CN109536428A

CN109536428A - 一种产l-异亮氨酸的基因工程菌及其构建方法和应用

Info

Publication number: CN109536428A
Application number: CN201811493910.2A
Authority: CN
Inventors: 苏海霞; 朱程军; 邢盼盼; 王炯; 李敬; 皮莉; 左江; 黄治华; 鲁凡
Original assignee: WUHAN GRAND HOYO CO Ltd
Current assignee: WUHAN GRAND HOYO CO Ltd
Priority date: 2018-12-07
Filing date: 2018-12-07
Publication date: 2019-03-29
Anticipated expiration: 2038-12-07
Also published as: CN109536428B

Abstract

本发明公开了一种产L‑异亮氨酸的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)基因工程菌，其在出发菌株基因组中敲除了编码二氨基庚二酸脱氢酶的ddh基因，所述ddh基因的核苷酸序列如SEQ ID No:2所示；插入了编码天冬氨酸激酶的lysC操纵子，所述lysC操纵子含lysC突变基因、其5’端的启动子和3’端的终止子，其中所述lysC突变基因的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示；且所述出发菌株为保藏号为CCTCC NO:M2016609的C.glutamicum H5ΔargGΔalaT::ilvC。本发明还公开了所述基因工程菌的制备方法和应用。本发明所述基因工程菌L‑异亮氨酸的产量增加了5％，代谢支路的副产物赖氨酸的合成减弱了45.24％，降低了生产成本，具有广阔的工业应用前景。

Description

一种产L-异亮氨酸的基因工程菌及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体地涉及一种产L-异亮氨酸的基因工程菌及其构建方法和应用。

背景技术

L-异亮氨酸(L-isoleucine，ILE)，化学名为“β-甲基-α-氨基戊酸”，分子式：C₆H₁₃NO₂，相对分子质量：131.17，是八种必需的氨基酸之一，同时又与L-缬氨酸和L-亮氨酸统称为“分支链氨基酸”(BCAAs)。L-异亮氨酸是人体激素、蛋白质合成和能量生成的原料，能够促进蛋白质合成并抑制其分解，在磷脂双层膜蛋白的跨膜结构域相互作用中也发挥至关重要的作用。因此，L-异亮氨酸被广泛应用于食品和医药等行业，具有巨大的商业价值。

传统的L-异亮氨酸生产方法主要有提取法、化学合成法和微生物发酵法。提取法是水解蛋白质从混合氨基酸中分离纯化L-异亮氨酸，由于原料来源有限、提取过程中产生大量废水，目前工业生产中已不采用提取法生产L-异亮氨酸。化学合成法是利用丙二酸二乙酯、异戊酸等合成异亮氨酸，但此方法得到的是四种旋光异构体，消旋拆分反应过程复杂，导致生产成本昂贵，限制了该方法的工业应用。目前，工业生产异亮氨酸主要是发酵法，利用微生物的代谢作用可生物合成并过量积累L-异亮氨酸，具有原料成本低、易于控制等优点。国际上，日本发酵法生产L-异亮氨酸占有垄断地位，主要厂家有味之素、协和发酵和田边制药等，大罐菌株产酸能力达30～35g/L，糖酸转化率为20-25％，并可达60-70％的提取率，合计年产量400-500吨。国内厂家主要有梅花集团、阜丰集团、无锡晶海氨基酸公司等，产酸水平及产品质量离日本企业还有一定距离。

发酵法的技术核心在于菌种的产酸能力，目前，国内外也有较多关于改造L-异亮氨酸生产菌株的研究。CN107058323A公开了一种基于ilv衰减子的工程菌及其在生产L-异亮氨酸中的应用，该工程菌的摇瓶发酵产酸水平最高达2.55±0.35％。发明CN 104357503A公开了一种提高L-异亮氨酸产量的方法，通过紫外诱变育种选育出一株甲硫氨酸与赖氨酸双重缺陷型的L-异亮氨酸产生菌，通过5L发酵罐发酵，产酸达到38.9g/L。CN 104480057A公开了一株产L-异亮氨酸基因工程菌及其构建方法及应用，该发明构建了基因alr的敲除载体，电转到宿主菌中，得到alr的缺陷菌株IWJ001Δalr。利用PCR扩增基因fusA，frr，ilvBN，ilvA，ppnk，将基因片段连接到过表达载体，然后电转入谷氨酸棒杆菌IWJ001Δalr中，通过抗生素抗性筛选获得目的基因工程菌：产L-异亮氨酸基因工程菌IWJ001Δalr/pJYW-4-fusA-frr-ilvBN-ilvA-ppnk。其在3L发酵罐中产异亮氨酸含量为28.6g/L。CN 105176907 A公开了一种L-异亮氨酸生产菌，以L-苏氨酸基因工程菌CCTCC M2015556作为原始菌株，导入包含大肠杆菌MG1655基因簇ilvGMEDA的重组质粒，获得L-异亮氨酸生产菌，该菌株发酵L-异亮氨酸产量可高达16.31g/L，糖酸转化率达40.78％。CN 106701648 A公开了一株高产L异亮氨酸的谷氨酸棒杆菌基因工程菌，该菌是将谷氨酸棒杆菌Corynebacteriumglutamicum H5菌株敲除了编码精氨基玻咱酸合成酶的argG基因及编码氨基转移酶的alaT基因，且在alaT基因被敲除的位点插入了编码乙酰羟酸还原异构酶的ilvC基因的操纵子，所述谷氨酸棒杆菌保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2016609，产酸水平达到4.8％，即48g/L。以上技术的菌株均存在产酸水平较低的缺点。

发明内容

本发明要解决的技术问题是为了克服现有技术中L-异亮氨酸生产菌株产L-异亮氨酸能力不足的缺陷，提供一种产L-异亮氨酸的基因工程菌及其构建方法和应用。

本发明提供的技术方案如下：

本发明的技术方案之一为一种产L-异亮氨酸的谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)基因工程菌，其在出发菌株基因组中敲除了编码二氨基庚二酸脱氢酶的ddh基因，所述ddh基因的核苷酸序列如SEQ ID No:2所示；插入了编码天冬氨酸激酶的lysC操纵子，所述lysC操纵子含lysC突变基因、其5’端的启动子和3’端的终止子，其中所述lysC突变基因的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示；且所述出发菌株为保藏号为CCTCC NO:M2016609的C.glutamicum H5ΔargGΔalaT::ilvC。

本发明术语中，L-异亮氨酸和异亮氨酸均指L-异亮氨酸。本发明的操纵子是启动子、终止子等序列和一系列紧密连锁的结构基因的总称，是转录的功能单位。其中，启动子(promoter)是RNA聚合酶结合并启动转录的特异DNA序列，终止子(terminator)是给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列。在一个操纵子中，至少在结构基因群最后一个基因的后面有一个终止子。本发明中，所述结构基因为lysC突变基因。

所述基因敲除为本领域常规技术手段，其为通过同源重组将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，以达到定点修饰改造基因组上某一基因的目的的一种技术。所述外源基因通常具有功能基因起始位点几十至几百个核苷酸序列(即上游序列)甚至更长，以及功能基因终止位点前的几十至几百个核苷酸序列(即下游序列)甚至更长，而缺失了功能基因中游的核苷酸序列，从而使得该功能基因在丧失原有功能的同时，又能确保同源重组的有效进行。为了使ddh基因(如SEQ ID No:2所示)丧失其生理功能，在本发明中设计了置换型打靶载体，所述打靶载体中的外源基因包括ddh基因的上游序列ddhL和下游序列ddhR的如SEQ ID No:3所示的核苷酸序列，随后筛选具有SEQ ID No:3所示的核苷酸序列的菌株。由此，在一较佳的具体实施例中，所述敲除为将编码二氨基庚二酸脱氢酶的ddh基因置换为如SEQ ID No:3所示的核苷酸序列。

在一较佳的具体实施例中，所述启动子为来源于出发菌株基因组的pgro启动子，所述终止子为来源于大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭载体PXMJ19的rrnB终止子，所述lysC操纵子的序列如SEQ ID No:4所示。

在一更佳的具体实施例中，所述编码天冬氨酸激酶的lysC操纵子插入在ddh基因敲除的位点上。本发明中，基因敲除的位点指的是使用基因功能缺失的序列置换功能基因时，原功能基因所处的位置。在一优选的实施例中，所述插入形成如SEQ ID No:5所示的核苷酸序列，由此制得基因工程菌C.glutamicum H5ΔargGΔalaT::ilvCΔddh::lysC。如上所述，如SEQ ID No:5所示的核苷酸序列从5’至3’方向包括ddhL-lysC操纵子-ddhR序列；或更具体地，其包括ddhL-pgro-lysC突变基因-rrnB-ddhR序列。

本发明的技术方案之二为一种如上所述的基因工程菌的制备方法，其包括以下的步骤：

(1)在保藏号为CCTCC NO:M2016609的C.glutamicum H5ΔargGΔalaT::ilvC出发菌株基因组敲除ddh基因，获得C.glutamicum H5ΔargGΔalaT::ilvCΔddh菌株；

(2)在步骤(1)获得的C.glutamicum H5ΔargGΔalaT::ilvCΔddh菌株基因组上插入lysC操纵子，获得C.glutamicum H5ΔargGΔalaT::ilvCΔddh::lysC。

本发明的技术方案之三为一种L-异亮氨酸的制备方法，其包括以下的步骤：发酵培养如上所述的基因工程菌以产生L-异亮氨酸。

在一较佳的具体实施例中，所述发酵培养的温度为29～33℃；溶解氧为15～30％；所述％为体积百分比；发酵时间为至少55小时；氨水调节发酵培养基的pH为6.5～7.0。

在一更佳的具体实施例中，所述发酵培养的温度为29～33℃；溶解氧为15～30％；所述％为体积百分比；发酵时间为至少55小时；和，氨水调节发酵培养基的pH为6.5～7.0。

在一更佳的具体实施例中，发酵培养时流加50～80％葡萄糖溶液，控制发酵培养基残糖量为1.5～2.5％；所述％为重量体积(g/mL)百分比。

在一最佳的具体实施例中，所述发酵培养基为：葡萄糖16.0％、硫酸铵0.8％、玉米浆3.5％、酵母膏0.3％、丝肽粉0.3％、磷酸氢二钾0.1％、硫酸镁0.05％、维生素B10.00003％、生物素0.00002％、硫酸铁0.00001％、丙氨酸0.004％；余量为去离子水，pH为7；所述％为重量体积(g/mL)百分比。

本发明的技术方案之四为一种发酵培养基在培养如上所述的基因工程菌上的应用，其中所述发酵培养基为：葡萄糖16.0％、硫酸铵0.8％、玉米浆3.5％、酵母膏0.3％、丝肽粉0.3％、磷酸氢二钾0.1％、硫酸镁0.05％、维生素B1 0.00003％、生物素0.00002％、硫酸铁0.00001％、丙氨酸0.004％；余量为去离子水，pH为7；所述％为重量体积(g/mL)百分比。

本发明的技术方案之五为一种重组载体及其应用。

在一具体的实施例中，所述重组载体在多克隆位点上整合了lysC操纵子，所述lysC操纵子含lysC突变基因、其5’端的启动子和3’端的终止子，其中所述lysC突变基因的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。

在一优选的实施例中，所述启动子为来源于出发菌株基因组的pgro启动子，所述终止子为来源于大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭载体PXMJ19的rrnB终止子，所述lysC操纵子的序列如SEQ ID No:4所示。

在一更优选的实施例中，所述启动子pgro的5’端还包括ddh基因的上游片段ddhL；所述终止子的3’端还包括ddh基因的下游片段ddhR。

在一进一步更优选的实施例中，所述重组载体在多克隆位点上整合了如SEQ IDNo:5所示的核苷酸序列。

在一最优选的实施例中，所述的重组载体的骨架质粒为pk18mobsacB。

本发明的技术方案之六为上述基因工程菌和重组载体在制备L-亮氨酸中的应用。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：以L-异亮氨酸基因工程菌C.glutamicum H5ΔargGΔalaT::ilvC为出发菌株，利用基因工程技术来改造其基因组，通过敲除、插入相关基因，使其在发酵过程中能提高产L-异亮氨酸的能力。L-异亮氨酸的产酸率相对出发菌株C.glutamicum H5ΔargGΔalaT::ilvC提高了7.56％(p<0.05)。在5L发酵罐中，L-异亮氨酸产量增加了5％，达到51.7g/L，代谢支路的副产物赖氨酸的合成减弱了45.24％(p<0.01)，糖酸转化率达20％以上，降低了生产成本，具有广阔的工业应用前景。

附图说明

图1为△ddh-pk18mobsacB质粒构建流程；

图2为lysC-△ddh-pk18mobsacB质粒构建流程；

图3为ddh基因敲除流程图；

图4为lysC基因插入流程图；

图5为出发菌C.glutamicum H5ΔargGΔalaT::ilvC发酵上清液的HPLC图谱；

图6为目的菌C.glutamicum H5ΔargGΔalaT::ilvCΔddh::lysC发酵上清液的HPLC图谱；

图7为本发明与对照菌产酸比较。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

质粒pk18mobsacB购自武汉淼灵生物科技有限公司、穿梭质粒PXMJ19购自普如汀生物技术(北京)有限公司、大肠杆菌DH5α为本领域常规使用；DNA聚合酶(KOD DNAPolymerase)购自toyobo东洋纺(上海)生物科技有限公司；限制性内切酶(EcoRI、SalI、EcoRV)、DNAmarker、质粒小提取试剂盒、DNA胶回收纯化试剂盒，均购自Takara宝生物工程(大连)有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司、Gibson克隆重组试剂盒购自NEB北京公司；硫酸卡那霉素购自Biosharp公司；蔗糖等其余化学药品试剂均为国药分析纯。

质粒提取操作步骤参照质粒小提取试剂盒说明书；DNA胶回收操作步骤参照DNA胶回收试剂盒说明书；谷氨酸棒杆菌基因组提取操作步骤参照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书；DNA片段重组连接操作步骤参照Gibson克隆重组试剂盒明书；谷氨酸棒杆菌感受态的制备及转化方法参照van der Rest等的方法(M.E.van der Rest,C.Lange,D.Molenaar.Aheat shock following electroporation induces highly efficient transformationof Corynebacterium glutamicum with xenogeneic plasmidDNA.Appl.Microbiol.Biotechnol.,1999,52:541-545)。

HPLC检测条件：

色谱柱：依利特ODS2 4.6*250mm，5um；柱温：25℃；流速：0.4ml/min；波长：199nm；流动相：0.005mol/L磷酸氢二钠-0.015mol/L磷酸氢二铵(pH＝7.00)；标准曲线法。

活化培养基配方为：玉米浆5.0％、胰蛋白胨1.0％、氯化钠0.5％、硫酸铵0.4％、葡萄糖0.3％、磷酸氢二钾0.1％、硫酸镁0.05％、丙氨酸0.004％、琼脂粉2.0％，余量为去离子水，pH为7；所述％为重量体积(g/mL)百分比。

种子培养基配方为：葡萄糖3.0％、硫酸铵2.5％、玉米浆3.5％、酵母膏0.3％、丝肽粉0.3％、磷酸氢二钾0.1％、硫酸镁0.05％、维生素B1 0.00003％、生物素0.00002％、硫酸铁0.00001％、碳酸钙4％、丙氨酸0.004％、余量为去离子水，pH为7；所述％为重量体积(g/mL)百分比。

发酵培养基配方为：葡萄糖16.0％、硫酸铵0.8％、玉米浆3.5％、酵母膏0.3％、丝肽粉0.3％、磷酸氢二钾0.1％、硫酸镁0.05％、维生素B1 0.00003％、生物素0.00002％、硫酸铁0.00001％、丙氨酸0.004％，余量为去离子水，pH为7；所述％为重量体积(g/mL)百分比。

实施例1构建Δddh-pk18mobsacB重组质粒

本实施例构建Δddh-pk18mobsacB重组质粒，该质粒包含编码二氨基庚二酸脱氢酶的ddh基因的上、下游片段、以及作用于谷氨酸棒杆菌同源重组的转座基因mob和蔗糖敏感基因sacB。

利用EcoRI/SalI双酶切质粒pk18mobsacB(质粒pk18mobsacB购自武汉淼灵生物科技有限公司)，反应体系为：质粒1μg、10×buffer 5μl、EcoRI 1μl、SalI 1μl、补水至50μl。37℃酶切5h。1％琼脂糖凝胶电泳检测并DNA胶回收纯化试剂盒回收5.6kb核苷酸片段；

甘油保存的菌株C.glutamicum H5ΔargGΔalaT::ilvC(自行构建的菌株，详见专利CN 106701648A)与标准菌株C.glutamicum ATCC 13032相比，敲除了基因组内编码精氨酸琥珀酸合成酶的argG基因；敲除了基因组编码氨基转移酶的alaT基因；且在alaT基因被敲除的位点插入了编码乙酰羧基还原异构酶的ilvC基因。将C.glutamicum H5ΔargGΔalaT::ilvC接种至5ml的LBG液体培养基中，31℃、200rpm振荡培养16h；取5ml的菌液，10,000rpm离心2分钟，弃上清；湿菌体用天根基因组提取试剂盒抽提基因组DNA。

以C.glutamicum H5ΔargGΔalaT::ilvC基因组为模板，设计二氨基庚二酸脱氢酶(ddh)基因上下游片段Δddh-L、Δddh-R的引物(斜体为酶切位点处；下划线为ddh基因上下游片段重合序列)：

Δddh-L Forward Primer(FP)：

Δddh-L Reverse Primer(RP)：

5‘CTTCAGGATGTATTCCACGgatatcAGGGTGGCCCGGCGCGAG’3

Δddh-R Forward Primer(FP)：

5‘CTCGCGCCGGGCCACCCTgatatcCGTGGAATACATCCTGAAG’3

Δddh-R Reverse Primer(RP)：

高保真KOD聚合酶PCR扩增核苷酸片段ddh-L、ddh-R，各约1.3kb。PCR反应体系(50μl)为：5×PCR buffer 10μl、dNTP 5μl、引物各1.5μl、模板1μl、KOD酶1μl、加水至50μl。反应条件为：95℃5min，95℃30s，55℃30s，68℃2min，30个循环；68℃10min。1％琼脂糖凝胶电泳检测且DNA胶回收纯化试剂盒回收1.3kb的2个PCR产物。

Gibson克隆重组试剂盒重组上述双酶切产物(即EcoR I/Sal I双酶切质粒pk18mobsacB)及两个PCR产物，重组产物转化大肠杆菌DH5α，涂布于含硫酸卡那霉素的平板，经过37℃过夜培养后，挑选转化子送测序，测序正确的转化子即含有重组质粒Δddh-pk18mobsacB。

实施例2构建重组菌株C.glutamicum H5ΔargGΔalaT::ilvCΔddh

将实施例1中测序正确的转化子转接5ml LB培养基，37℃、200rpm振荡培养16h，取5ml的菌液，10,000rpm离心2分钟，弃上清；湿菌体用质粒小量提取试剂盒抽提质粒。将质粒电转入出发菌株C.glutamicum H5ΔargGΔalaT::ilvC中，转化产物涂布于含硫酸卡那霉素的LBHIS固体培养基中，30℃培养48h至长出转化子，挑选转化子转接3ml LB培养基，30℃、200rpm振荡培养24h，菌液稀释涂布于含10％蔗糖的平板，30℃培养48h至长出单菌落，挑选单菌落分别接种于含硫酸卡那霉素的平板及含10％蔗糖的平板，挑选在10％的蔗糖平板上生长而在硫酸卡那霉素平板上不生长的单菌落送测序，测序正确的单菌落即为ddh基因缺陷的工程菌C.glutamicum H5ΔargGΔalaT::ilvCΔddh。

LBHIS培养基配方为：蛋白胨1％、酵母0.5％、氯化钠1％、脑心津液2％、山梨醇4％、琼脂粉2％、硫酸卡那霉素100μg/ml、余量为去离子水，PH为7；所述％为重量百分比。

10％蔗糖培养基配方为：蛋白胨1％、酵母0.5％、氯化钠1％、葡萄糖0.5％、蔗糖10％、余量为去离子水，PH为7；所述％为重量百分比。

实施例3构建lysC-Δddh-pk18mobsacB重组质粒

构建lysC-Δddh-pk18mobsacB重组质粒，该质粒包含了来自于菌株C.glutamicumH5ΔargGΔalaT::ilvC基因组内编码编码伴侣蛋白groES基因的pgro启动子、编码天冬氨酸激酶的lysC基因、来自于大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭载体的rrnB终止子、编码二氨基庚二酸脱氢酶的ddh基因的上、下游片段、以及可有效作用于谷氨酸棒杆菌同源重组的转座基因mob和蔗糖敏感基因sacB，具体步骤如下所述。

利用EcoR V酶切载体Δddh-pk18mobsacB，反应体系为：质粒1μg、10×buffer 5μl、EcoR V 1μl、补水至50μl。37℃酶切5h。1％琼脂糖凝胶电泳检测并DNA胶回收纯化试剂盒回收8.2kb核苷酸片段。

以C.glutamicum H5ΔargGΔalaT::ilvC基因组为模板，设计引物lysC FP/RP，高保真KOD聚合酶PCR扩增lysC基因片段；以C.glutamicum H5ΔargGΔalaT::ilvC基因组为模板，设计引物pgro FP/RP，用高保真KOD聚合酶PCR扩增启动子片段pgro；以大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭质粒PXMJ19为模板，设计引物rrnB FP/RP，用高保真KOD聚合酶PCR扩增终止子rrnB片段；PCR反应体系(50μl)为：5×PCR buffer 10μl、dNTP 5μl、引物各1.5μl、模板1μl、KOD酶1μl、加水至50μl。反应条件为：95℃5min，95℃30s，55℃30s，68℃2min，30个循环；68℃10min。扩增3个片段所用的引物分别为：

lysC FP：5‘CTCATGGAGGGATTCACCATGGCCCTGGTCGTACAG’3

lysC RP：5‘tcatccgccaaaacagccTTAGCGTCCGGTGCCTGC’3

pgro FP：5‘CTCGCGCCGGGCCACCCTgatGCAACGCTGTATATAACC’3

pgro RP：5‘CTGTACGACCAGGGCCATGGTGAATCCCTCCATGAG’3

rrnB FP：5‘GCAGGCACCGGACGCTAAggctgttttggcggatga’3

rrnBRP：5‘CTTCAGGATGTATTCCACGgatagagtttgtagaaacgcaaa’3

1％琼脂糖凝胶电泳检测且DNA胶回收纯化试剂盒回收3个PCR产物。Gibson克隆重组试剂盒重组上述双酶切产物3个PCR产物，重组产物转化大肠杆菌DH5α，涂布于含硫酸卡那霉素的平板，经过37℃过夜培养后，挑选转化子测序，测序正确的转化子即含有重组质粒lysC-ddh-pk18mobsacB，该质粒包括pgro启动子、lysC基因及rrnB终止子及ddh基因的上、下游片段。

实施例4构建高产L-异亮氨酸的菌株C.glutamicum H5ΔargGΔalaT::ilvCΔddh::lysC

将实施例3中测序正确的转化子转接至5ml LB培养基，37℃、200rpm振荡培养16h，取5ml的菌液，10,000rpm离心2分钟，弃上清；湿菌体用质粒小量提取试剂盒抽提质粒。将质粒电转入实施例3获得的菌株C.glutamicum H5ΔargGΔalaT::ilvCΔddh中。转化产物涂布于含硫酸卡那霉素的LBHIS固体培养基中，30℃培养48h至长出转化子，挑选转化子转接3ml LB培养基，30℃、200rpm振荡培养24h，菌液稀释涂布于含10％蔗糖的平板，30℃培养48h至长出单菌落，挑选单菌落分别接种于含硫酸卡那霉素的平板及含10％蔗糖的平板，挑选在10％的蔗糖平板上生长而在硫酸卡那霉素平板上不生长的单菌落送测序，测序正确的单菌落即为ddh基因缺陷的工程菌C.glutamicum H5ΔargGΔalaT::ilvCΔddh::lysC。

效果实施例1菌株C.glutamicum H5ΔargGΔalaT::ilvC与菌株C.glutamicum H5ΔargGΔalaT::ilvCΔddh::lysC上罐发酵

以菌株C.glutamicum H5ΔargGΔalaT::ilvC为对照，将重组菌C.glutamicum H5ΔargGΔalaT::ilvCΔddh::lysC上5L发酵罐培养。分别取两株重组菌的甘油菌种1ml固态活化培养基上划线，30℃培养16h；从活化培养基上挑一接种环菌苔转接到例如100ml种子培养基中，30℃、200rpm振荡培养12～16h。按10％的体积比接种种子至含有3L发酵培养基的5L发酵罐中，控温30℃，氨水控制pH在7.0，通过调整转速及通气量维持溶氧在30％，当残糖含量低于1.5％时，流加80％的葡萄糖，维持残糖含量在1.5～2.5％，发酵时间为55h以上，本实施例发酵时间65h。分别取样进行HPLC检测，比较发酵液中两株菌发酵过程相应的发酵参数的差异。

图5和6分别为出发菌株C.glutamicum H5ΔargGΔalaT::ilvC和目的菌株C.glutamicum H5ΔargGΔalaT::ilvCΔddh::lysC各自发酵64h后，发酵液离心取上清衍生化后，使用HPLC对各主要氨基酸进行分析的色谱图。其实验结果统计如表1、图7所示，对照菌株产L-异亮氨酸最高为4.78％。重组菌产L-异亮氨酸最高为5.17％(即51.7g/L)，产量较对照菌株提高了7.56％，该产酸量差距具有统计学意义(p<0.05)。此外，本发明杂酸如赖氨酸的产量由34.94g/L降低为19.13g/L，降低了45.24％，其杂酸含量的差距也具有统计学意义(p<0.01)。

本发明还检测了仅敲除ddh基因，即使用C.glutamicum H5ΔargGΔalaT::ilvCΔddh生产L-异亮氨酸，其产量与对照菌株相比没有差别，说明单独敲除ddh基因并没有提高L-异亮氨酸产量。

表1各菌株氨基酸产量数据比较

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 武汉远大弘元股份有限公司

<120> 一种产L-异亮氨酸的基因工程菌及其制备方法和应用

<130> P180115572C

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1266

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> lysC突变基因

<400> 1

atggccctgg tcgtacagaa atatggcggt tcctcgcttg agagtgcgga acgcattaga 60

aacgtcgctg aacggatcgt tgccaccaag aagactagaa atgatgtcgt ggttgtctgc 120

tccgcaatgg gagacaccac ggatgaactt ctagaacttg cagcggcagt gaatcccgtt 180

ccgccagctc gtgaaatgga tatgctcctg actgctggtg agcgtatttc taacgctctc 240

gtcgccatgg ctattgagtc ccttggcgca gaagctcaat ctttcactgg ctctcaggct 300

ggtgtgctca ccaccgagcg ccacggaaac gcacgcattg ttgacgtcac accgggtcgt 360

gtgcgtgaag cactcgatga gggcaagatc tgcattgttg ctggttttca gggtgttaat 420

aaagaaaccc gcgatgtcac cacgttgggt cgtggtggtt ctgacaccac tgcagttgcg 480

ttggcagctg ctttgaacgc tgatgtgtgt gagatttact cggacgttga cggtgtgtat 540

accgctgacc cgcgcatcgt tcctaatgca cagaagctgg aaaagctcag cttcgaagaa 600

atgctggaac ttgctgctgt tggctccaag attttggtgc tgcgcagtgt tgaatacgct 660

cgtgcattca atgtgccact tcgcgtacgc tcgtcttata gtaatgatcc cggcactttg 720

attgccggct ctatggagga tattcctgtg gaagaagcag tccttaccgg tgtcgcaacc 780

gacaagtccg aagccaaagt aaccgttctg ggtatttccg ataagccagg cgagactgcc 840

aaggttttcc gtgcgttggc tgatgcagaa atcaacattg acatggttct gcagaacgtc 900

tcctctgtgg aagacggcac caccgacatc acgttcacct gccctcgcgc tgacggacgc 960

cgtgcgatgg agatcttgaa gaagcttcag gttcagggca actggaccaa tgtgctttac 1020

gacgaccagg tcggcaaagt ctccctcgtg ggtgctggca tgaagtctca cccaggtgtt 1080

accgcagagt tcatggaagc tctgcgcgat gtcaacgtga acatcgaatt gatttccacc 1140

tctgagatcc gcatttccgt gctgatccgt gaagatgatc tggatgctgc tgcacgtgca 1200

ttgcatgagc agttccagct gggcggcgaa gacgaagccg tcgtttatgc aggcaccgga 1260

cgctaa 1266

<210> 2

<211> 963

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ddh基因

<400> 2

atgaccaaca tccgcgtagc tatcgtaggc tacggaaacc tgggacgcag cgtcgaaaag 60

cttattgcca agcagcccga catggacctt gtaggaatct tctcgcgccg ggccaccctc 120

gacacaaaga cgccagtctt tgatgtcgcc gacgtggaca agcacgccga cgacgtggac 180

gtgctgttcc tgtgcatggg ctccgccacc gacatccctg agcaggcacc aaagttcgcg 240

cagttcgcct gcaccgtaga cacctacgac aaccatcgcg acatcccacg ccaccgccag 300

gtcatgaacg aagccgccac cgcagccggc aacgttgcac tggtctctac cggctgggat 360

ccaggaatgt tctccatcaa ccgcgtctac gcagcggcag tcttagccga gcaccagcag 420

cacaccttct ggggcccagg tttgtcacag ggccactccg atgctttgcg acgcatccct 480

ggcgttcaaa aggccgtcca gtacaccctc ccatccgaag aagccctgga aaaggcccgc 540

cgtggcgaag ccggcgacct caccggaaag caaacccaca agcgccaatg cttcgtggtt 600

gccgacgcgg ccgaccacga gcgcatcgaa aacgacatcc gcaccatgcc tgattacttc 660

gttggctacg aagtcgaagt caacttcatc gacgaagcaa ccttcgacgc cgagcacacc 720

ggcatgccac acggcggaca cgtgatcacc accggcgaca ccggtggctt caaccacacc 780

gtggaataca tcctgaagct ggaccgaaac ccagatttca ccgcttcttc acagatcgct 840

ttcggccgcg cagctcaccg catgaagcag cagggccaaa gcggtgcctt caccgtcctc 900

gaagttgctt catacttgct ctccccggag aacttggatg atctgatcgc acgcgacgtc 960

taa 963

<210> 3

<211> 309

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ddh基因被敲除后的核酸序列

<400> 3

atgaccaaca tccgcgtagc tatcgtaggc tacggaaacc tgggacgcag cgtcgaaaag 60

cttattgcca agcagcccga catggacctt gtaggaatct tctcgcgccg ggccaccctg 120

atatccgtgg aatacatcct gaagctggac cgaaacccag atttcaccgc ttcttcacag 180

atcgctttcg gccgcgcagc tcaccgcatg aagcagcagg gccaaagcgg tgccttcacc 240

gtcctcgaag ttgcttcata cttgctctcc ccggagaact tggatgatct gatcgcacgc 300

gacgtctaa 309

<210> 4

<211> 1893

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> lysC操纵子核苷酸序列

<400> 4

gcaacgctgt atataacctg cgtacggctt aaagtttggc tgccatgtga atttttagca 60

ccctcaacag ttgagtgctg gcactctcgg gggtagagtg ccaaataggt tgtttgacac 120

acagttgttc acccgcgacg acggctgtgc tggaaaccca caaccggcac acacaaaatt 180

tttctcatgg agggattcac catggccctg gtcgtacaga aatatggcgg ttcctcgctt 240

gagagtgcgg aacgcattag aaacgtcgct gaacggatcg ttgccaccaa gaagactaga 300

aatgatgtcg tggttgtctg ctccgcaatg ggagacacca cggatgaact tctagaactt 360

gcagcggcag tgaatcccgt tccgccagct cgtgaaatgg atatgctcct gactgctggt 420

gagcgtattt ctaacgctct cgtcgccatg gctattgagt cccttggcgc agaagctcaa 480

tctttcactg gctctcaggc tggtgtgctc accaccgagc gccacggaaa cgcacgcatt 540

gttgacgtca caccgggtcg tgtgcgtgaa gcactcgatg agggcaagat ctgcattgtt 600

gctggttttc agggtgttaa taaagaaacc cgcgatgtca ccacgttggg tcgtggtggt 660

tctgacacca ctgcagttgc gttggcagct gctttgaacg ctgatgtgtg tgagatttac 720

tcggacgttg acggtgtgta taccgctgac ccgcgcatcg ttcctaatgc acagaagctg 780

gaaaagctca gcttcgaaga aatgctggaa cttgctgctg ttggctccaa gattttggtg 840

ctgcgcagtg ttgaatacgc tcgtgcattc aatgtgccac ttcgcgtacg ctcgtcttat 900

agtaatgatc ccggcacttt gattgccggc tctatggagg atattcctgt ggaagaagca 960

gtccttaccg gtgtcgcaac cgacaagtcc gaagccaaag taaccgttct gggtatttcc 1020

gataagccag gcgagactgc caaggttttc cgtgcgttgg ctgatgcaga aatcaacatt 1080

gacatggttc tgcagaacgt ctcctctgtg gaagacggca ccaccgacat cacgttcacc 1140

tgccctcgcg ctgacggacg ccgtgcgatg gagatcttga agaagcttca ggttcagggc 1200

aactggacca atgtgcttta cgacgaccag gtcggcaaag tctccctcgt gggtgctggc 1260

atgaagtctc acccaggtgt taccgcagag ttcatggaag ctctgcgcga tgtcaacgtg 1320

aacatcgaat tgatttccac ctctgagatc cgcatttccg tgctgatccg tgaagatgat 1380

ctggatgctg ctgcacgtgc attgcatgag cagttccagc tgggcggcga agacgaagcc 1440

gtcgtttatg caggcaccgg acgctaaggc tgttttggcg gatgagagaa gattttcagc 1500

ctgatacaga ttaaatcaga acgcagaagc ggtctgataa aacagaattt gcctggcggc 1560

agtagcgcgg tggtcccacc tgaccccatg ccgaactcag aagtgaaacg ccgtagcgcc 1620

gatggtagtg tggggtctcc ccatgcgaga gtagggaact gccaggcatc aaataaaacg 1680

aaaggctcag tcgaaagact gggcctttcg ttttatctgt tgtttgtcgg tgaacgctct 1740

cctgagtagg acaaatccgc cgggagcgga tttgaacgtt gcgaagcaac ggcccggagg 1800

gtggcgggca ggacgcccgc cataaactgc caggcatcaa attaagcaga aggccatcct 1860

gacggatggc ctttttgcgt ttctacaaac tct 1893

<210> 5

<211> 4319

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ddhL-lysC操纵子-ddhR核酸序列

<400> 5

cagacgggtg cgttgttcgg cacgatcggt gtctctgtca acaagaagat cggcgtggat 60

cgcctgctga agtacctgaa cgcagatcgc gcaaacacca ttgcgttcgg cgacagcgat 120

gaggatctct ccctatttga ggcgagcgct tacggcgtcg cgatgggcga ggccaccgaa 180

tcgctcaagg ctgctgctga cctggtcacg gatgcggttg ggcaggacgg cttgcgcaat 240

gcgtttttaa aacttgagct tatcgacgcc tgaccccatc aaagaacttc ccaatctcct 300

cagccgctat cactgatgtg gttgaggggc ctagaaattc tggataagtt ttcccacttg 360

gtaccaagtg gccgatcccg ttgagtgtcc aaaactcaac gggattttct ccatcccagg 420

tatcgatcga caccacatca tcaatcacct ggtggcggtg ttcggtcagt ccgtttcggg 480

cggcaatata ggcagctgaa tcaaaggcgg acatgcccac gccacggcgg tgttcgcgac 540

caataccggc atcgccacac cggatgtgtc ttgaaagctt tcacctgtgg caaggtattt 600

tcagcaactg gcatgttgga tgcaatggtt gcagcgccac tgagcatctt gggaacctca 660

tgcatgagcc gcaacaccat ctgcccaccg ttggaatagc caacaataaa gatcctcttg 720

atgccatacg tgttgcccaa gtgcgtggcg agttttacaa agaaccccac atcatcaatg 780

cctaactggc gggtattttc atccaaaccc aaccgcgcat cattccaatg ctgatccacc 840

ccatccggat aaaccaccat gaacggcaac ggatcaaaag tcctgttggt gaagctgcgc 900

cccacagatc ctgactgctg ggagccatga aaatagatca gcgcatccgt ggtggaacca 960

aaaggctcaa caatacgaaa cgttcgcttt cggtcctgat gaaagagatg tccctgaatc 1020

atcatctaag tatgcatctc ggtaagctcg accaggacag tgccaccaca attttggagg 1080

attacaagaa catgaccaac atccgcgtag ctatcgtagg ctacggaaac ctgggacgca 1140

gcgtcgaaaa gcttattgcc aagcagcccg acatggacct tgtaggaatc ttctcgcgcc 1200

gggccaccct gatgcaacgc tgtatataac ctgcgtacgg cttaaagttt ggctgccatg 1260

tgaattttta gcaccctcaa cagttgagtg ctggcactct cgggggtaga gtgccaaata 1320

ggttgtttga cacacagttg ttcacccgcg acgacggctg tgctggaaac ccacaaccgg 1380

cacacacaaa atttttctca tggagggatt caccatggcc ctggtcgtac agaaatatgg 1440

cggttcctcg cttgagagtg cggaacgcat tagaaacgtc gctgaacgga tcgttgccac 1500

caagaagact agaaatgatg tcgtggttgt ctgctccgca atgggagaca ccacggatga 1560

acttctagaa cttgcagcgg cagtgaatcc cgttccgcca gctcgtgaaa tggatatgct 1620

cctgactgct ggtgagcgta tttctaacgc tctcgtcgcc atggctattg agtcccttgg 1680

cgcagaagct caatctttca ctggctctca ggctggtgtg ctcaccaccg agcgccacgg 1740

aaacgcacgc attgttgacg tcacaccggg tcgtgtgcgt gaagcactcg atgagggcaa 1800

gatctgcatt gttgctggtt ttcagggtgt taataaagaa acccgcgatg tcaccacgtt 1860

gggtcgtggt ggttctgaca ccactgcagt tgcgttggca gctgctttga acgctgatgt 1920

gtgtgagatt tactcggacg ttgacggtgt gtataccgct gacccgcgca tcgttcctaa 1980

tgcacagaag ctggaaaagc tcagcttcga agaaatgctg gaacttgctg ctgttggctc 2040

caagattttg gtgctgcgca gtgttgaata cgctcgtgca ttcaatgtgc cacttcgcgt 2100

acgctcgtct tatagtaatg atcccggcac tttgattgcc ggctctatgg aggatattcc 2160

tgtggaagaa gcagtcctta ccggtgtcgc aaccgacaag tccgaagcca aagtaaccgt 2220

tctgggtatt tccgataagc caggcgagac tgccaaggtt ttccgtgcgt tggctgatgc 2280

agaaatcaac attgacatgg ttctgcagaa cgtctcctct gtggaagacg gcaccaccga 2340

catcacgttc acctgccctc gcgctgacgg acgccgtgcg atggagatct tgaagaagct 2400

tcaggttcag ggcaactgga ccaatgtgct ttacgacgac caggtcggca aagtctccct 2460

cgtgggtgct ggcatgaagt ctcacccagg tgttaccgca gagttcatgg aagctctgcg 2520

cgatgtcaac gtgaacatcg aattgatttc cacctctgag atccgcattt ccgtgctgat 2580

ccgtgaagat gatctggatg ctgctgcacg tgcattgcat gagcagttcc agctgggcgg 2640

cgaagacgaa gccgtcgttt atgcaggcac cggacgctaa ggctgttttg gcggatgaga 2700

gaagattttc agcctgatac agattaaatc agaacgcaga agcggtctga taaaacagaa 2760

tttgcctggc ggcagtagcg cggtggtccc acctgacccc atgccgaact cagaagtgaa 2820

acgccgtagc gccgatggta gtgtggggtc tccccatgcg agagtaggga actgccaggc 2880

atcaaataaa acgaaaggct cagtcgaaag actgggcctt tcgttttatc tgttgtttgt 2940

cggtgaacgc tctcctgagt aggacaaatc cgccgggagc ggatttgaac gttgcgaagc 3000

aacggcccgg agggtggcgg gcaggacgcc cgccataaac tgccaggcat caaattaagc 3060

agaaggccat cctgacggat ggcctttttg cgtttctaca aactctatcc gtggaataca 3120

tcctgaagct ggaccgaaac ccagatttca ccgcttcttc acagatcgct ttcggccgcg 3180

cagctcaccg catgaagcag cagggccaaa gcggtgcctt caccgtcctc gaagttgctt 3240

catacttgct ctccccggag aacttggatg atctgatcgc acgcgacgtc taatttagct 3300

cgagaggcaa ggaaacagtg tggttttctt gcctcctttg gacttttcgg agggtgtctg 3360

ccgcggaccg aggggaaacc agacaggcgt gacaaaaatc tggatttccg ccaggttttg 3420

gcacgcctgt ccggtttagg ggattggaaa ccggacacac gtgccaaaac ttcgactttt 3480

tcgctaatct tgtcacgcct gtctggcttg cctcggatga ggtgatttca tggccaagat 3540

cccctaaaag ttcgacctcg caggatcgct tctaagggcc tttagcggac caacctaggc 3600

cgatacccat gtggaaatct cgacgtctta aatggacgat tagagctaaa accacgaaca 3660

gctgggattt tccacgatag gattgggtct cgtggagatt cgttggttgg aaggctttat 3720

tgcggtcgcg gaagaattgc actttagtaa tgctgcgatt cgtttgggga tgccgcaatc 3780

gccgttgagt cagttgatcc ggcggttgga gtcggagttg gggcagaagc tttttgatcg 3840

cagtacccgg tcggtggagt taactgccgc gggtcgggcg tttttgccgc atgccagggg 3900

gattgtggcg agcgctgcgg tggcgaggga agctgtgaat gctgccgagg gggagatcgt 3960

tggtgttgtt cgcattggtt tttctggtgt gctgaactat tccacgctgc cgattttgac 4020

cagtgaggtg cataaacggc ttcctaatgt ggagttggag ctcgttggtc agaagttgac 4080

gagggaagcg gtaagtttgc tgcgcttggg ggcgttggat attacgttga tgggtttgcc 4140

cattggggat ccagagattg agactcggct gattagtttg gaagagtttc gcgtggtgtt 4200

gccgaaggat catcgtcttg cgggggaagg agtggtggat ttggtggatc tggctgaaga 4260

tgggtttgtg acgacgccgg agtttgcggg gtctgtgttt aggaattcca cctttcagt 4319

Claims

1.一种产L-异亮氨酸的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)基因工程菌，其特征在于，其在出发菌株基因组中敲除了编码二氨基庚二酸脱氢酶的ddh基因，所述ddh基因的核苷酸序列如SEQ ID No:2所示；插入了编码天冬氨酸激酶的lysC操纵子，所述lysC操纵子含lysC突变基因、其5’端的启动子和3’端的终止子，其中所述lysC突变基因的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示；且所述出发菌株为保藏号为CCTCC NO:M2016609的C.glutamicumH5 ΔargG ΔalaT::ilvC。

2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述敲除为将编码二氨基庚二酸脱氢酶的ddh基因置换为如SEQ ID No:3所示的核苷酸序列。

3.如权利要求1或2所述的基因工程菌，其特征在于，所述启动子为来源于出发菌株基因组的pgro启动子，所述终止子为来源于大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭载体PXMJ19的rrnB终止子，所述lysC操纵子的序列如SEQ ID No:4所示。

4.如权利要求1-3任一项所述的基因工程菌，其特征在于，所述编码天冬氨酸激酶的lysC操纵子插入在ddh基因敲除的位点上；优选地，所述插入形成如SEQ ID No:5所示的核苷酸序列，由此制得基因工程菌C.glutamicum H5 ΔargG ΔalaT::ilvCΔddh::lysC。

5.一种如权利要求1-4任一项所述的基因工程菌的制备方法，其特征在于，其包括以下的步骤：

(1)在保藏号为CCTCC NO:M2016609的C.glutamicum H5 ΔargG ΔalaT::ilvC出发菌株基因组敲除ddh基因，获得C.glutamicum H5 ΔargG ΔalaT::ilvCΔddh菌株；

(2)在步骤(1)获得的C.glutamicum H5 ΔargG ΔalaT::ilvCΔddh菌株基因组上插入lysC操纵子，获得C.glutamicum H5 ΔargG ΔalaT::ilvCΔddh::lysC。

6.一种L-异亮氨酸的制备方法，其特征在于，其包括以下的步骤：发酵培养权利要求1-4任一项所述的基因工程菌以产生L-异亮氨酸。

7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养的温度为29～33℃；溶解氧为15～30％，所述％为体积百分比；发酵时间为至少55小时；和/或，氨水调节发酵培养基的pH为6.5～7.0。

8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，发酵培养时流加50～80％葡萄糖溶液，控制发酵培养基残糖量为1.5～2.5％；优选地，所述发酵培养基为：葡萄糖16.0％、硫酸铵0.8％、玉米浆3.5％、酵母膏0.3％、丝肽粉0.3％、磷酸氢二钾0.1％、硫酸镁0.05％、维生素B1 0.00003％、生物素0.00002％、硫酸铁0.00001％、丙氨酸0.004％；余量为去离子水，pH为7；所述％为重量体积(g/mL)百分比。

9.一种重组载体，所述重组载体在多克隆位点上整合了lysC操纵子，所述lysC操纵子含lysC突变基因、其5’端的启动子和3’端的终止子，其中所述lysC突变基因的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示；优选地，所述启动子为来源于出发菌株基因组的pgro启动子，所述终止子为来源于大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭载体PXMJ19的rrnB终止子，所述lysC操纵子的序列如SEQ ID No:4所示；更优选地，所述启动子pgro的5’端还包括ddh基因的上游片段ddhL；所述终止子的3’端还包括ddh基因的下游片段ddhR；进一步更优选地，所述重组载体在多克隆位点上整合了如SEQ ID No:5所示的核苷酸序列；最优选地，所述的重组载体的骨架质粒为pk18mobsacB。

10.如权利要求1-4任一项所述的基因工程菌或如权利要求9所述的重组载体在制备L-异亮氨酸中的应用。