JP2007117082A - Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法 - Google Patents

Abstract

【課題】Ｌ−アミノ酸の発酵生産の効率を向上させる。
【解決課題】Ｌ−アミノ酸生産能を有し、かつEvgAS二成分制御系に関与する転写因子をコードするevgA遺伝子、gadE遺伝子、ydeO遺伝子から選択される一または二以上の遺伝子の発現量が増強するように改変された腸内細菌科に属する微生物を培地で培養して、Ｌ−アミノ酸を該培地中又は菌体内に生成蓄積させ、該培地又は菌体よりＬ−アミノ酸を採取する、Ｌ−アミノ酸の製造法を提供する。
【選択図】図１

Description

本発明は、微生物を用いたＬ−アミノ酸の製造法、特にＬ−リジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン等のＬ−アミノ酸の製造法に関する。Ｌ−リジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファンは、動物飼料用の添加物、健康食品の成分、又はアミノ酸輸液等として、産業上有用なＬ−アミノ酸である。

微生物を用いた発酵法によってＬ−アミノ酸等の目的物質を製造するには、野生型微生物（野生株）を用いる方法、野生株から誘導された栄養要求株を用いる方法、野生株から種々の薬剤耐性変異株として誘導された代謝調節変異株を用いる方法、栄養要求株と代謝調節変異株の両方の性質を持った株を用いる方法等がある。

近年は、目的物質の発酵生産に、組換えＤＮＡ技術を用いることが行われている。例えば、Ｌ−アミノ酸生合成系酵素をコードする遺伝子の発現を増強すること（特許文献１、特許文献２）、又はＬ−アミノ酸生合成系への炭素源の流入を増強すること（特許文献３）によって、微生物のＬ−アミノ酸生産性を向上させることが行われている。

これまでにエシェリヒア・コリなどの腸内細菌群に見出されている二成分制御系EvgASについては、センサーキナーゼであるEvgSの機能は不明であったが、レスポンスレギュレーター転写因子であるEvgAが多くの遺伝子の転写を制御することが知られている（非特許文献１）。転写因子EvgAは、さらにYdeOとGadEの２つの転写因子をコードする遺伝子ydeO及びgadEの転写を正に制御し、YdeOはgadE遺伝子の転写を正に制御していることが知られている（非特許文献２、非特許文献３）。しかし、これまでにこれらの転写因子をコードする遺伝子evgA、gadE、あるいはydeOを増強した微生物を用いた、アミノ酸の生産の報告はない。
米国特許第5168056号明細書 米国特許第5776736号明細書 米国特許第5906925号明細書 J. Bacteriol. 2002. 184(22):6225-6234. Masuda, N., Church, G. M. Escherichia coli gene expression responsive to levels of the response regulator EvgA. Mol. Microbiol. 2003. 48(3):699-712. Masuda, N. and Church, G. M. Regulatory network of acid resistance genes in Escherichia coli. ：J. Bacteriol. 2004. 186(21):7378-7389. Ma, Z., Masuda, N., and Foster, J. W. Characterization of EvgAS-YdeO-GadE branched regulatory circuit governing glutamate-dependent acid resistance in Escherichia coli.

本発明は、Ｌ−アミノ酸を効率よく生産することのできる腸内細菌科に属する細菌の菌株を提供すること、及び該菌株を用いてＬ−アミノ酸を効率よく生産する方法を提供することを課題とする。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、EvgAS二成分制御系に関与する転写因子をコードする、evgA遺伝子、gadE遺伝子 、ydeO遺伝子から選択される一または二以上の遺伝子の発現量が増強するように微生物を改変することにより、Ｌ−
アミノ酸の生産性が向上することを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）Ｌ−アミノ酸生産能を有し、かつEvgAS二成分制御系に関与する転写因子をコードするevgA遺伝子、gadE遺伝子、ydeO遺伝子から選択される一または二以上の遺伝子の発現量が増大するように改変された腸内細菌科に属する細菌を培地で培養して、Ｌ−アミノ酸を該培地中に生成蓄積させ、該培地よりＬ−アミノ酸を採取する、Ｌ−アミノ酸の製造法。
（２）前記一または二以上の遺伝子の発現量が、各々の遺伝子のコピー数を高めること、又は該遺伝子の発現調節配列を改変されたことによって増大された、前記方法。
（３）前記一または二以上の遺伝子の発現量が、センサーキナーゼをコードするevgS遺伝子の発現量が増大するように改変されたことによって増大された、前記方法。
（４）前記evgA遺伝子が、下記（ａ）又は（ｂ）に記載のＤＮＡである、前記方法。
（ａ）配列番号２３に示す塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｂ）配列番号２３に示す塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、転写因子活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（５）前記gadE遺伝子が下記（ｃ）又は（ｄ）に記載のＤＮＡである前記方法。
（ｃ）配列番号２７に示す塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｄ）配列番号２７に示す塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、転写因子活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（６）前記ydeO遺伝子が下記（ｅ）又は（ｆ）に記載のＤＮＡである、前記方法。
（ｅ）配列番号２９に示す塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｆ）配列番号２９に示す塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、転写因子活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（７）前記evgS遺伝子が下記（ｇ）又は（ｈ）に記載のＤＮＡである、前記方法。
（ｇ）配列番号２５に示す塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｈ）配列番号２５に示す塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、リン酸転移活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（８）前記evgA遺伝子が、下記（Ａ）又は（Ｂ）に記載のタンパク質をコードする、前記方法。
（Ａ）配列番号２４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）配列番号２４に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、転写因子活性を有するタンパク質。
（９）前記gadE遺伝子が、下記（Ｃ）又は（Ｄ）に記載のタンパク質をコードする、前記方法。
（Ｃ）配列番号２８に示すアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｄ）配列番号２８に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、転写因子活性を有するタンパク質。
（１０）前記ydeO遺伝子が、下記（Ｅ）又は（Ｆ）に記載のタンパク質をコードする、前記方法。
（Ｅ）配列番号３０に示すアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｆ）配列番号３０に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、転写因子活性を有するタンパク質。
（１１）前記evgS遺伝子が、下記（Ａ）又は（Ｂ）に記載のタンパク質をコードする、前記方法。
（Ｃ）配列番号２６に示すアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｄ）配列番号２６に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、リン酸転移活性を有するタンパク質。
（１２）前記細菌が、エシェリヒア属細菌、エンテロバクター属細菌、パントエア属細菌、クレブシエラ属細菌、セラチア属細菌からなる群より選ばれる腸内細菌科に属する細菌である、前記方法。
（１３）前記Ｌ−アミノ酸がＬ−リジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファンからなる群より選択される１種又は２種以上のアミノ酸である、前記方法。

本発明の微生物を用いることにより、効率よく、Ｌ−アミノ酸、特にＬ−リジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファンを発酵生産することが出来る。

以下、本発明を詳細に説明する。

＜１＞本発明の微生物
本発明の微生物は、Ｌ−アミノ酸生産能を有し、かつ、EvgAS二成分制御系に関与する転写因子をコードするevgA、gadE、ydeO遺伝子から選択される一または二以上の遺伝子の発現量が増大するように改変された腸内細菌科に属する微生物である。ここで、Ｌ−アミノ酸生産能とは、本発明の微生物を培地中で培養したときに、培地中または菌体内にＬ−アミノ酸を生成し、培地中または菌体から回収できる程度に蓄積する能力をいう。なお、本発明の微生物は複数のＬ−アミノ酸の生産能を有するものであってもよい。Ｌ−アミノ酸の生産能を有する微生物としては、本来的にＬ−アミノ酸の生産能を有するものであってもよいが、下記のような微生物を、変異法や組換えDNA技術を利用して、Ｌ−アミノ酸の生産能を有するように改変したものであってもよい。
また、「遺伝子の発現量の増大」とは、遺伝子の転写及び／又は翻訳の量が増大することをいう。

Ｌ−アミノ酸の種類は特に制限されないが、Ｌ−リジン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−シトルリンのような塩基性アミノ酸、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−グリシンのような脂肪族アミノ酸、Ｌ−スレオニン、Ｌ−セリンのようなヒドロキシモノアミノカルボン酸であるアミノ酸、Ｌ−プロリンのような環式アミノ酸、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファンのような芳香族アミノ酸、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｌ−メチオニンのような含硫アミノ酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギンのような酸性アミノ酸が挙げられ、特にＬ−リジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファンが好ましい。本発明の微生物は２種類以上のアミノ酸の生産能を有するものであってもよい。

＜１−１＞ Ｌ−アミノ酸生産能の付与
以下に、微生物にＬ−アミノ酸生産能を付与する方法及び本発明で使用することのできるＬ−アミノ酸生産能が付与された微生物を例示する。ただし、Ｌ−アミノ酸生産能を有する限り、これらに制限されない。

本発明に用いる微生物としては、エシェリヒア属、エンテロバクター属、パントエア属、クレブシエラ属、セラチア属、エルビニア属、サルモネラ属、モルガネラ属など、腸内
細菌科に属する微生物であって、Ｌ−アミノ酸を生産する能力を有するものであれば、特に限定されない。具体的にはNCBI（National Center for Biotechnology Information）データベースに記載されている分類により腸内細菌科に属するものが利用できる。
（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Taxonomy/wgetorg?mode=Tree&id=1236&lvl=3&keep=1&srchmode=1&unlock）。改変に用いる腸内細菌科の親株としては、中でもエシェリヒア属細菌、エンテロバクター属細菌、パントエア属細菌を用いることが望ましい。

本発明のエシェリヒア属細菌を得るために用いるエシェリヒア属細菌の親株としては、特に限定されないが、具体的にはNeidhardtらの著書（Backmann, B. J. 1996. Derivations and Genotypes of some mutant derivatives of Escherichia coli K-12, p. 2460-2488. Table 1. In F. D. Neidhardt (ed.), Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology/Second Edition, American Society for Microbiology Press, Washington, D.C.）に挙げられるものが利用できる。その中では、例えばエシェリヒア・コリが挙げられる。エシェリヒア・コリとしては具体的には、プロトタイプの野生株Ｋ１２株由来のエシェリヒア・コリ W3110 （ATCC 27325）、エシェリヒア・コリ MG1655 (ATCC 47076)等が挙げられる。

これらを入手するには、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所
P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America）より分譲を受けることが出来る。すなわち各菌株に対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることが出来る（http://www.atcc.org/参照）。各菌株に対応する登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。

エンテロバクター属細菌としては、エンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter
agglomerans）、エンテロバクター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)等、パントエア属細菌としてはパントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）が挙げられる。尚、近年、エンテロバクター・アグロメランスは、16S rRNAの塩基配列解析などにより、パントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans）又はパントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）、パントエア・スチューアルティ（Pantoea stewartii）に再分類されているものがある。本発明においては、腸内細菌科に分類されるものであれば、エンテロバクター属又はパントエア属のいずれに属するものであってもよい。パントエア・アナナティスを遺伝子工学的手法を用いて育種する場合には、パントエア・アナナティスAJ13355株（FERM BP-6614）、AJ13356株（FERM BP-6615）、AJ13601株（FERM BP-7207）及びそれらの誘導体を用いることができる。これらの株は、分離された当時はエンテロバクター・アグロメランスと同定され、エンテロバクター・アグロメランスとして寄託されたが、上記のとおり、16S rRNAの塩基配列解析などにより、パントエア・アナナティスに再分類されている。

以下、腸内細菌科に属する微生物にＬ−アミノ酸生産能を付与する方法、又はこれらの微生物にＬ−アミノ酸生産能を増強する方法について述べる。

Ｌ−アミノ酸生産能を付与するには、栄養要求性変異株、アナログ耐性株又は代謝制御変異株の取得や、Ｌ−アミノ酸の生合成系酵素の発現が増強された組換え株の創製等、従来、コリネ型細菌又はエシェリヒア属細菌等の育種に採用されてきた方法を適用することができる（アミノ酸発酵、（株）学会出版センター、1986年5月30日初版発行、第77-100頁参照）。ここで、Ｌ−アミノ酸生産菌の育種において、付与される栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質は、単独でもよく、２種又は３種以上であってもよい。また、発現が増強されるＬ−アミノ酸生合成系酵素も、単独であっても、２種又は３種以上であってもよい。さらに、栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質の付与と、生合成系酵素の増強が組み合わされてもよい。

Ｌ−アミノ酸生産能を有する栄養要求性変異株、Ｌ−アミノ酸のアナログ耐性株、又は代謝制御変異株を取得するには、親株又は野生株を通常の変異処理、すなわちＸ線や紫外線の照射、またはN-メチル-N’-ニトロ-N-ニトロソグアニジン(NTG)もしくはエチルメタンスルフォネート（EMS）等の変異剤処理などによって処理し、得られた変異株の中から、栄養要求性、アナログ耐性、又は代謝制御変異を示し、かつＬ−アミノ酸生産能を有するものを選択することによって得ることができる。

以下、Ｌ−リジン生産菌又はその構築方法を例として示す。
例えば、Ｌ−リジン生産能としては、Ｌ−リジンアナログ耐性株又は代謝制御変異株が挙げられる。Ｌ−リジンアナログの例としては、オキサリジン、リジンヒドロキサメート、Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン（AEC）、γ−メチルリジン、α−クロロカプロラクタムなどが挙げられるが、これらに限定されない。これらのリジンアナログに対して耐性を有する変異株は、エシェリヒア属に属する細菌を通常の人工変異処理に付すことによって得ることができる。Ｌ−リジン生産菌として具体的には、エシェリヒア・コリAJ11442株（FERM BP-1543、NRRL B-12185；特開昭56-18596号公報及び米国特許第4346170号明細書参照）、エシェリヒア・コリ VL611株（特開2000-189180号公報）等が挙げられる。また、エシェリヒア・コリのＬ−リジン生産菌として、WC196株（国際公開第96/17930号パンフレット参照）を用いることも出来る。WC196株は、エシェリヒア・コリK-12由来のW3110株にAEC耐性を付与することによって育種されたものである。同株は、エシェリヒア・コリAJ13069株と命名され、平成６年１２月６日付で工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM P-14690として寄託され、平成７年９月29日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-5252が付与されている。

また、Ｌ−リジン生合成系の酵素活性を上昇させることによっても、Ｌ−リジン生産菌を構築することが出来る。これらの酵素活性の上昇は、酵素をコードする遺伝子のコピー数を細胞内で上昇させること、発現調節配列を改変することによって、達成できる。

Ｌ−リジン生合成系酵素をコードする遺伝子としては、ジヒドロジピコリン酸合成酵素遺伝子（dapA）、アスパルトキナーゼ遺伝子(lysC)、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ遺伝子(dapB)、ジアミノピメリン酸脱炭酸酵素遺伝子(lysA)、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子(ddh)（以上、国際公開第96/40934号パンフレット）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子(ppc) （特開昭60-87788号公報）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子(aspC)（特公平6-102028号公報）、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ遺伝子(dapF)（特開2003-135066号公報）、アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素遺伝子（asd）(国際公開第00/61723号パンフレット)等のジアミノピメリン酸経路の酵素の遺伝子、あるいはホモアコニット酸ヒドラターゼ遺伝子（特開2000-157276号公報）等のアミノアジピン酸経路の酵素等の遺伝子が挙げられる。

例えば、以下のようにして、Ｌ−リジン生合成系の酵素をコードする遺伝子を宿主に導入することによって、Ｌ−リジン生産能を付与することができる。すなわち、Ｌ−リジン生合成系遺伝子をコードする遺伝子断片を、Ｌ−リジンの製造に用いる宿主微生物で機能するベクター、好ましくはマルチコピー型ベクターと連結して組み換えＤＮＡを作製し、これで宿主を形質転換する。形質転換により宿主細胞内のＬ−リジン生合成系酵素コードする遺伝子のコピー数が上昇し発現量が増強する結果、これらの酵素の活性が増強される。

Ｌ−リジン生合成系酵素をコードする遺伝子としては、宿主微生物中で発現することが
できる遺伝子であれば、特に限定されないが、例えば、エシェリヒア・コリ由来の遺伝子、コリネ型細菌由来の遺伝子が挙げられる。エシェリヒア・コリ、コリネバクテリウム・グルタミカムのいずれも全ゲノム配列が明らかにされているので、これらの遺伝子の塩基配列に基づいてプライマーを合成し、エシェリヒア・コリ K-12等の微生物のゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ法により、これらの遺伝子を取得することが可能である。

遺伝子のクローニングに使用されるプラスミドとしては、腸内細菌科において自律複製可能なものであればよく、具体的には、pBR322、pTWV228（宝バイオ社）、pMW119（ニッポンジーン社）、pUC19、pSTV29（宝バイオ社製）、RSF1010 （Gene, 75:271-288 (1989)）,等が挙げられる。他にもファージＤＮＡのベクターも利用できる。

目的遺伝子を上記ベクターに連結して組み換えDNAを調製するには、目的遺伝子を含むDNA断片の末端に合うような制限酵素でベクターを切断する。連結は、T4 DNAリガーゼ等のリガーゼを用いて行うのが普通である。目的遺伝子は、それぞれ別個のベクターに搭載してもよく、同一のベクターに搭載してもよい。DNAの切断、連結、その他、ゲノムDNAの調製、PCR、プラスミドDNAの調製、形質転換、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの設定等の方法は、当業者によく知られている通常の方法を採用することができる。これらの方法は、刊行物（Sambrook, J., and Russell, D.W. Molecular Cloning A Laboratory Manual/Third Edition. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)等）に記載されている。上記のようにして調製した組換えＤＮＡを微生物に導入するには、十分な形質転換効率が得られる方法ならば、いかなる方法を用いてもよいが、例えば、エレクトロポレーション法（Can. J. Microbiol. 43:197-201 (1997)）が挙げられる。このような方法により作製されたプラスミドとして、dapA、dapB及びlysC遺伝子を搭載したLys生産用プラスミドpCABD2（国際公開第WO01/53459号パンフレット）が挙げられる。

また、Ｌ−リジン生合成系酵素をコードする遺伝子の発現増強は、目的遺伝子を微生物のゲノムＤＮＡ上に多コピー導入することによっても達成できる。微生物のゲノムDNA上に目的遺伝子を多コピーで導入するには、ゲノムDNA上に多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行う。このような相同組換えを利用した遺伝子置換による部位特異的変異導入は既に確立しており、直鎖上DNAを用いる方法や温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法などがある（米国特許第6303383号、又は特開平05-007491号公報）。ゲノムDNA上に多コピー存在する配列としては、レペティティブDNA、転移因子の端部に存在するインバーテッド・リピートが利用できる。またＬ−リジン生合成系遺伝子は、元々ゲノム上に存在する遺伝子の横にタンデムに連結させてもよいし、ゲノム上の不要な領域を欠損することによって、Ｌ−リジン収率が向上する遺伝子領域に導入してもよい。あるいは、特開平2-109985号公報に開示されているように、目的遺伝子をトランスポゾンに搭載してこれを転移させてゲノムDNA上に多コピー導入することも可能である。いずれの方法によっても形質転換株内の目的遺伝子のコピー数が上昇する結果、Ｌ−リジン生合成系の酵素活性が増強される。

Ｌ−リジン生合成系酵素の活性増強は、上記の遺伝子増幅による以外に、目的遺伝子のプロモーター等の発現調節配列をより強力なものに置換することによっても達成される（特開平1-215280号公報参照）。たとえば、lacプロモーター、trpプロモーター、trcプロモーター、tacプロモーター、araBAプロモーター、ラムダファージのPRプロモーター、PLプロモーター、tetプロモーター、T7プロモーター、φ10プロモーター等が強力なプロモーターとして知られている。これらのプロモーターへの置換により、目的遺伝子の発現が強化されることによって酵素活性が増幅される。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Goldsteinらの論文（Prokaryotic promoters in biotechnology.
Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128, (1995)）等に記載されている。

また、目的酵素の活性増強は、目的酵素をコードする遺伝子の発現調節に関与する因子、例えばオペレーターやリプレッサーを改変することによっても達成される(Hamilton et
al, J. Bacteriol. 171:4617-4622 (1989))。国際公開WO00/18935に開示されているように、目的遺伝子のプロモーター領域に数塩基の塩基置換を導入し、より強力なものに改変することも可能である。さらに、リボソーム結合部位（RBS）と開始コドンとの間のスペーサー、特に開始コドンのすぐ上流の配列における数個のヌクレオチドの置換がmRNAの翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られており、これらを改変することも可能である。目的遺伝子のプロモーター等の発現調節領域は、プロモーター検索ベクターやGENETYX（GENETYX CORPORATION）等の遺伝子解析ソフトを用いて決定することが出来る。これらのプロモーター置換または改変により目的遺伝子の発現が強化される。発現調節配列の置換は、例えば、上述の温度感受性プラスミドを用いた遺伝子置換と同様にして行うことができる。また、Redドリブンインテグレーション法(WO2005/010175)を使用することも出来る。

さらに、Ｌ−アミノ酸生産菌は、Ｌ−アミノ酸の生合成経路から分岐してＬ−リジン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性や、Ｌ−アミノ酸の合成又は蓄積に負に機能する酵素活性が低下または欠損していてもよい。Ｌ−リジン生産において、このような酵素としては、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、リジンデカルボキシラーゼ（cadA, ldcC）、マリックエンザイム等があり、該酵素の活性が低下または欠損した株は国際公開第WO95/23864号、第WO96/17930号パンフレット、第WO2005/010175号パンフレットなどに記載されている。

これらの酵素活性を低下あるいは欠損させる方法としては、通常の変異処理法又は遺伝子組換え技術によって、ゲノム上の上記酵素の遺伝子に、細胞中の当該酵素の活性が低下または欠損するような変異を導入すればよい。このような変異の導入は、例えば、遺伝子組換えによって、ゲノム上の酵素をコードする遺伝子を欠損させたり、プロモーターやシャインダルガルノ（SD）配列等の発現調節配列を改変したりすることなどによって達成される。また、ゲノム上の酵素をコードする領域にアミノ酸置換（ミスセンス変異）を導入すること、また終始コドンを導入すること（ナンセンス変異）、一〜二塩基付加・欠失するフレームシフト変異を導入すること、遺伝子の一部分、あるいは全領域を欠失させることによっても達成出来る（J. Biol. Chem. 272:8611-8617（1997））。また、コード領域の全体又は一部が欠失したような変異酵素をコードする遺伝子を構築し、相同組換えなどによって、該遺伝子でゲノム上の正常遺伝子を置換すること、トランスポゾン、IS因子を該遺伝子に導入することによっても酵素活性を低下または欠損させることができる。

例えば、上記の酵素の活性を低下または欠損させるような変異を遺伝子組換えにより導入する為には、以下のような方法が用いられる。目的遺伝子の部分配列を改変し、正常に機能する酵素を産生しないようにした変異型遺伝子を作製し、該遺伝子を含むＤＮＡで腸内細菌科に属する微生物に形質転換し、変異型遺伝子とゲノム上の遺伝子で組換えを起こさせることにより、ゲノム上の目的遺伝子を変異型に置換することが出来る。このような相同組換えを利用した遺伝子置換は、「Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)」と呼ばれる方法（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000)）、Redドリブンインテグレーション法とλファージ由来の切り出しシステム（Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184: 5200-5203 (2002)）と組合わせた方法（WO2005/010175号参照）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法や、温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法などがある（米国特許第6303383号; 特開平05-007491号公報）。また、上述のような相同組換えを利用した遺伝０子置換により部位特異的変異導入は、宿主上で複製能力を持たないプラスミドを用いても行うことが出来る。

上記のようなＬ−リジン生合成に関与する酵素活性を増強する方法、酵素活性を低下さ
せる方法は、他のＬ−アミノ酸生産菌の育種にも同様に適用することができる。以下、他のＬ−アミノ酸生産菌の育種方法について述べる。

本発明に用いられるＬ−トリプトファン生産菌として好ましいものは、アントラニル酸合成酵素活性、ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ活性もしくはトリプトファンシンターゼ活性のうち、１又は２以上の活性が増強された細菌である。アントラニル酸合成酵素及びホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼは、それぞれＬ−トリプトファン及びＬ−セリンによるフィードバック阻害を受けるため、脱感作型の変異酵素を保持させることにより、酵素活性を強化することができる。具体的には、例えば、アントラニル酸合成酵素遺伝子（trpE）、及び／又はホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ遺伝子（serA）を、フィードバック阻害を受けないように変異させ、得られた変異型遺伝子を腸内細菌科に属する微生物に導入することによって、脱感作型酵素を保持する細菌を取得することができる。このような細菌としてより具体的には、脱感作型アントラニル酸合成酵素を保持するエシェリヒア・コリSV164に、脱感作型ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼをコードする変異型serAを持つプラスミドpGH5（国際公開第94/08031号パンフレット参照）を導入することによって得られる形質転換株が挙げられる。SV164は、trpE欠損株エシェリヒア・コリKB862（DSM7196）に、脱感作型アントラニル酸合成酵素をコードする変異遺伝子を導入することによって得られた株である（国際公開第94/08031号パンフレット参照）。

また、トリプトファンオペロンを含む組換えＤＮＡが導入された細菌も、好適なＬ−トリプトファン生産菌である。具体的には、脱感作型アントラニル酸合成酵素をコードする遺伝子を含むトリプトファンオペロンが導入されたエシェリヒア・コリが挙げられる（特開昭57-71397号公報、特開昭62-244382号公報、米国特許第4,371,614明細書）。また、トリプトファンオペロンのうち、トリプトファンシンターゼをコードする遺伝子（trpBA）の発現を強化することによっても、Ｌ−トリプトファン生産能を向上又は付与することができる。トリプトファンシンターゼは、α及びβサブユニットからなり、それぞれtrpA、trpBによってコードされている。trpAの塩基配列を配列番号１３、trpBの塩基配列を配列番号１５に示す。

また、トリプトファンオペロンのリプレッサーであるtrpRを欠損した株、trpRに変異が導入された株も好適なＬ−トリプトファン生産菌である（米国特許第4,371,614号公報、国際公開第WO2005/056776号パンフレット）。

また、マレートシンターゼ・イソシトレートリアーゼ・イソシトレートデヒドロゲナーゼキナーゼ／フォスファターゼオペロン（aceオペロン）が構成的に発現するか、又は同オペロンの発現が強化された細菌も好適なＬ−トリプトファン生産菌である。具体的には、aceオペロンのプロモーターがリプレッサーであるiclRによって抑制を受けないこと、又はiclRによる抑制が解除されていることが望ましく、このような細菌はiclR遺伝子を破壊すること、又はaceオペロンの発現調節配列を改変することによって、取得することができる。エシェリヒア・コリのiclR遺伝子を配列番号５に示す。aceオペロンの発現が強化された細菌は、aceオペロンを含むＤＮＡを強力なプロモーターに連結し、これをプラスミドや相同組換えによって、細菌内に導入することや、トランスポゾンによって上記ＤＮＡを多コピー存在させることによって取得できる。aceオペロンに含まれるＤＮＡとしては、aceB、aceA、aceKが挙げられる、aceBの遺伝子配列を配列番号９に、aceAの遺伝子配列を配列番号７に、aceKの遺伝子配列を配列番号１１に示す。

さらに、Ｌ−トリプトファン生産菌としては、Ｌ−フェニルアラニン及びＬ−チロシン要求性の形質を有する菌株エシェリヒア・コリAGX17(pGX44)〔NRRL B-12263〕株、及びトリプトファンオペロンを含むプラスミドpGX50を保持するAGX6(pGX50)aroP〔NRRL B-12264〕株（いずれも米国特許第 4,371,614号明細書参照）が挙げられる。これらの菌株は、ア
グリカルチュラル・リサーチ・サービス・カルチャー・コレクション、ナショナル・センター・フォー・アグリカルチュラル・ユティライゼーション・リサーチ（Agricultural Research Service Culture Collection, National Center for Agricultural Utilization
Research）（住所：Peoria, Illinois 61604, USA ））から入手することができる。

Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシンは共に芳香族アミノ酸で生合成系が共通しており、芳香族アミノ酸の生合成系酵素をコードする遺伝子としては、デオキシアラビノ−ヘプツロン酸リン酸シンターゼ(aroG)、３−デヒドロキネートシンターゼ（aroB）、シキミ酸デヒドラターゼ、シキミ酸キナーゼ（aroL）、５−エノール酸ピルビンシキミ酸３−リン酸シンターゼ（aroA）、コリスミ酸シンターゼ(aroC)が挙げられる。（欧州出願公開763127号明細書）従って、これらの酵素をコードする遺伝子をプラスミド、あるいはゲノム上で多コピー化することにより、芳香族アミノ酸の生産能を向上させることができる。また、これらの遺伝子はチロシンリプレッサーによって制御されることが知られており（tyrR）、tyrR遺伝子を欠損させることによって、芳香族アミノ酸の生合成系酵素活性を上昇してもよい。（欧州特許763127号明細書参照）

Ｌ−フェニルアラニン生産菌としては、tyrA,tyrRが欠損したエシェリヒア・コリAJ12739 (tyrA::Tn10, tyrR) (VKPM B-8197)や、フェニルアラニン排出遺伝子であるyddG、又はyedA遺伝子を増幅した株（各々国際公開第03/044192号パンフレット、US2003/0148473A1）が挙げられる。

本発明に用いられるＬ−スレオニン生産菌として好ましいものとしては、Ｌ−スレオニン生合成系酵素を強化した腸内細菌科に属する微生物が挙げられる。Ｌ−スレオニン生合成系酵素をコードする遺伝子としては、アスパルトキナーゼIII遺伝子（lysC）、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（asd）、thrオペロンにコードされるアスパルトキナーゼI遺伝子（thrA）、ホモセリンキナーゼ遺伝子（thrB）、スレオニンシンターゼ遺伝子（thrC）が挙げられる。カッコ内は、その遺伝子の略記号である。これらの遺伝子は２種類以上導入してもよい。Ｌ−スレオニン生合成系遺伝子は、スレオニン分解が抑制されたエシェリヒア属細菌に導入してもよい。スレオニン分解が抑制されたエシェリヒア属細菌としては、例えば、スレオニンデヒドロゲナーゼ活性が欠損したTDH6株（特開2001-346578号）等が挙げられる。

Ｌ−スレオニン生合成系酵素は、最終産物のＬ−スレオニンによって酵素活性が抑制される。従って、Ｌ−スレオニン生産菌を構築するためには、Ｌ−スレオニンによるフィードバック阻害を受けないようにＬ−スレオニン生合成系遺伝子を改変することが望ましい。また、上記thrA、thrB、thrC遺伝子は、スレオニンオペロンを構成しているが、スレオニンオペロンは、アテニュエーター構造を形成しており、スレオニンオペロンの発現は、培養液中のイソロイシン、スレオニンにより阻害を受け、また、アテニュエーションにより発現が抑制される。この改変は、アテニュエーション領域のリーダー配列あるいは、アテニュエーターを除去することにより達成出来る（Lynn, S. P., Burton, W. S., Donohue, T. J., Gould, R. M., Gumport, R. I., and Gardner, J. F. J. Mol. Biol. 194:59-69 (1987); 国際公開第02/26993号パンフレット; 国際公開第2005/049808号パンフレット参照）。

スレオニンオペロンの上流には、固有のプロモーターが存在するが、non-nativeのプロモーターに置換してもよいし（WO98/04715号パンフレット参照）、スレオニン生合成関与遺伝子の発現がラムダファージのリプレッサーおよびプロモーターにより支配されるようなスレオニンオペロンを構築してもよい（欧州特許第0593792号明細書参照）。また、Ｌ−スレオニンによるフィ−ドバック阻害を受けないようにエシェリヒア属細菌を改変するために、α−amino−β−hydroxyvaleric acid（AHV）に耐性な菌株を選抜することによ
っても得られる。

このようにＬ−スレオニンによるフィ−ドバック阻害を受けないように改変されたスレオニンオペロンは、宿主内でコピー数が上昇しているか、あるいは強力なプロモーターに連結し、発現量が向上していることが好ましい。コピー数の上昇は、プラスミドによる増幅の他、トランスポゾン、Mu−ファージ等でゲノム上にスレオニンオペロンを転移させることによっても達成出来る。

また、アスパルトキナ−ゼIII遺伝子（lysC）は、Ｌ−リジンによるフィ−ドバック阻害を受けないように改変した遺伝子を用いることが望ましい。このようなフィ−ドバック阻害を受けないように改変したlysC遺伝子は、米国特許5,932,453号明細書に記載の方法により取得できる。

Ｌ−スレオニン生合成系酵素以外にも、解糖系、TCA回路、呼吸鎖に関する遺伝子や遺伝子の発現を制御する遺伝子、糖の取り込み遺伝子を強化することも好適である。これらのＬ−スレオニン生産に効果がある遺伝子としては、トランスヒドロナーゼ遺伝子（pntAB）（欧州特許733712号明細書）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（pepC）(国際公開95/06114号パンフレット）、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ遺伝子（pps）(欧州特許877090号明細書)、コリネ型細菌あるいはバチルス属細菌のピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（国際公開99/18228号パンフレット、欧州出願公開1092776号明細書）が挙げられる。

また、Ｌ−スレオニンに耐性を付与する遺伝子、及び／又はＬ−ホモセリンに耐性を付与する遺伝子の発現を強化することや、宿主にＬ−スレオニン耐性、及び／又はＬ−ホモセリン耐性を付与することも好適である。耐性を付与する遺伝子としては、rhtA遺伝子(Res. Microbiol. 154:123−135 (2003))、rhtB遺伝子（欧州特許出願公開第0994190号明細書）、rhtC遺伝子（欧州特許出願公開第1013765号明細書）、yfiK、yeaS遺伝子（欧州特許出願公開第1016710号明細書）が挙げられる。また宿主にＬ−スレオニン耐性を付与する方法は、欧州特許出願公開第0994190号明細書や、国際公開第90/04636号パンフレット記載の方法を参照出来る。

Ｌ−スレオニン生産菌として、エシェリヒア・コリVKPM B-3996株（米国特許第5,175,107号明細書参照）を例示することが出来る。このVKPM B-3996株は、１９８７年１１月１９日にロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズム（Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNII Genetika）（住所：Russia, 117545 Moscow, 1 Dorozhny proezd. 1）に登録番号VKPM B-3996のもとに寄託されている。また、このVKPM B-3996株は、ストレプトマイシン耐性マーカーを有する広域ベクタープラスミドpAYC32（Chistorerdov, A. Y., and Tsygankov, Y.
D. Plasmid, 16, 161-167 (1986)を参照のこと）にスレオニン生合成系遺伝子（スレオニンオペロン：thrABC）を挿入して得られたプラスミドpVIC40（国際公開第90/04636号パンフレット）を保持している。このpVIC40においては、スレオニンオペロン中のthrAがコードするアスパルトキナーゼＩ−ホモセリンデヒドロゲナーゼＩの、Ｌ−スレオニンによるフィードバック阻害が解除されている。

また、エシェリヒア・コリVKPM B-5318株(欧州特許第0593792号明細書参照)も好適なＬ−スレオニン生産菌として例示することができる。VKPM B-5318株は、1987年11月19日にロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズム（Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNII Genetika
）に登録番号VKPM B-5318のもとに寄託されている。またこのVKPM B-5318株は、イソロイシン非要求性菌株であり、ラムダファージの温度感受性C1リプレッサー、PRプロモータ
ーおよびCroタンパク質のN末端部分の下流に、本来持つ転写調節領域であるアテニュエーター領域を欠失したスレオニンオペロンすなわちスレオニン生合成関与遺伝子が位置し、スレオニン生合成関与遺伝子の発現がラムダファージのリプレッサーおよびプロモーターにより支配されるように構築された組換えプラスミドDNAを保持している。

本発明に用いられるＬ−グルタミン酸生産菌としては、例えば、Ｌ−グルタミン酸生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現が増強するように改変された腸内細菌科に属する微生物を挙げることが出来る。Ｌ−グルタミン酸生合成に関与する酵素としては、例えば、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（以下、「GDH」ともいう）、グルタミンシンテターゼ、グルタミン酸シンターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、アコニット酸ヒドラターゼ、クエン酸シンターゼ（以下、「CS」ともいう）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（以下、「PEPC」ともいう）、ピルビン酸カルボキシラーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ、エノラーゼ、ホスホグリセルムターゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、フルトースビスリン酸アルドラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼなどをが挙げられる。これらの酵素遺伝子の中では、CS、PEPC及びGDHのいずれか１種以上が好ましく、３種全てがより好ましい。

以上のような方法によりクエン酸シンターゼ遺伝子、フォスフォエノールピルベートカルボキシラーゼ遺伝子、及び／又はグルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現が増強するように改変された腸内細菌科に属する微生物としては、米国特許6,197,559号、6,331,419号明細書、欧州特許0999282号明細書に記載された微生物が例示できる。

また、さらに６−ホスホグルコン酸デヒドラターゼ活性もしくは２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコン酸アルドラーゼ活性、又はこれらの両方の活性が増強するように改変された腸内細菌科に属する微生物を用いてもよい（欧州特許出願公開1352966号明細書）。

また、Ｌ−グルタミン酸生産能を有する腸内細菌科に属する微生物としては、Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐して他の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性を低下または欠損させた微生物を用いてもよい。Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素としては、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ、イソクエン酸リアーゼ、リン酸アセチルトランスフェラーゼ、酢酸キナーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼ、アセト乳酸シンターゼ、ギ酸アセチルトランスフェラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、１−ピロリンデヒドロゲナーゼなどが挙げられる。この中では特に、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を低下又は欠損させることが好ましい。

腸内細菌科に属する微生物の２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を欠損もしくは低下させる方法は、米国特許5,573,945米国特許6,197,559号明細書、米国特許6,331,419号明細書に記載されている。２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が欠損もしくは低下した腸内細菌科に属する微生物としては、具体的には、
パントエア・アナナティス AJ13601（FERM BP-7207)
クレブシエラ・プランティコーラ AJ13410株（FERM BP-6617）
パントエア・アナナティス AJ13355（FERM BP-6614)
エシェリヒア・コリ AJ12949（FERM BP-4881）
等が挙げられる。

本発明に用いるＬ−ヒスチジン生産菌として好ましいものは、Ｌ−ヒスチジン生合成に
関与する遺伝情報を担うDNAを組み込んだベクターを導入したエシェリヒア・コリFERM P-5038, FERM P-5048株 (特開昭56-005099)や、アミノ酸排出遺伝子Rhtを導入した菌株（欧州特許公開公報1016710）、スルファグアニジン、D,L-1,2,4-triazole-3-alanine、及びストレプトマイシン耐性が付与されたエシェリヒア・コリ80株（VKPM B-7270 ロシア特許公報2119536号）等が挙げられる。

Ｌ−ヒスチジン生産能を有する微生物としては、Ｌ−ヒスチジン生合成経路の酵素をコードする遺伝子の発現量が増大した微生物を用いてもよい。Ｌ−ヒスチジン生合成系酵素をコードする遺伝子としては、ATP フォスフォリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（hisG）、フォスフォリボシルAMP サイクロヒドロラーゼ遺伝子（hisI）、フォスフォリボシル-ATP ピロフォスフォヒドラーゼ（phosphoribosyＬ−ATP pyrophosphohydrolase）遺伝子（hisIE）、フォスフォリボシルフォルミミノ−５−アミノイニダゾールカルボキシアミドリボタイドイソメラーゼ（phosphoribosylformimino-5-aminoimidazole carboxamide ribotide Isomerase）遺伝子（hisA）、アミドトランスフェラーゼ遺伝子（amidotransferase）(hisH）、ヒスチヂノールフォスフェートアミノトランスフェラーゼ遺伝子（hisC）、ヒスチヂノールフォスファターゼ遺伝子（hisB）、ヒスチヂノールデヒドロゲナーゼ遺伝子（hisD）等が挙げられる。

本発明のＬ−システイン生産菌として好ましいものとしては、シスタチオニン−β−リアーゼ活性が低下した細菌（特開2003-169668号公報）や、Ｌ−システインによるフィードバック阻害が低減されたセリンアセチルトランスフェラーゼを保持するエシェリヒア属細菌（特開平11-155571号公報）が挙げられる。

本発明のＬ−プロリン生産菌として好ましいものとしては、3,4-デヒドロキシプロリン、アザチジン−２−カルボキシレート耐性株であるエシェリヒア・コリ702株（VKPMB-8011）や、702のilvA欠損株である702ilvA株（VKPMB-8012株）が挙げられる（特開2002−300874号公報）。

Ｌ−アルギニン生産菌としては、α−メチルメチオニン、ｐ−フルオロフェニルアラニン、Ｄ−アルギニン、アルギニンヒドロキサム酸、Ｓ−（２−アミノエチル）−システイン、α−メチルセリン、β−２−チエニルアラニン、又はスルファグアニジンに耐性を有するエシェリヒア・コリ変異株（特開昭56-106598号公報参照）等が挙げられる。また、Ｌ−アルギニンによるフィードバック阻害に耐性な変異を有し、かつ、高い活性を有するＮ−アセチルグルタミン酸シンターゼ及び同酵素を保持するＬ−アルギニン生産菌である、エシェリヒア・コリ２３７株（ロシア特許出願第2000117677号）も、好適なＬ−アルギニン生産株である。同株は、2000年４月10日にロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズム（Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNII Genetika） にVKPM B-7925の番号で寄託され、2001年５月18日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管された。237株の誘導体で、酢酸資化能を向上させたＬ−アルギニン生産菌である、エシェリヒア・コリ382株（特開2002-017342号公報）を用いることもできる。エシェリヒア・コリ382株は、2000年４月10日にRussian National Collection of Industrial Microorganisms（VKPM）にVKPM B-7926の番号で寄託されている。

またＬ−アルギニン生産能を有する微生物として、Ｌ−アルギニン生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現量を向上させた微生物を用いることが出来る。例えば、Ｌ−アルギニン生合成系酵素しては、Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ（argA）、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ（argC）、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ（argJ）、N-アセチルグルタミン酸キナーゼ（argB）、アセチルオルニチントランスアミナーゼ（argD）、アセチルオルニチンデアセチラーゼ（argE）オルニチンカルバモイルト
ランスフェラーゼ（argF）、アルギニノコハク酸シンターゼ（argG）、アルギニノコハク酸リアーゼ（argH）カルバモイルリン酸シンターゼ（carAB）から選ばれる１種又は２種以上が挙げられる。これらの酵素名の後のカッコ内は、各酵素をコードする遺伝子名である。中でもN-アセチルグルタミン酸シンターゼ（argA）は、野生型の１５位〜１９位に相当するアミノ酸配列が置換されたＬ−アルギニンによるフィードバック阻害が解除された変異型の遺伝子を用いるとより好適である（欧州出願公開1170361号明細書）。

Ｌ−ロイシン生産菌としては、ilvE遺伝子にコードされる分岐鎖アミノ酸トランスアミナーゼを不活性化させ、tyrB遺伝子にコードされる芳香族アミノ酸トランスアミナーゼの活性を増強させたエシェリヒア属細菌（特開2004-024259）4-アザロイシン又は5,5,5−トリフルオロロイシンに耐性を有する、エシェリヒア・コリH-9068株（ATCC21530）、エシェリヒア・コリH-9070株（FERM BP-4704）、エシェリヒア・コリH-9072株（FERM BP-4706）（米国特許第5,744,331号明細書）、Ｌ−ロイシンによるイソプロピルリンゴ酸シンターゼのフィードバック阻害が脱感作されたエシェリヒア・コリ株（欧州特許第1067191号明細書）、β−２チエニルアラニン及びβ−ヒドロキシロイシンに耐性を有するエシェリヒア・コリAJ11478株（米国特許第5,763,231号明細書）などを用いることもできる。

Ｌ−イソロイシン生産菌としては、Ｌ−イソロイシン生産能を有する６−ジメチルアミノプリン耐性のエシェリヒア・コリ変異株（特開平5-304969号公報）、Ｌ−イソロイシンハイドロキサメート耐性のエシェリヒア・コリ変異株（特開平5-130882号公報）、チアイソロイシン耐性のエシェリヒア・コリ変異株（特開平5-130882号公報）、ＤＬ−エチオニン耐性のエシェリヒア・コリ変異株（特開平5-130882号公報）、アルギニンハイドロキサメートに耐性の変異株（特開平5-130882号公報）があり、組換え体エシェリヒア属細菌としては、Ｌ−イソロイシン生合成酵素であるスレオニンデアミナーゼあるいはアセトヒドロキシ酸シンターゼをコードする遺伝子をプラスミドで増強した菌株（特開平2-458号公報、特開平2-42988号公報、特開平8-47397号公報）等が挙げられる。

Ｌ−バリン生産菌としては、例えばエシェリヒア・コリVL1970株（米国特許第5,658,766）等が挙げられる。また、WO96/06926に記載されているような、生育のためにリポ酸を要求する変異または／及びプロトンATPaseを欠損する変異を有 するＬ−バリン生産菌、あるいは、少なくともilvG、ilvM、ilvE及びilvDの各遺伝子を発現し、ilvGMEDAオペロンを含むＤＮＡ断片が細胞内に導入されたエシェリヒア属細菌も、好適に使用することができる。尚、ilvGMEDAオペロンは、Ｌ−バリン及び／又はＬ−イソロイシン及び／又はＬ−ロイシンによるオペロンの発現調節（アテニュエーション）を受けるので、生成するＬ−バリンによる発現抑制を解除するために、アテニュエーションに必要な領域が除去又は変異されていることが好ましい（米国特許5,998,178号明細書）。また、ilvGMEDAオペロンは、スレオニンデアミナーゼ活性を発現しないことが好ましい。上記のような、アテニュエーションが解除されるileS17変異を持つエシェリヒア・コリVL1970は、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズムス（VKPM）・デポジタリー GNIIgenetika（RussianNational Collection of Industrial Microorganisms（VKPM）Depositary, GNIIgenetika）（住所：1, Dorozhny Proezd., 1, 113545, Moscow, Russia）に、VKPM B-4411の登録番号で寄託されている。

また、本発明に用いるＬ−アミノ酸生産菌は、固有の生合成系酵素をコードする遺伝子以外に、糖の取り込み、糖代謝（解糖系）、エネルギー代謝に関与する遺伝子が増幅されていてもよい。

糖代謝に関与する遺伝子としては、解糖系酵素をコードする遺伝子や糖の取り込み遺伝子が挙げられ、グルコース６−リン酸イソメラーゼ遺伝子（pgi；国際公開第01/02542号パンフレット）、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ遺伝子（pps; 欧州出願公開8770
90号明細書）、ホスホグルコムターゼ遺伝子（pgm；国際公開03/04598号パンフレット）、フルクトース二リン酸アルドラーゼ遺伝子（pfkB;国際公開03/04664号パンフレット）、ピルビン酸キナーゼ遺伝子（pykF;国際公開03/008609号パンフレット）、トランスアルドラーゼ遺伝子（talB;国際公開03/008611号パンフレット）、フマラーゼ遺伝子（fum;国際公開01/02545号パンフレット）、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ遺伝子（pps;欧州出願公開877090号パンフレット）、non-PTSシュクロース取り込み遺伝子遺伝子（csc;欧州出願公開149911号パンフレット）、シュクロース資化性遺伝子（scrABオペロン；国際公開第90/04636号パンフレット）が挙げられる。

エネルギー代謝に関与する遺伝子としては、トランスヒドロゲナーゼ遺伝子（pntAB;米国特許 5,830,716号明細書）、cytochromoe bo type oxidase遺伝子(cyoB 欧州特許出願公開1070376号明細書)が挙げられる。

本発明の微生物は、上述したようなＬ−アミノ酸生産能を有する微生物をEvgAS二成分制御系に関与する転写因子をコードする遺伝子である、evgA遺伝子、gadE遺伝子、ydeO遺伝子から選択される一または二以上の遺伝子の発現量が増大するように改変することによって得ることができる。先にevgA遺伝子、gadE遺伝子、ydeO遺伝子の発現量が増強するように改変する行った後に、目的物質生産能を付与してもよい。なお、evgA遺伝子、gadE遺伝子、ydeO遺伝子の発現量増強は、後述するように、プロモーター改変を始めとする発現調節領域改変などによる内因性evgA遺伝子、gadE遺伝子、ydeO遺伝子の発現増強であってもよいし、evgA遺伝子、gadE遺伝子、ydeO遺伝子を含むプラスミドの導入などによる外因性evgA遺伝子、gadE遺伝子、ydeO遺伝子の発現増強であってもよい。さらに、これらを組み合わせてもよい。

本発明における「EvgAS二成分制御系」とは、EvgS-EvgAのヒスチジン−アスパラギン酸リン酸リレー制御により、転写因子を活性化している経路を意味する。詳しくは、センサーキナーゼであるEvgSタンパク質（配列番号26）が、同タンパク質のヒスチジン残基を自己リン酸化し、次いで、レスポンスレギュレーターであり転写因子であるEvgAタンパク質(配列番号24)の特定のアスパラギン酸残基にリン酸基を転移する。レスポンスレギュレーター転写因子であるEvgAは、このリン酸化によって活性化され、多くの遺伝子の転写を制御するとともに、転写因子であるYdeOタンパク質(配列番号30)をコードする遺伝子ydeO(配列番号29)及び/又はGadEタンパク質(配列番号28)をコードする遺伝子gadE(配列番号27)の転写を活性化する（J. Bacteriol. 184:6225-6234, 2002; Mol. Microbiol. 48:699-712, 2003）。YdeOタンパク質もgadE遺伝子の転写を活性化する。gadE遺伝子は、活性化されたEvgAタンパク質及びYdeOタンパク質によって転写が活性される結果、GadEタンパク質の発現量が増大し、正の転写因子として他の遺伝子の転写を増強させる（Microbiology. 150:61-72, 2004; J Bacteriol. 186:7378-89, 2004）。従って、本発明における「EvgAS二成分制御系に関与する転写因子」とは、EvgAタンパク質、GadEタンパク質、及びYdeOタンパク質を意味する。

ここで、本発明において、「センサーキナーゼ」とは、環境因子であるリガンドを感知し、ATPを用いて自分自身のヒスチジン残基をリン酸化した後、レスポンスレギュレーターにそのリン酸基を渡す役割を担うタンパク質である。本発明において、「レスポンスレギュレーター」とは、センサーキナーゼより特定のアスパラギン酸にリン酸化を受けとることで活性化され、細胞内に情報を伝る役割を担うタンパク質であり、多くの場合、転写因子である。

EvgAタンパク質、GadEタンパク質、YdeOタンパク質をコードする遺伝子（以下evgA、gadE、ydeO遺伝子）の発現が親株、例えば野生株や非改変株と比べて向上していることの確認は、mRNAの量を野生型、あるいは非改変株と比較することによって確認出来る。発現量
の確認方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、Reverse-Transcriptase PCR（RT-PCR）が挙げられる（Sambrook, J., and Russell, D.W. Molecular Cloning A Laboratory Manual/Third Edition. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)）。酵素活性の上昇については、野生株あるいは非改変株と比較して、上昇していればいずれでもよいが、例えば野生株、非改変株と比べて１．５倍以上、より好ましくは２倍以上、さらに好ましくは３倍以上上昇していることが望ましい。また、酵素活性の増強は、目的とするタンパク質量が非改変株、野生株と比較して上昇していることによって確認することができ、例えば抗体を用いてウェスタンブロットによって検出することが出来る（Sambrook, J., and Russell, D.W. Molecular Cloning A Laboratory Manual/Third Edition. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)）。

本発明における「転写因子」とは、EvgSA二成分制御系で発現が支配される遺伝子の転写因子を意味し、EvgAタンパク質、GadEタンパク質、及びYdeOタンパク質が該当する。EvgAタンパク質、GadEタンパク質及びYdeOタンパク質は、EvgSA二成分制御系の支配下に属する種々の生合成系酵素を正に転写を調節する。例えば、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（6-phosphogluconate dehydrogenase（GND））をコードするgnd遺伝子やアデニルコハク酸シンターゼ（adenylosuccinate synthase）をコードするpurA遺伝子の転写がEvgAS二成分制御系の転写因子により活性化される。すなわち、EvgAタンパク質、GadEタンパク質、YdeOタンパク質の産生量を野生株、または非改変株と比べて向上させることによって、EvgAS二成分制御系で発現が支配される遺伝子の転写量が増大する。転写因子の活性は、ＤＮＡとの結合を測定する方法として電気泳動移動度シフト解析法（electrophoretic mobility shift assay）、試験管内で転写活性を測定する試験管内転写解析法（in vitro transcription assay）により測定することが可能である（Sambrook, J., and Russell, D.W. Molecular Cloning A Laboratory Manual/Third Edition. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)）。

本発明のevgA遺伝子とは、エシェリヒア属細菌のevgA遺伝子、及びそのホモログをいう。エシェリヒア・コリのevgA遺伝子としては、配列番号２４のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子（配列番号２３）を例示することができる（Genbank Accession No. NP_416870 [gi:16130301]）。

evgA遺伝子ホモログとは、他の微生物由来で、エシェリヒア属細菌のevgA遺伝子構造と高い類似性を示し、宿主に導入した際にＬ−アミノ酸の生産能を向上させ、転写因子の活性を示す遺伝子をいう。例えばevgAのホモログとしては、サルモネラ属、シゲレラ属、エルシニア属等のGenbankに登録されているevgA遺伝子が挙げられる。さらに、evgA遺伝子は、上記で例示された遺伝子との相同性に基づいて、コリネバクテリウム・グルタミカム、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム等のコリネ型細菌、シュードモナス・アエルジノーサ等のシュードモナス属細菌、マイコバクテリウム・ツベルクロシス等のマイコバクテリウム属細菌、バチルス属細菌からクローニングされるものであってもよい。エシェリヒア属細菌のevgAと相同性が高ければ、異なる遺伝子名が付与されているものでもよい。例えば、evgA遺伝子ホモログは、配列番号１７、配列番号１８の合成オリゴヌクレオチドを用いてクローニング出来る遺伝子も含まれる。

また、evgA遺伝子ホモログの塩基配列は、上記の配列情報に基づき、相同性が高い遺伝子を公知のデータベースから検索することにより取得できる。アミノ酸配列および塩基配列の相同性は、例えばKarlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST(Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873 (1993))やFASTA(Methods Enzymol., 183, 63 (1990))を用いて決定することができる。このアルゴリズムBLASTに基づいて、BLASTNやBLASTXとよばれるプログラムが開発されている(http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/参照)。

本発明のgadE遺伝子とは、エシェリヒア属細菌のgadE遺伝子、及びそのホモログをいう。エシェリヒア・コリのgadE遺伝子としては、配列番号２８のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子（配列番号２７）を例示することができる（Genbank Accession No. NP_417969 [gi:16131384]）。

gadE遺伝子ホモログとは、上述のevgA遺伝子ホモログ同様、他の微生物由来で、エシェリヒア属細菌のgadE遺伝子構造と高い類似性を示し、宿主に導入した際にＬ−アミノ酸の生産能を向上させ、転写因子の活性を示す遺伝子をいう。gadE遺伝子ホモログは、配列番号１９、配列番号２０の合成オリゴヌクレオチドを用いてクローニング出来る遺伝子も含まれる。

本発明のydeO遺伝子とは、エシェリヒア属細菌のydeO遺伝子、及びそのホモログをいう。エシェリヒア・コリのydeO遺伝子としては、配列番号２８のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子（配列番号２７）を例示することができる（Genbank Accession No. NP_417969 [gi:16131384]）。

ydeO遺伝子ホモログとは、上述のydeO遺伝子ホモログ同様、他の微生物由来で、エシェリヒア属細菌のydeO遺伝子構造と高い類似性を示し、宿主に導入した際にＬ−アミノ酸の生産能を向上させ、転写因子の活性を示す遺伝子をいうydeO遺伝子ホモログは、配列番号２１、配列番号２２の合成オリゴヌクレオチドを用いてクローニング出来る遺伝子も含まれる。

また、本発明に用いるevgA遺伝子、gadE遺伝子、ydeO遺伝子は、野生型遺伝子には限られず、コードされるタンパク質の機能、すなわち転写因子活性が損なわれない限り、配列番号２４、２８、３０のアミノ酸配列において、１若しくは複数の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含む配列を有するタンパク質をコードする、変異体又は人為的な改変体であってもよい。ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には２〜２０個、好ましくは２〜１０個、より好ましくは２〜５個を意味する。上記の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加は、転写因子活性が維持される保存的変異である。保存的変異とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換であり、保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、evgA、gadE、ydeO遺伝子を保持する微生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。このような遺伝子は、例えば、部位特異的変異法によって、コードされるタンパク質の特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入または付加を含むように配列番号２３、２５、２９に示す塩基配列を改変することによって取得することができる。

さらに、evgA 、gadE、ydeO遺伝子は、配列番号２４、２８、３０のアミノ酸配列全体に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上の相同性を有するタンパク質をコードし、かつ、転写因子をコードする配列を用いることが出来る。また、それぞれevgA、gadE、ydeO遺伝子が導入される宿主で使用しやすいコドンに置換したものでもよい。同様にevgA、gadE、ydeO遺伝子は、転写因子の機能を有する限り、Ｎ末端側、C末端側が延長したものあるいは削られているものでもよい。例えば延長・削除する長さは、アミノ酸残基で50以下、好ましくは20以下、より好ましくは10以下、特に好ましくは5以下である。より具体的には、配列番号２４、２８、３０のアミノ酸配列のＮ末端側より50アミノ酸から5アミノ酸、Ｃ末端側より50アミノ酸から5アミノ酸延長・削除したものでもよい。

また、以下のような従来知られている変異処理によっても取得され得る。変異処理としてはevgA、gadE、ydeO遺伝子をヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、および該遺伝子を保持する微生物、例えばエシェリヒア属細菌を、紫外線またはN-メチル-N’-ニトロ-N-ニトロソグアニジン(NTG)もしくはエチルメタンスルフォネート（EMS）等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。これらの遺伝子が転写因子活性を有するタンパク質をコードしているか否かは、例えば、これらの遺伝子を適当な細胞で発現させ、転写因子活性を有しているかを調べることにより、確かめることができる。

また、evgA、gadE、ydeO遺伝子はそれぞれ、配列番号２３、２７、３０の塩基配列又はこれらの配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ転写因子活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば70％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である60℃、１×ＳＳＣ，0.1％ＳＤＳ、好ましくは、0.1×ＳＳＣ、0.1％ＳＤＳ、さらに好ましくは、68℃、0.1×ＳＳＣ、0.1％ＳＤＳに相当する塩濃度、温度で、１回、より好ましくは２〜３回洗浄する条件が挙げられる。

プローブとしては、配列番号２３、２７、２９またはこれらの一部の配列を用いることもできる。そのようなプローブは、、配列番号２３、２７、２９の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、これらの塩基配列を含むＤＮＡ断片を鋳型とするＰＣＲによって作製することができる。例えば、プローブとして、300 bp程度の長さのＤＮＡ断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件は、50℃、2×ＳＳＣ、0.1％ＳＤＳが挙げられる。

evgA、gadE、ydeO遺伝子の発現を増強するための改変は、例えば、遺伝子組換え技術を利用して、細胞中の遺伝子のコピー数を高めることによって行うことができる。例えば、
evgA、gadE、ydeO遺伝子を含むＤＮＡ断片を、宿主微生物で機能するベクター、好ましくはマルチコピー型のベクターと連結して組換えDNAを作製し、これを微生物に導入して形質転換すればよい。

evgA、gadE、ydeO遺伝子としてエシェリヒア・コリのevgA、gadE、ydeO遺伝子を用いる場合、配列番号２３、２７、２９の塩基配列に基づいて作製したプライマー、例えば、evgA遺伝子の場合、配列番号１７及び１８に示すプライマー、gadE遺伝子の場合、配列番号１９、２０に示すプライマー、ydeO遺伝子の場合、配列番号２１及び２２に示すプライマ
ーを用いて、エシェリヒア・コリのゲノムDNAを鋳型とするPCR法（PCR：polymerase chain reaction； White,T.J. et al., Trends Genet. 5, 185 (1989)参照）によって、evgA、gadE、ydeO遺伝子を取得することができる。他の腸内細菌科に属する微生物のevgA、gadE、ydeO遺伝子も、その微生物において公知のevgA、gadE、ydeO遺伝子もしくは他種の微生物のevgA、gadE、ydeO遺伝子又は、他の転写因子の配列情報に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲ法、又は、前記配列情報に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプローブとするハイブリダイゼーション法によって、微生物のゲノムＤＮＡ又はゲノムＤＮＡライブラリーから、取得することができる。なお、ゲノムＤＮＡは、ＤＮＡ供与体である微生物から、例えば、斎藤、三浦の方法（H. Saito and K.Miura, Biochem. Biophys. Acta, 72, 619 (1963)、生物工学実験書、日本生物工学会編、97-98頁、培風館、1992年参照）等により調製することができる。

次に、PCR法により増幅されたevgA、gadE、ydeO遺伝子を、宿主微生物の細胞内において機能することのできるベクターDNAに接続して組換えDNAを調製する。宿主微生物の細胞内において機能することのできるベクターとしては、宿主微生物の細胞内において自律複製可能なベクターを挙げることができる。エシェリヒア・コリ細胞内において自律複製可能なベクターとしては、pUC19、pUC18、pHSG299、pHSG399、pHSG398、pACYC184（pHSG、pACYCは宝バイオ社より入手可）、RSF1010、pBR322、pMW219（pMW219はニッポンジーン社より入手可）、pSTV29(宝バイオ社より入手可)等が挙げられる。

上記のように調製した組換えDNAを微生物に導入するには、これまでに報告されている形質転換法に従って行えばよい。例えば、エシェリヒア・コリK-12について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してDNAの透過性を増す方法（Mandel,M.and Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)）があり、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してDNAを導入する方法（Duncan, C. H.,Wilson, G. A. and Young, F. E., Gene, 1, 153 (1977)）がある。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵母について知られているような、DNA受容菌の細胞を、組換えDNAを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えDNAをDNA受容菌に導入する方法（Chang, S. and Choen, S. N., Molec.
Gen. Genet., 168, 111 (1979); Bibb, M. J., Ward, J. M. and Hopwood, O. A., Nature, 274, 398 (1978); Hinnen, A., Hicks, J. B. and Fink, G. R., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 75, 1929 (1978)）も応用できる。

一方、evgA、gadE、ydeO遺伝子のコピー数を高めることは、上述のようなevgA、gadE、ydeO遺伝子を微生物のゲノムDNA上に多コピー存在させることによっても達成できる。微生物のゲノムDNA上にevgA、gadE、ydeO遺伝子を多コピーで導入するには、ゲノムDNA上に多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行う。ゲノムDNA上に多コピー存在する配列としては、レペティティブDNA、転移因子の端部に存在するインバーテッド・リピートが利用できる。また、ゲノム上に存在するevgA、gadE、ydeO遺伝子の横にタンデムに連結させてもよいし、ゲノム上の不要な遺伝子上に重複して組み込んでもよい。これらの遺伝子導入は、温度感受性ベクターを用いて、あるいはintegrationベクターを用いて達成することが出来る。

あるいは、特開平2-109985号公報に開示されているように、evgA、gadE、ydeO遺伝子をトランスポゾンに搭載してこれを転移させてゲノムDNA上に多コピー導入することも可能である。ゲノム上に遺伝子が転移したことの確認は、evgA、gadE、ydeO遺伝子の一部をプローブとして、サザンハイブリダイゼーションを行うことによって確認出来る。

さらに、evgA、gadE、ydeO遺伝子の発現の増強は、上記した遺伝子コピー数の増幅以外に、国際公開00/18935号パンフレットに記載した方法で、ゲノムDNA上またはプラスミド
上のevgA、gadE、ydeO遺伝子の各々のプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換することや、各遺伝子の−35、−10領域をコンセンサス配列に近づけること、evgA、gadE、ydeO遺伝子の発現を上昇させるようなレギュレーターを増幅すること、又は、evgA、gadE、ydeO遺伝子の発現を低下させるようなレギュレーターを欠失または弱化させることによっても達成される。例えば、lacプロモーター、trpプロモーター、trcプロモーター、tacプロモーター、araBAプロモーター、ラムダファージのPRプロモーター、PLプロモーター、tetプロモーター、T7プロモーター、φ10プロモーター等が強力なプロモーターとして知られている。また、evgA、gadE、ydeO遺伝子のプロモーター領域、SD領域に塩基置換等を導入し、より強力なものに改変することも可能である。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Goldsteinらの論文（Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128 (1995)）等に記載されている。さらに、リボソーム結合部位（RBS）と開始コドンとの間のスペーサー、特に開始コドンのすぐ上流の配列における数個のヌクレオチドの置換がmRNAの翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られており、これらを改変することも可能である。evgA、gadE、ydeO遺伝子のプロモーター等の発現調節領域は、プロモーター検索ベクターやGENETYX等の遺伝子解析ソフトを用いて決定することも出来る。これらのプロモーター置換または改変によりevgA、gadE、ydeO遺伝子の発現が強化される。発現調節配列の置換は、例えば温度感受性プラスミドを用いた方法や、Redドリブンインテグレーション法(WO2005/010175)を使用することが出来る。

また、evgA、gadE、ydeO遺伝子によって発現が制御される遺伝子の転写活性が上昇するような変異をevgA、gadE、ydeO遺伝子に導入してもよい。evgA、gadE、ydeO遺伝子によってコードされるタンパク質の活性が上昇するような変異としては、evgA、gadE、ydeO遺伝子の転写量が増大するようなプロモーター配列の変異、及び、転写の比活性が高くなるような遺伝子のコード領域内の変異が挙げられる。

本発明において、evgA、gadE、ydeO遺伝子がコードするタンパク質は、ヒスチジンキナーゼEvgSによって活性化されるので、本発明の微生物は、EvgSをコードするevgS遺伝子の発現量の増大によって、evgA、gadE、ydeO遺伝子の発現量が増大したものでもよい。ここで、本発明のevgS遺伝子とは、エシェリヒア属細菌のevgS遺伝子、及びそのホモログをいう。エシェリヒア・コリのevgS遺伝子としては、配列番号26のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子（配列番号25）を例示することができる（Genbank Accession No. NP_417969 [gi:16131384]）。

evgS遺伝子ホモログとは、他の微生物由来で、エシェリヒア属細菌のevgS遺伝子構造と高い類似性を示し、宿主に導入した際にＬ−アミノ酸の生産能を向上させ、転写因子の活性を示す遺伝子をいう。例えばevgSのホモログとしては、サルモネラ属、シゲレラ属、エルシニア属等のGenbankに登録されているevgS遺伝子が挙げられる。さらに、evgS遺伝子は、上記で例示された遺伝子との相同性に基づいて、コリネバクテリウム・グルタミカム、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム等のコリネ型細菌、シュードモナス・アエルジノーサ等のシュードモナス属細菌、マイコバクテリウム・ツベルクロシス等のマイコバクテリウム属細菌、バチルス属細菌からクローニングされるものであってもよい。エシェリヒア属細菌のevgSと相同性が高ければ、異なる遺伝子名が付与されているものでもよい。例えば、エシェリヒア・コリでは、evgS遺伝子はevgA遺伝子とオペロンを形成しており、配列番号１７、配列番号１８の合成オリゴヌクレオチドを用いたPCRにより、evgA遺伝子とともに取得することができる。他の微生物でも、同様に配列番号１７、配列番号１８のオリゴヌクレオチドを用いて、これらの遺伝子を取得できると考えられる。

また、本発明に用いるevgS遺伝子は、野生型遺伝子には限られず、コードされるタンパク質の機能、すなわち転写因子活性が損なわれない限り、配列番号２６のアミノ酸配列に
おいて、１若しくは複数の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含む配列を有するタンパク質、すなわち保存的変異を有するタンパク質をコードする、変異体又は人為的な改変体であってもよい。「数個」、「保存的変異」とは、前記evgA遺伝子、gadE遺伝子、ydeO遺伝子について記載したのと同様である。

evgSの発現量の増大は、上述のevgA、gadE、ydeO遺伝子の発現量向上と同様の方法を用いて行うことができる。evgA、gadE、ydeO遺伝子の発現量の増大は、すべての遺伝子について上記の手段のいずれか一つによって行われてもよく、各々の遺伝子毎に異なる手段によって行われてもよい。

＜２＞Ｌ−アミノ酸の製造法
本発明のＬ−アミノ酸の製造法は、本発明の微生物を培地で培養して、Ｌ−アミノ酸を該培地中に生成蓄積させ、該培地又は菌体よりＬ−アミノ酸を回収することを特徴とする。

使用する培地は、微生物を用いたＬ−アミノ酸の発酵生産において従来より用いられてきた培地を用いることができる。すなわち、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地を用いることができる。ここで、炭素源としては、グルコース、シュクロース、ラクトース、ガラクトース、フラクトースやでんぷんの加水分解物などの糖類、グリセロールやソルビトールなどのアルコール類、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類を用いることができる。なかでも、グルコース、フルクトース、シュクロースを炭素源として用いることが好ましい。窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。有機微量栄養源としては、ビタミンＢ１、Ｌ−ホモセリンなどの要求物質または酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。これらの他に、必要に応じて、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。なお、本発明で用いる培地は、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じてその他の有機微量成分を含む培地であれば、天然培地、合成培地のいずれでもよい。

また生育や生産性を向上させるようなＬ−アミノ酸を添加する場合がある。例えばＬ−リジン発酵の場合、Ｌ−スレオニン、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−イソロイシンを、Ｌ−スレオニン発酵の場合、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−ホモセリンを、Ｌ−トリプトファン発酵では、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン等を添加することが好ましい。添加濃度は0.01-10g/L程度である。

培養は好気的条件下で１〜７日間実施するのがよく、培養温度は２４℃〜３７℃、培養中のｐＨは５〜９がよい。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用することができる。発酵液からのＬ−アミノ酸の回収は通常イオン交換樹脂法、沈殿法その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。なお、菌体内にＬ−アミノ酸が蓄積する場合には、例えば菌体を超音波などにより破砕し、遠心分離によって菌体を除去して得られる上清からイオン交換樹脂法などによって、Ｌ−アミノ酸を回収することができる。

以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。

〔参考例１〕＜Ｌ−トリプトファン生産菌の構築＞
＜1−１＞serA遺伝子の導入
プラスミドpGH5（国際公開第9408031号パンフレット）上のホスホグリセレートデヒド
ロゲナーゼ遺伝子（serA）の、トランスポゾンMudを用いたゲノム上への挿入を試みた。MudII1734を含有するプラスミドpCE1134（特開平2-109985号公報）をBamHIで切断してlacオペロン含有DNA断片を除去し、平滑末端後SmaIリンカーを挿入した。このプラスミドをSmaIで再切断し自己閉環して得られたプラスミドをpMu1134と命名した。E. coli由来のserA遺伝子を含有するプラスミドpGH5からScaI、SalI切断にてserA含有DNA断片を切り出し、平滑末端後、上記のpMu1134のSmaIサイトに挿入することによって、pGH5由来のserA遺伝子が挿入されたMud（MudserAと命名）を搭載したプラスミドpMudserAを構築した。

脱感作型アントラニル酸合成酵素を保持するＬ−トリプトファン生産菌SV164株（国際公開第9408031号パンフレット）を受容菌として、pMudserAを用いて定法に従いカナマイシン耐性付与を指標にしてMudserAをゲノム上に転移させた菌株L1株を取得した。L1株は、サザンハイブリダイゼーション実験の結果、MudserAの挿入位置は一箇所のみと推定された。また、PCRによるMudserA含有ゲノムDNA断片のクローニングとその塩基配列決定にて、E. coli K-12ゲノム（GenBank Accession No. U00096）上のNo.240,950の位置に挿入されていると同定された。

＜１−２＞trpオペロンの導入
次に、trpオペロンのトランスポゾンを用いたゲノム上への挿入によるコピー数の追加を試みた。trpオペロン遺伝子はプラスミドpGX100より切り出した。pGX100は、pBR313に、脱感作型trpE遺伝子を有するE. coli MTR#2株（米国特許第4,371,614号明細書）由来のDNA断片を挿入したものであり、XhoI、SmaI切断によって約7.6 kbのtrpオペロン含有DNA断片を切り出すことができる。pGX100からXhoI、SmaI切断にてtrpオペロン含有DNA断片を切り出し、平滑末端後、上記のpCE1134のSmaIサイトに挿入した。同様のtrpオペロン含有DNA断片は、E. coli MTR#2株ゲノムDNAより、配列表に記載した配列番号１及び２のプライマーを用いて直接PCR法によってクローニングすることも可能である。以上のようにして、MTR#2株由来のtrpオペロン遺伝子が挿入されたMud（MudtrpG' lacと命名）を搭載するプラスミドpMudtrpG’lacが構築された。

MudtrpG' lacのゲノム上への挿入によるコピー数の追加に先立ち、挿入株の選択マーカーとしてラクトース資化能相補を用いる目的で、宿主株へのラクトース資化能欠損の性質付与を実施した。L1株に、Ｌ−スレオニン生産菌VKPM B-3996由来のilvG遺伝子をP1形質導入することによって（米国特許第5,175,107号明細書）Ｌ−バリン耐性を導入した（国際公開WO2005/103228号パンフレット参照）。定法に従い、P1形質導入実験を実施し、M9最小培地（4 g/L glucose、12.8 g/L Na₂HPO₄・7H2O、3 g/L KH₂PO4、0.5 g/L NaCl、1 g/L NH₄Cl、5 mM MgSO₄、0.1 mM CaCl₂、1 mg/L thiamine、20 mg/l L-Phe、20 mg/L L-Tyr、20 mg/L L-Met、3 mg/L pyridoxine、20 mg/L L-Val、20 mg/L tetracycline）に塗布し、出現したコロニーをVal耐性株として取得し、L1ValRと名づけた。

ME8581株（HfrH(valS←uxuAB):lacZ98::Tn10 relA1 thi-1、国立遺伝学研究所に寄託）よりTn10由来のテトラサイクリン耐性を指標として、lacZ98::Tn10を定法に従いL1ValRにP1形質導入した。得られた株は、予想通りラクトース資化能は欠損していた。次いで、ラクトース資化能は欠損しているが、Tn10自体は除去された株を取得するため、形質導入株からテトラサイクリン感受性株14-1-lac-tetsを、レプリカ処理によって取得した。14-1-lac-tets株は、ラクトース資化能は欠損したままであった。サザンハイブリダイゼーション実験にて同株のTn10の状況を確認したところ、tet遺伝子にハイブリするバンドは検出されなかったが、Tn10のIS10領域にハイブリするバンドは検出されたので、本株ではlacZ遺伝子上にIS10が残存していると考えられた。

14-1-lac-tets株を受容菌として、pMudtrpG' lacを用いて定法に従いラクトース資化能相補を指標にしてMudtrpG' lacをゲノム上に転移させた菌株N0.202株を取得した。得られ
たトランスポゾン挿入株から挿入トランスポゾンあるいはトランスポゾン上の遺伝子が脱落しやすい場合には、栄養培地上で植え継ぎ、カナマイシン耐性、ラクトース資化能等を安定に保持する菌株を選択すればよい。No.202株は、サザンハイブリダイゼーション実験の結果、MudtrpG' lacの挿入位置は一箇所のみと推定された。また、PCRによるMudtrpG' lac含有ゲノムDNA断片のクローニングとその塩基配列決定にて、E. coliK-12ゲノム（GenBank Accession No. U00096）上のNo.530,249の位置に挿入されていると同定された。

次にシュクロース資化性に関与する遺伝子scrK, scrY, scrA, scrB, scrRをP1形質導入により、No.202に導入し、本菌株をNo.202 scrとした（国際公開パンフレットWO90/04636号参照）。
＜１−３＞iclR破壊用プラスミド構築

添付説明書にしたがってPyrobest DNA Polymerase（宝酒造）を用いたPCR法によりiclR断片を増幅した。PCR反応には、RNA/DNA maxi Kit（キアゲン）を用いて抽出したW3110ゲノムを鋳型とし、プライマーには配列表に示した配列番号３、配列番号４のオリゴヌクレオチドを用いた。PCR後の増幅DNA断片は、Wizard PCR Preps（プロメガ）を用いて精製した。精製したDNA断片を制限酵素EcoRI、HindIII（宝酒造）にて切断したのち、フェノールクロロホルム処理、エタノール沈殿を行い精製した。この切断断片と、同酵素にて切断し精製したpUC18（宝酒造）とを、DNA ligation Kit Ver.2（宝酒造）を用いて結合した。この結合反応液にてJM109コンピテント細胞（宝酒造）を形質転換し、アンピシリン（Amp）（明治製菓）を50μg/mL含むLB寒天プレート（LB+Ampプレート）にまき、37℃でコロニーを選択した。コロニーを50μg/mL のAmpを含むLB培地で37℃にて試験管培養し、自動プラスミド抽出機PI-50（クラボウ）を用いてプラスミド抽出を行った。

得られたプラスミドpUCiclRを制限酵素EcoO65I（宝酒造）にて切断した後、BKL kit（宝酒造）を用いて末端平滑化及び結合を行った。結合反応液にてJM109を形質転換し、上記のようにコロニーの選択、プラスミド抽出を行った。得られたプラスミドをEcoRI、HindIIIで切断後精製し、同酵素で切断後精製した温度感受性プラスミドpTS1（pMAN031（J. Bacteriol. 162, 1196-1202 (1985)、図１参照）とpBR322（宝酒造）のそれぞれのPstI-HindIII断片を繋ぎ換えたもの）と結合した。結合反応液にてJM109を形質転換し、LB+Ampプレートにて30℃でコロニーを選択した。コロニーを50 μg/mL のAmpを含むLB培地で30℃にて試験管培養し、上記のようにプラスミドを抽出した。EcoRI、HindIIIで切断して目的長断片が得られるプラスミドを、iclR破壊用プラスミドpTSΔiclRとした。

＜１−４＞ iclR破壊株の取得
pTSΔiclR でNo.202scrを形質転換し、LB+Ampプレート上30℃でコロニーを選択した。30℃で液体培養を一晩おこなった後10^-3希釈してLB+Ampプレートにまき、42℃でコロニーを選択した。30℃でLB+Ampプレートに塗り広げた後、1/8プレート分の菌体をLB培地 2 mLに懸濁し、42℃で4-5時間振とう培養した。10^-5希釈した菌体をLBプレートにまき得られたコロニーのうち数百コロニーをLBプレートとLB＋Ampプレートに植菌し生育を確認することで、Amp感受性・耐性を確認した。Amp感受性株について配列番号３及び４のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてコロニーPCRを行い、増幅断片がEcoO65Iにより切断されないものをiclR欠損株（No.202ΔiclR）として取得した。

〔実施例１〕＜evgAS,gadE,ydeO遺伝子増強用プラスミドの構築＞
＜１−１＞ evgA,evgS遺伝子増強用プラスミドの構築
エシェリヒア・コリ(エシェリヒア・コリK-12株)のゲノムの全塩基配列は既に明らかにされており（Science, 277, 1453-1474 (1997)）、evgASはオペロン構造を形成していることが知られている。この文献に報告されているevgAS遺伝子の塩基配列（Genbank Accession No. AAC75428, AAC75429）に基づいて、5’プライマーとしてHindIIIサイトを有し
た配列番号１７に示す合成オリゴヌクレオチド、3’側プライマーとしてEcoRIサイトを有した配列番号１８に示す合成オリゴヌクレオチドを作製した。これらのプライマーを用いて、エシェリヒア・コリ W3110株のゲノムDNAを鋳型としてPCRを行い、制限酵素HindIII及びEcoRIにて処理し、evgAS遺伝子を含む遺伝子断片を得た。精製したPCR産物を、HindIII及びEcoRIで消化したベクターpMW118（ニッポンジーン社製）に連結してevgAS遺伝子増幅用プラスミドpMW-evgASを構築した。

＜１−２＞ gadE増強用プラスミドの構築
エシェリヒア・コリ(エシェリヒア・コリK-12株)のゲノムの全塩基配列は既に明らかにされており（Science, 277, 1453-1474 (1997)）、この文献に報告されているgadE遺伝子の塩基配列（Genbank Accession No. AAC76537）に基づいて、5’プライマーとしてBamHIサイトを有した配列番号１９に示す合成オリゴヌクレオチド、配列番号２０に示す3’側プライマーとしてHindIIIサイトを有した合成オリゴヌクレオチドを作製した。これらのプライマーを用いて、エシェリヒア・コリ W3110株のゲノムDNAを鋳型としてPCRを行い、制限酵素HindIII及びBamHIにて処理し、gadE遺伝子を含む遺伝子断片を得た。精製したPCR産物を、HindIII及びBamHIで消化したベクターpMW118（ニッポンジーン社製）に連結してgadE増幅用プラスミドpMW-gadEを構築した。

＜１−３＞ ydeO増強用プラスミドの構築
エシェリヒア・コリ(エシェリヒア・コリK-12株)のゲノムの全塩基配列は既に明らかにされており（Science, 277, 1453-1474 (1997)）、この文献に報告されているydeO遺伝子の塩基配列（Genbank Accession No. AAC74572）に基づいて、5' プライマーとしてHindIIIサイトを有した配列番号２１に示す合成オリゴヌクレオチド、3’側プライマーとしてEcoRIサイトを有した配列番号２２に示す合成オリゴヌクレオチドを作製した。これらのプライマーを用いて、エシェリヒア・コリ W3110株のゲノムDNAを鋳型としてPCRを行い、制限酵素HindIII及びEcoRIにて処理し、ydeO遺伝子を含む遺伝子断片を得た。精製したPCR産物を、HindIII及びEcoRIで消化したベクターpMW118（ニッポンジーン社製）に連結してydeO増幅用プラスミドpMW-ydeOを構築した。

〔実施例２〕エシェリヒア属細菌Ｌ−トリプトファン生産株でのevgAS遺伝子、ydeO遺伝子、gadE遺伝子増幅の効果

参考例１にて構築したＬ−トリプトファン生産株No.202ΔiclR株を、実施例１で作製したgadE増幅用プラスミドpMW-gadEとevgAS増幅用プラスミドpMW-evgAS、及びydeO増幅プラスミドpMW-ydeOで形質転換し、アンピシリン耐性株を得た。所定のプラスミドが導入されていることを確認し、gadE増幅用プラスミドpMW-gadE導入株をNo.202ΔiclR /gadE株、evgAS増幅用プラスミドpMW-evgAS導入株をNo.202ΔiclR /evgAS株、及びydeO増幅用プラスミドpMW-ydeO導入株をNo.202ΔiclR /ydeO株と名づけた。
No.202ΔiclR株の代りに他の公知のＬ−トリプトファン生産菌でevgAS、ydeO又はgadEを同様にして増幅してもよい。

上記で作製した株を50 mg/Lのアンピシリンを含むLB培地にてOD600が約0.6となるまで37℃にて培養した後、培養液と等量の40%グリセロール溶液を加えて攪拌した後、適当量ずつ分注、-80℃に保存し、グリセロールストックとした。

これらの株のグリセロールストックを融解し、各100 μLを、50 mg/Lのアンピシリンを含むLプレートに均一に塗布し、37℃にて24時間培養した。得られたプレートのおよそ1/8量の菌体を、500 mL容坂口フラスコの、50 mg/Lのアンピシリンを含む発酵培地の20 mLに接種し、往復振とう培養装置で37℃において48時間培養した。培養後、培地中に蓄積したＬ−トリプトファンの量をアミノ酸アナライザーL-8500（Hitachi社製）を用いて測定し
た。培養に用いた培地組成を以下に示す。

［Ｌ−トリプトファン生産培地］
Glucose 40 g/L
(NH₄)₂SO₄ 15 g/L
KH₂PO₄ 1.5 g/L
MgSO₄・7H₂O 0.3 g/L
FeSO₄・7H₂O 0.01 g/L
MｎSO₄・7H₂O 0.01 g/L
Yeast Extract 2.0 g/L
ThiaminHCl 0.005 g/L
Pyridoxine 0.03 g/L
L-Met 0.05 g/L
L-Phe 0.1 g/L
L-Tyr 0.1 g/L
CaCO₃ 30 g/L
KOHでpH7.0に調整し、120℃で20分オートクレーブを行なった。但し、GlucoseとMgSO₄・7H₂Oは混合し、他の成分と別殺菌した。CaCO₃は乾熱滅菌後に添加した。

４８時間目のOD600とＬ−トリプトファン蓄積を表１に示す。

evgAS遺伝子、ydeO遺伝子、gadE遺伝子増幅株である、No.202ΔiclR /evgAS 、No.202ΔiclR /ydeO No.202ΔiclR /gadEは、対照のNo.202ΔiclRと比べて、Ｌ−トリプトファンの蓄積が上昇した。

〔実施例３〕エシェリヒア属細菌Ｌ−スレオニン生産株でのevgAS、ydeO、gadE増幅の効果
エシェリヒア・コリのＬ−スレオニン生産株として、エシェリヒア・コリB-5318株(欧州特許第0593792号明細書参照)を用いた。

VKPM B-5318株を、実施例１で作製したgadE増幅用プラスミドpMW-gadEとevgAS増幅用プラスミドpMW-evgAS、及びydeO増幅プラスミドpMW-ydeOで形質転換し、アンピシリン耐性株を得た。所定のプラスミドが導入されていることを確認し、gadE増幅用プラスミドpMW-gadE導入株をB5318/gadE株、evgAS増幅用プラスミドpMW-evgAS導入株をB5318/evgAS株、及びydeO増幅用プラスミドpMW-ydeO導入株をB5318/ydeO株と名づけた。
VKPM B-5318株の代りに他の公知のＬ−スレオニン生産菌でevgAS、ydeO又はgadEを同様にして増幅してもよい。

上記で作製した株を50 mg/Lのアンピシリンを含むLB培地にてOD600が約0.6となるまで37℃にて培養した後、培養液と等量の40%グリセロール溶液を加えて攪拌した後、適当量ずつ分注、-80℃に保存し、グリセロールストックとした。

これらの株のグリセロールストックを融解し、各100 μLを、50 mg/Lのアンピシリンを含むLプレートに均一に塗布し、37℃にて24時間培養した。得られたプレートのおよそ1/8量の菌体を、500 mL容坂口フラスコの、50mg/Lのアンピシリンを含む以下に記載の発酵培地の20 mLに接種し、往復振とう培養装置で37℃において48時間培養した。培養後、培地中に蓄積したＬ−スレオニンの量をアミノ酸アナライザーL-8500（Hitachi社製）を用いて測定した。培養に用いた培地組成を以下に示す。

［Ｌ−スレオニン生産培地］
Glucose 40g/L
(NH₄)₂SO₄ 16g/L
KH₂PO₄ 1.0g/L
MgSO₄・7H₂O 1.0g/L
FeSO₄・7H₂O 0.01g/L
MｎSO₄・7H₂O 0.01g/L
Yeast Extract 2.0g/L
CaCO₃（日本薬局方） 30g/L

KOHでpH7.0に調整し、120℃で20分オートクレーブを行なった。但し、GlucoseとMgSO₄・7H₂Oは混合し、別殺菌した。CaCO₃は乾熱滅菌後に添加した。
４８時間目のOD600とＬ−スレオニン蓄積を表２に示す。

evgAS遺伝子、ydeO遺伝子、gadE遺伝子増幅株、B5318/evgAS B5318/ydeO B5318/gadE
は、対照のVKPM B-5318と比べて、Ｌ−スレオニンの蓄積が上昇した。

〔実施例４〕Ｌ−リジン生産菌の構築
＜４−１＞リジンデカルボキシラーゼをコードするcadA,ldcC遺伝子破壊株の構築
まずリジンデカルボキシラーゼ非産生株の構築を行った。リジンデカルボキシラーゼアイソザイムは、cadA遺伝子（Genbank Accession No. NP_418555。配列番号３１）、ldcC遺伝子（Genbank Accession No. NP_414728. 配列番号３３）によってコードされている（国際公開WO96/17930号パンフレット参照）。ここで親株は、エシェリヒア・コリのＬ−リジン生産株として、ＡＥＣ(Ｓ−（２−アミノエチル）−システイン)耐性株であるWC196株（WO96/17930号国際公開パンフレット参照）を用いた。

リジンデカルボキシラーゼをコードするcadA、ldcC遺伝子の欠失は、DatsenkoとWannerによって最初に開発された「Red-driven integration」と呼ばれる方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97. 6640-6645 (2000））とλファージ由来の切り出しシステム（J. Bacteriol. 184. 5200-5203 (2002)）によって行った。「Red-driven integration」方法によれば、目的とする遺伝子の一部を合成オリゴヌクレオチドの5’側に、抗生物質耐性遺伝子の一部を3’側にデザインした合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて得られたPCR産物を用いて、一段階で遺伝子破壊株を構築することができる。さらにλファージ由来の切り出しシステムを組合わせることにより、遺伝子破壊株に組み込んだ抗生物質耐性遺伝子を除去することが出来る（特開2005-058227）。

＜４−２＞cadA遺伝子の破壊
PCRの鋳型として、プラスミドpMW118-attL-Cm-attR（特開2005-058827）を使用した。pMW118-attL-Cm-attRは、pMW118(宝バイオ社製)にλファージのアタッチメントサイトであるattL及びattR遺伝子と抗生物質耐性遺伝子であるcat遺伝子を挿入したプラスミドであり、attL-cat-attRの順で挿入されている

このattLとattRの両端に対応する配列をプライマーの3’末端に、目的遺伝子であるcadA遺伝子の一部に対応する配列をプライマーの5’末端に有する配列番号３５及び３６に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーに用いてPCRを行った。

増幅したPCR産物をアガロースゲルで精製し、温度感受性の複製能を有するプラスミドpKD46を含むエシェリヒア・コリWC196株にエレクトロポレーションにより導入した。プラスミドpKD46（Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97. 6640-6645 (2000)）は、アラビノース誘導性ParaBプロモーターに制御されるλRed相同組換えシステムのRed レコンビナーゼをコードする遺伝子（γ、β、exo遺伝子）を含むλファージの合計2154塩基のDNAフラグメント（GenBank/EMBL アクセッション番号 J02459、第31088番目〜33241番目）を含む。プラスミドpKD46はPCR産物をWC196株の染色体に組み込むために必要である。

エレクトロポレーション用のコンピテントセルは次のようにして調製した。すなわち、100mg／Lのアンピシリンを含んだLB培地中で30℃、一晩培養したエシェリヒア・コリWC196株を、アンピシリン（20mg/L）とＬ−アラビノース（1mM）を含んだ5mLのSOB培地（モレキュラークローニング：実験室マニュアル第２版、Sambrook, J.ら，Cold Spring Harbor
Laboratory Press（1989年））で100倍希釈した。得られた希釈物を30℃で通気しながらOD600が約0.6になるまで生育させた後、100倍に濃縮し、10%グリセロールで3回洗浄することによってエレクトロポレーションに使用できるようにした。エレクトロポレーションは70μＬのコンピテントセルと約100ngPCR産物を用いて行った。エレクトロポレーション後のセルは1mLのSOC培地（モレキュラークローニング：実験室マニュアル第２版、Sambrook, J.ら，Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989年））を加えて37℃で２．５時間培養した後、37℃でCm（クロラムフェニコール）(25mg/L)を含むL寒天培地上で平板培養し、Cm耐性組換え体を選択した。次に、pKD46プラスミドを除去するために、Cmを含むＬ−寒天培地上、42℃で2回継代し、得られたコロニーのアンピシリン耐性を試験し、pKD46が脱落しているアンピシリン感受性株を取得した。

クロラムフェニコール耐性遺伝子によって識別できた変異体のcadA遺伝子の欠失を、PCRによって確認した。得られたcadA欠損株をWC196ΔcadA::att-cat株と名づけた。

次に、cadA遺伝子内に導入されたatt-cat遺伝子を除去するために、ヘルパープラスミド上述のpMW-intxis-ts（特開2005-058827）を使用した。pMW-intxis-tsは、λファージのインテグラーゼ（Int）をコードする遺伝子、エクシジョナーゼ(Xis)をコードする遺伝子を搭載し、温度感受性の複製能を有するプラスミドである

上記で得られたWC196ΔcadA::att-cat株のコンピテントセルを常法に従って作製し、ヘルパープラスミドpMW-intxis-tsにて形質転換し、30℃で50 mg/Lのアンピシリンを含むＬ−寒天培地上にて平板培養し、アンピシリン耐性株を選択した。
次に、pMW-intxis-tsプラスミドを除去するために、Ｌ−寒天培地上、42℃で2回継代し、得られたコロニーのアンピシリン耐性、及びクロラムフェニコール耐性を試験し、att-cat、及びpMW-intxis-tsが脱落しているcadA破壊株であるクロラムフェニコール、アンピシリン感受性株を取得した。この株をWC196ΔcadAと名づけた。

＜４−４＞WC196ΔcadA 株のldcC遺伝子の欠失
WC196ΔcadA 株におけるldcC遺伝子の欠失は、上記手法に則って、ldcC破壊用プライマーとして、配列番号３７、３８のプライマーを使用して行った。これによって、cadA、ldcC破壊株であるWC196ΔcadAΔldcCを得た。

〔実施例５〕エシェリヒア属細菌Ｌ−リジン生産株でのevgAS増幅の効果＞
＜５−１＞WC196ΔcadAΔldcC株へのリジン生産用プラスミド導入
WC196ΔcadAΔldcC株をdapA、dapB及びlysC遺伝子を搭載したリジン生産用プラスミドpCAB1（国際公開第WO01/53459号パンフレット）で常法に従い形質転換し、WC196ΔcadAΔldcC/pCAB1株（WC196LC/pCAB1）を得た。

WC196LC/pCAB1株を、実施例1で作製したevgAS増幅用プラスミドpMW-evgASで形質転換し、アンピシリン耐性株を得た。所定のプラスミドが導入されていることを確認し、evgAS増幅用プラスミドpMW-evgAS導入株をWC196LC/pCAB1/evgAS株と名づけた。
WC196LC/pCAB1の代りに他の公知のＬ−リジン生産菌でevgASを同様にして増幅してもよい。

上記で作製した株を25 mg/Lのストレプトマイシンと50 mg/Lのアンピシリンを含むLB培地にてOD600が約0.6となるまで37℃にて培養した後、培養液と等量の40%グリセロール溶液を加えて攪拌した後、適当量ずつ分注、-80℃に保存し、グリセロールストックとした。

＜５−２＞リジン生産培養
これらの株のグリセロールストックを融解し、各100 μLを、50 mg/Lのアンピシリンを含むLプレートに均一に塗布し、37℃にて24時間培養した。得られたプレートのおよそ1/8量の菌体を、500 mL容坂口フラスコの、50mg/Lのアンピシリンを含む以下に記載の発酵培地の20 mLに接種し、往復振とう培養装置で37℃において48時間培養した。培養後、培地中に蓄積したＬ−リジンの量をバイオテックアナライザーAS210（サクラ精機）により測定した。培養に用いた培地組成を以下に示す。

［Ｌ−リジン生産培地］
Glucose 40g/L
(NH₄)₂SO₄ 16g/L
KH₂PO₄ 1.0g/L
MgSO₄・7H₂O 1.0g/L
FeSO₄・7H₂O 0.01g/L
MnSO₄・7H₂O 0.01g/L
Yeast Extract 2.0g/L
CaCO₃（日本薬局方） 30g/L
KOHでpH7.0に調整し、120℃で20分オートクレーブを行なった。但し、GlucoseとMgSO₄・7H₂Oは混合し、別殺菌した。CaCO₃は乾熱滅菌後に添加した。

48時間目のOD、Ｌ−リジン蓄積を表３に示す。

evgAS遺伝子増幅株WC196LC/pCAB1/evgASは、対照のWC196LC/pCAB1と比べて、大幅にＬ−リジンの蓄積が上昇した。

〔実施例６〕エシェリヒア属細菌Ｌ−リジン生産株でのgadE増幅の効果
＜６−１＞ gadE遺伝子を増強したＬ−リジン生産株の構築
実施例１で作製したシェリヒア・コリ W3110株のgadE遺伝子を含むプラスミドpMW-gadEからgadE遺伝子断片を切出し、HindIII及びBamHIで消化したベクターpUC18（宝酒造社製）に連結してgadE増幅用プラスミドpUC-gadEを構築した。

WC196LC/pCAB1株を、上記pUC-gadEで形質転換し、アンピシリン耐性株を得た。所定のプラスミドが導入されていることを確認し、gadE増幅用プラスミドpUC-gadE導入株をWC196LC/pCAB1/pUC-gadE株と名づけた。
WC196LC/pCAB1の代りに他の公知のＬ−リジン生産菌でgadEを同様にして増幅してもよい。また、evgAS、ydeO遺伝子及びgadE遺伝子を任意の組み合わせで増幅してもよい。

上記で作製した株を25 mg/Lのストレプトマイシンと50 mg/Lのアンピシリンを含むLB培地にてOD600が約0.6となるまで37℃にて培養した後、培養液と等量の40%グリセロール溶液を加えて攪拌した後、適当量ずつ分注、-80℃に保存し、グリセロールストックとした。

＜６−２＞リジン生産培養
これらの株のグリセロールストックを融解し、各100 μLを25 mg/Lのストレプトマイシンと50 mg/Lのアンピシリンを含むLプレートに均一に塗布し、37℃にて24時間培養した。得られたプレートのおよそ1/8量の菌体を、500 mL容坂口フラスコの、25 mg/Lのストレプトマイシンと50mg/Lのアンピシリンを含む以下に記載の発酵培地の20 mLに接種し、往復振とう培養装置で37℃において48時間培養した。培養後、培地中に蓄積したＬ−リジンの量をバイオテックアナライザーAS210（サクラ精機）により測定した。培養に用いた培地組成を以下に示す。

［Ｌ−リジン生産培地］
GlucoseあるいはFructose 40g/L
(NH₄)₂SO₄ 16g/L
KH₂PO₄ 1.0g/L
MgSO₄・7H₂O 1.0g/L
FeSO₄・7H₂O 0.01g/L
MnSO₄・7H₂O 0.01g/L
Isoleucine 0.1g/L
Yeast Extract 2.0g/L
CaCO₃（日本薬局方） 30g/L
KOHでpH7.0に調整し、120℃で20分オートクレーブを行なった。但し、GlucoseとMgSO₄・7H₂Oは混合し、別殺菌した。CaCO₃は乾熱滅菌後に添加した。

48時間目のOD、Ｌ−リジン蓄積を表４に示す。

gadE遺伝子増幅株WC196LC/pCAB1/pUCgadEは、対照のWC196LC/pCAB1と比べて、グルコース培養、フルクトース培養いずれにおいてもＬ−リジン蓄積が向上し、特にフルクトース培養において大幅にＬ−リジンの蓄積が上昇した。

〔配列表の説明〕
配列番号１：trpオペロン増幅用プライマー
配列番号２：trpオペロン増幅用プライマー
配列番号３：iclR遺伝子増幅用プライマー
配列番号４：iclR遺伝子増幅用プライマー
配列番号５：iclR遺伝子の塩基配列
配列番号６：iclR遺伝子によってコードされるアミノ酸配列
配列番号７：aceA遺伝子の塩基配列
配列番号８：aceA遺伝子によってコードされるアミノ酸配列
配列番号９：aceB遺伝子の塩基配列
配列番号10：aceB遺伝子によってコードされるアミノ酸配列
配列番号11：aceK遺伝子の塩基配列
配列番号12：aceK遺伝子によってコードされるアミノ酸配列
配列番号13：trpA遺伝子の塩基配列
配列番号14：trpA遺伝子によってコードされるアミノ酸配列
配列番号15：trpB遺伝子の塩基配列
配列番号16：trpB遺伝子によってコードされるアミノ酸配列
配列番号17：evgASオペロン増幅用プライマー
配列番号18：evgASオペロン増幅用プライマー
配列番号19：gadE遺伝子増幅用プライマー
配列番号20：gadE遺伝子増幅用プライマー
配列番号21：ydeO遺伝子増幅用プライマー
配列番号22：ydeO遺伝子増幅用プライマー
配列番号23：evgA遺伝子の塩基配列
配列番号24：EvgAのアミノ酸配列
配列番号25：evgS遺伝子の塩基配列
配列番号26：EvgSのアミノ酸配列
配列番号27：gadE遺伝子の塩基配列
配列番号28：GadEのアミノ酸配列
配列番号29：ydeO遺伝子の塩基配列
配列番号30：Yde0のアミノ酸配列
配列番号31：cadA遺伝子の塩基配列
配列番号32：cadA遺伝子によってコードされるアミノ酸配列
配列番号33：ldcC遺伝子の塩基配列
配列番号34：ldcC遺伝子によってコードされるアミノ酸配列
配列番号35：cadA遺伝子破壊用PCRプライマー
配列番号36：cadA遺伝子破壊用PCRプライマー
配列番号37：ldcC遺伝子破壊用PCRプライマー
配列番号38：ldcC遺伝子破壊用PCRプライマー

温度感受性複製開始起点を有するプラスミドベクターpTS1の構築図

Claims (13)

1. Ｌ−アミノ酸生産能を有し、かつEvgAS二成分制御系に関与する転写因子をコードするevgA遺伝子、gadE遺伝子、ydeO遺伝子から選択される一または二以上の遺伝子の発現量が増大するように改変された腸内細菌科に属する細菌を培地で培養して、Ｌ−アミノ酸を該培地中に生成蓄積させ、該培地よりＬ−アミノ酸を採取する、Ｌ−アミノ酸の製造法。
2. 前記一または二以上の遺伝子の発現量が、各々の遺伝子のコピー数を高めること、又は該遺伝子の発現調節配列を改変されたことによって増大された、請求項１に記載の方法。
3. 前記一または二以上の遺伝子の発現量が、センサーキナーゼをコードするevgS遺伝子の発現量が増大するように改変されたことによって増大された、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記evgA遺伝子が、下記（ａ）又は（ｂ）に記載のＤＮＡである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法：
   （ａ）配列番号２３に示す塩基配列を含むＤＮＡ、
   （ｂ）配列番号２３に示す塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、転写因子活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
5. 前記gadE遺伝子が下記（ｃ）又は（ｄ）に記載のＤＮＡである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法：
   （ｃ）配列番号２７に示す塩基配列を含むＤＮＡ、
   （ｄ）配列番号２７に示す塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、転写因子活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
6. 前記ydeO遺伝子が下記（ｅ）又は（ｆ）に記載のＤＮＡである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法：
   （ｅ）配列番号２９に示す塩基配列を含むＤＮＡ、
   （ｆ）配列番号２９に示す塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、転写因子活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
7. 前記evgS遺伝子が下記（ｇ）又は（ｈ）に記載のＤＮＡである、請求項３に記載の方法：
   （ｇ）配列番号２５に示す塩基配列を含むＤＮＡ、
   （ｈ）配列番号２５に示す塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、リン酸転移活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
8. 前記evgA遺伝子が、下記（Ａ）又は（Ｂ）に記載のタンパク質をコードする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法：
   （Ａ）配列番号２４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質。
   （Ｂ）配列番号２４に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、転写因子活性を有するタンパク質。
9. 前記gadE遺伝子が、下記（Ｃ）又は（Ｄ）に記載のタンパク質をコードする、請求項１
   〜３のいずれか一項に記載の方法：
   （Ｃ）配列番号２８に示すアミノ酸配列からなるタンパク質。
   （Ｄ）配列番号２８に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、転写因子活性を有するタンパク質。
10. 前記ydeO遺伝子が、下記（Ｅ）又は（Ｆ）に記載のタンパク質をコードする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法：
    （Ｅ）配列番号３０に示すアミノ酸配列からなるタンパク質。
    （Ｆ）配列番号３０に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、転写因子活性を有するタンパク質。
11. 前記evgS遺伝子が、下記（Ａ）又は（Ｂ）に記載のタンパク質をコードする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法：
    （Ｃ）配列番号２６に示すアミノ酸配列からなるタンパク質。
    （Ｄ）配列番号２６に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、リン酸転移活性を有するタンパク質。
12. 前記細菌が、エシェリヒア属細菌、エンテロバクター属細菌、パントエア属細菌、クレブシエラ属細菌、セラチア属細菌からなる群より選ばれる腸内細菌科に属する細菌である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記Ｌ−アミノ酸がＬ−リジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファンからなる群より選択される１種又は２種以上のアミノ酸である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。

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