와같이 측정한다. 그 결과, 어떠한 이염기성 돌연변이 AKIII로 억제 유발 정도도 일염기성 돌연변이 AKIII의 것보다 높다(표 4). 부수적으로, pLYSC582L, pLYSC345I 및 pLYSC345V내 돌연변이 lysC는 신규한 돌연변이 유전자이다. 각각의 유전자 산물에 있어서는, 라이신에 의한 피이드 백 억제가 해제되고 다른 돌연변이와의 연결로 억제 해제 정도가 더욱 증가된다. 이 산물은 또한 이염기성 돌연변이 AKIII의 작제용 중간체로써 유용하다.
균주 돌연변이 지점(아미노산) 피이드백 억제 해제도(%)
GT3/pLYSC2*48GT3/pLYSC2*117GT3/pLYSC2*126GT3/pLYSC2*150GT3/pLYSC2*158 325Leu→Phe345Ser→Leu323Gly→Asp318Met→Ile347Val→Met 1275583
GT3/pU345IGT3/pU345VGT3/pU358L 345Ser→Ile345Ser→Val358Ser→Leu 108983
GT3/pU2547MGT3/pU2347MGT3/pU2545LGT3/pU2358LGT3/pU2345VGT3/pU22345IGT3/pU1823D 325Leu→Phe, 347Val→Met323Gly→Asp, 347Val→Met325Leu→Phe, 345Ser→Leu323Gly→Asp, 358Ser→Leu323Gly→Asp, 345Ser→Val323Gly→Asp, 345Ser→Ile318Met→Ile, 323Gly→Asp 90941721810915291
실시예 3
돌연변이 DDPS 유전자 및 돌연변이 AKIII 유전자가 도입된 균주를 사용하는 발효를 통한 L-라이신의 생산
돌연변이 DDPS 유전자 및 돌연변이 AKIII 유전자와 관련하여 L-라이신의 생산 효과는 국제 공개 공보 팜플렛 제WO95/16042호에 기술되어 있다. 이러한 효과를 증진시키기 위하여, 실시예 1에서 수득한 돌연변이 AKIII 유전자를 돌연변이 DDPS 유전자를 사용하여 함께 존재하도록 한다.
국제 공개 공보 팜플렛 제WO95/16042호에 기술된 돌연변이 DDPS 유전자를 갖는 플라스미드 RSF24P를 이. 콜라이 JM109 균주내로 도입시킴에 의해 수득한 균주를 AJ12395로 지명한다. 이것은 기탁기관[National Institute of Bioscience and Human Technology of the Agency of Industrial Science and Technology (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaragiken, 305)]에 기탁번호 제FERM P-13935호로 1993년 10월 28일 기탁되었다. 이 균주는 1994년 11월 1일 부다페스트 조약하에 국제 기탁물로 이전되었으며 기탁 번호 제FERM BP-4858호를 새로이 부여받았다.
돌연변이 AKIII 유전자, pMLYSC2*Y1, pMLYSC2*Y6, pMLYSC2*Y14, pMLYSC2*Y21, pMLYSC2*Y28, pMLYSC2*Y29, pMLYSC2*Y30, pU254M, pU254L, pU2358L, pU2545V, pU2345I 및 pU1823D를 포함하는 플라스미드로부터 선택된 한가지 유형으로부터 플라스미드 RSFDY1, RSFDY6, RSFDY14, RSFDY21, RSFDY28, RSFDY29, RSFDY30, RSFD2547M, RSFD2347M, RSFD2545L, RSFD2358L, RSFD2345V, RSFD2345I 및 RSFD1823D를 제2도에 나타낸 바와 같이 제조한다.
국제 공개 공보 팜플렛 제WO95/16042호에 기술된 플라스미드 RSFD80을 대조군으로서 사용한다. 플라스미드 RSFD80을 이. 콜라이 JM109 균주내로 도입시킴에 의해 수득한 균주를 AJ12396으로 지명한다. 이것은 기탁기관[National Institute of Bioscience and Human Technology of the Agency of Industrial Science and Technology (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaragiken, 305)]에 기탁번호 제FERM P-13936호로 1993년 10월 28일 기탁되었다. 이 균주는 1994년 11월 1일 부다페스트 조약하에 국제 기탁물로 이전되었으며 기탁 번호 제FERM BP-4859호를 새로이 부여받았다.
상기 수득한 플라스미드 RSFDY1, RSFDY6, RSFDY14, RSFDY21, RSFDY28, RSFDY29, RSFDY30, RSFD2547M, RSFD2347M, RSFD2545L, RSFD2358L, RSFD2345V, RSFD2345I 및 RSFD1823D를 B-399 균주내로 통상의 방법에 의해 도입시켜 L-라이신 생산 균주를 형성시킨다. 상술한 균주의 라이신 생산성을 평가한다. 라이신 생산성의 평가는 대조군으로서 B-399/FSFD80와 관련하여 또한 수행한다. B-399를 수득하는 방법은 국제 공개 공보 팜플렛 제WO95/16042호에 기술되어 있다.
배양은 L-라이신 생산 배지내에서 37℃로 48시간 동안 114 내지 116rpm으로 교반함을 통해 국제 공개 공보 팜플렛 제WO95/16042호에 기술된 방법에 따라 수행한다. 이 결과는 표 5에 나타낸다.
균주 형성된 L-라이신·HCl의 양
B-399/RSFD80 9.2 g/L
B-399/RSFDY1B-399/RSFDY6B-399/RSFDY14B-399/RSFDY21B-399/RSFDY28B-399/RSFDY29B-399/RSFDY30 9.4 g/L9.6 g/L9.6 g/L9.5 g/L9.6 g/L9.5 g/L9.3 g/L
B-399/RSFD2547MB-399/RSFD2347MB-399/RSFD2545LB-399/RSFD2358LB-399/RSFD2345VB-399/RSFD2345IB-399/RSFD1823D 9.6 g/L9.5 g/L9.6 g/L9.3 g/L9.4 g/L9.3 g/L9.6 g/L
실시예 4
돌연변이 DDPS 유전자 및 돌연변이 AKIII 유전자가 도입된 균주를 사용하는 발효를 통한 L-라이신의 생산(2)
돌연변이 DDPS 유전자 및 돌연변이 AKIII 유전자를 갖도록 에스케리키아 속의 세균을 제조함에 의해 L-라이신의 생산성을 향상시킬 수 있다는 점에서 실시예 3과 동일하다. 이 시험은 이러한 효과가 숙주를 변화시키는 경우에도 유지될 수 있는지의 여부에 대해 수행된다.
이. 콜라이 W3110(tyrA) 균주를 숙주로써 사용한다. 이. 콜라이 W3110(tyrA) 균주는 유럽 특허 공개 공보 제488,424/192호에 기술되어 있다. 유럽 특허 공개 공보 제488,424/192호는 플라스미드를 이. 콜라이 W3110(tyrA) 균주내로 도입시킴에 의해 수득된 다수의 균주를 기술하고 있다. 예를 들어, 플라스미드 pHATerm을 도입시킴에 의해 수득된 균주는 이. 콜라이 W3110(tyrA)/pHATerm 균주 로 지명된다. 이것은 국제 기탁기관[National Institute of Bioscience and Human Technology of the Agency of Industrial Science and Technology (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaragiken, 305)]에 1991년 11월 18일에 부다페스트 조약하에 기탁되었으며, 기탁 번호 제FERM BP-3653호가 지정되었다. W3110(tyrA) 균주는 또한 이. 콜라이 W3110(tyrA)/pHATerm 균주로부터 플라스미드 pHATerm을 제거함에 의해 수득될 수 있다. 플라스미드의 제거는 통상의 방법으로 수행한다.
실시예 3에서 수득된 돌연변이 DDPS 유전자 및 돌연변이 AKIII 유전자를 포함하는 플라스미드, 즉, RSFDY1, RSFDY6, RSFDY14, RSFDY21, RSFDY28, RSFDY29, RSFDY30, RSFD2547M, RSFD2347M, RSFD2545L, RSFD2358L, RSFD2345V, RSFD2345I 및 RSFD1823D를 상술한 W3110(tyrA) 균주내로 도입시키고 L-라이신 생산성을 실시예 3에서와 같이 평가한다. 대조군으로서, W3110(tyrA)/RSFD80은 W3110(tyrA) 균주내로 RSFD80을 도입시킴에 의해 제조하고, 이 균주의 L-라이신 생산성을 또한 평가한다. 이 결과를 표 6에 나타낸다.
균주 형성된 L-라이신 ·HCl의 양
W3110(tyrA)/RSFD80 8.9 g/L
W3110(tyrA)/RSFDY1W3110(tyrA)/RSFDY6W3110(tyrA)/RSFDY14W3110(tyrA)/RSFDY21W3110(tyrA)/RSFDY28W3110(tyrA)/RSFDY29W3110(tyrA)/RSFDY30 9.1 g/L9.3 g/L9.3 g/L9.2 g/L9.3 g/L9.2 g/L9.0 g/L
W3110(tyrA)/RSFD2547MW3110(tyrA)/RSFD2347MW3110(tyrA)/RSFD2545LW3110(tyrA)/RSFD2358LW3110(tyrA)/RSFD2345VW3110(tyrA)/RSFD2345IW3110(tyrA)/RSFD1823D 9.3 g/L9.2 g/L9.3 g/L9.0 g/L9.1 g/L9.0 g/L9.3 g/L
실시예 5
돌연변이 AKIII 유전자가 도입된 균주를 사용하는 발효를 통한 L-라이신의 생산
이. 콜라이 트레오닌 생산 균주로서, B-3996 균주는 현재 공지된 것들중에서 가장 우수한 생산성을 갖는다. 따라서, 돌연변이 AKIII을 평가하는데 있어서, B-3996 균주가 숙주로서 사용된다. 이 B-3996 균주는 미국 특허 제5,175,107호에 기술되어 있으며 기탁기관(Research Institute for Genetics and Industrial Microorganism Breeding)에 기탁번호 제BKIIM B-3996호로 기탁된 것으로 되어 있다. 또한, 평가를 위한 돌연변이 AKIII 유전자로서, 실시예 4에서 고 L-라이신 생산성을 갖는 돌연변이 유전자중 3개 유형의 돌연변이 유전자(RSFDY6, RSFE254M 및 RSFD1823D의 돌연변이 AKIII 유전자)를 선별하여, 시험에 적용시킨다. 우선, 돌연변이 AKIII 유전자의 발현양을 증가시키기 위하여, pMLYSC2*Y6중에 존재하는 돌연변이 AKIII 유전자를 pUC19의 lacZ 프로모터(Takara Shuzo Co., Ltd.제조)의 하부 영역과 연결시킨다. 이렇게 형성된 신규한 플라스미드를 pLLC*Y6으로 지명한다(도3). pU2547M 및 pU1823D내에서, 돌연변이 AKIII 유전자는 원래 pUC19의 lacZ 프로모터(Takara Shuzo Co., Ltd.제조)의 하부에 위치하므로, 그 자체로써 사용된다.
이 플라스미드를 통상의 방법으로 B-3996 균주내에 도입시키고 평가한다. 배양은 국제 공개 공보 팜플렛 제WO94/11517호에 기술된 방법으로 수행한다.
pLLC*Y6, pU2547M 및 pU1823D를 B-3996 균주내로 형질전환시키고, 이 형질전환체를 1g/ℓ의 라이신의 존재 또는 부재하에 배양한다. 숙주 B-3996 단독 및 국제 공개 공보 팜플렛 제WO94/11517호에 기술된 B-3996/pLLC*80을 대조군으로서 사용한다.
이 결과를 표 7에 나타낸다. 표 7에서 라이신 감도는 (라이신 부재하에서 소모된 슈가의 양)에 대한 (라이신의 존재하에서 소모된 슈가의 양)의 비를 말한다. B-3996 균주에 있어서, 라이신의 존재하에 배양시 소모된 슈가의 양에 있어서의 감소는 라이신의 부재하에 배양 영역 내에서의 것과 비교하여 대략 0.74이며, B-3996/pLLC*80에 있어서, 라이신의 존재하에 배양시 소모된 슈가의 양에 있어서의 감소는 라이신의 부재하에 배양 영역 내에서의 것과 비교하여 대략 0.90이다. 이 시기에 새로이 수득된 돌연변이 AKIII 유전자는 트레오닌 생산성 및 라이신 감도에 있어 약간 우세하다.
균주 첨가된 L-라이신의양(g/L) 소모된 슈가의 수율(%) 라이신 감도
B-3996 01 30.722.6 0.74
B-3996/pLLC*80 01 39.735.6 0.90
B-3996/pLLC*Y6 01 40.539.2 0.97
B-3996/pU2547M 01 40.739.5 0.97
B-3996/pU1823D 01 41.440.5 0.98
본 발명은 라이신에 의한 피이드백 억제를 잘 해제시키는 에스케리키아 속의 세균으로부터 기원한 돌연변이 AKIII 유전자의 생산을 가능케한다. 이전의 것보다 더욱 개선된 L-아미노산 생산 균주는 상술한 유전자를 에스케리키아 속의 세균내로 도입시킴에 의해 형성될 수 있다. 이러한 L-아미노산 생산 균주를 사용함에 의해 통상의 방법보다 훨씬 우수한 발효를 통해 L-아미노산을 생산하는 방법을 제공할 수 있다.
서열 목록
특징 키이: -10 시그날
위치: 265..273
측정 방법: S
특징 키이: 프라이머 결합
위치: 536..555
측정 방법: E
특징 키이: 프라이머 결합
위치: 2128..2147
측정 방법: E
특징 키이: RBS
위치: 575..578
측정 방법: S
특징 키이: CDS
위치: 584..1933
측정 방법: S
특징 키이: 터미네이터
위치: 1941..1968
측정 방법: S
서열 기술
서열 2
서열 길이: 20
서열 유형: 핵산
본쇄형: 일본쇄
위상: 선형
분자 유형: 기타 DNA
서열 기술
CTTCCCTTGT GCCAAGGCTG 20
서열 3
서열 길이: 18
서열 유형: 핵산
본쇄형: 일본쇄
위상: 선형
분자 유형: 기타 DNA
서열 기술
GAATTCCTTT GCGAGCAG 18
서열 4
서열 길이: 32
서열 유형: 핵산
본쇄형: 일본쇄
위상: 선형
분자 유형: 기타 DNA
서열 기술
GAGGTCAGAC CGGTGGTATC AAGGGTTAAT GC 32
서열 5
서열 길이: 51
서열 유형: 핵산
본쇄형: 일본쇄
위상: 선형
분자 유형: 기타 DNA
서열 기술
GGTATCAAGG GTTAATGCCA CGCTCACTTC GATCGTGGTG ATTAAGTCTA C51
서열 6
서열 길이: 51
서열 유형: 핵산
본쇄형: 일본쇄
위상: 선형
분자 유형: 기타 DNA
서열 기술
GGTATCAAGG GTTAATGCCA CGCTCACTTC AACCGTGGTG ATTAAGTCTA C51
서열 7
서열 길이: 30
서열 유형: 핵산
본쇄형: 일본쇄
위상: 선형
분자 유형: 기타 DNA
서열 기술
TGCAGTATAT TCAGGCTGTG CAAAGTGAGC 30

Claims (6)

  1. 아스파르토키나제 III의 318번 메티오닌 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되고 323번 글라이신 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 돌연변이, 325번 루이신 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되고 347번 발린 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 돌연변이, 323번 글라이신 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되고 347번 발린 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 돌연변이, 325번 루이신 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되고 345번 세린 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 돌연변이, 323번 글라이신 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되고 358번 세린 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 돌연변이, 344번 트레오닌 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 돌연변이, 250번 글루탐산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 돌연변이, 346번 글루탐산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되고 347번 루이신 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 돌연변이, 250번 글루탐산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되고 364번 트레오닌 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 돌연변이, 202번 아스파르트산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되고 321번 세린 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 돌연변이, 283번 아르기닌 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되고 333번 알라닌 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되며 338번 세린 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되고 346번 글루탐산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되고 414번 아스파라긴 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 돌연변이 또는 318번 메티오닌 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되고 321번 세린 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되며 328번 발린 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되고 349번 발린 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되고, 405번 글루탐산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 돌연변이인, 에스케리키아 속에 속하는 세균의 아스파르토키나제 III의 라이신에 의한 피이드백 억제(feedback inhibition)가 해제되는 돌연변이를 암호화 영역내에 갖는, 에스케리키아 속에 속하는 세균의 아스파르토키나제 III를 암호화하는 DNA.
  2. 제1항에 있어서, 돌연변이가 아스파르토키나제 III의 318번 메티오닌 잔기가 이소루이신 잔기로 치환되고 323번 글라이신 잔기가 아스파르트산 잔기로 치환된 돌연변이, 325번 루이신 잔기가 페닐알라닌 잔기로 치환되고 347번 발린 잔기가 메티오닌 잔기로 치환된 돌연변이, 323번 글라이신 잔기가 아스파르트산 잔기로 치환되고 347번 발린 잔기가 메티오닌 잔기로 치환된 돌연변이, 325번 루이신 잔기가 페닐알라닌 잔기로 치환되고 345번 세린 잔기가 루이신 잔기로 치환된 돌연변이, 323번 글라이신 잔기가 아스파르트산 잔기로 치환되고 358번 세린 잔기가 루이신 잔기로 치환된 돌연변이, 344번 트레오닌 잔기가 메티오닌 잔기로 치환된 돌연변이, 250번 글루탐산 잔기가 라이신 잔기로 치환된 돌연변이, 346번 글루탐산 잔기가 라이신 잔기로 치환되고 347번 루이신 잔기가 페닐알아닌 잔기로 치환된 돌연변이, 250번 글루탐산 잔기가 라이신 잔기로 치환되고 364번 트레오닌 잔기가 메티오닌 잔기로 치환된 돌연변이, 202번 아스파르트산 잔기가 글라이신 잔기로 치환되고 321번 세린 잔기가 프롤린 잔기로 치환된 돌연변이, 283번 아르기닌 잔기가 세린 잔기로 치환되고 333번 알라닌 잔기가 트레오닌 잔기로 치환되며 338번 세린 잔기가 트레오닌 잔기로 치환되고 346번 글루탐산 잔기가 아스파르트산 잔기로 치환되고, 414번 아스파라긴 잔기가 세린 잔기로 치환된 돌연변이 또는 318번 메티오닌 잔기가 라이신 잔기로 치환되고 321번 세린 잔기가 프롤린 잔기로 치환되며 328번 발린 잔기가 페닐알라닌 잔기로 치환되고 349번 발린 잔기가 글라이신 잔기로 치환되고 405번 글루탐산 잔기가 발린 잔기로 치환된 DNA.
  3. 제1항에 따른 DNA를 에스케리키아 속의 세균 세포내에서 자가 복제할 수 있는 벡터 DNA와 연결시킴에 의해 제조된 재조합 DNA.
  4. 제1항에 따른 DNA를 지닌 에스케리키아 속의 미생물.
  5. L-아미노산을 생성할 수 있는 능력을 갖는 제4항에 따른 미생물을 발효 배지내에서 배양하는 단계, 상기 배양 배지중에서 L-아미노산을 생산 및 축적시키는 단계 및 배양물로부터 L-아미노산을 수집하는 단계를 포함하는, L-아미노산의 생산 방법.
  6. 제5항에 있어서, L-아미노산이 L-라이신 또는 L-트레오닌인 방법.
KR1019970052674A 1996-10-15 1997-10-15 L-라이신에의한피이드백억제가해제된에스케리키아속세균의아스파르토키나제iii를암호화하는dna,당해dna를지닌미생물및당해미생물을이용한l-아미노산의생산방법 KR100430168B1 (ko)

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