CN116463304B - 苏氨酸脱氢酶基因突变体及其应用 - Google Patents
苏氨酸脱氢酶基因突变体及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116463304B CN116463304B CN202310699284.7A CN202310699284A CN116463304B CN 116463304 B CN116463304 B CN 116463304B CN 202310699284 A CN202310699284 A CN 202310699284A CN 116463304 B CN116463304 B CN 116463304B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- ilva
- seq
- gene
- microorganism
- recombinant
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108010043075 L-threonine 3-dehydrogenase Proteins 0.000 title claims abstract description 25
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 192
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims abstract description 126
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 75
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims abstract description 74
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 72
- 229960004295 valine Drugs 0.000 claims abstract description 70
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims abstract description 58
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims abstract description 57
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 57
- 229930182844 L-isoleucine Natural products 0.000 claims abstract description 41
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims abstract description 30
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 21
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 91
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 claims description 55
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 45
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 38
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 38
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 36
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 36
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 31
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 30
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 28
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 claims description 24
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 23
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 23
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 19
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 14
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 14
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 14
- 239000012620 biological material Substances 0.000 claims description 13
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 10
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 10
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 9
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 8
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims description 8
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 7
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 claims description 5
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 3
- 125000002987 valine group Chemical group [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 claims description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 2
- 101150095957 ilvA gene Proteins 0.000 abstract description 335
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 abstract description 30
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 abstract description 5
- 230000006872 improvement Effects 0.000 abstract description 5
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 107
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 105
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 36
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 36
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 28
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 28
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 28
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 27
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 27
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 27
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 27
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 21
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 241001485655 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 Species 0.000 description 16
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 16
- GUAHPAJOXVYFON-ZETCQYMHSA-N (8S)-8-amino-7-oxononanoic acid zwitterion Chemical compound C[C@H](N)C(=O)CCCCCC(O)=O GUAHPAJOXVYFON-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 14
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 14
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 13
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 13
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 13
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 12
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 12
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 description 12
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 description 12
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 11
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 11
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 description 10
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 10
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 10
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 10
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 10
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 10
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 9
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 9
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 9
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 9
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 9
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 8
- 101100139916 Escherichia coli (strain K12) rarA gene Proteins 0.000 description 8
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 8
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 8
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 8
- 101150070458 yaiT gene Proteins 0.000 description 8
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 7
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 7
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 6
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 6
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 6
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 6
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 6
- 101150051280 dmsA gene Proteins 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 6
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 6
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 5
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 5
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 5
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 5
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 5
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 5
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 5
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 5
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 description 4
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 3
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 101150063416 add gene Proteins 0.000 description 3
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 3
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 3
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 3
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 238000006209 dephosphorylation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 238000007849 hot-start PCR Methods 0.000 description 3
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 3
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 3
- KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-N 2-oxoglutaric acid Chemical compound OC(=O)CCC(=O)C(O)=O KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YQUVCSBJEUQKSH-UHFFFAOYSA-N 3,4-dihydroxybenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 YQUVCSBJEUQKSH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000186146 Brevibacterium Species 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 101710175625 Maltose/maltodextrin-binding periplasmic protein Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- 241000319304 [Brevibacterium] flavum Species 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 2
- 108010045262 enhanced cyan fluorescent protein Proteins 0.000 description 2
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 2
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 239000007320 rich medium Substances 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 241000588810 Alcaligenes sp. Species 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N Betaine Natural products C[N+](C)(C)CC([O-])=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 241000186145 Corynebacterium ammoniagenes Species 0.000 description 1
- 241000186249 Corynebacterium sp. Species 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000588914 Enterobacter Species 0.000 description 1
- 241001302584 Escherichia coli str. K-12 substr. W3110 Species 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000724791 Filamentous phage Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N HA peptide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N 0.000 description 1
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- RHGKLRLOHDJJDR-BYPYZUCNSA-N L-citrulline Chemical compound NC(=O)NCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O RHGKLRLOHDJJDR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 241000192041 Micrococcus Species 0.000 description 1
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-O N,N,N-trimethylglycinium Chemical compound C[N+](C)(C)CC(O)=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- RHGKLRLOHDJJDR-UHFFFAOYSA-N Ndelta-carbamoyl-DL-ornithine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=O RHGKLRLOHDJJDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000520272 Pantoea Species 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000607720 Serratia Species 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N Succinic acid Natural products OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- HWXBTNAVRSUOJR-UHFFFAOYSA-N alpha-hydroxyglutaric acid Natural products OC(=O)C(O)CCC(O)=O HWXBTNAVRSUOJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940009533 alpha-ketoglutaric acid Drugs 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003237 betaine Drugs 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N butanedioic acid Chemical compound O[14C](=O)CC[14C](O)=O KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 229960004106 citric acid Drugs 0.000 description 1
- 235000013477 citrulline Nutrition 0.000 description 1
- 229960002173 citrulline Drugs 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000030609 dephosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000005265 energy consumption Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical class [H]* 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000012269 metabolic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 238000004886 process control Methods 0.000 description 1
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 108010054624 red fluorescent protein Proteins 0.000 description 1
- 230000008844 regulatory mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 238000012807 shake-flask culturing Methods 0.000 description 1
- JXOHGGNKMLTUBP-HSUXUTPPSA-N shikimic acid Chemical compound O[C@@H]1CC(C(O)=O)=C[C@@H](O)[C@H]1O JXOHGGNKMLTUBP-HSUXUTPPSA-N 0.000 description 1
- JXOHGGNKMLTUBP-JKUQZMGJSA-N shikimic acid Natural products O[C@@H]1CC(C(O)=O)=C[C@H](O)[C@@H]1O JXOHGGNKMLTUBP-JKUQZMGJSA-N 0.000 description 1
- 230000003584 silencer Effects 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- -1 thus Proteins 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/06—Alanine; Leucine; Isoleucine; Serine; Homoserine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
- C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
- C12Y101/01103—L-Threonine 3-dehydrogenase (1.1.1.103)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/15—Corynebacterium
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/185—Escherichia
- C12R2001/19—Escherichia coli
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了苏氨酸脱氢酶基因突变体及其应用，属于生物技术领域，所要解决的技术问题是如何提高微生物L‑缬氨酸或L‑异亮氨酸的产量。本发明具体公开了工程化苏氨酸脱氢酶，其包含相对于参比序列（SEQ ID No.2）的第131、171或218位的氨基酸中的突变。本发明构建了过表达ilvAV131A、ilvAR171H和/或ilvAM218I基因的重组菌，以及点突变重组菌，结果表明突变基因的过表达可以提高受体菌的L‑缬氨酸和/或L‑异亮氨酸的产量，并具有协同促进L‑缬氨酸和/或L‑异亮氨酸生产的作用，而ilvA基因的点突变则有助于L‑异亮氨酸产量的提高。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及苏氨酸脱氢酶基因突变体及其在L-缬氨酸或L-异亮氨酸合成中的应用。
背景技术
氨基酸作为生命体蛋白质的基本组成单位，在人和动物的营养健康方面发挥着重要的作用。虽然存在于自然界中的氨基酸有300余种，但组成人体蛋白质的氨基酸仅有20种，且均属L-氨基酸（除甘氨酸外）。氨基酸工业是发酵工业的支柱产业之一，近年来，L-氨基酸在食品工业、医药、农业、畜牧业、以及人类健康、保健、化妆品行业等方面，发挥了越来越广泛的作用。我国是氨基酸生产和消费大国，一些高附加值的氨基酸品种如L-缬氨酸或L-异亮氨酸等迅速发展，产能及产量均有所提升，但仍然存在着主要生产技术指标落后、能源消耗大、生产成本较高、发酵产率和转化率低等问题。传统的氨基酸生产方法有提取法、化学合成法、酶法以及微生物发酵法。提取法和化学合成法由于原料来源受限制、生产成本较高、污染环境，难以实现大规模工业化生产。而微生物发酵法具有原料成本低、反应条件温和、容易实现大规模生产等优点，是目前生产L-氨基酸最主要的方法。
优良的生产菌种是提高氨基酸产量和质量的保障。随着重组DNA技术的发展和相关微生物基因组信息的获得，基于代谢工程原理的基因工程育种技术逐渐成为主流。对微生物的代谢途径及代谢网络进行有目的的改造，人为改变菌种的代谢调控机制，可使微生物体内的代谢流按照所要求的方向进行，过量积累氨基酸、大幅提高氨基酸的产量、降低成本。通过优良菌种的不断改良，开发高效、高产的基因工程菌是氨基酸行业发展与竞争的关键，有利于加快L-氨基酸产业化的进程。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何通过基因的遗传改造提高谷氨酸棒杆菌或大肠杆菌L-缬氨酸和/或L-异亮氨酸的产量，所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了工程化苏氨酸脱氢酶，所述工程化苏氨酸脱氢酶为蛋白质，所述蛋白质可包括下述任一种：
A1）蛋白质，其包含相对于参比序列的第131位的氨基酸、第171位的氨基酸或第218位的氨基酸中的突变，所述参比序列如SEQ ID No.2所示；
A2）在A1）的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质；
所述第131位的氨基酸突变为丙氨酸（A）；所述第171位的氨基酸突变为组氨酸（H）；所述第218位的氨基酸突变为异亮氨酸（I）。
进一步地，所述蛋白质（工程化苏氨酸脱氢酶）可包括下述任一种：
M1）氨基酸序列包含如SEQ ID No.4、SEQ ID No.6或SEQ ID No.8所示的蛋白质；
M2）在M1）的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。
本文所述标签包括但不限于：GST（谷胱甘肽巯基转移酶）标签蛋白、His6标签蛋白（His-tag）、MBP（麦芽糖结合蛋白）标签蛋白、Flag标签蛋白、SUMO标签蛋白、HA标签蛋白、Myc标签蛋白、eGFP（增强型绿色荧光蛋白）、eCFP（增强型青色荧光蛋白）、eYFP（增强型黄绿色荧光蛋白）、mCherry（单体红色荧光蛋白）或AviTag标签蛋白。
氨基酸序列包含如SEQ ID No.4所示的蛋白质名称可为ilvAV131A蛋白，氨基酸序列包含如SEQ ID No.6所示的蛋白质名称可为ilvAR171H蛋白，氨基酸序列包含如SEQ ID No.8所示的蛋白质名称可为ilvAM218I蛋白。
本发明还提供了生物材料，所述生物材料可包括下述任一种：
B1）编码所述工程化苏氨酸脱氢酶的核酸分子；
B2）含有B1）所述核酸分子的表达盒；
B3）含有B1）所述核酸分子的重组载体、或含有B2）所述表达盒的重组载体；
B4）含有B1）所述核酸分子的重组微生物、或含有B2）所述表达盒的重组微生物、或含有B3）所述重组载体的重组微生物；
B5）含有B1）所述核酸分子的重组细胞、或含有B2）所述表达盒的重组细胞、或含有B3）所述重组载体的重组细胞。
上述生物材料中，B1）所述的核酸分子可为编码序列是SEQ ID No.3、SEQ ID No.5或SEQ ID No.7所示的DNA分子。
SEQ ID No.3所示的DNA分子即为本发明所述突变型ilvAV131A基因，其编码SEQ IDNo.4所示的突变蛋白质ilvAV131A蛋白；SEQ ID No.5所示的DNA分子即为本发明所述突变型ilvAR171H基因，其编码SEQ ID No.6所示的突变蛋白质ilvAR171H蛋白；SEQ ID No.7所示的DNA分子即为本发明所述突变型ilvAM218I基因，其编码SEQ ID No.8所示的突变蛋白质ilvAM218I蛋白。
所述ilvAV131A蛋白氨基酸序列（SEQ ID No.4）中第131位的丙氨酸（A）由缬氨酸（V）突变而来；所述ilvAR171H蛋白氨基酸序列（SEQ ID No.6）中第171位的组氨酸（H）由精氨酸（R）突变而来；所述ilvAM218I蛋白氨基酸序列（SEQ ID No.8）中第218位的异亮氨酸（I）由甲硫氨酸（M）突变而来。
所述ilvAV131A基因的核苷酸序列（SEQ ID No.3）中第392位的鸟嘌呤（G）由腺嘌呤（A）突变而来；所述ilvAR171H基因的核苷酸序列（SEQ ID No.5）中第512位的胸腺嘧啶（T）由胞嘧啶（C）突变而来；所述ilvAM218I基因的核苷酸序列（SEQ ID No.7）中第654位的胸腺嘧啶（T）由胞嘧啶（C）突变而来。
上述生物材料中，B4）所述的重组微生物可为下述任一种：
D1）将氨基酸序列包含如SEQ ID No.4、SEQ ID No.6和/或SEQ ID No.8所示蛋白质的编码基因导入所述目的微生物得到的重组微生物；
D2）将编码序列包含SEQ ID No.3、SEQ ID No.5和/或SEQ ID No.7所示的DNA分子导入所述目的微生物得到的重组微生物。
上述生物材料中，所述微生物可为谷氨酸棒杆菌或大肠杆菌。
本文所述载体是指能够把外源DNA或目的基因运载进入宿主细胞进行扩增和表达的载体，所述载体可以是克隆载体也可以是表达载体，包括但不限于：质粒、噬菌体（如λ噬菌体或M13丝状噬菌体等）、黏粒（即柯斯质粒）或病毒载体。具体可为载体pET28(a)、pGRB克隆载体和/或pREDCas9质粒。
本文所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属（Escherichia sp.）、欧文氏菌属（Erwinia sp.）、土壤杆菌属（Agrobacterium sp.）、黄杆菌属（Flavobacterium sp.）、产碱菌属（Alcaligenes sp.）、假单胞菌属（Pseudomonas sp.）、芽胞杆菌属（Bacillus sp.）、短杆菌属（Brevibacterium sp.）、棒状杆菌属（Corynebacterium sp.）、气杆菌属（Aerobacter sp.）、肠杆菌属（Enterobacteria sp.）、微球菌属（Micrococcus sp.）、沙雷氏菌属（Serratia sp.）、沙门氏菌属（Salmonella sp.）、链霉菌属（Streptomyces sp.）、普罗维登斯菌属（Providencia sp.）等但不限于此。
进一步地，所述细菌可为大肠杆菌（Escherichia coli）、谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）、乳酸发酵短杆菌（Brevibacterium lactofermentum）、黄色短杆菌（Brevibacterium flavum）、北京棒杆菌（Corynebacterium pekinense）、噬氨短杆菌（Brevibacterium ammoniagenes，产氨短杆菌）、钝齿棒状杆菌（Corynebacterium crenatum）或泛菌（Pantoea）但不限于此。
在本发明的一个或多个实施方案中，所述微生物为大肠杆菌（Escherichia coli），具体为大肠杆菌DH5α、大肠杆菌W3110、大肠杆菌CGMCC22721、谷氨酸棒杆菌ATCC13032和/或谷氨酸棒杆菌CGMCC 20437。
本文所述细胞可为植物细胞或动物细胞。所述细胞可为任何可以合成目的氨基酸的生物细胞。
本文所述重组载体是指将外源目的基因与载体在体外连接构建而成的重组体DNA分子，可以任何合适的方式构建，只要构建的重组载体可携带外源目的基因进入受体细胞、并为外源目的基因提供在受体细胞的复制、整合、扩增和/或表达能力即可。
进一步地，本文所述重组载体可为ilvAV131A基因、ilvAR171H基因和/或ilvAM218I基因的过表达载体，进一步地，本文所述重组载体可为含有SEQ ID No.3、SEQ ID No.5和/或SEQID No.7所示DNA分子的重组载体。
本文所述重组微生物（或重组宿主细胞）是指对目的微生物（或目的宿主细胞）的基因进行操作和修饰，从而得到功能发生变化的重组微生物（或功能发生变化的重组宿主细胞）。如将外源目的基因或重组载体导入目的微生物（或目的宿主细胞）后得到的重组微生物（或重组宿主细胞），或直接对目的微生物（或目的宿主细胞）的内源基因进行基因编辑后得到的重组微生物（或重组宿主细胞）。所述重组微生物（或重组宿主细胞）可理解为不仅是指特定的重组微生物（或重组宿主细胞），而且也指这种细胞的后代，且由于天然的、偶然的或有意的突变和/或改变，该子代可以不必与原始的亲代细胞完全一致，但仍包括在重组微生物（或重组宿主细胞）的范围中。
进一步地，本文所述重组微生物可为过表达ilvAV131A基因、ilvAR171H基因和/或ilvAM218I基因的工程菌株，进一步地，本文所述重组微生物可为含有SEQ ID No.3、SEQ IDNo.5和/或SEQ ID No.7所示DNA的重组微生物。
在本发明的一个或多个实施方案中，所述重组微生物可为：YPVAL-ilvA-001～YPVAL-ilvA-010、YPILE-ilvA-001～YPILE-ilvA-024中的任一重组菌。
其中YPVAL-ilvA-001～YPVAL-ilvA-010可为以大肠杆菌CGMCC22721为出发菌，在基因组上过表达ilvAV131A基因、ilvAR171H基因和/或ilvAM218I得到的重组菌；YPILE-ilvA-001～YPILE-ilvA-006可为以谷氨酸棒杆菌CGMCC 20437为出发菌，对野生型ilvA基因进行点突变得到的重组菌；YPILE-ilvA-007～YPILE-ilvA-020可为以谷氨酸棒杆菌CGMCC 20437为出发菌，在基因组上过表达ilvAV131A基因、ilvAR171H基因和/或ilvAM218I得到的重组菌；YPILE-ilvA-020～YPILE-ilvA-024可为以谷氨酸棒杆菌CGMCC 20437为出发菌，在质粒上过表达ilvAV131A基因、ilvAR171H基因和/或ilvAM218I得到的重组菌，即由质粒携带外源基因在染色体外进行过表达。
本发明还提供了所述工程化苏氨酸脱氢酶或所述生物材料的下述任一种应用：
E1）在调控微生物L-缬氨酸或L-异亮氨酸的产量中的应用；
E2）在制备L-缬氨酸或L-异亮氨酸中的应用；
E3）在构建产L-缬氨酸或L-异亮氨酸的基因工程菌中的应用；
所述微生物可为谷氨酸棒杆菌或大肠杆菌。
所述调控可包括上调（提高）或下调（降低）。
所述调控微生物L-缬氨酸的产量可为上调（提高）或下调（降低）微生物中L-缬氨酸的积累量（即促进或抑制L-缬氨酸的生物合成）。
所述调控微生物L-异亮氨酸的产量可为上调（提高）或下调（降低）微生物中L-异亮氨酸的积累量（即促进或抑制L-异亮氨酸的生物合成）。
本文中，所述L-氨基酸可包括L-缬氨酸或L-异亮氨酸。
本发明还提供了一种提高目的微生物L-氨基酸的产量或者制备L-氨基酸的方法，所述方法可包括下述任一种：
F1）提高目的微生物中至少任一所述核酸分子的表达量或含量，得到L-氨基酸的产量高于所述目的微生物的微生物；
F2）对目的微生物中的核苷酸序列为SEQ ID No.1的DNA分子进行突变，得到L-氨基酸的产量高于所述目的微生物的微生物，所述突变包括：将SEQ ID No.1所示DNA分子编码的氨基酸序列的第131位的缬氨酸残基突变为丙氨酸（A）、第171位的精氨酸突变为组氨酸（H）或第218位的甲硫氨酸突变为异亮氨酸（I）；
所述L-氨基酸为L-缬氨酸或L-异亮氨酸，所述目的微生物为谷氨酸棒杆菌或大肠杆菌。
进一步地，将SEQ ID No.1所示DNA分子编码的氨基酸序列的第131位的缬氨酸残基突变为丙氨酸具体可为将SEQ ID No.1所示DNA分子中第392位的核苷酸A突变为G。所述第171位的精氨酸突变为组氨酸具体可为将SEQ ID No.1所示DNA分子中第512位的核苷酸C突变为T。所述第218位的甲硫氨酸突变为异亮氨酸具体可为将SEQ ID No.1所示DNA分子中第654位的核苷酸C突变为T。
进一步地，所述突变可通过基因编辑技术或定点突变方法进行。
进一步地，所述突变可为点突变（point mutation），即单个核苷酸的突变。
进一步地，所述F1）可通过如下任一方法实现：（1）增加目的微生物中ilvAV131A基因、ilvAR171H基因和/或ilvAM218I基因的拷贝数（如将单拷贝或多拷贝的基因导入目的微生物）；（2）通过表达调控序列增强ilvAV131A基因、ilvAR171H基因和/或ilvAM218I基因的表达（如修饰基因的表达调控序列），所述表达调控序列可为启动子、增强子或沉默子序列。
所述制备L-氨基酸的方法可包括利用本文所述重组微生物通过发酵法来生产L-氨基酸。
本文中，所述L-氨基酸可包括L-缬氨酸和/或L-异亮氨酸。
本发明还提供了制备L-缬氨酸的方法，所述方法可包括如下步骤：
Q1）在培养基中培养重组菌YPVAL-ilvA-001～YPVAL-ilvA-010中的至少一种；
Q2）从所述重组菌菌体和/或培养基中收集所述L-缬氨酸。
本发明还提供了制备L-异亮氨酸的方法，所述方法可包括如下步骤：
R1）在培养基中培养重组菌YPILE-ilvA-001～YPILE-ilvA-024中的至少一种；
R2）从所述重组菌菌体和/或培养基中收集所述L-异亮氨酸。
所述培养可以根据本领域的常规方法进行，包括但不限于孔板培养、摇瓶培养、批次培养、连续培养和分批补料培养等，并可以根据实际情况适当地调整各种培养条件如温度、时间和培养基的pH值等。
上述方法中，所述方法可包括下述任一种：
G1）将氨基酸序列包含如SEQ ID No.4、SEQ ID No.6和/或SEQ ID No.8所示蛋白质的编码基因导入所述目的微生物；
G2）将编码序列包含SEQ ID No.3、SEQ ID No.5和/或SEQ ID No.7所示的DNA分子导入所述目的微生物。
所述目的微生物为谷氨酸棒杆菌或大肠杆菌。
本发明还提供了所述工程化苏氨酸脱氢酶在制备含有L-缬氨酸或L-异亮氨酸的食品、化妆品、药品或饲料中的应用。
本发明还提供了所述生物材料在制备含有L-缬氨酸或L-异亮氨酸的食品、化妆品、药品或饲料中的应用。
本文所述目的微生物可来源于棒状杆菌属（Corynebacterium sp.）或埃希氏菌属（Escherichia sp.），具体地，所述目的微生物可为谷氨酸棒杆菌或大肠杆菌。
本文所述导入可包括通过化学转化法（如Ca2+诱导的转化法、聚乙二醇介导的转化法或金属阳离子介导的转化法）或电穿孔转化法等任何已知的转化方法将携带本发明DNA分子的载体转化宿主菌；也可为通过噬菌体转导的方法将本发明DNA分子转导进入宿主菌。导入的DNA分子可以是单拷贝也可以是多拷贝。所述导入可以是将外源基因整合到宿主染色体中，也可以是由质粒在染色体外表达。
利用本发明所述ilvA基因或其变体（如ilvAV131A基因、ilvAR171H基因、ilvAM218I基因）构建的重组微生物或重组细胞可用于生产多种产物，包括但不限于实施例中的缬氨酸和/或异亮氨酸，所生产的产物还可包括赖氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸、莽草酸、原儿茶酸、丁二酸、α酮戊二酸、柠檬酸、鸟氨酸和/或瓜氨酸。
本发明以大肠杆菌CGMCC22721为出发菌，构建了在基因组上过表达ilvAV131A基因、ilvAR171H基因和/或ilvAM218I基因的重组菌。并以谷氨酸棒杆菌CGMCC 20437为出发菌，分别构建了在基因组和质粒上过表达ilvAV131A基因、ilvAR171H基因和/或ilvAM218I基因的重组菌，同时还以谷氨酸棒杆菌CGMCC 20437为出发菌，对该菌的ilvA基因进行点突变构建了点突变的重组菌，将构建的工程菌株进行发酵实验，结果表明：ilvAV131A基因、ilvAR171H基因和/或ilvAM218I基因的过表达可以提高受体菌的L-缬氨酸和/或L-异亮氨酸的产量，并且这些突变型基因的过表达具有协同促进L-缬氨酸和/或L-异亮氨酸生产的作用。来源于谷氨酸棒杆菌的ilvA基因的氨基酸序列的点突变ilvAV131A、ilvAR171H、ilvAM218I则有助于L-异亮氨酸产量的提高。本发明构建的基因工程菌种，可以促进L-缬氨酸和/或L-异亮氨酸的积累，提高L-缬氨酸和/或L-异亮氨酸的产量。本发明培育了符合工业化生产的高产、高质量菌种，有利于推动L-缬氨酸及L-异亮氨酸的工业化生产进程。
保藏说明
菌种名称：大肠埃希氏菌
拉丁名：Escherichia coli
分类命名：大肠埃希氏菌Escherichia coli
菌株编号：YP045
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏单位简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2021年06月15日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.22721
菌种名称：谷氨酸棒杆菌
拉丁名：Corynebacterium glutamicum
分类命名：谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum
菌株编号：YPILE001
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏单位简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2020年08月17日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.20437
附图说明
图1为W3110-ilvA突变株的高效液相色谱法L-氨基酸分析结果。
图2为ilvA突变体取代的氨基酸酸及在各自突变体中使用的引物名称。
图3为W3110-ilvA（第131位点突变）突变株的高效液相色谱法L-氨基酸分析结果。
图4为W3110-ilvA（第171位点突变）突变株的高效液相色谱法L-氨基酸分析结果。
图5为W3110-ilvA（第218位点突变）突变株的高效液相色谱法L-氨基酸分析结果。
图6为实施例4中培养基的组成和培养条件。
图7为实施例4中SSCP电泳的PAGE的制备及电泳条件。
图8为实施例8中发酵培养基配方（其余为水）。
图9为实施例8中发酵控制工艺。
图10为实施例8中L-缬氨酸发酵实验结果。
图11为实施例9中L-异亮氨酸发酵实验结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的大肠杆菌W3110为美国典型培养物保藏中心（American TypeCulture Collection，ATCC）的菌株，保藏编号为：ATCC27325。
下述实施例中的谷氨酸棒杆菌ATCC13032为美国典型培养物保藏中心（AmericanType Culture Collection，ATCC）的菌株，保藏编号为：ATCC13032。
下述实施例中的L-缬氨酸生产菌CGMCC22721为大肠埃希氏菌（Escherichia coli）YP045 CGMCC No.22721，也称为大肠杆菌CGMCC22721。已于2021年06月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏登记号为CGMCC No.22721。
下述实施例中的谷氨酸棒杆菌CGMCC 20437为谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）YPILE001 CGMCC No.20437。已于2020年08月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏登记号为CGMCC No.20437。
下述实施例中的pGRB克隆载体和pREDCas9质粒为addgene公司产品。
实施例1、构建苏氨酸脱氢酶基因突变的W3110菌株
一、苏氨酸脱氢酶基因ilvA突变表达质粒的构建
为了研究方便，首先将野生型ilvA基因（序列如SEQ ID No.1）克隆到表达载体pET28(a)中。以NCBI公布的谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）ATCC13032基因组序列为模板，以pET28-PF和pET28-PR为引物进行PCR扩增，获得野生型ilvA基因片段。回收后与经EcoR I/HindIII酶切回收的表达载体pET28(a)（购自TaKaRa公司，含有卡那霉素抗性）用NEBuilder酶（购自NEB公司）50℃连接30 min，连接产物转化大肠杆菌DH5α，涂布到含有卡那霉素（50 mg/L）的2-YT琼脂平板上37℃培养，获得含ilvA及其启动子的pET28(a)转化子（转化后在含有卡那霉素的平板上长出的菌落即为转化子），对培养长出的单克隆用引物T7F/T7R和r Taq聚合酶进行PCR鉴定，PCR扩增出含有大小1811 bp片段的菌落为阳性克隆，即含有ilvA基因（SEQ ID No.1）的阳性转化子（重组菌）DH5α/pET28(a)-ilvA，提取质粒后命名为pET28(a)-ilvA。
为了获得苏氨酸脱氢酶基因ilvA的突变体，使用随机诱变试剂盒（AgilentTechnologies，USA）制备了ilvA突变型基因质粒，方法为：以质粒pET28(a)-ilvA为模板，以pET28-PF和pET28-PR为引物进行PCR扩增，获得了包含随机点突变的ilvA基因片段1603bp。
PCR扩增体系：5×HiFi with Mg2+ Buffer 10 μL，dNTP Mixture（10 mM）1.5 μL，引物（10 pM）各1.6 μL，KAPA HiFi HotStart(1 U/μL) 0.5 μL，补ddH2O至总体积50 μL。
PCR扩增程序：95℃预变性5 min，（98℃变性20 s；56℃退火15 s；72℃延伸60 s；30个循环），72℃过度延伸5 min。
回收的DNA片段（包含随机点突变的ilvA基因片段1603 bp）与经EcoR I/Hind III酶切回收的线性化表达载体pET28(a)用NEBuilder酶于50℃连接30 min，连接产物转化大肠杆菌DH5α，涂布到含有卡那霉素（50 mg/L）的2-YT琼脂平板上37℃培养。对培养长出的单克隆用引物T7F /T7R和r Taq聚合酶进行PCR鉴定，PCR扩增出含有大小1811 bp片段的为含ilvA随机突变的pET28(a)阳性转化子，提取质粒即为ilvA随机突变质粒。
PCR扩增体系：2×Premix r Taq 12.5 μL，引物（10 pM）各1 μL，补ddH2O至总体积25 μL。
PCR扩增程序：94℃预变性5 min，94℃变性30 s；56℃退火30 s；72℃延伸90 s（30个循环），72℃过度延伸10 min。
引物设计如下（上海invitrogen公司合成）：
pET28-PF:5'-ACTGGTGGACAGCAAATGGGTCGCGGATCCGAATTCTTAGGTCAAGTATTCGTACT-3'（带下划线的核苷酸序列为pET28(a)同源臂序列）（SEQ ID No.15），
pET28-PR:5'-GGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTGCGGCCGCAAGCTAGACAAAACTTTTCTCCTGG-3'（带下划线的核苷酸序列为pET28(a)同源臂序列）（SEQ ID No.16）。
T7F:5'-CAGCAGCCATCATCATCATC-3'（SEQ ID No.17），
T7R:5'-ATCCGGATATAGTTCCTCC-3'（SEQ ID No.18）。
二、苏氨酸脱氢酶基因ilvA突变菌株的构建
将步骤一中构建的ilvA随机突变质粒转化到大肠杆菌W3110菌株中（转化和鉴定同步骤一），将阳性转化子在含有卡那霉素（50 mg/L）的2-YT琼脂平板上连续传代三次后，接种到装有丰富培养基30 mL的500 mL三角瓶中37℃摇瓶发酵24 h，发酵培养菌体长至OD600=0.2时加入终浓度0.1 mM的IPTG以诱导苏氨酸脱氢酶过表达。
发酵培养结束后采用高效液相色谱法（HPLC）分析L-氨基酸的浓度，如图1所示。挑选具有比W3110对照的L-氨基酸生产能力优越的菌株，即为W3110-ilvA突变株。
丰富培养基：溶剂是水，溶质及其浓度为葡萄糖30 g/L，(NH4)2SO4 2 g/L，H3PO4 0.5 g/L，KCl 0.8 g/L，MgSO4•7H2O 0.8 g/L，FeSO4•7H2O 0.05 g/L，MnSO4•H2O 0.05 g/L，FM902酵母粉1.5 g/L，玉米浆5 g/L，糖蜜17 g/L，甜菜碱0.5 g/L，柠檬酸2 g/L，VH 20 mg/L，VB11.5 mg/L，VB31.5 mg/L VB121.5 g/L，氢氧化钠调节pH7.0。
结果如图1所示，本发明的大肠杆菌W3110-ilvA突变株具有产部分L-氨基酸的能力，其中W3110-ilvA突变株2、突变株3和突变株5产L-缬氨酸的能力更优越。
通过从W3110-ilvA突变株2提取质粒对ilvA基因进行测序的结果，确认了W3110-ilvA突变株2中核苷酸序列的第392位腺嘌呤（A）突变为鸟嘌呤（G），其突变型蛋白质氨基酸序列中的第131位缬氨酸（V）突变为丙氨酸（A），从W3110-ilvA突变株2提取的质粒为随机突变中产生点突变（A-G）的突变质粒，命名为重组载体pET28(a)-ilvAV131A。
野生型ilvA基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1，其编码的野生型ilvA蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.2。
将野生型ilvA基因的核苷酸序列（SEQ ID No.1）中第392位腺嘌呤（A）突变为鸟嘌呤（G）后得到的突变基因命名为ilvAV131A基因，ilvAV131A基因的核苷酸序列为SEQ ID No.3，其编码的突变蛋白命名为ilvAV131A蛋白，ilvAV131A蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.4，其中突变蛋白ilvAV131A氨基酸序列中第131位的丙氨酸（A）由缬氨酸（V）突变而来。
通过从W3110-ilvA突变株3提取质粒对ilvA基因进行测序的结果，确认了W3110-ilvA突变株3中核苷酸序列的第512位胞嘧啶（C）突变为胸腺嘧啶（T），其突变型蛋白质氨基酸序列中的第171位精氨酸（R）突变为组氨酸（H），从W3110-ilvA突变株3提取的质粒为随机突变中产生点突变（C-T）的突变质粒，命名为重组载体pET28(a)-ilvAR171H。
将野生型ilvA基因的核苷酸序列（SEQ ID No.1）中第512位胞嘧啶（C）突变为胸腺嘧啶（T）后得到的突变基因命名为ilvAR171H基因，ilvAR171H基因的核苷酸序列为SEQ IDNo.5，其编码的突变蛋白命名为ilvAR171H蛋白，ilvAR171H蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.6，其中突变蛋白ilvAR171H氨基酸序列中第171位的组氨酸（H）由精氨酸（R）突变而来。
通过从W3110-ilvA突变株5提取质粒对ilvA基因进行测序的结果，确认了W3110-ilvA突变株5中核苷酸序列的第654位胞嘧啶（C）突变为胸腺嘧啶（T），其突变型蛋白质氨基酸序列中的第218位甲硫氨酸（M）突变为异亮氨酸（I），从W3110-ilvA突变株5提取的质粒为随机突变中产生点突变（C-T）的突变质粒，命名为重组载体pET28(a)-ilvAM218I。
将野生型ilvA基因的核苷酸序列（SEQ ID No.1）中第654位胞嘧啶（C）突变为胸腺嘧啶（T）后得到的突变基因命名为ilvAM218I基因，ilvAM218I基因的核苷酸序列为SEQ IDNo.7，其编码的突变蛋白命名为ilvAM218I蛋白，ilvAM218I蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.8，其中突变蛋白ilvAM218I氨基酸序列中第218位的异亮氨酸（I）由甲硫氨酸（M）突变而来。
三、苏氨酸脱氢酶三个位点（131、171和218）突变质粒的构建
以随机突变的方式利用野生型大肠杆菌W3110获得了W3110-ilvA突变株2、W3110-ilvA突变株3、W3110-ilvA突变株5。为了获得更多ilvA突变株以提高其L-缬氨酸的生产能力，构建以上述ilvA突变位置的氨基酸用不同氨基酸取代的突变体。具体地，以步骤二中测序的质粒为模板，构建了在ilvA蛋白第131位、第171位及第218位氨基酸各用不同氨基酸取代的15种突变体（每个位点5种突变体）。突变体取代的氨基酸及在各自突变体中使用的引物名称如图2所示。
引物设计如下（上海invitrogen公司合成）（加粗字体为突变位点）：
V-FR: 5'-AAAGCGTGACCGCATCATGTTTCACGGCGGAGAGTTTGTC-3'（SEQ ID No.19），
V-FF: 5'-GACAAACTCTCCGCCGTGAAACATGATGCGGTCACGCTTT-3'（SEQ ID No.20），
V-DR: 5'-AAAGCGTGACCGCATCATGGATCACGGCGGAGAGTTTGTC-3'（SEQ ID No.21），
V-DF: 5'-GACAAACTCTCCGCCGTGATCCATGATGCGGTCACGCTTT-3'（SEQ ID No.22），
V-GR: 5'-AAAGCGTGACCGCATCATGGGTCACGGCGGAGAGTTTGTC-3'（SEQ ID No.23），
V-GF: 5'-GACAAACTCTCCGCCGTGACCCATGATGCGGTCACGCTTT-3'（SEQ ID No.24），
V-ER: 5'-AAAGCGTGACCGCATCATGGAACACGGCGGAGAGTTTGTC-3'（SEQ ID No.25），
V-EF: 5'-GACAAACTCTCCGCCGTGTTCCATGATGCGGTCACGCTTT-3'（SEQ ID No.26），
V-LR: 5'-AAAGCGTGACCGCATCATGCTTCACGGCGGAGAGTTTGTC-3'（SEQ ID No.27），
V-LF: 5'-GACAAACTCTCCGCCGTGAAGCATGATGCGGTCACGCTTT-3'（SEQ ID No.28），
R-CR: 5'-GATCGAGCCTTTCGATGCTTGCAACACCGTCATCGGTCAG-3'（SEQ ID No.29），
R-CF: 5'-CTGACCGATGACGGTGTTGCAAGCATCGAAAGGCTCGATC-3'（SEQ ID No.30），
R-QR: 5'-GATCGAGCCTTTCGATGCTCAAAACACCGTCATCGGTCAG-3'（SEQ ID No.31），
R-QF: 5'-CTGACCGATGACGGTGTTTTGAGCATCGAAAGGCTCGATC-3'（SEQ ID No.32），
R-PR: 5'-GATCGAGCCTTTCGATGCTCCCAACACCGTCATCGGTCAG-3'（SEQ ID No.33），
R-PF: 5'-CTGACCGATGACGGTGTTGGGAGCATCGAAAGGCTCGATC-3'（SEQ ID No.34），
R-LR: 5'-GATCGAGCCTTTCGATGCTCTCAACACCGTCATCGGTCAG-3'（SEQ ID No.35），
R-LF:5'-CTGACCGATGACGGTGTTGAGAGCATCGAAAGGCTCGATC-3'（SEQ ID No.36），
R-SR: 5'-GATCGAGCCTTTCGATGCTTCCAACACCGTCATCGGTCAG-3'（SEQ ID No.37），
R-SF: 5'-CTGACCGATGACGGTGTTGGAAGCATCGAAAGGCTCGATC-3'（SEQ ID No.38），
M-KR: 5'-TGGTCAGCTACATGGCTGATGAAGCACCTCGCACTGCGAT-3'（SEQ ID No.39），
M-KF: 5'-ATCGCAGTGCGAGGTGCCTTATCAGCCATGTAGCTGACCA-3'（SEQ ID No.40），
M-TR: 5'-TGGTCAGCTACATGGCTGATACGGCACCTCGCACTGCGAT-3'（SEQ ID No.41），
M-TF: 5'-ATCGCAGTGCGAGGTGCCGTATCAGCCATGTAGCTGACCA-3'（SEQ ID No.42），
M-LR: 5'-TGGTCAGCTACATGGCTGATCTGGCACCTCGCACTGCGAT-3'（SEQ ID No.43），
M-LF: 5'-ATCGCAGTGCGAGGTGCCAGATCAGCCATGTAGCTGACCA-3'（SEQ ID No.44），
M-RR: 5'-TGGTCAGCTACATGGCTGATAGGGCACCTCGCACTGCGAT-3'（SEQ ID No.45），
M-RF: 5'-ATCGCAGTGCGAGGTGCCCTATCAGCCATGTAGCTGACCA-3'（SEQ ID No.46），
M-VR: 5'-TGGTCAGCTACATGGCTGATGTGGCACCTCGCACTGCGAT-3'（SEQ ID No.47），
M-VF: 5'-ATCGCAGTGCGAGGTGCCACATCAGCCATGTAGCTGACCA-3'（SEQ ID No.48）。
分别以步骤二中测序的质粒pET28(a)-ilvAV131A、pET28(a)-ilvAR171H和pET28(a)-ilvAM218I为模板，分别以图2中各自对应的引物和KAPA HiFi HotStart进行PCR扩增，获得两条分别带有ilvA突变碱基的Up DNA片段和Down DNA片段，其中在131位点突变的Up131DNA片段大小为976 bp，down131DNA片段大小为667 bp；171位点突变的Up171DNA片段大小为856bp，down131DNA片段大小为786 bp；218位点突变的Up218DNA片段大小为716 bp，down131DNA片段大小为927 bp。PCR反应结束后，采用柱式DNA凝胶回收试剂盒分别进行琼脂糖凝胶电泳回收Up和Down DNA片段。回收后的DNA片段与经EcoRI/Hind III酶切回收的线性化表达载体pET28(a)用NEBuilder酶于50 ℃连接30 min，连接产物转化DH5α，涂布到含有卡那霉素（50 mg/L）的2-YT琼脂平板上37℃培养。对培养长出的单克隆用引物T7F/T7R进行PCR鉴定，PCR扩增出含有大小1811 bp片段的菌落为含有ilvA突变的阳性转化子，提取质粒即为苏氨酸脱氢酶三个位点（131、171和218）突变质粒，突变质粒的命名如图2中最后一列（ilvA突变载体的名称）所示。
PCR扩增体系：5×HiFi with Mg2+ Buffer 10 μL，dNTP Mixture（10 mM）1.5 μL，引物（10 pM）各1.6 μL，KAPA HiFi HotStart（1 U/μL）0.5 μL，补ddH2O至总体积50 μL。
PCR扩增程序：95℃预变性5 min，（98℃变性20 s；56℃退火15 s；72℃延伸60 s；30个循环），72℃过度延伸5 min。
PCR鉴定的扩增体系：2×Premix r Taq 12.5 μL，引物（10 pM）各1 μL，补ddH2O总体积25 μL。
PCR鉴定的扩增程序：94℃预变性5 min，94℃变性30 s；56℃退火30 s；72℃延伸90 s（30个循环），72℃过度延伸10 min。
四、苏氨酸脱氢酶ilvA突变体菌株的构建
为了鉴定ilvA突变对L-缬氨酸的生产性能的影响，将步骤三中构建的突变质粒（图2中最后一列所示的ilvA突变载体）和步骤二中的重组载体pET28(a)-ilvAV131A、pET28(a)-ilvAR171H和pET28(a)-ilvAM218I分别转化到大肠杆菌W3110菌株中（转化和鉴定同步骤一），将阳性转化子分别在含有卡那霉素（50 mg/L）的2-YT琼脂平板上连续传代三次后，接种到装有30 mL丰富培养基的500 mL三角瓶中37℃摇瓶发酵24 h，发酵培养菌体长至OD600=0.2时加入终浓度0.1 mM的IPTG以诱导苏氨酸脱氢酶过表达。
发酵培养结束后采用高效液相色谱法（HPLC）分析L-氨基酸的浓度，在第131位的各点突变菌株发酵结果如图3所示；在第171位的各点突变菌株发酵结果如图4所示；在第218位的各点突变菌株发酵结果如图5所示。
由图3的发酵结果可知，突变株W3110-pET28(a)-V131A产L-缬氨酸的能力比W3110-pET28(a)-V131F、W3110-pET28(a)-V131D、W3110-pET28(a)-V131G、W3110-pET28(a)-V131E和W3110-pET28(a)-V131L更强。同时，发现突变株W3110-pET28(a)-V131A具有产异亮氨酸能力。
由图4的发酵结果可知，突变株W3110-pET28(a)-R171H产L-缬氨酸的能力比W3110-pET28(a)-R171C、W3110-pET28(a)-R171Q、W3110-pET28(a)-R171P、W3110-pET28(a)-R171L和W3110-pET28(a)-R171S更强。同时，发现W3110-pET28(a)-V131A具有产异亮氨酸能力。
由图5的发酵结果可知，突变株W3110-pET28(a)-M218I产L-缬氨酸的能力比W3110-pET28(a)-M218K、W3110-pET28(a)-M218T、W3110-pET28(a)-M218L、W3110-pET28(a)-M218R和W3110-pET28(a)-M218V更强。同时，发现突变株W3110-pET28(a)-M218I具有产异亮氨酸的能力。
实施例2、构建基因组上过表达苏氨酸脱氢酶野生型基因和突变型基因的工程菌株
依据NCBI公布的大肠杆菌（Escherichia coli）W3110基因组序列，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在L-缬氨酸生产菌CGMCC22721的yaiT基因编码区内（经测序确认缬氨酸生产菌株CGMCC22721染色体上保留有野生型的yaiT基因）分别整合野生型ilvA基因和突变型ilvAV131A基因，以此在高产菌株（CGMCC22721）中更深入研究ilvA基因及突变型ilvAV131A基因对L-缬氨酸合成量的影响。
依据NCBI公布的大肠杆菌（Escherichia coli）W3110基因组序列，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在L-缬氨酸生产菌CGMCC22721的ycaJ基因编码区内（经测序确认缬氨酸生产菌株CGMCC22721染色体上保留有野生型的ycaJ基因）分别整合野生型ilvA基因和突变型ilvAR171H基因，以此在高产菌株（CGMCC22721）中更深入研究突变型ilvAR171H基因对L-缬氨酸合成量的影响。
依据NCBI公布的大肠杆菌（Escherichia coli）W3110基因组序列，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在L-缬氨酸生产菌CGMCC22721的dmsA基因编码区内（经测序确认缬氨酸生产菌株CGMCC22721染色体上保留有野生型的dmsA基因）分别整合野生型ilvA基因和突变型ilvAM218I基因，以此在高产菌株中更深入研究突变型ilvAM218I基因对L-缬氨酸合成量的影响。
一、sgRNA质粒的构建
依据NCBI公布的大肠杆菌（Escherichia coli）W3110基因组序列，使用CRISPRRGEN Tools（http://www.rgenome.net/cas-designer/）设计sgRNA靶序列，选择好合适的sgRNA靶序列后，在靶序列的5'和3'最末端添加线性化pGRB克隆载体末端序列，以便通过重组形成完整的sgRNA质粒。
扩增含有sgRNA靶序列的DNA片段，无需模板，只需进行PCR退火过程即可，体系及程序如下。PCR反应体系：sgRNA-1F（在yaiT位点插入，在ycaJ位点插入为sgRNA-2F，在dsmA位点插入引物为sgRNA-3F）10 μL，sgRNA-1R（在yaiT位点插入，在ycaJ位点插入为sgRNA-2R，在dsmA位点插入引物为sgRNA-3R）10 μL；PCR反应程序：95℃变性5 min，50℃退火1min。退火完成后，采用DNA纯化试剂盒回收目的片段，测定其DNA浓度，并将浓度稀释至100ng/μL。最终得到含有sgRNA靶序列的DNA片段分别命名为DNA片段1、DNA片段2和DNA片段3。
pGRB质粒用SpeI酶切得到线性化pGRB质粒后进行去磷酸化处理以防止pGRB质粒自连。酶切体系：10×Buffer 5 μL，SpeⅠ 2.5 μL，pGRB质粒DNA 3000-5000 ng，补ddH2O至50 μL。37℃酶切3 h后琼脂糖凝胶电泳切胶回收后进行去磷酸化反应，去磷酸化反应体系：10×Buffer 5 μL，pGRB质粒DNA 1000-2000 ng，CIAP 2.5 μL，补ddH2O至50 μL。37℃处理1h后采用DNA纯化试剂盒回收线性pGRB质粒。再利用Gibson Assembly试剂盒（New England公司）将含有sgRNA靶序列的DNA片段（DNA片段1、DNA片段2和DNA片段3）与线性pGRB质粒分别进行重组连接。重组体系：NEB组装酶2.5 μL，线性pGRB质粒2 μL，含有sgRNA靶序列的DNA片段0.5 μL。50℃组装30 min后将产物转化DH5α感受态细胞，提取质粒，用测序引物sgRNA-PF/sgRNA-PR测序鉴定。将构建好的sgRNA质粒分别命名为pGRB-sgRNA-1、pGRB-sgRNA-2、pGRB-sgRNA-3。
本实验所用引物设计如下（上海invitrogen公司合成），带下划线的碱基为pGRB克隆载体同源臂序列，小写字体的碱基为sgRNA靶序列：
sgRNA-1F:5'-TGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAATACTAGTggcaactatgtaaactatagGT TTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGG-3'（SEQ ID No.49），
sgRNA-1R:5'-CCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACctatagtttacatagttgccAC TAGTATTATACCTAGGACTGAGCTAGCTGTCA-3'（SEQ ID No.50），
sgRNA-2F:5'-TGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAATACTAGTgaacaggatcaaaatagcccGT TTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGG-3'（SEQ ID No.51），
sgRNA-2R:5'-CCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACgggctattttgatcctgttcAC TAGTATTATACCTAGGACTGAGCTAGCTGTCA-3'（SEQ ID No.52），
sgRNA-3F:5'-TGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAATACTAGTcacatacaaaccttgttcagGT TTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGG-3'（SEQ ID No.53），
sgRNA-3R:5'-CCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACctgaacaaggtttgtatgtgAC TAGTATTATACCTAGGACTGAGCTAGCTGTCA-3'（SEQ ID No.54），
sgRNA-PF：5'-GTCTCATGAGCGGATACATATTTG-3'（SEQ ID No.55），
sgRNA-PR：5'-ATGAGAAAGCGCCACGCT-3'（SEQ ID No.56）。
二、PCR扩增基因组过表达的DNA序列
依据NCBI公布的大肠杆菌（Escherichia coli）W3110基因组序列，设计并合成四对扩增上下游同源臂序列及ilvA或ilvAV131A基因、ilvAR171H基因、ilvAM312I基因编码区及启动子区的引物，以CRISPR/Cas9基因编辑的方式分别在L-缬氨酸生产菌CGMCC22721的yaiT编码区内、ycaJ基因、dmsA基因编码区后分别引入ilvA基因或ilvAV131A基因、ilvAR171H基因、ilvAM312I基因。
引物设计如下（上海invitrogen公司合成）：
P1:5'-AAGAGAATGGAAGAGAGGCC-3'（SEQ ID No.57），
P2:5'-AGTACGAATACTTGACCTAACCCAATCAAGTGCTGTAACG-3'（SEQ ID No.58），
P3:5'-CGTTACAGCACTTGATTGGGTTAGGTCAAGTATTCGTACT-3'（SEQ ID No.59），
P4:5'-AAGATTACACTAGTCAACCATGAGTGAAACATACGTGTCT-3'（SEQ ID No.60），
P5:5'-AGACACGTATGTTTCACTCATGGTTGACTAGTGTAATCTT-3'（SEQ ID No.61），
P6:5'-CGGTAGTGTAGGTTTCGTTGAGACAAAACTTTTCTCCTGG-3'（SEQ ID No.62），
P7:5'-CCAGGAGAAAAGTTTTGTCTCAACGAAACCTACACTACCG-3'（SEQ ID No.63），
P8:5'-CGACCTGTAGTATCCCATTC-3'（SEQ ID No.64）。
P9:5'-TTACTGACCGAAATCGCCGG-3'（SEQ ID No.65），
P10:5'-AGTACGAATACTTGACCTAATTAACGGTAGCGTTTTATGG-3'（SEQ ID No.66），
P11:5'-CCATAAAACGCTACCGTTAATTAGGTCAAGTATTCGTACT-3'（SEQ ID No.67），
P12:5'-GAAGATTACACTAGTCAACCATGAGTGAAACATACGTGTC-3'（SEQ ID No.68），
P13:5'-GACACGTATGTTTCACTCATGGTTGACTAGTGTAATCTTC-3'（SEQ ID No.69），
P14:5'-ACATTACCGCAACGATAACAAGACAAAACTTTTCTCCTGG-3'（SEQ ID No.70），
P15:5'-CCAGGAGAAAAGTTTTGTCTTGTTATCGTTGCGGTAATGT-3'（SEQ ID No.71），
P16:5'-CAGCTTAACTGCAGCTGCAA-3'（SEQ ID No.72）。
P17:5'-TCACGTTGCTTATAAAGCCT-3'（SEQ ID No.73），
P18:5'-AGTACGAATACTTGACCTAATTACACCTTTTCAACCTGAA-3'（SEQ ID No.74），
P19:5'-TTCAGGTTGAAAAGGTGTAATTAGGTCAAGTATTCGTACT-3'（SEQ ID No.75），
P20:5'-AGGAGAAGATTACACTAGTCAACCATGAGTGAAACATACG-3'（SEQ ID No.76），
P21:5'-CGTATGTTTCACTCATGGTTGACTAGTGTAATCTTCTCCT-3'（SEQ ID No.77），
P22:5'-GGGTTGTCATCGGTTACTCCAGACAAAACTTTTCTCCTGG-3'（SEQ ID No.78），
P23:5'-CCAGGAGAAAAGTTTTGTCTGGAGTAACCGATGACAACCC-3'（SEQ ID No.79），
P24:5'-TATTGGCATTGGGTTTGATC-3'（SEQ ID No.80）。
以W3110基因组DNA为模板，以引物P1/P2和P7/P8及KAPA HiFi HotStart进行PCR扩增，获得上同源臂片段590 bp（SEQ ID No.9的1-590位）和下同源臂片段605 bp（SEQ IDNo.9的2082-2686位）；以谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组DNA为模板，以引物P5/P6和KAPAHiFi HotStart PCR扩增ilvA启动子片段220 bp（SEQ ID No.9的1882-2101位）；分别以谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组DNA和质粒pET28(a)-ilvAV131A为模板，以引物P3/P4和KAPAHiFi HotStart分别PCR扩增ilvA基因（SEQ ID No.9的571-1881位）和ilvAV131A基因（SEQ IDNo.10的571-1881位）1311 bp。PCR反应结束后，采用柱式DNA凝胶回收试剂盒分别进行琼脂糖凝胶电泳回收。回收后的DNA以引物P1和P8进行overlap PCR扩增，分别获得基因组过表达的DNA重组片段Up-ilvA-Down（SEQ ID No.9）和Up-ilvAV131A-Down（SEQ ID No.10）2686bp。
以W3110基因组DNA为模板，以引物P9/P10和P15/P16及KAPA HiFi HotStart进行PCR扩增，获得上同源臂片段559 bp（SEQ ID No.11的1-559位）和下同源臂片段581 bp（SEQID No.11的2151-2731位）；以ATCC13032基因组DNA为模板，以引物P13/P14和KAPA HiFiHotStart PCR扩增ilvA启动子片段220 bp（SEQ ID No.11的1951-2160位）；分别以ATCC13032基因组DNA和质粒pET28(a)-ilvAR171H为模板，以引物P11/P12和KAPA HiFiHotStart分别PCR扩增ilvA基因（SEQ ID No.11的640-1950位）和ilvAV131A基因（SEQ IDNo.12的640-1950位）1311 bp。PCR反应结束后，采用柱式DNA凝胶回收试剂盒分别进行琼脂糖凝胶电泳回收。回收后的DNA以引物P9和P16进行overlap PCR扩增，分别获得基因组过表达的DNA重组片段Up-ilvA-Down（SEQ ID No.11）和Up-ilvAR171H-Down（SEQ ID No.12）2731bp。
以W3110基因组DNA为模板，以引物P17/P18和P23/P24及KAPA HiFi HotStart进行PCR扩增，获得上同源臂片段585 bp（SEQ ID No.13的1-585位）和下同源臂片段595 bp（SEQID No.13的2077-2671位）；以ATCC13032基因组DNA为模板，以引物P21/P22和KAPA HiFiHotStart PCR扩增ilvA启动子片段220 bp（SEQ ID No.13的1877-2096位）；分别以ATCC13032基因组DNA和质粒pET28(a)-ilvAM218I为模板，以引物P19/P20和KAPA HiFiHotStart分别PCR扩增ilvA基因（SEQ ID No.13的566-1876位）和ilvAM218I基因（SEQ IDNo.14的566-1876位）1311 bp。PCR反应结束后，采用柱式DNA凝胶回收试剂盒分别进行琼脂糖凝胶电泳回收。回收后的DNA以引物P17和P24进行overlap PCR扩增，分别获得基因组过表达的DNA重组片段Up-ilvA-Down（SEQ ID No.13）和Up-ilvAM218I-Down（SEQ ID No.14）2671bp。
PCR扩增体系：5× HiFi with Mg2+ Buffer 10 μL，dNTP Mixture（10 mM）1.5 μL，引物（10 pM）各1.6 μL，KAPA HiFi HotStart（1 U/μL）0.5 μL，补ddH2O至总体积50 μL。
PCR扩增程序：95℃预变性5 min，（98℃变性20 s；56℃退火15 s；72℃延伸150 s；30个循环），72℃过度延伸5 min。
三、感受态的制备及转化
制备L-缬氨酸高产菌CGMCC22721-Cas9感受态细胞：将pREDCas9质粒导入CGMCC22721得到重组菌，当重组菌体长至OD600=0.1加入终浓度0.1 mM的IPTG以诱导λ-Red介导的同源重组。当OD600=0.6时，收集菌体制备得到含有pREDCas9质粒的感受态细胞。
（1）基因组过表达ilvA基因和ilvAV131A基因的工程菌株（整合位点：yaiT基因）
将本实施例步骤一中构建的pGRB-sgRNA-1质粒分别与步骤二制备的基因组过表达的DNA重组片段Up-ilvA-Down（SEQ ID No.9）和Up-ilvAV131A-Down（SEQ ID No.10）转化至上述CGMCC22721-Cas9感受态细胞中，转化后的菌体涂布到含有壮观霉素（100 mg/L）和氨苄霉素（100 mg/L）的2-YT琼脂平板上32℃培养。对培养产生的单菌落通过引物P25/P26用rTaq PCR鉴定，PCR扩增出含有大小1826 bp的片段为阳性转化子，扩增不到片段的为原菌。
将阳性转化子接种于含壮观霉素（100 mg/L）和终浓度为0.2%的阿拉伯糖的2-YT培养基中以消除质粒pGRB-sgRNA-1，挑选在壮观霉素（100 mg/L）培养基上生长而在含氨苄霉素（100 mg/L）培养基上不生长的菌落，即为消除质粒pGRB-sgRNA-1的重组菌。再将这些菌落转接到2-YT培养基上42℃培养以消除pREDCas9质粒，挑选在含壮观霉素（100 mg/L）培养基上不生长而在无抗的2-YT培养基上生长的菌落，即为消除pRedCas9质粒的重组菌。对消除质粒后的重组菌通过引物P27/P28用r Taq PCR鉴定，PCR扩增出含有大小1306 bp片段的为阳性转化子，扩增不到片段的为原菌。
将L-缬氨酸生产菌CGMCC22721基因组过表达野生型ilvA基因和突变型ilvAV131A基因的重组菌分别命名为YPVAL-ilvA-001（不含突变点）和YPVAL-ilvA-002（含突变点）。
重组菌YPILE-ilvA-001含有单拷贝的SEQ ID No.1所示的ilvA基因；具体地，重组菌YPILE-ilvA-001是将Escherichia coli L-缬氨酸生产菌CGMCC22721基因组上yaiT部分编码区替换为ilvA基因及其启动子，保持其基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌。含有ilvA基因的重组菌可以显著和稳定地提高ilvA基因的表达量。
重组菌YPILE-ilvA-002含有SEQ ID No.3所示的突变的ilvAV131A基因；具体地，重组菌YPILE-ilvA-002是将Escherichia coli L-缬氨酸生产菌CGMCC22721基因组上yaiT部分编码区替换为突变型ilvAV131A基因及其启动子，保持其基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌。导入了突变型ilvAV131A基因的重组菌在基因组上过表达ilvAV131A基因。
（2）基因组过表达ilvA基因和ilvAR171H基因的工程菌株（整合位点：ycaJ基因）
将本实施例步骤一中构建的pGRB-sgRNA-2质粒分别与步骤二制备的基因组过表达的DNA重组片段Up-ilvA-Down（SEQ ID No.11）和Up-ilvAR171H-Down（SEQ ID No.12）转化至上述CGMCC22721-Cas9感受态细胞中，转化后的菌体涂布到含有壮观霉素（100 mg/L）和氨苄霉素（100 mg/L）的2-YT琼脂平板上32℃培养。对培养产生的单菌落通过引物P29/P30用r Taq PCR鉴定，PCR扩增出含有大小1623 bp的片段为阳性转化子，扩增不到片段的为原菌。
将阳性转化子接种于含壮观霉素（100 mg/L）和终浓度为0.2%的阿拉伯糖的2-YT培养基中以消除质粒pGRB-sgRNA-2，挑选在壮观霉素（100 mg/L）培养基上生长而在含氨苄霉素（100 mg/L）培养基上不生长的菌落，即为消除质粒pGRB-sgRNA-2的重组菌。再将这些菌落转接到2-YT培养基上42℃培养以消除pREDCas9质粒，挑选在含壮观霉素（100 mg/L）培养基上不生长而在无抗的2-YT上生长的菌落，即为消除pRedCas9质粒的重组菌。对消除质粒后的重组菌通过引物P31/P32用r Taq PCR鉴定，PCR扩增出含有大小1468 bp片段的为阳性转化子，扩增不到片段的为原菌。
将L-缬氨酸生产菌CGMCC22721基因组过表达野生型ilvA基因和突变型ilvAR171H基因的重组菌分别命名为YPVAL-ilvA-003（不含突变点）和YPVAL-ilvA-004（含突变点）。
重组菌YPVAL-ilvA-003含有单拷贝的SEQ ID No.1所示的ilvA基因；具体地，重组菌YPVAL-ilvA-003是在Escherichia coli L-缬氨酸生产菌CGMCC22721基因组上ycaJ编码区终止密码子后插入ilvA基因及其启动子，保持其基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌。含有ilvA基因的重组菌可以显著和稳定地提高ilvA基因的表达量。
重组菌YPVAL-ilvA-004含有SEQ ID No.5所示的突变的ilvAR171H基因；具体地，重组菌YPVAL-ilvA-004是将Escherichia coli L-缬氨酸生产菌CGMCC22721基因组上ycaJ编码区终止密码子后插入突变型ilvAR171H基因及其启动子，保持其基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌。导入了突变型ilvAR171H基因的重组菌在基因组上过表达ilvAR171H基因。
（3）基因组过表达ilvA基因和ilvAM218I基因的工程菌株（整合位点：dmsA基因）
将本实施例步骤一中构建的pGRB-sgRNA-3质粒分别与步骤二制备的基因组过表达的DNA重组片段Up-ilvA-Down（SEQ ID No.13）和Up-ilvAM218I-Down（SEQ ID No.14）转化至上述CGMCC22721-Cas9感受态细胞中，转化后的菌体涂布到含有壮观霉素（100 mg/L）和氨苄霉素（100 mg/L）的2-YT琼脂平板上32℃培养。对培养产生的单菌落通过引物P33/P34用r Taq PCR鉴定，PCR扩增出含有大小1429 bp的片段为阳性转化子，扩增不到片段的为原菌。
将阳性转化子接种于含壮观霉素（100 mg/L）和终浓度为0.2%的阿拉伯糖的2-YT培养基中以消除质粒pGRB-sgRNA-3，挑选在壮观霉素（100 mg/L）上生长而在含氨苄霉素（100 mg/L）培养基上不生长的菌落，即为消除质粒pGRB-sgRNA-3的重组菌。再将这些菌落转接到2-YT培养基上42℃培养以消除pREDCas9质粒，挑选在含壮观霉素（100 mg/L）培养基上不生长而在无抗的2-YT上生长的菌落，即为消除pRedCas9质粒的重组菌。对消除质粒后的重组菌通过引物P35/P36用r Taq PCR鉴定，PCR扩增出含有大小1602 bp的为阳性转化子，扩增不到片段的为原菌。
将L-缬氨酸生产菌CGMCC22721基因组过表达野生型ilvA基因和突变型ilvAM218I基因的重组菌分别命名为YPVALilvA-005（不含突变点）和YPVAL-ilvA-006（含突变点）。
重组菌YPVAL-ilvA-005含有单拷贝的SEQ ID No.1所示的ilvA基因；具体地，重组菌YPVAL-ilvA-006是在Escherichia coli L-缬氨酸生产菌CGMCC22721基因组上dmsA编码区终止密码子后插入ilvA基因及其启动子，保持其基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌。含有ilvA基因的重组菌可以显著和稳定地提高ilvA基因的表达量。
重组菌YPVAL-ilvA-006含有SEQ ID No.7所示的突变的ilvAM218I基因；具体地，重组菌YPVAL-ilvA-006是将Escherichia coli L-缬氨酸生产菌CGMCC22721基因组上dmsA编码区终止密码子后插入突变型ilvAM218I基因及其启动子，保持其基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌。导入了突变型ilvAM218I基因的重组菌在基因组上过表达ilvAM218I基因。
按上述步骤，以YPVAL-ilvA-002（含点突变ilvAV131A）为出发菌，分别转化pGRB-sgRNA-2质粒和Up-ilvAR171H-Down（SEQ ID No.12）以及pGRB-sgRNA-3质粒和Up-ilvAM218I-Down（SEQ ID No.14），分别得到过表达ilvAV131A基因和ilvAR171H基因的重组菌YPVAL-ilvA-002/ilvAR171H（命名为YPVAL-ilvA-007），以及过表达ilvAV131A基因和ilvAM218I基因的重组菌YPVAL-ilvA-002/ilvAM218I（命名为YPVAL-ilvA-008）；以YPVAL-ilvA-004（含点突变ilvAR171H）为出发菌，转化pGRB-sgRNA-3质粒和Up-ilvAM218I-Down（SEQ ID No.14），得到过表达ilvAR171H基因和ilvAM218I基因的重组菌YPVAL-ilvA-004/ilvAM218I（命名为YPVAL-ilvA-009）；以YPVAL-ilvA-007为出发菌，转化pGRB-sgRNA-3质粒和Up-ilvAM218I-Down（SEQ IDNo.14）,得到过表达ilvAV131A基因、ilvAR171H基因和ilvAM218I基因的重组菌YPVAL-ilvA-007/ilvAM218I（YPVAL-ilvA-010）。
引物设计如下（上海invitrogen公司合成）：
P25: 5'-CAACGAAACCTACACTACCG-3'（SEQ ID No.81），
P26: 5'-GCAGGTATCGTTGCCGCATC-3'（SEQ ID No.82），
P27: 5'-AGGCTCGATCAGCGTTGCGC-3'（SEQ ID No.83），
P28: 5'-CGACCTGTAGTATCCCATTC-3'（SEQ ID No.84），
P29: 5'-ACACGACGCGCCATTGCTGA-3'（SEQ ID No.85），
P30: 5'-TCGGCTGCAGCGCATGAAGA-3'（SEQ ID No.86），
P31: 5'-TGCAAGAAGTCCGCCACCGC-3'（SEQ ID No.87），
P32: 5'-CGACAGTGCGCGGTGCAT-3'（SEQ ID No.88），
P33: 5'-TACCCAGGAAGAGTGGATGC-3'（SEQ ID No.89），
P34: 5'-TCCATGGGCAAGAGTGCAGA-3'（SEQ ID No.90），
P35: 5'-AGTCTCCAAAGTGATTGGTC-3'（SEQ ID No.91），
P36: 5'-TCCCATCTCACACCTCCTTC-3'（SEQ ID No.92）。
PCR扩增体系：2×Premix r Taq 12.5 μL，引物（10 pM）各1 μL，补ddH2O总体积25μL。
PCR扩增程序：94℃预变性5 min，94℃变性30 s；56℃退火30 s；72℃延伸90 s（30个循环），72℃过度延伸10 min。
实施例3、构建包含点突变的ilvA基因编码区片段的重组载体
本实施例用于谷氨酸棒状杆菌基因操作。依据NCBI公布的谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）ATCC13032基因组序列，设计并合成6对扩增ilvA基因编码区的引物，以等位基因置换的方式在谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）CGMCC20437（经测序确认该菌株染色体上保留有野生型的ilvA基因）的ilvA基因编码区（SEQ IDNo.1）中引入点突变，所述点突变为分别将ilvA基因的核苷酸序列（SEQ ID No.1）中的第392位腺嘌呤（A）突变为鸟嘌呤（G，SEQ ID No.3），第512位胞嘧啶（C）突变为胸腺嘧啶（T，SEQ ID No.5），第654位胞嘧啶（C）突变为胸腺嘧啶（T，SEQ ID No.7）。
采用NEBuilder重组技术进行载体构建，对ilvA基因进行定点突变，引物设计如下（上海invitrogen公司合成），加粗字体的碱基为突变位置：
P37:5'-CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGCACTCGAGGTTGAGCACGGC-3'（SEQ ID No.93），
P38: 5'-CATCATGGtTCACGGCGGAGAGTTTGTCTCCTTGGTGGTC-3'（SEQ ID No.94），
P39: 5'-GACCACCAAGGAGACAAACTCTCCGCCGTGAaCCATGATG-3'（SEQ ID No.95），
P40: 5'-TCGAGCCTTTCGATGCTCgCAACACCGTCATCGGTCAGGG-3'（SEQ ID No.96），
P41: 5'-CCCTGACCGA TGACGGTGTTGcGAGCATCGAAAGGCTCGA-3'（SEQ ID No.97），
P42: 5'-GTCAGCTACATGGCTGATATgGCACCTCGCACTGCGATCG-3'（SEQ ID No.98），
P43: 5'-CGATCGCAGTGCGAGGTGCcATATCAGCCATGTAGCTGAC-3'（SEQ ID No.99），
P44:5'-CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCAGACAAAACTTTTCTCCTGG-3'（SEQ ID No.100）。
构建方法如下：以谷氨酸棒杆菌ATCC13032为模板，分别以引物P37/P38、P39/P44进行PCR扩增，获得两条分别带有突变碱基，大小分别为1195 bp和679 bp的ilvA基因编码区的DNA片段（ilvAV131AUp和ilvAV131A Down）；以谷氨酸棒杆菌ATCC13032为模板，分别以引物P37/P40、P41/P44进行PCR扩增，获得两条分别带有突变碱基，大小分别为1086 bp和789bp的ilvA基因编码区的DNA片段（ilvAR171HUp和ilvAR171HDown）；以谷氨酸棒杆菌ATCC13032为模板，分别以引物P37/P42、P43/P44进行PCR扩增，获得两条分别带有突变碱基，大小分别为946 bp和929 bp的ilvA基因编码区的DNA片段（ilvAM218IUp和ilvAM218IDown）。
PCR扩增体系：5× HiFi with Mg2+ Buffer 10 μL，dNTP Mixture（10 mM）1.5 μL，引物（10 pM）各1.6 μL，KAPA HiFi HotStart（1 U/μL）0.5 μL，补ddH2O至总体积50 μL。
PCR扩增程序：95℃预变性5 min，（98℃变性20 s；56℃退火15 s；72℃延伸60 s；30个循环），72℃过度延伸5 min。
将上述DNA片段（ilvAUp和ilvA Down）经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后，与经过酶切（Xbal I/BamHI）后纯化的pK18mobsacB质粒（购自Addgene公司，质粒上含有卡那霉素抗性标记）用NEBuilder酶于50 ℃连接30 min，连接产物转化DH5a后长出的单克隆经M13引物（M13F: 5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’（ SEQ ID No.101），M13R:5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3’（SEQ ID No.102））PCR鉴定获得阳性重组载体pK18-ilvAV131A、pK18-ilvAR171H、pK18-ilvAM218I。将酶切正确的重组载体pK18-ilvAV131A、pK18-ilvAR171H、pK18-ilvAM218I送测序公司测序鉴定，并将含有正确点突变（V131A，R171H，M218I）的重组载体pK18-ilvAV131A、pK18-ilvAR171H、pK18-ilvAM218I保存备用。
重组载体pK18-ilvAV131A中含有整合ilvAV131AUp和ilvAV131A Down的DNA片段，命名为ilvAV131AUp-Down，DNA大小1311 bp，ilvAV131AUp-Down（序列如SEQ ID No.3所示）含有突变位点，用于将谷氨酸棒杆菌CGMCC 20437中ilvA基因编码区的第392位腺嘌呤（A）突变为鸟嘌呤（G），最终导致编码蛋白的第131位缬氨酸（V）突变为丙氨酸（A）。
重组载体pK18-ilvAR171H中含有整合ilvAR171HUp和ilvAR171HDown的DNA片段，命名为ilvAR171HUp-Down，DNA大小1838 bp，ilvAR171HUp-Down（序列如SEQ ID No.5所示）含有突变位点，用于将谷氨酸棒杆菌CGMCC 20437中ilvA基因编码区的第512位胞嘧啶（C）突变为胸腺嘧啶（T），最终导致编码蛋白的第171位精氨酸（R）突变为组氨酸（H）。
重组载体pK18-ilvAM218I中含有整合ilvAM218IUp和ilvAM218IDown的DNA片段，命名为ilvAM218IUp-Down，DNA大小1838 bp，ilvAM218IUp-Down（序列如SEQ ID No.7所示）含有突变位点，用于将谷氨酸棒杆菌CGMCC 20437中ilvA基因编码区的第654位胞嘧啶（C）突变为胸腺嘧啶（T），最终导致编码蛋白的第218位甲硫氨酸（M）突变为异亮氨酸（I）。
实施例4、构建包含基因ilvAV131A、ilvAR171H、ilvAM218I的产异亮氨酸工程菌株
构建方法：将实施例3中的等位替换质粒pk18-ilvAV131A、pk18-ilvAR171H、pk18-ilvAM218I通过电击分别转化入谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）ATCC13032和CGMCC 20437（产L-异亮氨酸）中后，在培养基中进行培养，培养基成分和培养条件参见图6，对培养产生的单菌落分别通过实施例3中的引物P37和通用引物M13R（5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3’， SEQ ID No.102）进行鉴定，能扩增出1845 bp大小条带的菌株为阳性菌株。将阳性菌株在含15%蔗糖的培养基上培养，对培养产生的单菌落分别在含有卡那霉素和不含卡那霉素的培养基上培养，选择在不含卡那霉素的培养基上生长，而在含卡那霉素的培养基上不生长的菌株进一步采用如下引物进行PCR鉴定：
P45: 5'-CCACAAAGGGATCAACAGTC-3'（SEQ ID No.103），
P46: 5'-TCTATGTTCCTGTGCAGACT-3'（SEQ ID No.104）。
将得到的PCR扩增产物（420 bp）通过95℃高温变性10 min、冰浴5 min后进行SSCP（Single-Strand Conformation Polymorphis）电泳（分别以质粒pk18-ilvAV131A、pk18-ilvAR171H、pk18-ilvAM218I扩增片段为阳性对照，谷氨酸棒杆菌ATCC13032扩增片段为阴性对照，水作为空白对照），SSCP电泳的PAGE的制备及电泳条件参见图7，由于片段结构不同，电泳位置不同，因此片段电泳位置与阴性对照片段位置不一致且与阳性对照片段位置一致的菌株为等位替换成功的菌株。再次通过引物P45/P46 PCR扩增阳性菌株ilvA基因片段，并连接到PMD19-T载体进行测序，通过序列比对，碱基序列发生突变（A392G，C512T，C654T）的菌株为等位替换成功的阳性菌株，并被分别命名为ATCC13032-ilvAV131A（YPILE-ilvA-001），ATCC13032-ilvAR171H（YPILE-ilvA-002），ATCC13032-ilvAM218I（YPILE-ilvA-003）、CGMCC20437-ilvAV131A（YPILE-ilvA-004），CGMCC 20437-ilvAR171H（YPILE-ilvA-005），CGMCC20437-ilvAM218I（YPILE-ilvA-006）。
重组菌YPILE-ilvA-001、YPILE-ilvA-004含有SEQ ID No.3所示的突变的基因ilvAV131A。重组菌YPILE-ilvA-002、YPILE-ilvA-005含有SEQ ID No.5所示的突变的基因ilvAR171H。重组菌YPILE-ilvA-003、YPILE-ilvA-006含有SEQ ID No.7所示的突变的基因ilvAM218I。
实施例5、构建谷氨酸棒状杆菌基因组上过表达ilvA基因和ilvAV131A、ilvAR171H及ilvAM218I基因的工程菌株
采用NEBuilder重组技术进行载体构建，依据NCBI公布的谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组序列，设计并合成扩增上下游同源臂片段及ilvA或ilvAV131A基因、ilvAR171H基因及ilvAM218I基因编码区及启动子区的引物，以同源重组的方式在谷氨酸棒杆菌CGMCC 20437（产异亮氨酸）中引入ilvA或ilvAV131A基因、ilvAR171H基因及ilvAM218I基因。
引物设计如下（上海invitrogen公司合成）：
P47:5'-CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAACGGCCCACGAGTGGAAAA-3'（SEQ ID No.105），
P48:5'-CCCTGAGTACGAATACTTGACCTAATCATTTCAGCGTCAG-3'（SEQ ID No.106），
P49:5'-CTGACGCTGAAATGATTAGGTCAAGTATTCGTACTCAGGG-3'（SEQ ID No.107），
P50:5'-CCCTATTCCGGATAGAAACCGGCAAGACAAAACTTTTCTC-3'（SEQ ID No.108），
P51:5'-GAGAAAAGTTTTGTCTTGCCGGTTTCTATCCGGAATAGGG-3'（SEQ ID No.109），
P52:5'-CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGATGGTGGCAAGGATGGTGT-3'（SEQ ID No.110）。
P53:5'-CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGACCCTGGGTCGTTCCCTGGA-3'（SEQ ID No.111），
P54:5'-GTACGAATACTTGACCTAATCAACGCTTGGAGTACTGAGG-3'（SEQ ID No.112），
P55:5'-CCTCAGTACTCCAAGCGTTGATTAGGTCAAGTATTCGTAC-3'（SEQ ID No.113），
P56:5'-TGCCAGGAGAAAAGTTTTGTCTTATTTACTCAACGTTTGC-3'（SEQ ID No.114），
P57:5'-TGCCAGGAGAAAAGTTTTGTCTTATTTACTCAACGTTTGC-3'（SEQ ID No.115），
P58:5'-CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCCAAACAACGGTCAGCATCAC-3'（SEQ ID No.116）。
P59:5'-CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAAGACGCCAGAAAAGCCGGT-3'（SEQ ID No.117），
P60:5'-GAGTACGAATACTTGACCTAATTCGCTTTTCTTAGTGGGT-3'（SEQ ID No.118），
P61:5'-ACCCACTAAGAAAAGCGAATTAGGTCAAGTATTCGTACTC-3'（SEQ ID No.119），
P62:5'-GAGAAGTAGAGACAAAACTTTTCTCCTGGCAATAAATAT-3'（SEQ ID No.120），
P63:5'-ATATTTATTGCCAGGAGAAAAGTTTTGTCTCTACTTCTC-3'（SEQ ID No.121），
P64:5'-CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCCGATATGAACTACGCCGGCA-3'（SEQ ID No.122）。
构建方法：分别以谷氨酸棒杆菌ATCC13032或YPILE-ilvA-004为模板，分别以引物P47/P48，P49/P50，P51/P52进行PCR扩增，获得上游同源臂片段690 bp（对应于谷氨酸棒杆菌CGMCC 20437 cg0669编码区终止子后），ilvA基因及其启动子片段1570 bp或ilvAV131A基因及其启动子片段1570 bp及下游同源臂片段760 bp（对应于谷氨酸棒杆菌CGMCC 20437cg0669编码区终止子后）。
PCR反应结束后，对每个模板扩增得到的3个片段采用柱式DNA凝胶回收试剂盒分别进行电泳回收。回收后的3个片段与经过Xbal I/BamH I酶切后纯化的pK18mobsacB质粒（该质粒上含有卡那霉素抗性作为筛选标记）用NEBuilder酶于50 ℃连接30 min，连接产物转化DH5a后长出的单克隆用M13引物经PCR鉴定获得阳性整合质粒（重组载体），分别为pK18-ilvAOEcg0669、pK18-ilvAV131AOE，该阳性整合质粒上含有卡那霉素抗性标记，可以通过卡那霉素筛选获得质粒整合到基因组上的重组子。
分别以谷氨酸棒杆菌ATCC13032或YPILE-ilvA-005为模板，分别以引物P53/P54，P55/P56，P57/P58进行PCR扩增，获得上游同源臂片段750 bp（对应于谷氨酸棒杆菌CGMCC20437 rpsl编码区终止子后），ilvA基因及其启动子片段1570 bp或ilvAR171H基因及其启动子片段1570 bp及下游同源臂片段940 bp（对应于谷氨酸棒杆菌CGMCC 20437 rpsl编码区终止子后）。
PCR反应结束后，对每个模板扩增得到的3个片段采用柱式DNA凝胶回收试剂盒分别进行电泳回收。回收后的3个片段与经过Xbal I/BamH I酶切后纯化的pK18mobsacB质粒（该质粒上含有卡那霉素抗性作为筛选标记）用NEBuilder酶于50 ℃连接30 min，连接产物转化DH5a后长出的单克隆用M13引物经PCR鉴定获得阳性整合质粒（重组载体），分别为pK18-ilvAOErpsl、pK18- ilvAR171HOE，该阳性整合质粒上含有卡那霉素抗性标记，可以通过卡那霉素筛选获得质粒整合到基因组上的重组子。
分别以谷氨酸棒杆菌ATCC13032或YPILE-ilvA-006为模板，分别以引物P59/P60，P61/P62，P63/P64进行PCR扩增，获得上游同源臂片段940 bp（对应于谷氨酸棒杆菌CGMCC20437 cg0680编码区终止子后），ilvA基因及其启动子片段1570 bp或ilvAM312I基因及其启动子片段1570 bp及下游同源臂片段820 bp（对应于谷氨酸棒杆菌CGMCC 20437 cg0680编码区终止子后）。
PCR反应结束后，对每个模板扩增得到的3个片段采用柱式DNA凝胶回收试剂盒分别进行电泳回收。回收后的3个片段与经过Xbal I/BamH I酶切后纯化的pK18mobsacB质粒（该质粒上含有卡那霉素抗性作为筛选标记）用NEBuilder酶于50 ℃连接30 min，连接产物转化DH5a后长出的单克隆用M13引物经PCR鉴定获得阳性整合质粒（重组载体），分别为pK18-ilvAOEcg0680、pK18- ilvAM218IOE，该阳性整合质粒上含有卡那霉素抗性标记，可以通过卡那霉素筛选获得质粒整合到基因组上的重组子。
PCR扩增体系：2×Premix r Taq 12.5 μL，引物（10 pM）各1 μL，补ddH2O总体积25μL。
PCR扩增程序：94℃预变性5 min，94℃变性30 s；56℃退火30 s；72℃延伸180 s（30个循环），72℃过度延伸10 min。
将测序正确的整合质粒（pK18-ilvAOEcg0669、pK18-ilvAV131AOE，pK18-ilvAOErpsl、pK18-ilvAR171HOE，pK18-ilvAOEcg0680、pK18-ilvAM218IOE）分别电转化入谷氨酸棒杆菌CGMCC20437中，在培养基中进行培养，培养基成分和培养条件参见图6，对培养产生的单菌落分别通过P65/P66引物进行PCR鉴定cg0669位点插入ilvA或ilvAV131A，PCR扩增出含有大小900 bp的片段的为阳性菌株，扩增不到片段的为原菌。将阳性菌株在含15%蔗糖的培养基上培养，对培养产生的单菌落进一步采用P67/P68引物进行PCR鉴定，扩增出大小为1111 bp的菌为ilvA或ilvAV131A基因整合到谷氨酸棒杆菌CGMCC 20437基因组上cg0669后的阳性菌株，分别命名为YPILE-ilvA-007（不含突变点）和YPILE-ilvA-008（含突变点）。
重组菌YPV-ilvA-007含有双拷贝的SEQ ID No.1所示的ilvA基因；具体地，重组菌YPILE-ilvA-007是将谷氨酸棒杆菌CGMCC 20437的基因组中cg0669基因后插入ilvA基因，保持谷氨酸棒杆菌CGMCC 20437的基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌。含有双拷贝ilvA基因的重组菌可以显著和稳定地提高ilvA基因的表达量。
重组菌YPILE-ilvA-008含有SEQ ID No.3所示的突变的ilvAV131A基因；具体地，重组菌YPILE-ilvA-008是将谷氨酸棒杆菌CGMCC 20437基因组中的cg0669后插入ilvAV131A基因，保持谷氨酸棒杆菌CGMCC 20437的基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌。
对培养产生的单菌落分别通过P69/P70引物进行PCR鉴定rpsl位点插入ilvA或ilvAR171H，PCR扩增出含有大小960 bp的片段的为阳性菌株，扩增不到片段的为原菌。将阳性菌株在含15%蔗糖的培养基上培养，对培养产生的单菌落进一步采用P71/P72引物进行PCR鉴定，扩增出大小为1351 bp的菌为ilvA或ilvAR171H基因整合到谷氨酸棒杆菌CGMCC 20437基因组上rpsl后的阳性菌株，分别命名为YPILE-ilvA-009（不含突变点）和YPILE-ilvA-010（含突变点）。
重组菌YPILE-ilvA-009含有双拷贝的SEQ ID No.1所示的ilvA基因；具体地，重组菌YPILE-ilvA-009是将谷氨酸棒杆菌CGMCC 20437的基因组中rpsl基因后插入ilvA基因，保持谷氨酸棒杆菌CGMCC 20437的基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌。含有双拷贝ilvA基因的重组菌可以显著和稳定地提高ilvA基因的表达量。
重组菌YPILE-ilvA-010含有SEQ ID No.5所示的突变的ilvAR171H基因；具体地，重组菌YPILE-ilvA-010是将谷氨酸棒杆菌CGMCC 20437基因组中的rpsl后插入ilvAR171H基因，保持谷氨酸棒杆菌CGMCC 20437的基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌。
对培养产生的单菌落分别通过P73/P74引物进行PCR鉴定cg0680位点插入ilvA或ilvAM218I，PCR扩增出含有大小1200 bp的片段的为阳性菌株，扩增不到片段的为原菌。将阳性菌株在含15%蔗糖的培养基上培养，对培养产生的单菌落进一步采用P75/P76引物进行PCR鉴定，扩增出大小为1171 bp的菌为ilvA或ilvAM218I基因整合到谷氨酸棒杆菌CGMCC20437基因组上rpsl后的阳性菌株，分别命名为YPILE-ilvA-011（不含突变点）和YPILE-ilvA-012（含突变点）。
重组菌YPILE-ilvA-011含有双拷贝的SEQ ID No.1所示的ilvA基因；具体地，重组菌YPILE-ilvA-011是将谷氨酸棒杆菌CGMCC 20437的基因组中的cg0680基因后插入ilvA基因，保持谷氨酸棒杆菌CGMCC 20437的基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌。含有双拷贝ilvA基因的重组菌可以显著和稳定地提高ilvA基因的表达量。
重组菌YPILE-ilvA-012含有SEQ ID No.7所示的突变的ilvAM218I基因；具体地，重组菌YPILE-ilvA-012是将谷氨酸棒杆菌CGMCC 20437基因组中的cg0680后插入ilvAM218I基因，保持谷氨酸棒杆菌CGMCC 20437的基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌。
以YPILE-ilvA-011为出发菌，分别转化pk18-ilvAOEcg0669和pk18-ilvAOErpsl，通过前述操作步骤，获得过表达ilvA基因（3拷贝）的重组菌YPILE-ilvA-011/ilvAcg0669和YPILE-ilvA-011/ilvArpsl，分别命名为YPILE-ilvA-013（无点突变）、YPILE-ilvA-014（无点突变）。
分别以YPILE-ilvA-007及YPILE-ilvA-013为出发菌，均转化pk18-ilvAOErpsl质粒，获得过表达ilvA基因（3拷贝）的重组菌YPILE-ilvA-007/ilvArpsl（无点突变）、过表达ilvA基因（4拷贝）的重组菌YPILE-ilvA-013/ilvArpsl（无点突变），分别命名为YPILE-ilvA-015（无点突变）、YPILE-ilvA-016（无点突变）。
以YPILE-ilvA-012为出发菌，分别转化pk18-ilvAOEV131A、pk18-ilvAOER171H质粒，获得过表达ilvAM218I基因和ilvAV131A基因的重组菌YPILE-ilvA-012/ilvAV131A和过表达ilvAM218I基因和ilvAR171H基因的重组菌YPILE-ilvA-012/ilvAR171H，分别命名为YPILE-ilvA-017、YPILE-ilvA-018。
分别以YPILE-ilvA-008和YPILE-ilvA-017为出发菌，均转化pk18-ilvAR171H质粒，获得过表达ilvAV131A基因和ilvAR171H基因的重组菌YPVal-008/ilvAR171H和过表达ilvAM218I基因、ilvAV131A基因和ilvAR171H基因的重组菌YPILE-ilvA-017/ilvAR171H。分别命名为YPILE-ilvA-019、YPILE-ilvA-020。
PCR鉴定引物如下所示：
P65: 5'-TGACCTGCGGTGGGGTTGGA-3'（SEQ ID No.123），
P66: 5'-CCCGCAAAAGCCTGGTCAGT-3'（SEQ ID No.124），
P67: 5'-GGTGCAATGACGGAGGAAAT-3'（SEQ ID No.125），
P68: 5'-TACGTTCAGCGCCTTGGGCA-3'（SEQ ID No.126），
P69: 5'-AAGCGCGAGCGCGAAATGCG-3'（SEQ ID No.127），
P70: 5'-GCTGTTTGAGTACCTCAAGC-3'（SEQ ID No.128），
P71: 5'-TCACGCTTAAGGTAGATTTC-3'（SEQ ID No.129），
P72: 5'-GTTGCCATCCTTGTCCACAG-3'（SEQ ID No.130），
P73: 5'-AAGACCACACCTGCTGCCGT-3'（SEQ ID No.131），
P74: 5'-GTTGTTGCGCTTGAGGTACT-3'（SEQ ID No.132），
P75: 5'-ACTGCAATGGAGTTGGTGCA-3'（SEQ ID No.133），
P76: 5'-CCAAGCGCGGACCGCACCGC-3'（SEQ ID No.134）。
实施例6、构建质粒上过表达ilvA基因或ilvAV131A、ilvAR171H、ilvAM218I基因的工程菌株
采用NEBuilder重组技术进行载体构建，依据NCBI公布的谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组序列，设计并合成一对扩增ilvA或ilvAV131A、ilvAR171H、ilvAM218I基因编码区及启动子区的引物，引物设计如下（上海invitrogen公司合成）：
P77:5'-GCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCTTAGGTCAAGTATTCGTACT-3'（带下划线的核苷酸序列为pXMJ19上的序列）（SEQ ID No.135），
P78:5'-ATCAGGCTGAAAATCTTCTCTCATCCGCCAAAACAGACAAAACTTTTCTCCTGG-3'（带下划线的核苷酸序列为pXMJ19上的序列）（SEQ ID No.136）。
构建方法：分别以谷氨酸棒杆菌ATCC13032和YPILE-ilvA-020为模板，以引物P77/P78进行PCR扩增，获得ilvA基因及其启动子片段、ilvAV131A基因及其启动子片段1601 bp、ilvAR171H基因及其启动子片段1601 bp、ilvAM218I基因及其启动子片段1601 bp，对扩增产物进行电泳并采用柱式DNA凝胶回收试剂盒进行纯化回收，回收的DNA片段与经EcoR I/KpnI酶切回收的穿梭质粒pXMJ19（购自Addgene公司，该质粒上含有氯霉素抗性作为筛选标记）用NEBuilder酶于50 ℃连接30 min，连接产物转化DH5α后长出的单克隆用M13R（-48）（5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3'，SEQ ID No.137）/P18引物进行PCR鉴定,获得1640 bp片段为阳性子，将过表达质粒pXMJ19-ilvA（含有ilvA基因）、pXMJ19-ilvAV131A（含有ilvAV131A基因）、pXMJ19-ilvAR171H（含有ilvAR171H基因）、pXMJ19-ilvAM218I（含有ilvAM218I基因）送测序。因质粒上含有氯霉素抗性标记，可以通过氯霉素来筛选质粒是否转化到菌株中。
PCR扩增体系：2×Premix r Taq 12.5 μL，引物（10 pM）各1 μL，补ddH2O总体积25μL。
PCR扩增程序：94℃预变性5 min，94℃变性30 s；56℃退火30 s；72℃延伸180 s（30个循环），72℃过度延伸10 min。
将测序正确的pXMJ19-ilvA、pXMJ19-ilvAV131A、pXMJ19-ilvAR171H和pXMJ19-ilvAM218I质粒分别电转化入谷氨酸棒杆菌CGMCC 20437中，在培养基中进行培养，培养基成分和培养条件参见图6，对培养产生的单菌落通过引物M13R（-48（5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3'，SEQ ID No.137）/P18进行PCR鉴定，PCR扩增出含有大小1640 bp片段的为阳性菌株，被分别命名为YPILE-ilvA-021（含pXMJ19-ilvA质粒）和YPILE-ilvA-022（含pXMJ19-ilvAV131A质粒）、YPILE-ilvA-023(含pXMJ19-ilvAR171H质粒）、YPILE-ilvA-024(含pXMJ19-ilvAM312I质粒）。
实施例7、构建基因组上缺失ilvA基因的工程菌株
采用NEBuilder重组技术进行载体构建，根据NCBI公布的谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组序列，合成两对扩增ilvA基因编码区两端片段的引物，作为上下游同源臂片段。引物设计如下（上海invitrogen公司合成）：
P79:5'-CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGTGCATTCTCTCGATGATCGC-3'（SEQ ID No.138），
P80: 5'-GAAAAGTCCAGGAGTGATGGTGACCTAAACATAGCTGAAG-3'（SEQ ID No.139），
P81: 5'-CTTCAGCTATGTTTAGGTCACCATCACTCCTGGACTTTTC-3'（SEQ ID No.140），
P82:5'-CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGCATTGCATCAAAGGAACTG-3'（SEQ ID No.141）。
构建方法：以谷氨酸棒杆菌ATCC13032为模板，分别以引物P79/P80和P81/P82进行PCR扩增，获得ilvA的上游同源臂片段1020 bp及ilvA的下游同源臂片段900 bp。
对扩增的产物进行电泳并采用柱式DNA凝胶回收试剂盒进行纯化，回收的DNA片段与经过Xbal I/BamHI酶切后纯化的pK18mobsacB质粒（该质粒上含有卡那霉素抗性作为筛选标记）用NEBuilder酶于50 ℃连接30 min，连接产物转化DH5α后长出的单克隆用P79/P82引物经PCR鉴定获得阳性敲除载体pK18-ΔilvA，此重组质粒pK18-ΔilvA中包含ΔilvA的Up-Down DNA 1994 bp。
将该质粒送测序，将测序正确的敲除质粒pK18-ΔilvA电转化入谷氨酸棒杆菌CGMCC 20437，在培养基中进行培养，培养基成分和培养条件参见图6，对培养产生的单菌落通过如下引物（上海invitrogen公司合成）进行PCR鉴定：
P83: 5'-CCTTCTTTTGCTCCCACACC-3'（SEQ ID No.142），
P84: 5'-GTGTCAGTGCGTCAGAGGAC-3'（SEQ ID No.143）。
上述PCR同时扩增出大小840 bp及2160 bp的条带的菌株为阳性菌株，只扩增出2160 bp条带的菌株为原菌。阳性菌株在15%蔗糖培养基上筛选后分别在含有卡那霉素和不含卡那霉素的培养基上培养，选择在不含卡那霉素的培养基上生长，而在含卡那霉素的培养基上不生长的菌株进一步采用P83/P84引物进行PCR鉴定，扩增出大小为840 bp条带的菌株为ilvA基因编码区被敲除的阳性菌株CGMCC 20437/ΔilvA。再次通过P83/P84引物PCR扩增阳性菌株ilvA片段，并连接到pMD19-T载体进行测序，将测序正确的菌株命名为YPILE-ilvA-025（谷氨酸棒杆菌CGMCC 20437上的基因组上的ilvA基因被敲除）。
实施例8、L-缬氨酸发酵实验
将上述实施例构建的菌株（YPVAL-ilvA-001～YPVAL-ilvA-010）和原始菌株大肠杆菌CGMCC22721在BLBIO-5GC-4-H型号的发酵罐（购自上海百仑生物科技有限公司）中以图8所示的培养基和图9所示的控制工艺进行发酵实验。每个菌株重复三次，结果如图10所示。
结果如图10所示，在大肠杆菌中对ilvA基因及点突变型ilvAV131A，ilvAR171H，ilvAM218I基因过表达，有助于L-缬氨酸产量及转化率的提高，而对基因进行敲除或弱化，不利于L-缬氨酸的积累。
由发酵结果可知，ilvA基因对L-缬氨酸的发酵具有重要作用，ilvA基因、ilvAV131A基因、ilvAR171H基因和ilvAM218I基因的过表达均能提高缬氨酸的产量，尤其ilvAV131A、ilvAR171H、ilvAM218I基因的过表达对缬氨酸的生产非常有利，且这些突变型基因的过表达有协同促进缬氨酸生产的作用。
实施例9、L-异亮氨酸发酵实验
将上述实施例构建的异亮氨酸生产菌株（YPILE-ilvA-001～YPILE-ilvA-025）和原始菌株谷氨酸棒杆菌CGMCC 20437在BLBIO-5GC-4-H型号的发酵罐（购自上海百仑生物科技有限公司）中以如下所示的培养基和控制工艺进行发酵实验。每个菌株重复三次，结果如图11所示。
L-异亮氨酸发酵培养基：溶剂是水，溶质及其浓度为葡萄糖13 g/L，(NH4)2SO41 g/L，H3PO4 0.5 g/L，KCl 0.8 g/L，MgSO4•7H2O 0.8 g/L，FeSO4•7H2O 0.01 g/L，MnSO4•H2O0.01 g/L，FM902酵母粉1.5 g/L，玉米浆5 g/L，糖蜜17 g/L，通氨调节pH7.0。
L-异亮氨酸发酵培养条件：
校正DO 100%：温度37℃、风量5 L/min、转速800 rpm、罐压0 Mpa，5 min后标定；
接种量：10%；
培养温度：32℃；pH：7.0±0.1；溶氧：20%-30%；
初始条件：pH 7.0、培养温度37℃、罐压0 Mpa、风量0.5 L/min、转速400 rpm；
全程控制：1、溶氧＜30%时，依次提转速500 rpm→600 rpm→风量1 L/min→700rpm→800 rpm；2、发酵8 h提罐压0.01 Mpa; 12 h提罐压0.02 Mpa→0.03 Mpa→0.04 Mpa→0.05 Mpa；
残糖控制：F12h前0.1%-0.5%；F12h后结合DO要求控制残糖0.1%-0.3%；
流加物料：25%氨水、55%浓糖、10%泡敌；
发酵周期：30 h左右，控制过程以溶氧20%-30%做提降风量标准。
由以上发酵结果可见，对于高产L-异亮氨酸菌株CGMCC 20437，ilvA基因的氨基酸序列的点突变ilvAV131A、ilvAR171H、ilvAM218I，都有助于L-异亮氨酸产量的提高；而无论是基因组上还是质粒上过表达野生型ilvA基因或突变型ilvAV131A、ilvAR171H和ilvAM218I基因，都可以促进L-异亮氨酸的积累，提高L-异亮氨酸的产量，并且这些野生型和突变型基因的过表达具有协同促进L-异亮氨酸生产（积累）的作用。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。
Claims (10)
1.工程化苏氨酸脱氢酶，其特征在于，所述工程化苏氨酸脱氢酶为蛋白质，所述蛋白质相对于参比序列的第131位的氨基酸、第171位的氨基酸或第218位的氨基酸发生突变，所述参比序列如SEQ ID No.2所示；
所述第131位的氨基酸突变为丙氨酸；所述第171位的氨基酸突变为组氨酸；所述第218位的氨基酸突变为异亮氨酸。
2.生物材料，其特征在于，所述生物材料包括下述任一种：
B1）编码权利要求1所述工程化苏氨酸脱氢酶的核酸分子；
B2）含有B1）所述核酸分子的表达盒；
B3）含有B1）所述核酸分子的重组载体、或含有B2）所述表达盒的重组载体；
B4）含有B1）所述核酸分子的重组微生物、或含有B2）所述表达盒的重组微生物、或含有B3）所述重组载体的重组微生物；
B5）含有B1）所述核酸分子的重组细胞、或含有B2）所述表达盒的重组细胞、或含有B3）所述重组载体的重组细胞。
3.根据权利要求2所述的生物材料，其特征在于，B1）所述的核酸分子为编码序列是SEQID No.3、SEQ ID No.5或SEQ ID No.7所示的DNA分子。
4.根据权利要求2所述的生物材料，其特征在于，B4）所述的重组微生物为下述任一种：
D1）将氨基酸序列为如SEQ ID No.4、SEQ ID No.6和/或SEQ ID No.8所示蛋白质的编码基因导入目的微生物得到的重组微生物；
D2）将编码序列为SEQ ID No.3、SEQ ID No.5和/或SEQ ID No.7所示的DNA分子导入目的微生物得到的重组微生物。
5.根据权利要求2所述的生物材料，其特征在于，所述微生物为谷氨酸棒杆菌或大肠杆菌。
6.权利要求1所述的工程化苏氨酸脱氢酶或权利要求2-5中任一所述生物材料的下述任一种应用：
E1）在调控微生物L-缬氨酸或L-异亮氨酸的产量中的应用；
E2）在制备L-缬氨酸或L-异亮氨酸中的应用；
E3）在构建产L-缬氨酸或L-异亮氨酸的基因工程菌中的应用。
7.一种提高目的微生物L-氨基酸的产量或者制备L-氨基酸的方法，其特征在于，所述方法包括下述任一种：
F1）提高目的微生物中的权利要求2或3中至少任一所述核酸分子的表达量或含量，得到L-氨基酸的产量高于所述目的微生物的微生物；
F2）对目的微生物中的核苷酸序列为SEQ ID No.1的DNA分子进行突变，得到L-氨基酸的产量高于所述目的微生物的微生物，所述突变为：将SEQ ID No.1所示DNA分子编码的氨基酸序列的第131位的缬氨酸残基突变为丙氨酸、第171位的精氨酸突变为组氨酸或第218位的甲硫氨酸突变为异亮氨酸；
所述L-氨基酸为L-缬氨酸或L-异亮氨酸，所述目的微生物为谷氨酸棒杆菌或大肠杆菌。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法包括下述任一种：
G1）将氨基酸序列为如SEQ ID No.4、SEQ ID No.6和/或SEQ ID No.8所示蛋白质的编码基因导入所述目的微生物；
G2）将编码序列为SEQ ID No.3、SEQ ID No.5和/或SEQ ID No.7所示的DNA分子导入所述目的微生物。
9.权利要求1所述的工程化苏氨酸脱氢酶在制备含有L-缬氨酸和/或L-异亮氨酸的食品、化妆品、药品或饲料中的应用。
10.权利要求2-5中任一所述的生物材料在制备含有L-缬氨酸和/或L-异亮氨酸的食品、化妆品、药品或饲料中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310699284.7A CN116463304B (zh) | 2023-06-14 | 2023-06-14 | 苏氨酸脱氢酶基因突变体及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310699284.7A CN116463304B (zh) | 2023-06-14 | 2023-06-14 | 苏氨酸脱氢酶基因突变体及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116463304A CN116463304A (zh) | 2023-07-21 |
| CN116463304B true CN116463304B (zh) | 2023-09-05 |
Family
ID=87182829
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310699284.7A Active CN116463304B (zh) | 2023-06-14 | 2023-06-14 | 苏氨酸脱氢酶基因突变体及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116463304B (zh) |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102199578A (zh) * | 2011-03-14 | 2011-09-28 | 安徽师范大学 | 一种谷氨酸脱氢酶的突变体酶及其构建方法 |
| CN111748535A (zh) * | 2019-03-28 | 2020-10-09 | 安徽华恒生物科技股份有限公司 | 一种丙氨酸脱氢酶突变体及其在发酵生产l-丙氨酸中的应用 |
| CN112662605A (zh) * | 2020-12-30 | 2021-04-16 | 宁夏伊品生物科技股份有限公司 | Yh66_10715基因改造的高产l-异亮氨酸的菌株及其构建方法和应用 |
| CN114402070A (zh) * | 2020-06-26 | 2022-04-26 | Cj第一制糖株式会社 | 新的l-苏氨酸脱水酶变体及使用其生产l-异亮氨酸的方法 |
| CN114540399A (zh) * | 2022-02-15 | 2022-05-27 | 宁夏伊品生物科技股份有限公司 | 一种制备l-缬氨酸的方法及其所用基因突变体和生物材料 |
| CN114657159A (zh) * | 2022-05-24 | 2022-06-24 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 4-磷酸羟基-L-苏氨酸脱氢酶PdxA突变体及其在制备维生素B6中的应用 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100858913B1 (ko) * | 2007-03-09 | 2008-09-17 | 한국과학기술원 | 부위특이적 변이에 의해 제조된 고수율의 ｌ－쓰레오닌생산균주 및 이를 이용한 ｌ－쓰레오닌의 제조방법 |
-
2023
- 2023-06-14 CN CN202310699284.7A patent/CN116463304B/zh active Active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102199578A (zh) * | 2011-03-14 | 2011-09-28 | 安徽师范大学 | 一种谷氨酸脱氢酶的突变体酶及其构建方法 |
| CN111748535A (zh) * | 2019-03-28 | 2020-10-09 | 安徽华恒生物科技股份有限公司 | 一种丙氨酸脱氢酶突变体及其在发酵生产l-丙氨酸中的应用 |
| CN114402070A (zh) * | 2020-06-26 | 2022-04-26 | Cj第一制糖株式会社 | 新的l-苏氨酸脱水酶变体及使用其生产l-异亮氨酸的方法 |
| CN112662605A (zh) * | 2020-12-30 | 2021-04-16 | 宁夏伊品生物科技股份有限公司 | Yh66_10715基因改造的高产l-异亮氨酸的菌株及其构建方法和应用 |
| CN114540399A (zh) * | 2022-02-15 | 2022-05-27 | 宁夏伊品生物科技股份有限公司 | 一种制备l-缬氨酸的方法及其所用基因突变体和生物材料 |
| CN114657159A (zh) * | 2022-05-24 | 2022-06-24 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 4-磷酸羟基-L-苏氨酸脱氢酶PdxA突变体及其在制备维生素B6中的应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| "Generation of mutant threonine dehydratase and its effects on isoleucine synthesis in Corynebacterium glutamicum";Yanfeng Guo 等;《World J Microbiol Biotechnol》;第31卷;第1369-1377页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116463304A (zh) | 2023-07-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| WO2022143763A1 (zh) | 具有增强的l-谷氨酸生产力的菌株及其构建方法与应用 | |
| KR20230122116A (ko) | 변형 유전자 bbd29_04920에 의한 l-글루탐산 생산용재조합 균주, 이의 구축 방법 및 응용 | |
| CN114181288B (zh) | 制备l-缬氨酸的方法及其所用的基因与该基因编码的蛋白质 | |
| CN114540399B (zh) | 一种制备l-缬氨酸的方法及其所用基因突变体和生物材料 | |
| CN116463304B (zh) | 苏氨酸脱氢酶基因突变体及其应用 | |
| CN112625992B (zh) | 一种改造基因bbd29_11265产l-谷氨酸的重组菌株及其构建方法与应用 | |
| CN112538491B (zh) | 一种基于yh66_08550基因的产l-异亮氨酸的重组菌株及其构建方法与应用 | |
| CN112175894B (zh) | 一种产l-氨基酸的重组菌株及其构建方法与应用 | |
| WO2022143646A1 (zh) | 一种改造基因bbd29_09525产l-谷氨酸的重组菌株及其构建方法与应用 | |
| CN112725253A (zh) | 一种改造基因bbd29_14900的重组菌株及其构建方法与应用 | |
| CN114539367B (zh) | Cey17_rs11900基因突变体及其在制备l-缬氨酸中的应用 | |
| CN114315998B (zh) | Cey17_rs00300基因突变体及其在制备l-缬氨酸中的应用 | |
| CN114277069B (zh) | 制备l-缬氨酸的方法及其所用生物材料 | |
| CN114369559B (zh) | 一种产l-氨基酸的重组菌株及其构建方法与应用 | |
| CN116555152B (zh) | 大肠杆菌及其构建方法与在生产l-缬氨酸中的应用 | |
| CN116904418A (zh) | yfdH基因突变体及其在制备L-缬氨酸中的应用 | |
| CN115873814A (zh) | 双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶编码基因folD在L-氨基酸合成中的应用 | |
| CN116555213A (zh) | 乙酰乳酸合酶III调控亚基编码基因ilvH和其突变体及其生产L-氨基酸中应用 | |
| CN115028694A (zh) | 与l-谷氨酸产量相关的蛋白及其相关生物材料和应用 | |
| CN114315999A (zh) | leuD蛋白突变体和相关生物材料及其在制备L-缬氨酸中的应用 | |
| CN117535335A (zh) | Bbd29_12340基因启动子突变体及其在发酵生产l-谷氨酸中的应用 | |
| US20230313122A1 (en) | Recombinant strain for producing l-amino acid, construction method therefor, and application thereof | |
| CN115960183A (zh) | 氨基酸产量相关蛋白编码基因rplP及其生物材料和应用 | |
| CN117535293A (zh) | Bbd29_03870基因启动子突变体及其应用 | |
| CN116286759A (zh) | 氨基酸产量相关蛋白cynT及其生物材料和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |