JP2002209596A - Ｌ−アミノ酸の製造法 - Google Patents
Ｌ−アミノ酸の製造法Info
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- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/185—Escherichia
- C12R2001/19—Escherichia coli
Abstract
(57)【要約】
【課題】 エシェリヒア属細菌におけるＬ−アミノ酸生
成効率を向上させる。 【解決手段】 Ｌ−アミノ酸生産能を有するエシェリヒ
ア属細菌をフルクトースを主要な炭素源として含む培
地、好ましくは３０重量％以上のフルクトースと、７０
重量％以下のグルコースからなる炭素源を含む培地で培
養し、Ｌ−アミノ酸を該培地中に生成蓄積させ、該培地
よりＬ−アミノ酸を採取する。
成効率を向上させる。 【解決手段】 Ｌ−アミノ酸生産能を有するエシェリヒ
ア属細菌をフルクトースを主要な炭素源として含む培
地、好ましくは３０重量％以上のフルクトースと、７０
重量％以下のグルコースからなる炭素源を含む培地で培
養し、Ｌ−アミノ酸を該培地中に生成蓄積させ、該培地
よりＬ−アミノ酸を採取する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、発酵法によるＬ−
アミノ酸の製造法に関する。Ｌ−アミノ酸は、医薬の原
料、調味料、飼料等として広く用いられている。
アミノ酸の製造法に関する。Ｌ−アミノ酸は、医薬の原
料、調味料、飼料等として広く用いられている。
【０００２】
【従来の技術】従来、Ｌ−アミノ酸は、ブレビバクテリ
ウム属やコリネバクテリウム属に属するコリネ型細菌を
用いて発酵法により工業生産されている。また、近年で
は、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌を用い
たＬ−アミノ酸の製造法も開発されている。また、遺伝
子組換え技術により、Ｌ−アミノ酸の生産能を増加させ
る種々の技術が開示されている（特開昭５７−７１３９
７号、米国特許４３７１６１４号）。
ウム属やコリネバクテリウム属に属するコリネ型細菌を
用いて発酵法により工業生産されている。また、近年で
は、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌を用い
たＬ−アミノ酸の製造法も開発されている。また、遺伝
子組換え技術により、Ｌ−アミノ酸の生産能を増加させ
る種々の技術が開示されている（特開昭５７−７１３９
７号、米国特許４３７１６１４号）。
【０００３】ところで、タンパク質の大量発現を行う際
に、炭素源としてフルクトースを用いると酢酸の生成が
低減して菌体収率が上昇することが報告されている（Bi
otechnol. Prog., 15, 140-145 (1999))。しかし、フル
クトースとＬ−アミノ酸生産との関係については知られ
ていない。
に、炭素源としてフルクトースを用いると酢酸の生成が
低減して菌体収率が上昇することが報告されている（Bi
otechnol. Prog., 15, 140-145 (1999))。しかし、フル
クトースとＬ−アミノ酸生産との関係については知られ
ていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】上述のように、微生物
の育種や製造法の改良により、Ｌ−アミノ酸の生産性は
かなり高まってはいるが、今後の需要の一層の増大に応
えるためには、さらに安価かつ効率的なＬ−アミノ酸の
製造法の開発が求められている。
の育種や製造法の改良により、Ｌ−アミノ酸の生産性は
かなり高まってはいるが、今後の需要の一層の増大に応
えるためには、さらに安価かつ効率的なＬ−アミノ酸の
製造法の開発が求められている。
【０００５】本発明は、エシェリヒア属細菌におけるＬ
−アミノ酸の生成効率を向上させる技術を提供すること
を課題とする。
−アミノ酸の生成効率を向上させる技術を提供すること
を課題とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意研究を行った結果、エシェリヒア
属細菌の培養に用いる培地の炭素源としてフルクトース
を用いると、Ｌ−アミノ酸生産能が向上することを見出
し、本発明を完成するに至った。
を解決するために鋭意研究を行った結果、エシェリヒア
属細菌の培養に用いる培地の炭素源としてフルクトース
を用いると、Ｌ−アミノ酸生産能が向上することを見出
し、本発明を完成するに至った。
【０００７】すなわち本発明は、以下のとおりである （１）Ｌ−アミノ酸生産能を有するエシェリヒア属細菌
をフルクトースを主要な炭素源として含む培地で培養
し、Ｌ−アミノ酸を該培地中に生成蓄積させ、該培地よ
りＬ−アミノ酸を採取するＬ−アミノ酸の製造法。 （２）前記培地は、炭素源全量に対し３０重量％以上の
フルクトースを含む(1)のＬ−アミノ酸の製造法。 （３）前記培地は、炭素源全量に対し３０重量％以上、
９５重量％以下のフルクトースを含む(1)のＬ−アミノ
酸の製造法。 （４）前記培地は、炭素源全量に対し３０重量％以上の
フルクトースと、７０重量％以下のグルコースを含む
(1)のＬ−アミノ酸の製造法。 （５）エシェリヒア属細菌がエシェリヒア・コリである
(1)〜(4)のいずれかのＬ−アミノ酸の製造法。 （６）前記Ｌ−アミノ酸がＬ−トリプトファンである
(1)〜(5)のいずれかのＬ−アミノ酸の製造法。
をフルクトースを主要な炭素源として含む培地で培養
し、Ｌ−アミノ酸を該培地中に生成蓄積させ、該培地よ
りＬ−アミノ酸を採取するＬ−アミノ酸の製造法。 （２）前記培地は、炭素源全量に対し３０重量％以上の
フルクトースを含む(1)のＬ−アミノ酸の製造法。 （３）前記培地は、炭素源全量に対し３０重量％以上、
９５重量％以下のフルクトースを含む(1)のＬ−アミノ
酸の製造法。 （４）前記培地は、炭素源全量に対し３０重量％以上の
フルクトースと、７０重量％以下のグルコースを含む
(1)のＬ−アミノ酸の製造法。 （５）エシェリヒア属細菌がエシェリヒア・コリである
(1)〜(4)のいずれかのＬ−アミノ酸の製造法。 （６）前記Ｌ−アミノ酸がＬ−トリプトファンである
(1)〜(5)のいずれかのＬ−アミノ酸の製造法。
【０００８】なお、本明細書において「Ｌ−アミノ酸生
産能」とは、エシェリヒア属細菌を培地に培養したとき
に、培地中に有意な量のＬ−アミノ酸を蓄積する能力、
又は菌体中のＬ−アミノ酸含量を増加させる能力をい
う。本発明において、Ｌ−アミノ酸としては、Ｌ−トリ
プトファン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−リジン、Ｌ−
スレオニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイ
シン、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−グルタミン酸等が挙げられ
る。
産能」とは、エシェリヒア属細菌を培地に培養したとき
に、培地中に有意な量のＬ−アミノ酸を蓄積する能力、
又は菌体中のＬ−アミノ酸含量を増加させる能力をい
う。本発明において、Ｌ−アミノ酸としては、Ｌ−トリ
プトファン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−リジン、Ｌ−
スレオニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイ
シン、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−グルタミン酸等が挙げられ
る。
【０００９】
【発明の実施の形態】本発明に用いる細菌は、エシェリ
ヒア属細菌であって、かつ、Ｌ−アミノ酸生産能を有す
るものであれば特に制限されない。エシェリヒア属細菌
として具体的には、ナイトハルトらの著書（Neidhardt,
F.C. et.al.,Escherichia coli and Salmonella Typhim
urium,American Society for Microbiology,Washington
D.C.,1208, table 1）に挙げられるもの、及びそれら
の細菌に由来する誘導体が挙げられる。
ヒア属細菌であって、かつ、Ｌ−アミノ酸生産能を有す
るものであれば特に制限されない。エシェリヒア属細菌
として具体的には、ナイトハルトらの著書（Neidhardt,
F.C. et.al.,Escherichia coli and Salmonella Typhim
urium,American Society for Microbiology,Washington
D.C.,1208, table 1）に挙げられるもの、及びそれら
の細菌に由来する誘導体が挙げられる。
【００１０】Ｌ−アミノ酸生産能を有するエシェリヒア
・コリは、変異株であっても、遺伝子組換え株であって
もよい。変異株としては、Ｌ−アミノ酸の生合成に関与
する酵素の細胞内の活性が上昇するような変異、具体的
には酵素の発現量が上昇する変異、又はフィードバック
阻害が解除される変異を有する変異株が挙げられる。ま
た、遺伝子組換え株としては、Ｌ−アミノ酸の生合成に
関与する酵素をコードする遺伝子のコピー数が高められ
た株、該遺伝子の発現量が上昇するように発現調節配列
が改変された株、又はフィードバック阻害が解除された
酵素をコードする遺伝子が導入された株等が挙げられ
る。
・コリは、変異株であっても、遺伝子組換え株であって
もよい。変異株としては、Ｌ−アミノ酸の生合成に関与
する酵素の細胞内の活性が上昇するような変異、具体的
には酵素の発現量が上昇する変異、又はフィードバック
阻害が解除される変異を有する変異株が挙げられる。ま
た、遺伝子組換え株としては、Ｌ−アミノ酸の生合成に
関与する酵素をコードする遺伝子のコピー数が高められ
た株、該遺伝子の発現量が上昇するように発現調節配列
が改変された株、又はフィードバック阻害が解除された
酵素をコードする遺伝子が導入された株等が挙げられ
る。
【００１１】変異株は、紫外線照射またはN−メチル−
N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜
硝酸等の通常変異処理に用いられている変異剤によっ
て、エシェリヒア属細菌野生株又はその誘導体を処理す
ることによって、得ることができる。
N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜
硝酸等の通常変異処理に用いられている変異剤によっ
て、エシェリヒア属細菌野生株又はその誘導体を処理す
ることによって、得ることができる。
【００１２】遺伝子のコピー数を高めるには、目的遺伝
子とエシェリヒア属細菌で機能するベクターを連結して
組換えＤＮＡを調製し、同組換えＤＮＡでエシェリヒア
属細菌を形質転換すればよい。また、形質転換は、D.A.
Morrisonの方法（Methods inEnzymology, 68, 326, 197
9）あるいは受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤ
ＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M. and Higa,A.,J.Mo
l.,Biol.,53,159(1970)）等により行うことができる。
前記ベクターとしては、pUC19、pUC18、pUC118、pUC11
9、pBR322、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、RSF
1010、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218、pSTV28、pSTV
29等が挙げられ、その他ファージベクターも使用するこ
とができる。
子とエシェリヒア属細菌で機能するベクターを連結して
組換えＤＮＡを調製し、同組換えＤＮＡでエシェリヒア
属細菌を形質転換すればよい。また、形質転換は、D.A.
Morrisonの方法（Methods inEnzymology, 68, 326, 197
9）あるいは受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤ
ＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M. and Higa,A.,J.Mo
l.,Biol.,53,159(1970)）等により行うことができる。
前記ベクターとしては、pUC19、pUC18、pUC118、pUC11
9、pBR322、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、RSF
1010、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218、pSTV28、pSTV
29等が挙げられ、その他ファージベクターも使用するこ
とができる。
【００１３】遺伝子のコピー数を高めることは、目的遺
伝子をエシェリヒア属細菌の染色体ＤＮＡ上に多コピー
存在させることによっても達成できる。エシェリヒア属
細菌の染色体ＤＮＡ上に目的遺伝子を多コピーで導入す
るには、染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列を標的
に利用して相同組換えにより行う。染色体ＤＮＡ上に多
コピー存在する配列としては、レペティティブＤＮＡ、
転移因子の端部に存在するインバーティッド・リピート
が利用できる。あるいは、特開平2-109985号公報に開示
されているように、目的遺伝子をトランスポゾンに搭載
してこれを転移させて染色体ＤＮＡ上に多コピー導入す
ることも可能である。
伝子をエシェリヒア属細菌の染色体ＤＮＡ上に多コピー
存在させることによっても達成できる。エシェリヒア属
細菌の染色体ＤＮＡ上に目的遺伝子を多コピーで導入す
るには、染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列を標的
に利用して相同組換えにより行う。染色体ＤＮＡ上に多
コピー存在する配列としては、レペティティブＤＮＡ、
転移因子の端部に存在するインバーティッド・リピート
が利用できる。あるいは、特開平2-109985号公報に開示
されているように、目的遺伝子をトランスポゾンに搭載
してこれを転移させて染色体ＤＮＡ上に多コピー導入す
ることも可能である。
【００１４】目的酵素の活性を上昇させるには、目的酵
素をコードする遺伝子のプロモーター等の発現調節配列
を強力なものに置換することによっても達成される（特
開平1-215280号公報参照）。たとえば、lacプロモータ
ー、trpプロモーター、trcプロモーター、tacプロモー
ター、ラムダファージのPRプロモーター、PLプロモータ
ー、tetプロモーター、amyEプロモーター等が強力なプ
ロモーターとして知られている。
素をコードする遺伝子のプロモーター等の発現調節配列
を強力なものに置換することによっても達成される（特
開平1-215280号公報参照）。たとえば、lacプロモータ
ー、trpプロモーター、trcプロモーター、tacプロモー
ター、ラムダファージのPRプロモーター、PLプロモータ
ー、tetプロモーター、amyEプロモーター等が強力なプ
ロモーターとして知られている。
【００１５】以下に、エシェリヒア属に属するＬ−アミ
ノ酸生産菌としてＬ−トリプトファン生産菌について、
育種法及び具体的な菌株を例示する。Ｌ−トリプトファ
ンの生合成に関与する酵素としては、Ｌ−トリプトファ
ン生合成系３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロン酸
−７−リン酸合成酵素（特開平5-236947号公報参照）、
トランスケトラーゼ（米国特許第5,906,925号）、アン
トラニル酸合成酵素（WO94/08031号（特表平7-507693
号））、ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（WO94/0
8031号）等が挙げられる。これらの酵素のうち、アント
ラニル酸合成酵素はＬ−トリプトファンにより、ホスホ
グリセレートデヒドロゲナーゼはＬ−セリンにより、そ
れぞれフィードバック阻害を受けることが知られてい
る。
ノ酸生産菌としてＬ−トリプトファン生産菌について、
育種法及び具体的な菌株を例示する。Ｌ−トリプトファ
ンの生合成に関与する酵素としては、Ｌ−トリプトファ
ン生合成系３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロン酸
−７−リン酸合成酵素（特開平5-236947号公報参照）、
トランスケトラーゼ（米国特許第5,906,925号）、アン
トラニル酸合成酵素（WO94/08031号（特表平7-507693
号））、ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（WO94/0
8031号）等が挙げられる。これらの酵素のうち、アント
ラニル酸合成酵素はＬ−トリプトファンにより、ホスホ
グリセレートデヒドロゲナーゼはＬ−セリンにより、そ
れぞれフィードバック阻害を受けることが知られてい
る。
【００１６】本発明に用いるＬ−トリプトファン生産性
のエシェリヒア属細菌として好ましいものは、脱感作型
アントラニル酸合成酵素、脱感作型ホスホグリセレート
デヒドロゲナーゼ、又はこれらの両方を保持するエシェ
リヒア属細菌である。このような性質を有するエシェリ
ヒア属細菌は、例えば、アントラニル酸合成酵素遺伝子
（trpE）、及び／又はホスホグリセレートデヒドロゲナ
ーゼ遺伝子（serA）を、フィードバック阻害を受けない
ように変異させ、得られた変異型遺伝子をエシェリヒア
属性菌に導入することによって、取得することができ
る。このようなエシェリヒア属細菌としてより具体的に
は、脱感作型アントラニル酸合成酵素を保持するエシェ
リヒア・コリSV164に、脱感作型ホスホグリセレートデ
ヒドロゲナーゼをコードする変異型serAを持つプラスミ
ドpGH5（WO94/08031号参照）を導入することによって得
られる形質転換株が挙げられる。
のエシェリヒア属細菌として好ましいものは、脱感作型
アントラニル酸合成酵素、脱感作型ホスホグリセレート
デヒドロゲナーゼ、又はこれらの両方を保持するエシェ
リヒア属細菌である。このような性質を有するエシェリ
ヒア属細菌は、例えば、アントラニル酸合成酵素遺伝子
（trpE）、及び／又はホスホグリセレートデヒドロゲナ
ーゼ遺伝子（serA）を、フィードバック阻害を受けない
ように変異させ、得られた変異型遺伝子をエシェリヒア
属性菌に導入することによって、取得することができ
る。このようなエシェリヒア属細菌としてより具体的に
は、脱感作型アントラニル酸合成酵素を保持するエシェ
リヒア・コリSV164に、脱感作型ホスホグリセレートデ
ヒドロゲナーゼをコードする変異型serAを持つプラスミ
ドpGH5（WO94/08031号参照）を導入することによって得
られる形質転換株が挙げられる。
【００１７】また、トリプトファンオペロンを含む組換
えＤＮＡが導入されたエシェリヒア属細菌も、好適なＬ
−トリプトファン生産菌である。具体的には、脱感作型
アントラニル酸合成酵素をコードする遺伝子を含むトリ
プトファンオペロンが導入されたエシェリヒア・コリが
挙げられる（特開昭57-71397号、特開昭62-244382号、
米国特許第4,371,614）。
えＤＮＡが導入されたエシェリヒア属細菌も、好適なＬ
−トリプトファン生産菌である。具体的には、脱感作型
アントラニル酸合成酵素をコードする遺伝子を含むトリ
プトファンオペロンが導入されたエシェリヒア・コリが
挙げられる（特開昭57-71397号、特開昭62-244382号、
米国特許第4,371,614）。
【００１８】さらに、Ｌ−トリプトファン生産菌とし
て、Ｌ−フェニルアラニン及びＬ−チロシン要求性の形
質を有する菌株エシェリヒア・コリAGX17(pGX44)〔NRRL
B-12263〕、及びトリプトファンオペロンを含むプラス
ミドpGX50を保持するAGX6(pGX50)aroP〔NRRL B-12264〕
（いずれも米国特許第 4,371,614号参照）株が挙げられ
る。
て、Ｌ−フェニルアラニン及びＬ−チロシン要求性の形
質を有する菌株エシェリヒア・コリAGX17(pGX44)〔NRRL
B-12263〕、及びトリプトファンオペロンを含むプラス
ミドpGX50を保持するAGX6(pGX50)aroP〔NRRL B-12264〕
（いずれも米国特許第 4,371,614号参照）株が挙げられ
る。
【００１９】また、Ｌ−トリプトファン生産能を有する
エシェリヒア属細菌細胞内のホスホエノールピルビン酸
の生産能を上昇させることによって、Ｌ−トリプトファ
ン生産能を強化することができる（WO97/08333号）。
エシェリヒア属細菌細胞内のホスホエノールピルビン酸
の生産能を上昇させることによって、Ｌ−トリプトファ
ン生産能を強化することができる（WO97/08333号）。
【００２０】前記の各酵素遺伝子又はオペロンは、当業
者によく知られた通常の遺伝子の単離法にしたがって取
得することができる。例えば、既知の配列に基づいてプ
ライマーを合成し、エシェリヒア・コリＫ−１２株等の
エシェリヒア属細菌の染色体ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲ
を行うことにより、目的の遺伝子を取得することが可能
である。
者によく知られた通常の遺伝子の単離法にしたがって取
得することができる。例えば、既知の配列に基づいてプ
ライマーを合成し、エシェリヒア・コリＫ−１２株等の
エシェリヒア属細菌の染色体ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲ
を行うことにより、目的の遺伝子を取得することが可能
である。
【００２１】染色体ＤＮＡの調製、染色体ＤＮＡライブ
ラリーの作製、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、プラ
スミドＤＮＡの調製、ＤＮＡの切断及び連結、形質転
換、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの設定
等、遺伝子のクローニング法及び宿主への導入方法は、
当業者によく知られている通常の方法を採用することが
できる。これらの方法は、Sambrook, J., Fritsch, E.
F., and Maniatis, T.,"Molecular Cloning A Laborato
ry Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Lab
oratory Press, (1989)等に記載されている。
ラリーの作製、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、プラ
スミドＤＮＡの調製、ＤＮＡの切断及び連結、形質転
換、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの設定
等、遺伝子のクローニング法及び宿主への導入方法は、
当業者によく知られている通常の方法を採用することが
できる。これらの方法は、Sambrook, J., Fritsch, E.
F., and Maniatis, T.,"Molecular Cloning A Laborato
ry Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Lab
oratory Press, (1989)等に記載されている。
【００２２】次に、他のＬ−アミノ酸生産菌を以下に例
示する。Ｌ−フェニルアラニン生産菌としては、エシェ
リヒア・コリ AJ 12604（FERMBP-3579)(欧州特許出願公
開第 488,424号参照）が挙げられる。Ｌ−リジン生産性
のエシェリヒア属細菌としては、Ｌ−リジンアナログに
耐性を有する変異株が例示できる。このＬ−リジンアナ
ログは、エシェリヒア属細菌の増殖を阻害するようなも
のであるが、その抑制はＬ−リジンが培地中に共存すれ
ば、全体的または部分的に解除されるようなものであ
る。例えば、オキサリジン、リジンハイドロキサメー
ト、（Ｓ）−２−アミノエチル−Ｌ−システイン（ＡＥ
Ｃ）、γ−メチルリジン、α−クロロカプロラクタム等
がある。これらのリジンアナログに耐性を有する変異株
は、通常の人工変異操作をエシェリヒア属の微生物に施
すことにより得られる。Ｌ−リジン製造に用いる菌株と
して、具体的には、エシェリヒア・コリ ＡＪ１１４４
２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１５４３、ＮＲＲＬ Ｂ−１２１８
５；特開昭５６−１８５９６号及び米国特許第４３４６
１７０号参照）、エシェリヒア・コリ VL611が挙げられ
る。ＡＪ１１４４２株は、１９８１年５月１日に、通商
産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３
０５ 日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に、受
託番号 FERM P-5084として寄託されており、１９８７年
１０月２９日に、この原寄託からブダペスト条約に基づ
く国際寄託へ移管され、FERM BP-1543として寄託されて
いる。以上の微生物のアスパルトキナーゼは、Ｌ−リジ
ンによるフィードバック阻害が解除されている。
示する。Ｌ−フェニルアラニン生産菌としては、エシェ
リヒア・コリ AJ 12604（FERMBP-3579)(欧州特許出願公
開第 488,424号参照）が挙げられる。Ｌ−リジン生産性
のエシェリヒア属細菌としては、Ｌ−リジンアナログに
耐性を有する変異株が例示できる。このＬ−リジンアナ
ログは、エシェリヒア属細菌の増殖を阻害するようなも
のであるが、その抑制はＬ−リジンが培地中に共存すれ
ば、全体的または部分的に解除されるようなものであ
る。例えば、オキサリジン、リジンハイドロキサメー
ト、（Ｓ）−２−アミノエチル−Ｌ−システイン（ＡＥ
Ｃ）、γ−メチルリジン、α−クロロカプロラクタム等
がある。これらのリジンアナログに耐性を有する変異株
は、通常の人工変異操作をエシェリヒア属の微生物に施
すことにより得られる。Ｌ−リジン製造に用いる菌株と
して、具体的には、エシェリヒア・コリ ＡＪ１１４４
２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１５４３、ＮＲＲＬ Ｂ−１２１８
５；特開昭５６−１８５９６号及び米国特許第４３４６
１７０号参照）、エシェリヒア・コリ VL611が挙げられ
る。ＡＪ１１４４２株は、１９８１年５月１日に、通商
産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３
０５ 日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に、受
託番号 FERM P-5084として寄託されており、１９８７年
１０月２９日に、この原寄託からブダペスト条約に基づ
く国際寄託へ移管され、FERM BP-1543として寄託されて
いる。以上の微生物のアスパルトキナーゼは、Ｌ−リジ
ンによるフィードバック阻害が解除されている。
【００２３】その他にも、たとえばＬ−スレオニン生産
菌が挙げられる。Ｌ−スレオニン生産菌も、一般的には
そのアスパルトキナーゼのＬ−リジンによる阻害が解除
されているからである。エシェリヒア・コリのＬ−スレ
オニン生産菌としては、エシェリヒア・コリ MG442（Gu
syatiner et al., Genetika(in Russian), 14, 947-956
(1978)参照）が挙げられる。
菌が挙げられる。Ｌ−スレオニン生産菌も、一般的には
そのアスパルトキナーゼのＬ−リジンによる阻害が解除
されているからである。エシェリヒア・コリのＬ−スレ
オニン生産菌としては、エシェリヒア・コリ MG442（Gu
syatiner et al., Genetika(in Russian), 14, 947-956
(1978)参照）が挙げられる。
【００２４】上記のＬ−リジン生産菌において、Ｌ−リ
ジン生合成系酵素遺伝子を強化してもよい。そのような
遺伝子としては、例えば、アスパラギン酸によるフィー
ドバック阻害を解除する変異を有するホスホエノールピ
ルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子（特公平
７−８３７１４号公報参照）が挙げられる。Ｌ−バリン
生産性のエシェリヒア属細菌として具体的には、エシェ
リヒア・コリ VL1970（VKPM B-4411）(欧州特許出願公
開第519,113号参照）が挙げられる。その他にも、制御
機構が実質的に解除されたＬ−バリン生合成系遺伝子を
保持するエシェリヒア属細菌が挙げられる。このような
エシェリヒア属細菌は、例えば、ｉｌｖＧＭＥＤＡオペ
ロン、好ましくはスレオニンデアミナーゼ活性を発現せ
ず、アテニュエーションが解除されたｉｌｖＧＭＥＤＡ
オペロンをエシェリヒア属細菌に導入することによって
得られる（特開平８−４７３９７号公報参照）。
ジン生合成系酵素遺伝子を強化してもよい。そのような
遺伝子としては、例えば、アスパラギン酸によるフィー
ドバック阻害を解除する変異を有するホスホエノールピ
ルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子（特公平
７−８３７１４号公報参照）が挙げられる。Ｌ−バリン
生産性のエシェリヒア属細菌として具体的には、エシェ
リヒア・コリ VL1970（VKPM B-4411）(欧州特許出願公
開第519,113号参照）が挙げられる。その他にも、制御
機構が実質的に解除されたＬ−バリン生合成系遺伝子を
保持するエシェリヒア属細菌が挙げられる。このような
エシェリヒア属細菌は、例えば、ｉｌｖＧＭＥＤＡオペ
ロン、好ましくはスレオニンデアミナーゼ活性を発現せ
ず、アテニュエーションが解除されたｉｌｖＧＭＥＤＡ
オペロンをエシェリヒア属細菌に導入することによって
得られる（特開平８−４７３９７号公報参照）。
【００２５】ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンの全塩基配列は
明らかにされている（Nucleic Acids Res. 15, 2137 (1
987)）ので、この配列に基づいて調製したオリゴヌクレ
オチドを用いたコロニーハイブリダイゼーション又はＰ
ＣＲにより、エシェリヒア・コリ染色体ＤＮＡから取得
することができる。ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを含むＤ
ＮＡ断片のエシェリヒア・コリへの導入は、前述のプラ
スミド、ファージ、トランスポゾンを用いた方法によっ
て行うことができる。
明らかにされている（Nucleic Acids Res. 15, 2137 (1
987)）ので、この配列に基づいて調製したオリゴヌクレ
オチドを用いたコロニーハイブリダイゼーション又はＰ
ＣＲにより、エシェリヒア・コリ染色体ＤＮＡから取得
することができる。ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを含むＤ
ＮＡ断片のエシェリヒア・コリへの導入は、前述のプラ
スミド、ファージ、トランスポゾンを用いた方法によっ
て行うことができる。
【００２６】Ｌ−ロイシン生産性のエシェリヒア属細菌
としては、β−２−チエニルアラニン耐性を有する菌
株、β−２−チエニルアラニン耐性及びβ−ヒドロキシ
ロイシン耐性を有する菌株（以上、特公昭62-34397号公
報）、４−アザロイシン耐性又は５，５，５−トリフル
オロロイシン耐性を有する菌株（特開平8-70879号公
報）が挙げられる。
としては、β−２−チエニルアラニン耐性を有する菌
株、β−２−チエニルアラニン耐性及びβ−ヒドロキシ
ロイシン耐性を有する菌株（以上、特公昭62-34397号公
報）、４−アザロイシン耐性又は５，５，５−トリフル
オロロイシン耐性を有する菌株（特開平8-70879号公
報）が挙げられる。
【００２７】Ｌ−イソロイシン生産性のエシェリヒア属
細菌としては、エシェリヒア・コリKX141（VKPM B-478
1）(欧州特許出願公開第519,113号参照）が挙げられ
る。
細菌としては、エシェリヒア・コリKX141（VKPM B-478
1）(欧州特許出願公開第519,113号参照）が挙げられ
る。
【００２８】Ｌ−スレオニン生産性のエシェリヒア属細
菌としては、エシェリヒア・コリ VKPM B-3996(RIA 186
7)(米国特許第5,175,107号参照）、MG442株が挙げられ
る。
菌としては、エシェリヒア・コリ VKPM B-3996(RIA 186
7)(米国特許第5,175,107号参照）、MG442株が挙げられ
る。
【００２９】Ｌ−ホモセリン生産性のエシェリヒア属細
菌としては、C600株（Appleyard R.K., Genetics, 39,
440-452 (1954)参照）のLeu+復帰変異株であるNZ10株が
挙げられる。
菌としては、C600株（Appleyard R.K., Genetics, 39,
440-452 (1954)参照）のLeu+復帰変異株であるNZ10株が
挙げられる。
【００３０】Ｌ−グルタミン酸生産性のエシェリヒア属
細菌としては、Ｌ−バリン耐性株、例えば、エシェリヒ
ア・コリＢ１１、エシェリヒア・コリＫ−１２（ＡＴＣ
Ｃ１０７９８）、エシェリヒア・コリＢ（ＡＴＣＣ１１
３０３）、エシェリヒア・コリＷ（ＡＴＣＣ９６３７）
が挙げられる。
細菌としては、Ｌ−バリン耐性株、例えば、エシェリヒ
ア・コリＢ１１、エシェリヒア・コリＫ−１２（ＡＴＣ
Ｃ１０７９８）、エシェリヒア・コリＢ（ＡＴＣＣ１１
３０３）、エシェリヒア・コリＷ（ＡＴＣＣ９６３７）
が挙げられる。
【００３１】本発明においては、Ｌ−アミノ酸生産能を
有するエシェリヒア属細菌を培養する際に、フルクトー
スを主要な炭素源として含む培地を用いる。フルクトー
スを主要な炭素源として用いることにより、Ｌ−アミノ
酸の対糖収率及び生産速度が向上する。
有するエシェリヒア属細菌を培養する際に、フルクトー
スを主要な炭素源として含む培地を用いる。フルクトー
スを主要な炭素源として用いることにより、Ｌ−アミノ
酸の対糖収率及び生産速度が向上する。
【００３２】炭素源としては、実質的にフルクトースの
みであってもよいし、フルクトース以外の他の炭素源を
含んでいていてもよい。フルクトースの含量は、炭素源
全量に対して３０重量％以上であることが好ましく、３
０〜７０重量％がより好ましく、約５０％付近が特に好
ましい。他の炭素源としては、グルコース、シュークロ
ース、マルトース等が挙げられる。これらのうちで好ま
しいものはグルコースである。本発明に用いる炭素源と
して具体的には、３０重量％以上のフルクトースと、７
０重量％以下のグルコースからなる混合物が挙げられ
る。
みであってもよいし、フルクトース以外の他の炭素源を
含んでいていてもよい。フルクトースの含量は、炭素源
全量に対して３０重量％以上であることが好ましく、３
０〜７０重量％がより好ましく、約５０％付近が特に好
ましい。他の炭素源としては、グルコース、シュークロ
ース、マルトース等が挙げられる。これらのうちで好ま
しいものはグルコースである。本発明に用いる炭素源と
して具体的には、３０重量％以上のフルクトースと、７
０重量％以下のグルコースからなる混合物が挙げられ
る。
【００３３】炭素源以外の培地成分は、窒素源、無機イ
オン、及び必要に応じ使用する有機微量栄養素等、通常
の培地成分である。窒素源としては、硫酸アンモニウ
ム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機ア
ンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモ
ニアガス、アンモニア水等を用いることができる。
オン、及び必要に応じ使用する有機微量栄養素等、通常
の培地成分である。窒素源としては、硫酸アンモニウ
ム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機ア
ンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモ
ニアガス、アンモニア水等を用いることができる。
【００３４】無機イオンとしては、リン酸カリウム、硫
酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添
加される。有機微量栄養素としては、ビタミンＢ1など
の要求物質または酵母エキス等を必要に応じ適量含有さ
せることが望ましい。
酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添
加される。有機微量栄養素としては、ビタミンＢ1など
の要求物質または酵母エキス等を必要に応じ適量含有さ
せることが望ましい。
【００３５】培養は、用いる菌株に応じた条件で行えば
よいが、具体的には、好気的条件下で１６〜７２時間実
施するのがよく、培養温度は３０℃〜４５℃に、培養中
ｐＨは５〜７に制御する。尚、ｐＨ調整には無機あるい
は有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニア
ガス等を使用することができる。
よいが、具体的には、好気的条件下で１６〜７２時間実
施するのがよく、培養温度は３０℃〜４５℃に、培養中
ｐＨは５〜７に制御する。尚、ｐＨ調整には無機あるい
は有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニア
ガス等を使用することができる。
【００３６】発酵液からのＬ−アミノ酸の採取は、Ｌ−
アミノ酸の種類に応じて、イオン交換樹脂法、沈澱法そ
の他の公知の方法を適宜組み合わせることにより実施で
きる。
アミノ酸の種類に応じて、イオン交換樹脂法、沈澱法そ
の他の公知の方法を適宜組み合わせることにより実施で
きる。
【００３７】
【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明する。
説明する。
【００３８】＜１＞エシェリヒア・コリのＬ−トリプト
ファン生産菌の構築 WO94/08031号（特表平7-507693号）の記載内容に従い、
trpE欠損株エシェリヒア・コリKB862（DSM7196）に、フ
ィードバック阻害が解除されたアントラニル酸合成酵素
（以下、阻害解除型ASともいう）をコードする変異遺伝
子を導入し、エシェリヒア・コリSV164(trpE8)を得た。
このSV164株に、フィードバック阻害が解除されたホス
ホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（以下、変異型PGDと
もいう）をコードする遺伝子を含むプラスミドpGH5（WO
94/08031号に記載）を導入した。SV164/pGH5は、トリプ
トファン及びセリン生産能を有する。エシェリヒア・コ
リKB862は、AJ13828と命名され、２０００年１２月２１
日に、工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号30
5-8566 日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に国
際寄託され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７４０５が付与
されている。
ファン生産菌の構築 WO94/08031号（特表平7-507693号）の記載内容に従い、
trpE欠損株エシェリヒア・コリKB862（DSM7196）に、フ
ィードバック阻害が解除されたアントラニル酸合成酵素
（以下、阻害解除型ASともいう）をコードする変異遺伝
子を導入し、エシェリヒア・コリSV164(trpE8)を得た。
このSV164株に、フィードバック阻害が解除されたホス
ホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（以下、変異型PGDと
もいう）をコードする遺伝子を含むプラスミドpGH5（WO
94/08031号に記載）を導入した。SV164/pGH5は、トリプ
トファン及びセリン生産能を有する。エシェリヒア・コ
リKB862は、AJ13828と命名され、２０００年１２月２１
日に、工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号30
5-8566 日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に国
際寄託され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７４０５が付与
されている。
【００３９】以下、SV164/pGH5の構築法を説明する。 （１）阻害解除型ASをコードする変異遺伝子のスクリー
ニングおよび染色体中への同変異遺伝子の組み込み トリプトファンアナログである５−メチルトリプトファ
ンを使用して、阻害解除型ASを保持する変異株をスクリ
ーニングした。E.coli K12 YMC9（ATCC33927）を、ミラ
ーの方法（Miller J.H.,1972,Experiments in Molecula
r Genetics,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spri
ng Harbor,N.Y.:125−129）により、Ｎ−メチル−Ｎ′
−ニトローＮ−ニトロソーグアニジン（NG）で変異処理
した。すなわち、YMC9の細胞約２×1O9個を、NG 50μg/
mlを含む0.1 Mクエン酸ナトリウム緩衝液(pH5.5)4ml中
で、37℃で30分間インキュベートした。0.1M リン酸ナ
トリウム緩衝液(pH7.0)で２回洗浄した後、細胞0.1mlを
37℃一晩で振盪しLB中で培養した。続いて、培養液をNa
Cl 0.9％で10-3、10-4、10-5となるように希釈し、希釈
液0.1mlを５−メチルトリプトファン100μg/mlを含む最
少培地プレート上に塗布した。最少培地の組成は、グル
コース5g/l、ビタミンB1 5mg/l、KH2PO4 3g/l、KH2PO4
12g/l、MgSO4・7H2O 0.3g/l、NaCl 0.1g/l、(NH4)2SO4 5
g/l、CaCl2・2H2O 14.7mg/l、FeSO4・7H2O 2mg/l, Na3ク
エン酸塩1g/lおよび寒天15g/lである。
ニングおよび染色体中への同変異遺伝子の組み込み トリプトファンアナログである５−メチルトリプトファ
ンを使用して、阻害解除型ASを保持する変異株をスクリ
ーニングした。E.coli K12 YMC9（ATCC33927）を、ミラ
ーの方法（Miller J.H.,1972,Experiments in Molecula
r Genetics,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spri
ng Harbor,N.Y.:125−129）により、Ｎ−メチル−Ｎ′
−ニトローＮ−ニトロソーグアニジン（NG）で変異処理
した。すなわち、YMC9の細胞約２×1O9個を、NG 50μg/
mlを含む0.1 Mクエン酸ナトリウム緩衝液(pH5.5)4ml中
で、37℃で30分間インキュベートした。0.1M リン酸ナ
トリウム緩衝液(pH7.0)で２回洗浄した後、細胞0.1mlを
37℃一晩で振盪しLB中で培養した。続いて、培養液をNa
Cl 0.9％で10-3、10-4、10-5となるように希釈し、希釈
液0.1mlを５−メチルトリプトファン100μg/mlを含む最
少培地プレート上に塗布した。最少培地の組成は、グル
コース5g/l、ビタミンB1 5mg/l、KH2PO4 3g/l、KH2PO4
12g/l、MgSO4・7H2O 0.3g/l、NaCl 0.1g/l、(NH4)2SO4 5
g/l、CaCl2・2H2O 14.7mg/l、FeSO4・7H2O 2mg/l, Na3ク
エン酸塩1g/lおよび寒天15g/lである。
【００４０】37℃で24〜48時間後、５−メチルトリプト
ファン耐性のクローンを、上記寒天培地上の播種した。
得られた変異株の性質を調べるために、ＡＳのＬ−トリ
プトファンに対するKi値を測定した（Bauerle R. et a
l., 1987, Methods in Enzymology Vol.142:366-38
6）。その結果、変異株は２つのクラスに分類すること
ができた。クラス１の変異株は、フィードバック耐性の
アントラニル酸合成酵素を有していた。クラス２の変異
株は、Ki値は変わらないが高活性のアントラニル酸合成
酵素活性を有していた。これらの変異株のＡＳ遺伝子を
クローン化し、塩基配列を決定した。各変異株の染色体
DNAを単離し、制限酵素NheIおよびClaIで切断し、約5kb
の大きさの断片を単離し、pBR322のNheI/ClaI断片（415
8bp）と連結させた。
ファン耐性のクローンを、上記寒天培地上の播種した。
得られた変異株の性質を調べるために、ＡＳのＬ−トリ
プトファンに対するKi値を測定した（Bauerle R. et a
l., 1987, Methods in Enzymology Vol.142:366-38
6）。その結果、変異株は２つのクラスに分類すること
ができた。クラス１の変異株は、フィードバック耐性の
アントラニル酸合成酵素を有していた。クラス２の変異
株は、Ki値は変わらないが高活性のアントラニル酸合成
酵素活性を有していた。これらの変異株のＡＳ遺伝子を
クローン化し、塩基配列を決定した。各変異株の染色体
DNAを単離し、制限酵素NheIおよびClaIで切断し、約5kb
の大きさの断片を単離し、pBR322のNheI/ClaI断片（415
8bp）と連結させた。
【００４１】連結反応物でE.coli KB 862（trpE）（DSM
7196）を形質転換した。Ｌ−トリプトファンを含まない
最少培地上で生育することができるクローンを選択し
た。trpE変異を相補するプラスミドは、全て5kbのNheI/
ClaI断片を含有していた。また、この5kbのNheI/ClaI断
片は、trpEおよびtrpDと、trpEの上流約0.8kb、及びtrp
Dの下流約1kbの配列を含んでいた。表１に、それぞれの
変異株が保持するプラスミド（pE0, pE5, pE6, pE8）に
コードされる変異ASのアミノ酸配列の相違、及びKi値を
示す。
7196）を形質転換した。Ｌ−トリプトファンを含まない
最少培地上で生育することができるクローンを選択し
た。trpE変異を相補するプラスミドは、全て5kbのNheI/
ClaI断片を含有していた。また、この5kbのNheI/ClaI断
片は、trpEおよびtrpDと、trpEの上流約0.8kb、及びtrp
Dの下流約1kbの配列を含んでいた。表１に、それぞれの
変異株が保持するプラスミド（pE0, pE5, pE6, pE8）に
コードされる変異ASのアミノ酸配列の相違、及びKi値を
示す。
【００４２】
【表１】 表１ ──────────────────────────────────── 酵素 アミノ酸配列 Ki/mM ──────────────────────────────────── 野生型trpE NPTA LFHQ LCGD RPAT LLLE SADI DSKD DLKS (配列番号1) 0.01 trpE0 -------------------------------------E- 0.1 trpE5 -S------------------------------------- 3.0 trpE6 -------------------------F-----------E- >15 tprE8 -S-----------------------------------E- 15 ────────────────────────────────────
【００４３】クラス２の変異酵素の配列解析により、変
異は、trpプロモーターのオペレーター領域内にも、trp
リーダーペプチドをコードするDNA領域内にも存在する
ことが示された。ΔtrpL1及びΔtrpL2と命名された変異
は、リーダーペプチドをコードするDNA領域内に、136bp
又は110bpの大きさの欠失を有していた。EMBLデータバ
ンクのアクセション番号V00372で登録されている配列
中、ΔtrpL1変異では、欠失は33〜168位の領域を含み、
ΔtrpL2変異では、11〜120位の領域を含んでいる。
異は、trpプロモーターのオペレーター領域内にも、trp
リーダーペプチドをコードするDNA領域内にも存在する
ことが示された。ΔtrpL1及びΔtrpL2と命名された変異
は、リーダーペプチドをコードするDNA領域内に、136bp
又は110bpの大きさの欠失を有していた。EMBLデータバ
ンクのアクセション番号V00372で登録されている配列
中、ΔtrpL1変異では、欠失は33〜168位の領域を含み、
ΔtrpL2変異では、11〜120位の領域を含んでいる。
【００４４】阻害解除型ASをコードする遺伝子を高発現
させるために、２つの変異体クラスを組み合わせた。ク
ラス２では、ΔtrpL1変異を使用した。プラスミドｐΔt
rpLからΔtrpL1の突然変異を有する1.6kbのNruI断片を
単離し、プラスミドpE0, pE5, pE6又はpE8の対応するNr
uI断片と置換した。得られたプラスミドをpIE0、pIE5、
pIE6又はpIE8と命名し、相同組換えによる染色体組込み
のために使用した。
させるために、２つの変異体クラスを組み合わせた。ク
ラス２では、ΔtrpL1変異を使用した。プラスミドｐΔt
rpLからΔtrpL1の突然変異を有する1.6kbのNruI断片を
単離し、プラスミドpE0, pE5, pE6又はpE8の対応するNr
uI断片と置換した。得られたプラスミドをpIE0、pIE5、
pIE6又はpIE8と命名し、相同組換えによる染色体組込み
のために使用した。
【００４５】各プラスミドからそれぞれ約5kbの大きさ
のNheI/ClaI断片を、低融点アガロースを用いて単離
し、直鎖状のままrecD株PD106［ΔtrpLD102］を形質転
換した。形質転換法として、Cohen et al., (1972) Pro
c.Nat1.Acad.Sci.USA, 69:2,110〜2114によるCaCl2法を
使用した。Ｌ−トリプトファンを含まない最少培地上で
生育することができ、かつアンピシリン感受性、すなわ
ちプラスミドを含まないクローンを選択した。各菌株か
ら、P1形質導入（Miller J.H., 1972, Experiments in
Molecular Genetics, Cold Spring Harbor, N.Y. :201
−205）により、阻害解除型ASをコードし、かつ、Δtrp
L1変異を併せ持つ変異型trpE遺伝子をKB862株中に転移
させ、トリプトファンを含まない最少培地で選択した。
得られた菌株を、PD103(trpE0)、KB862(trpE5)、SV164
(trpE8)およびSV163(trpE6)と命名した。
のNheI/ClaI断片を、低融点アガロースを用いて単離
し、直鎖状のままrecD株PD106［ΔtrpLD102］を形質転
換した。形質転換法として、Cohen et al., (1972) Pro
c.Nat1.Acad.Sci.USA, 69:2,110〜2114によるCaCl2法を
使用した。Ｌ−トリプトファンを含まない最少培地上で
生育することができ、かつアンピシリン感受性、すなわ
ちプラスミドを含まないクローンを選択した。各菌株か
ら、P1形質導入（Miller J.H., 1972, Experiments in
Molecular Genetics, Cold Spring Harbor, N.Y. :201
−205）により、阻害解除型ASをコードし、かつ、Δtrp
L1変異を併せ持つ変異型trpE遺伝子をKB862株中に転移
させ、トリプトファンを含まない最少培地で選択した。
得られた菌株を、PD103(trpE0)、KB862(trpE5)、SV164
(trpE8)およびSV163(trpE6)と命名した。
【００４６】（２）セリンに対して感受性を有するホス
ホグリセリン酸デヒドロゲナーゼを暗号解読するserA遺
伝子の製造。E.coli B株（ATCC 23226）から、PGDをコ
ードするserA遺伝子を、プラスミドベクターpUC18上に
クローン化した。B株を37℃で一晩、LB中で培養した。
細胞を遠心分離（4000g）で集め、Ausubel et al., 198
7, 2.4.1−2.4.2, Current Protocols in Molecular Bi
ology, Greene Publishing Associatesに記載された方
法により、染色体DNAを調製した。染色体DNA 10μgをSp
hIで切断した。消化物約3μgを、同様にSphI切断したプ
ラスミドpUC18 0.2μgと連結した。連結反応液で、serA
変異株PC1523（CGSC No.5411）（CGSC: E.coli Genetic
Stock Center, Department of Biology 255 OML,Yale
University,Postbox 6666,New Haven,CT,USA）を、前述
のCohenらの方法により形質転換した。
ホグリセリン酸デヒドロゲナーゼを暗号解読するserA遺
伝子の製造。E.coli B株（ATCC 23226）から、PGDをコ
ードするserA遺伝子を、プラスミドベクターpUC18上に
クローン化した。B株を37℃で一晩、LB中で培養した。
細胞を遠心分離（4000g）で集め、Ausubel et al., 198
7, 2.4.1−2.4.2, Current Protocols in Molecular Bi
ology, Greene Publishing Associatesに記載された方
法により、染色体DNAを調製した。染色体DNA 10μgをSp
hIで切断した。消化物約3μgを、同様にSphI切断したプ
ラスミドpUC18 0.2μgと連結した。連結反応液で、serA
変異株PC1523（CGSC No.5411）（CGSC: E.coli Genetic
Stock Center, Department of Biology 255 OML,Yale
University,Postbox 6666,New Haven,CT,USA）を、前述
のCohenらの方法により形質転換した。
【００４７】形質転換株をＬ−セリンを含まない最少培
地上に塗布した。生育したクロ一ンは、E. coliのserA
遺伝子を3.5kbのSphI断片中に含有していた。野生型のs
erA遺伝子の配列は、WO94/08031号に記載されている。s
erA遺伝子を有する組換えベクターをpGC3と命名した。
地上に塗布した。生育したクロ一ンは、E. coliのserA
遺伝子を3.5kbのSphI断片中に含有していた。野生型のs
erA遺伝子の配列は、WO94/08031号に記載されている。s
erA遺伝子を有する組換えベクターをpGC3と命名した。
【００４８】上記のようにした得た野生型serA遺伝子を
用いて、Ｃ末端アミノ酸を欠失した変異型PGDをコード
するserA遺伝子を作製した。pGC3をSalIおよびKpnIで切
断し、得られた断片をアガロースゲル電気泳動法によっ
て分離した。serA遺伝子全長を含む2.0kbの大きさのSal
I-KpnI断片をゲルから精製した。この断片0.2μg、これ
と等モル量の、HindIII/SalI切断されたpUC18、および
配列番号２、３に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオ
チドをアニールさせた二本鎖オリゴヌクレオチドを連結
した。このオリゴヌクレオチドは、serA遺伝子の８個の
最後のＣ末端コドンの中の７個を補完し、８番目のコド
ンの代わりに終始コドンTAAを導入する。従って、この
変異型serA遺伝子がコードするPGDは、Ｃ末端のアミノ
酸残基１個分短縮されている。この変異型serAを含むプ
ラスミドを、pGH5と命名した。同遺伝子がコードする変
異型PGDは、セリンに対するKi値は0.1μM〜50μMであ
り、セリンによるフィードバック阻害が解除されてい
る。
用いて、Ｃ末端アミノ酸を欠失した変異型PGDをコード
するserA遺伝子を作製した。pGC3をSalIおよびKpnIで切
断し、得られた断片をアガロースゲル電気泳動法によっ
て分離した。serA遺伝子全長を含む2.0kbの大きさのSal
I-KpnI断片をゲルから精製した。この断片0.2μg、これ
と等モル量の、HindIII/SalI切断されたpUC18、および
配列番号２、３に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオ
チドをアニールさせた二本鎖オリゴヌクレオチドを連結
した。このオリゴヌクレオチドは、serA遺伝子の８個の
最後のＣ末端コドンの中の７個を補完し、８番目のコド
ンの代わりに終始コドンTAAを導入する。従って、この
変異型serA遺伝子がコードするPGDは、Ｃ末端のアミノ
酸残基１個分短縮されている。この変異型serAを含むプ
ラスミドを、pGH5と命名した。同遺伝子がコードする変
異型PGDは、セリンに対するKi値は0.1μM〜50μMであ
り、セリンによるフィードバック阻害が解除されてい
る。
【００４９】＜２＞Ｌ−トリプトファンの製造 上記のトリプトファン生産菌エシェリヒア・コリSV164/
pGH5を、500ml容の三角フラスコに入れた50mlのLB培地
（トリプトン 1%、酵母抽出液 0.5%、塩化ナトリウム
0.5%）に接種し、30℃で7〜8時間、振盪下（150回転／
分）で前培養した。
pGH5を、500ml容の三角フラスコに入れた50mlのLB培地
（トリプトン 1%、酵母抽出液 0.5%、塩化ナトリウム
0.5%）に接種し、30℃で7〜8時間、振盪下（150回転／
分）で前培養した。
【００５０】前記の前培養物の約1mlを、下記組成を有
する300mlの種培地に接種した。1L容の小型発酵槽を用
いて、30℃で11〜15時間、800回転／分で培養した。
する300mlの種培地に接種した。1L容の小型発酵槽を用
いて、30℃で11〜15時間、800回転／分で培養した。
【００５１】〔種培地組成〕 グルコー ス 5g/L KH2PO4 12g/L (NH4)2SO4 0.1g/L MgSO4・7H2O 0.3g/L CaCl2・2H2O 15mg/L FeSO4・7H2O 2mg/L Na2 Citrate・2H2O 1g/L 痕跡元素溶液 1mg/L L-フェニルアラニン 40mg/L L-チロシン 40mg/L ビタミンB1 5mg/L テトラサイクリン 15mg/L （痕跡元素溶液） Na3MoO4 0.15g/L H3BO3 2.5g/L CoCl2・6H2O 0.7g/L CuSO4・5H2O 0.25g/L MnCl2・4H2O 1.5g/L ZnSO4・7H2O 0.3g/L
【００５２】上記種培養液30mlを、下記組成を有する30
0mlの主培養培地に接種した。1L容の小型発酵槽を用い
て、30℃、800回転／分の撹拌下で、滅菌フィルターに
より滅菌した圧縮空気を1vvm通気しながら培養した。ま
た、培養期間中温度は31℃に保持し、pHはアンモニアガ
スで6．7に保持した。
0mlの主培養培地に接種した。1L容の小型発酵槽を用い
て、30℃、800回転／分の撹拌下で、滅菌フィルターに
より滅菌した圧縮空気を1vvm通気しながら培養した。ま
た、培養期間中温度は31℃に保持し、pHはアンモニアガ
スで6．7に保持した。
【００５３】〔主培養培地組成〕 グルコース 17.5g/L KH2PO4 1.5g/L (NH4)2SO4 5g/L NaCl 0.5g/L MgSO4・7H2O 0.3g/L CaCl2・2H2O 15mg/L FeSO4・7H2O 75mg/L Na2Citrate.2H2O 1g/L 痕跡元素溶液 1mg/L L-フェニルアラニン 750mg/L L-チロシン 750mg/L ビタミンB1 5mg/L Yeast Extract 2.5g/L Tryptone 2.5g/L テトラサイクリン 20mg/L （痕跡元素溶液） Na3MoO4 0.15g/L H3BO3 2.5g/L CoCl2・6H2O 0.7g/L CuSO4・5H2O 0.25g/L MnCl2・4H2O 1.5g/L ZnSO4・7H2O 0.3g/L
【００５４】培養中、表２に示す組成の糖溶液700g/L
（W/V）（オートクレーブで殺菌した）をポンプ輸送す
ることによって、小型発酵槽内の糖濃度を5〜20g/Lに調
節した。培養４８時間後に、培地中のＬ−トリプトファ
ン濃度を測定した。対糖収率及び生産速度を表３に示
す。表３は、G100を１とした比率で表している。
（W/V）（オートクレーブで殺菌した）をポンプ輸送す
ることによって、小型発酵槽内の糖濃度を5〜20g/Lに調
節した。培養４８時間後に、培地中のＬ−トリプトファ
ン濃度を測定した。対糖収率及び生産速度を表３に示
す。表３は、G100を１とした比率で表している。
【００５５】
【表２】
【００５６】
【表３】
【００５７】その結果、グルコース100％の糖液を流下
したものに比べ、グルコースにフルクトースを混合する
と、対糖収率及び生産速度のいずれも向上することが判
明した。特に、炭素源に対するフルクトースの割合が50
%付近で、最も高い生産性を示した。
したものに比べ、グルコースにフルクトースを混合する
と、対糖収率及び生産速度のいずれも向上することが判
明した。特に、炭素源に対するフルクトースの割合が50
%付近で、最も高い生産性を示した。
【発明の効果】本発明によれば、エシェリヒア属細菌を
用いたＬ−トリプトファン等のＬ−アミノ酸の製造にお
いて、対糖収率及び／又は生産速度を向上させることが
できる。
用いたＬ−トリプトファン等のＬ−アミノ酸の製造にお
いて、対糖収率及び／又は生産速度を向上させることが
できる。
【配列表】 <110> Ajinomoto Co., Inc. <120> Ｌ−アミノ酸の製造法 <130> P-7719 <140> <141> 2001-01-19 <160> 3 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 32 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 1 Asn Pro Thr Ala Leu Phe His Gln Leu Cys Gly Asp Arg Pro Ala Thr 1 5 10 15 Leu Leu Leu Glu Ser Ala Asp Ile Asp Ser Lys Asp Asp Leu Lys Ser 20 25 30 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic oligonucleotide <400> 2 cattcgcgcc cgtctgctgt aata 24 <210> 3 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic oligonucleotide <400> 3 ctaggtaagc gcgggcagac gacattattc ga 32
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA05 AA10 BA71 BA75 DA06 EA04 GA11 4B064 AE03 AE08 AE34 CA02 CA19 CC03 CC24 CD09 DA10 4B065 AA26X AB01 BA18 BB15 CA17 CA41 CA43 CA44
Claims (6)
- 【請求項１】 Ｌ−アミノ酸生産能を有するエシェリヒ
ア属細菌をフルクトースを主要な炭素源として含む培地
で培養し、Ｌ−アミノ酸を該培地中に生成蓄積させ、該
培地よりＬ−アミノ酸を採取するＬ−アミノ酸の製造
法。 - 【請求項２】 前記培地は、炭素源全量に対し３０重量
％以上のフルクトースを含む請求項１記載のＬ−アミノ
酸の製造法。 - 【請求項３】 前記培地は、炭素源全量に対し３０重量
％以上、９５重量％以下のフルクトースを含む請求項１
記載のＬ−アミノ酸の製造法。 - 【請求項４】 前記培地は、炭素源全量に対し３０重量
％以上のフルクトースと、７０重量％以下のグルコース
を含む請求項１記載のＬ−アミノ酸の製造法。 - 【請求項５】 エシェリヒア属細菌がエシェリヒア・コ
リである請求項１〜４のいずれか一項に記載のＬ−アミ
ノ酸の製造法。 - 【請求項６】 前記Ｌ−アミノ酸がＬ−トリプトファン
である請求項１〜５のいずれか一項に記載のＬ−アミノ
酸の製造法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001011847A JP2002209596A (ja) | 2001-01-19 | 2001-01-19 | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| DE60205955T DE60205955T3 (de) | 2001-01-19 | 2002-01-16 | Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren |
| EP02000976.7A EP1225230B2 (en) | 2001-01-19 | 2002-01-16 | Methods for producing L-amino acids |
| US10/050,587 US20020173011A1 (en) | 2001-01-19 | 2002-01-18 | Methods for producing L-amino acids |
| US10/323,627 US7045320B2 (en) | 2001-01-19 | 2002-12-20 | Methods for producing L-amino acids |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001011847A JP2002209596A (ja) | 2001-01-19 | 2001-01-19 | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002209596A true JP2002209596A (ja) | 2002-07-30 |
Family
ID=18878936
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001011847A Pending JP2002209596A (ja) | 2001-01-19 | 2001-01-19 | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
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|---|---|
| US (2) | US20020173011A1 (ja) |
| EP (1) | EP1225230B2 (ja) |
| JP (1) | JP2002209596A (ja) |
| DE (1) | DE60205955T3 (ja) |
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| JP2005333984A (ja) * | 2004-04-26 | 2005-12-08 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法 |
| JP2017018094A (ja) * | 2012-01-10 | 2017-01-26 | シージェイ チェイルジェダン コーポレーションＣｊ Ｃｈｅｉｌｊｅｄａｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ | Ｌ−トリプトファン産生能が強化されたエシェリキア属微生物及びこれを用いてｌ−トリプトファンを産生する方法 |
| CN109536423A (zh) * | 2019-01-11 | 2019-03-29 | 宁夏医科大学 | 一种蜡样芽孢杆菌的培养方法及其专用培养基 |
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| US7300776B2 (en) | 2004-04-26 | 2007-11-27 | Ajinomoto Co., Inc. | L-amino acid-producing bacterium and a method for producing L-amino acid |
| JP2007117082A (ja) * | 2005-09-27 | 2007-05-17 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法 |
| RU2006129690A (ru) | 2006-08-16 | 2008-02-27 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИЙ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae, В КОТОРОЙ ОСЛАБЛЕНА ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА ydiN, ГЕНА ydiB ИЛИ ИХ КОМБИНАЦИИ |
| JP2010017082A (ja) | 2006-10-10 | 2010-01-28 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| JP2010017081A (ja) * | 2006-10-10 | 2010-01-28 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
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- 2001-01-19 JP JP2001011847A patent/JP2002209596A/ja active Pending
-
2002
- 2002-01-16 DE DE60205955T patent/DE60205955T3/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-01-16 EP EP02000976.7A patent/EP1225230B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-01-18 US US10/050,587 patent/US20020173011A1/en not_active Abandoned
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| US20030138918A1 (en) | 2003-07-24 |
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| US7045320B2 (en) | 2006-05-16 |
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| EP1225230B2 (en) | 2013-07-10 |
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