CN115028694A - 与l-谷氨酸产量相关的蛋白及其相关生物材料和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了与L‑谷氨酸产量相关的蛋白及其相关生物材料和应用。本发明所要解决的问题是如何调L‑谷氨酸生物合成能力。所述蛋白质为如下任一种蛋白质：A1)氨基酸序列是序列4所示的蛋白质；A2)将A1)所述蛋白质的经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具调控L‑谷氨酸的生物合的蛋白质；A3)将A1)或A2)的N末端或/和C末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质。上调或增强或提高L‑谷氨酸的生物合成相关蛋白基因表达的物质可用于L‑谷氨酸是生物合成能力的提高或L‑谷氨酸生物合成能力菌株的育种。

Description

与L-谷氨酸产量相关的蛋白及其相关生物材料和应用
技术领域
本发明涉及与L-谷氨酸产量相关的蛋白及其相关生物材料和应用。
背景技术
L-谷氨酸是一种酸性氨基酸，其在生物体内的蛋白质代谢过程中占重要地位，参与动物、植物和微生物中的许多重要化学反应。医学上，L-谷氨酸主要用于治疗肝性昏迷和改善儿童智力发育。食品工业上，L-谷氨酸主要作为味精用于增鲜。
通常，通过使用具有产生L-谷氨酸的能力的棒状杆菌型细菌(coryneformbacterium)，例如属于短杆菌属(Brevibacterium)或棒杆菌属(Corynebacterium)的细菌的发酵方法以工业规模生产L-谷氨酸。为此，已经使用从自然界分离的菌株或它们的人工突变体。
L-谷氨酸是由微生物细胞内柠檬酸循环的中间产物α-酮戊二酸通过生物合成而来的。由α-酮戊二酸通过铵离子的同化作用来形成L-谷氨酸的生物合成途径有两条。其中一条途径是在有高浓度的铵离子存在的情况下，通过谷氨酸脱氢酶(glutamatedehydrogenase，GDH)的催化来合成L-谷氨酸。另一条途径(GS/GOGAT途径)是由谷氨酰胺合成酶及谷氨酰胺-酮戊二酸氨基转移酶来合成L-谷氨酸。谷氨酰胺合成酶(glutaminesynthetase，GS)催化L-谷氨酸和铵离子转化为谷氨酰胺的反应；谷氨酰胺-酮戊二酸氨基转移酶(glutamine-oxoglutaric acid amino transferase，也称“谷氨酸合成酶”(glutamate synthase，GOGAT)催化L-谷氨酸合成反应，在该反应中，由已经由GS合成的一分子的谷氨酰胺和一分子的α-酮戊二酸分子合成两分子的L-谷氨酸。
对发酵法生产L-氨基酸的改进可以涉及发酵技术如搅拌和供应氧气或涉及营养培养基的组成，例如发酵过程中的糖浓度；或涉及将发酵液加工成合适的产品形式，例如通过干燥和造粒发酵液或离子交换色谱；或可以涉及相关微生物本身的固有性能性质。
用于改善这些微生物的性能性质的方法包括诱变、突变体的选择和筛选。以这种方式获得的菌株对抗代谢物具有抗性或对于具有调节重要性的代谢物是营养缺陷型并产生L-氨基酸等。
虽然已有大量方法可以提高L-谷氨酸的生产能力，但是为了满足日益增加的需求，仍需要发展生产L-谷氨酸的方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何调控微生物L-谷氨酸产量，如谷氨酸棒状杆菌L-谷氨酸产量。
为解决上述技术问题，本发明提供了蛋白质：
本发明所提供的蛋白质如下任一种蛋白质
A1)氨基酸序列是序列4所示的蛋白质；
A2)将A1)的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有调控L谷氨酸生物合成能力的蛋白质；
A3)在A1)或A2)的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。
A2)所述蛋白质为氨基酸序列是序列2所示的蛋白质。
上述蛋白质命名为BBD29_05105A21C蛋白质，来源于谷氨酸棒杆菌。
上述序列2所示的蛋白质可为如下任一种：
G1)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；
G2)将G1)的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有调控L谷氨酸生物合成能力的蛋白质；
G3)在G1)或G2)的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。
上述蛋白质中，所述蛋白标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。
上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
上述蛋白质中，所述80％以上的同一性可为至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。
上述蛋白质中，序列4(SEQ ID No.4)由个423个氨基酸残基组成。
BBD29_05105A21C蛋白质(SEQ ID No.4)是由BBD29_05105蛋白质(SEQ ID No.2)第21位丙氨酸(A)突变为半胱氨酸(C)而来。突变后的BBD29_05105A21C蛋白质(SEQ ID No.4)其活性更强。
为解决上述技术问题，本发明还提供了与所述蛋白质相关的生物材料。
本发明所提供的生物材料可为下述任一种：
F1)、编码所述蛋白质的核酸分子；
F2)、含有F1)所述核酸分子的表达盒；
F3)、含有F1)所述核酸分子的重组载体、或含有F2)所述表达盒的重组载体；
F4)、含有F1)所述核酸分子的重组微生物、或含有F2)所述表达盒的重组微生物、或含有F3)所述重组载体的重组微生物。
上述生物材料中，F1)所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如gRNA、mRNA、siRNA、shRNA、sgRNA、miRNA或反义RNA。
F1)所述核酸分子中，本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对本发明的序列4或2蛋白的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的序列4或2蛋白的核苷酸序列80％或80％以上同一性的核苷酸，只要编码BBD29_05105A21C蛋白质或BBD29_05105蛋白质且具有BBD29_05105A21C蛋白质或BBD29_05105蛋白质功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
上述80％或80％以上同一性，可为81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索以对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
上述生物材料中，F1)或B1)所述核酸分子可为所述蛋白质的编码基因。F1)所述核酸分子具体可为编码链的编码序列是序列3所示的DNA分子。B1)所述核酸分子具体可为编码链的编码序列是序列1所示的DNA分子。
BBD29_05105基因编码区(SEQ ID No.1)中引入点突变，所述点突变为将BBD29_05105基因的核苷酸序列(SEQ ID No.1)中的第61-62位鸟嘌呤和胞嘧啶(GC)突变为胸腺嘧啶和鸟嘌呤(TG)得到SEQ ID No.3所示的DNA分子(突变的BBD29_05105基因，名称为BBD29_05105GC61-62TG基因)。
本文中，所述载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒、噬菌体(如λ噬菌体或M13丝状噬菌体等)、黏粒(即柯斯质粒)、Ti质粒或病毒载体。具体可为载体pK18mobsacB或pXMJ19；
上述生物材料中，F2)所述的表达盒是指能够在宿主细胞中表达所述基因的DNA，该DNA不但可包括启动基因转录的启动子，还可包括终止基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)Plant Physiol 120:979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸曱酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4:3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I985)Nature 313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人Genes Dev.,5:141；Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,15:9627)。
为了便于对菌株进行鉴定及筛选，可对所用菌株表达载体进行加工，如加入可在菌株中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物(氯霉素标记物、卡那霉素标记物等)。
本文中，所述菌株可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可来自短杆菌属(Brevibacterium)、棒杆菌属(Corynebacterium)、埃希氏菌属(Escherichia)、气杆菌属(Aerobacter)、微球菌属(Micrococcus)、黄杆菌属(Flavobacterium)或芽孢杆菌属(Bacillus)等。
具体地，所述菌株可为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、黄色短杆菌(Brevibacteriumflavum)、乳酸发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)、产谷氨酸微球菌(Micrococcus glutamicus)、产氨短杆菌(Brevibacterum ammoniagenes)、大肠杆菌(Escherichia coli)或产气气杆菌(Aerobacter aerogenes)但不限于此。
具体地，所述菌株可为谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)CGMCCNo.21220，或谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13869。
为解决上述技术问题，本申请还提供了应用；
本申请所提供的的应用为下述任一种：
C1)所述的蛋白质或调控所述蛋白质的活性或含量的物质在调控微生物L-谷氨酸的产量中的应用；
C2)所述的蛋白质或调控所述蛋白质的活性或含量的物质在制备调控微生物L-谷氨酸的产量产品中的应用；
C3)所述的蛋白质或调控所述蛋白质的活性或含量的物质在构建产L-谷氨酸的重组微生物中的应用。上述调控所述蛋白质的活性或含量的物质，可为上述生物材料。
本申请中，所述调控可为上调或增强或提高，也可为下调或抑制或降低。
本发明中，所述调控菌株L-谷氨酸生物合成能力可为上调或增强或提高菌株L-谷氨酸生物合成能力，也可为下调或抑制或降低菌株L-谷氨酸生物合成能力。
上调或增强或提高所述蛋白质活性或含量可上调或增强或提高菌株L-谷氨酸生物合成能力。下调或抑制或降低所述蛋白质活性或含量可下调或抑制或降低菌株L-谷氨酸生物合成能力。
本文中，所述调控所述蛋白质的活性或含量的物质可为调控基因表达的物质，所述基因编码所述蛋白质。
上文中，所述调控基因表达的物质可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；3)对所述基因的RNA转运进行的调控(也就是对所述基因的mRNA由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的翻译进行的调控；5)对所述基因的mRNA降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。
本发明所提供的调控菌株L-谷氨酸生物合成能力的方法包括通过调控所述蛋白质的编码基因的表达或调控所述蛋白质的活性或含量，来调控菌株L-谷氨酸生物合成能力。
本发明中，所述菌株育种的目的可包括培育L-谷氨酸生物合成能力菌株。本文中所述菌株可为如下中的任一种：C1)细菌界；C2)放线菌纲；C3)棒状杆菌属，C4)谷氨酸棒状杆菌。
为了解决上述问题本申请提供了一种构建重组微生物的方法。
本申请提供的构建重组微生物的方法包括上调或增强或提高目的微生物中所述蛋白质的编码基因的表达量，得到重组微生物。
本文中，所述重组微生物的L-谷氨酸产量高于所述目的微生物。
所述上调或增强或提高目的微生物中所述蛋白质的编码基因的表达量可为下述任一种：
E1)向目的微生物中导入上述蛋白质的编码基因；
E2)将目的微生物中编码上述蛋白质的编码基因进行突变，所述突变为将SEQ IDNo.1所示DNA分子编码的氨基酸序列的第21位的丙氨酸残基突变为半胱氨酸残基。
为了解决上述问题，本申请还提供了一种提高微生物L-谷氨酸产量的方法。
本发明所提供的提高微生物L-谷氨酸产量的方法包括向微生物中导入上述的蛋白质的编码基因，以提高所述微生物的L-谷氨酸的产量。
上述向微生物中导入上述蛋白质的编码基因的启动子可为组成性启动子。
上述向微生物中导入上述蛋白质的编码基因可整合在宿主基因组中。
所述基因组位置可为BBD29_03485和BBD29_03490的间隔区域。
上述向微生物中导入上述蛋白质的编码基因也可在宿主基因组外，以独立可遗传的形式存在。具体可为以质粒形式存在。
为了解决上述问题，本申请还提供了一种生产L-谷氨酸的方法。
本申请提供的生产L-谷氨酸的方法包括利用F4)所述的任一重组微生物生产L-谷氨酸。
上述方法包括培养所述重组微生物，得到发酵产物，从所述发酵产物中纯化得到L-谷氨酸的步骤。
上所述的用途、方法中，所述菌株为如下任一种：
C1)细菌界；
C2)放线菌纲；
C3)棒状杆菌属，
C4)谷氨酸棒状杆菌。
上文中，所述谷氨酸棒状杆菌可为谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21220和/或谷氨酸棒杆菌ATCC13869。
本发明首先以等位基因置换的方式在谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)CGMCC No.21220(经测序确认该菌株染色体上保留有野生型的BBD29_05105基因)的BBD29_05105基因编码区(SEQ ID No.1)中引入突变，构建了包含突变(GC-TG)的基因工程菌YPG-61。为进一步研究验证在生产菌中过表达野生型BBD29_05105基因或其突变基因BBD29_05105GC61-62TG可以增加L-谷氨酸的生物合成能力，分别将外源基因整合到宿主染色体中或由质粒在染色体外表达，构建了基因组上和质粒上过表达BBD29_05105基因或BBD29_05105GC61-62TG基因的工程菌YPG-64、YPG-65。实验表明，BBD29_05105基因及其变体参与了L-谷氨酸的生物合成，通过对BBD29_05105基因进行过表达或敲除、或定点突变可以调控L-谷氨酸在微生物内的积累量。对BBD29_05105基因编码区进行突变或在生产菌中过表达BBD29_05105基因或其突变基因BBD29_05105GC61-62TG，有助于L-谷氨酸生物合成能力的提高，而对BBD29_05105基因进行敲除或弱化，不利于L-谷氨酸的积累。可利用BBD29_05105基因及其变体(如BBD29_05105GC61-62TG基因)来构建生产L-谷氨酸的基因工程菌种，以促进L-谷氨酸产量提高。
保藏说明
菌种名称：谷氨酸棒杆菌
拉丁名：Corynebacterium glutamicum
分类命名：谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)
菌株编号：YPGLU001
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏单位简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2020年11月23日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.21220。
具体实施方式
下述实施例中的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)YPGLU001 CGMCCNo.21220，并已于2020年11月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC No.21220。谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)YPGLU001，又称为谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21220。
谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13869购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心(http://www.china-cicc.org/cicc/detail2/？sid＝346，ATCC13869网站中名称谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum CICC 10227；菌株编号CICC10227)。
实施例1BBD29_05105GC61-62TG基因编码区片段的克隆和相关载体的构建
依据NCBI公布的谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)ATCC13869基因组序列，设计并合成两对扩增BBD29_05105基因编码区的引物，以等位基因置换的方式在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)CGMCC No.21220(经测序确认该菌株染色体上保留有野生型的BBD29_05105基因)及野生型谷氨酸棒杆菌菌株ATCC13869的BBD29_05105基因编码区(SEQ ID No.1)中引入点突变，所述点突变为将BBD29_05105基因的核苷酸序列(SEQ ID No.1)中的第61-62位鸟嘌呤和胞嘧啶(GC)突变为胸腺嘧啶和鸟嘌呤(TG)得到SEQID No.3所示的DNA分子(突变的BBD29_05105基因，名称为BBD29_05105GC61-62TG基因)。
其中，SEQ ID No.1所示的DNA分子编码氨基酸序列为SEQ ID No.2的蛋白质(所述蛋白质名称为BBD29_05105蛋白质)。
SEQ ID No.3所示的DNA分子编码氨基酸序列为SEQ ID No.4的突变蛋白质(所述突变蛋白质名称为BBD29_05105A21C蛋白质)。所述BBD29_05105A21C蛋白质的氨基酸序列(SEQID No.4)中的第21位半胱氨酸(C)由丙氨酸(A)突变而来。
采用NEBuilder重组技术进行载体构建，引物设计如下(上海invitrogen公司合成)，加粗字体的碱基为突变位置：
P1:5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGTTCGAGGCCTTTGGCGGCG3'，
P2:
Figure BDA0003718818270000061
P3:
Figure BDA0003718818270000062
P4:5'CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCCACGTTGGAATCGCCATTC3'。
构建方法：以谷氨酸棒杆菌ATCC13869为模板，分别以引物P1和P2，P3和P4进行PCR扩增，获得两条分别带有突变碱基，大小分别为746bp和748bp的BBD29_05105基因编码区的DNA片段(BBD29_05105Up和BBD29_05105Down)。
PCR扩增体系为：10×ExTaqBuffer5μL，dNTPMixture(各2.5mM)4μL，Mg2+(25mM)4μL，引物(10pM)各2μL，ExTaq(5U/μL)0.25μL，总体积50μL；
PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min，(94℃变性30s；52℃退火30s；72℃延伸40s；30个循环)，72℃过度延伸10min。
将上述两条DNA片段(BBD29_05105Up和BBD29_05105Down)经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后，与经过酶切(Xbal I/BamH I)后纯化的pK18mobsacB质粒(购自Addgene公司，质粒上含有卡那霉素抗性标记)用NEBuilder酶(购自NEB公司)50℃连接30min，连接产物转化DH5a后长出的单克隆经M13引物(M13F:5’TGTAAAACGACGGCCAGT3’，M13R:5’CAGGAAACAGCTATGACC3’)PCR鉴定获得阳性重组载体pK18-BBD29_05105GC61-62TG。将酶切正确的重组质粒pK18-BBD29_05105GC61-62TG送测序公司测序鉴定，并将含有正确点突变(GC-TG)的重组载体pK18-BBD29_05105GC61-62TG保存备用。
此重组载体pK18-BBD29_05105GC61-62TG中BBD29_05105GC61-62TG Up-Down DNA大小1454bp，BBD29_05105GC61-62TGUp-Down(序列如SEQ ID No.5所示)含有突变位点，将导致菌株谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21220中BBD29_05105基因编码区的第61-62位鸟嘌呤和胞嘧啶(GC)突变为胸腺嘧啶和鸟嘌呤(TG)，最终导致编码蛋白的第21位丙氨酸(A)突变为半胱氨酸(C)。
所述重组质粒pK18-BBD29_05105GC61-62TG是将pK18mobsacB质粒的Xbal I和BamH I识别位点间的片段(小片段)替换为序列表中SEQ ID No.5的第37-1416位所示的DNA片段，保持pK18mobsacB载体的其他序列不变，得到的重组载体。
所述重组载体pK18-BBD29_05105GC61-62TG含有SEQ ID No.3所示的突变基因BBD29_05105GC61-62TG的第1-762位所示的DNA分子。
实施例2BBD29_05105GC61-62TG基因编码区替换BBD29_05105基因工程菌株的构建
构建方法：将实施例1中的等位替换质粒(pK18-BBD29_05105GC61-62TG)通过电击转化入谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)CGMCC No.21220及野生型谷氨酸棒杆菌菌株ATCC13869中后，在培养基中进行培养，培养基成分和培养条件参见表1，对培养产生的单菌落分别通过实施例1中的引物P1和通用引物M13R(5’CAGGAAACAGCTATGACC3’)进行鉴定，能扩增出1461bp(序列如SEQ ID No.6所示)大小条带的菌株为阳性菌株。将阳性菌株在含15％蔗糖的培养基上培养，对培养产生的单菌落分别在含有卡那霉素和不含卡那霉素的培养基上培养，选择在不含卡那霉素的培养基上生长，而在含卡那霉素的培养基上不生长的菌株进一步采用如下引物(上海invitrogen公司合成)进行PCR鉴定：
P5:5'GACACGTCACTACATTTAAG 3'，
P6:5'CGTGCCGGACAGGGAGTTGA 3'，
将得到的PCR扩增产物(290bp)通过95℃高温变性10min、冰浴5min后进行SSCP(Single-Strand Conformation Polymorphis)电泳(以质粒pK18-BBD29_05105GC61-62TG扩增片段为阳性对照，谷氨酸棒杆菌ATCC13869扩增片段为阴性对照，水作为空白对照)，SSCP电泳的PAGE的制备及电泳条件参见表2，由于片段结构不同，电泳位置不同，因此片段电泳位置与阴性对照片段位置不一致且与阳性对照片段位置一致的菌株为等位替换成功的菌株。再次通过引物P5/P6 PCR扩增阳性菌株BBD29_05105基因片段，并连接到PMD19-T载体进行测序，通过序列比对，碱基序列发生突变(GC-TG)的菌株为等位替换成功的阳性菌株，分别命名为YPG-061、G05105-1。
重组菌YPG-061和G05105-1含有SEQ ID No.3所示的突变的基因BBD29_05105GC61 -62TG。重组菌YPG-061与谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)CGMCC No.21220的区别仅在于：YPG-061为将谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)CGMCCNo.21220的BBD29_05105基因替换为BBD29_05105GC61-62TG基因(序列3所示DNA分子)，并保持其他序列不变得到的菌株，重组菌G05105-1与ATCC13869的区别在于：G05105-1为将ATCC13869的BBD29_05105基因替换为BBD29_05105GC61-62TG基因SEQ ID No.3所示DNA分子)，并保持其他序列不变得到的菌株。
表1培养基的组成和培养条件
成分 配方
蔗糖 10g/L
多聚蛋白胨 10g/L
牛肉膏 10g/L
酵母粉 5g/L
尿素 2g/L
氯化钠 2.5g/L
琼脂粉 20g/L
水
pH 7.0
培养条件 32℃
表2 SSCP电泳的PAGE的制备及电泳条件
Figure BDA0003718818270000081
实施例3基因组整合过表达BBD29_05105基因和BBD29_05105GC61-62TG基因工程菌株的构建
采用NEBuilder重组技术进行载体构建，依据NCBI公布的谷氨酸棒杆菌ATCC13869基因组序列，设计并合成三对扩增上下游同源臂片段及BBD29_05105或BBD29_05105GC61-62TG基因编码区及启动子区的引物，以同源重组的方式在谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21220及野生型谷氨酸棒杆菌菌株ATCC13869中引入BBD29_05105或BBD29_05105GC61-62TG基因。
引物设计如下(上海invitrogen公司合成)：
P7:5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGGACCCGCTTGCCATACGAAG3'，
P8:5'ACCCGCTATTCTTAATACCCATCTACTCATCTGAAGAATC3'，
P9:5'GATTCTTCAGATGAGTAGATGGGTATTAAGAATAGCGGGT3'，
P10:5'CAAACCAGAGTGCCCACGAATTAGGAAGTTGCAGCGGTGG3'，
P11:5'CCACCGCTGCAACTTCCTAATTCGTGGGCACTCTGGTTTG3'，
P12:5'CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCCATAAGAAACAACCACTTCC3'。
构建方法：分别以谷氨酸棒杆菌ATCC13869或YPG-061为模板，分别以引物P7/P8，P9/P10，P11/P12进行PCR扩增，获得上游同源臂片段806bp(对应于谷氨酸棒杆菌CGMCCNo.21220BBD29_03480基因、BBD29_03485基因及其与BBD29_03490基因的间隔区，序列如SEQ ID No.7所示)，BBD29_05105基因及其启动子片段1540bp(序列如SEQ ID No.8所示)或BBD29_05105GC61-62TG基因及其启动子片段1540bp(序列如SEQ ID No.9所示)及下游同源臂片段788bp(对应于谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21220BBD29_03490基因及其与BBD29_03485的间隔区，序列如SEQ ID No.10所示)。
PCR反应结束后，对每个模板扩增得到的3个片段采用柱式DNA凝胶回收试剂盒分别进行电泳回收。回收后的3个片段与经过XbalI/BamHI酶切后纯化的pK18mobsacB质粒(购自Addgene公司，该质粒上含有卡那霉素抗性作为筛选标记)用NEBuilder酶(购自NEB公司)50℃连接30min，连接DH5a产物转化后长出的单克隆用M13引物(M13F:5’TGTAAAACGACGGCCAGT3’，M13R:5’CAGGAAACAGCTATGACC3’)经PCR鉴定获得阳性整合质粒(重组载体)，分别为pK18-BBD29_05105OE、pK18-BBD29_05105GC61-62TGOE，该阳性整合质粒上含有卡那霉素抗性标记，可以通过卡那霉素筛选获得质粒整合到基因组上的重组子。
PCR反应体系为：10×ExTaqBuffer5μL，dNTPMixture(各2.5mM)4μL，Mg2+(25mM)4μL，引物(10pM)各2μL，ExTaq(5U/μL)0.25μL，总体积50μL。
PCR反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s；52℃退火30s；72℃延伸60s(30个循环)，72℃过度延伸10min。
将测序正确的整合质粒(pK18-BBD29_05105OE、pK18-BBD29_05105GC61-62TGOE)分别电转化入谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21220及野生型谷氨酸棒杆菌菌株ATCC13869，在培养基中进行培养，培养基成分和培养条件参见表1，对培养产生的单菌落通过P13/P14引物进行PCR鉴定，PCR扩增出含有大小1580bp(不含点突变的序列如SEQ ID No.11所示；含点突变的第1119-1120位GC突变为TG，其余序列如SEQ ID No.11)的片段的为阳性菌株，扩增不到片段的为原菌。将阳性菌株在含15％蔗糖的培养基上培养，对培养产生的单菌落进一步采用P15/P16引物进行PCR鉴定，扩增出大小为1750bp(不含点突变的序列如SEQ ID No.12所示，含点突变的序列也如SEQ ID No.12所示)的菌为BBD29_05105或BBD29_05105GC61-62TG基因整合到谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21220基因组上同源臂BBD29_03485和下同源臂BBD29_03490的间隔区上的阳性菌株，以CGMCC No.21220为出发菌获得的菌株分别命名为YPG-062(不含突变点)和YPG-063(含突变点)，以ATCC13869为出发菌获得的菌株分别命名为G05105-2(不含突变点)和G05105-3(含突变点)。
重组菌YPG-062含有双拷贝的SEQ ID No.1所示的BBD29_05105基因；具体地，重组菌YPG-062是将谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21220的基因组中上同源臂BBD29_03485和下同源臂BBD29_03490的间隔区替换为BBD29_05105基因，保持谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21220的基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌。含有双拷贝BBD29_05105基因的重组菌可以显著和稳定地提高BBD29_05105基因的表达量。
重组菌YPG-063含有SEQ ID No.3所示的突变的BBD29_05105GC61-62TG基因；具体地，重组菌YPG-063是将谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21220的基因组中上同源臂BBD29_03485和下同源臂BBD29_03490的间隔区替换为BBD29_05105GC61-62TG基因，保持谷氨酸棒杆菌CGMCCNo.21220的基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌。
PCR鉴定引物如下所示：
P13:5'GTCCAAGGTGACGGCCGCAC 3'(对应上同源臂BBD29_03480的外侧)，
P14:5'GATGATCTGCTGGTTGGTGG 3'(对应BBD29_05105编码区)，
P15:5'CCCGCCACCTTCGCCGAGCG 3'(对应BBD29_05105编码区)，
P16:5'ATATTCGGCCCAGCAGCAGC 3'(对应下同源臂BBD29_03490的外侧)。
实施例4质粒过表达BBD29_05105基因或BBD29_05105GC61-62TG基因工程菌株的构建
采用NEBuilder重组技术进行载体构建，依据NCBI公布的谷氨酸棒杆菌ATCC13869基因组序列，设计并合成一对扩增BBD29_05105和BBD29_05105GC61-62TG基因编码区及启动子区的引物，引物设计如下(上海invitrogen公司合成)：
P17：'GCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCGGGTATTAAGAATAGCGGGT3'(带下划线的核苷酸序列为pXMJ19上的序列)，
P18：'ATCAGGCTGAAAATCTTCTCTCATCCGCCAAAACTTAGGAAGTTGCAGCGGTGG3'(带下划线的核苷酸序列为pXMJ19上的序列)。
构建方法：分别以谷氨酸棒杆菌ATCC13869和YPG-061为模板，以引物P17/18行PCR扩增，获得BBD29_05105基因及其启动子片段(序列如SEQ ID No.13所示)和BBD29_05105GC61-62TG基因及其启动子片段1570bp(序列如SEQ ID No.14所示)，对扩增产物进行电泳并采用柱式DNA凝胶回收试剂盒进行纯化回收，回收的DNA片段与经EcoR I/KpnI酶切回收的穿梭质粒pXMJ19(购自Addgene公司，该质粒上含有氯霉素抗性作为筛选标记)用NEBuilder酶(购自NEB公司)50℃连接30min，连接产物转化后长出的单克隆用M13R(-48)(5'AGCGGATAACAATTTCACACAGGA 3')/P18不含点突变的序列如SEQ ID No.15所示，含点突变的第364-365位GC突变为TG，其余序列如SEQ ID No.15)引物PCR鉴定获得阳性过表达质粒pXMJ19-BBD29_05105(含有BBD29_05105基因)和pXMJ19-BBD29_05105GC61-62TG(含有BBD29_05105GC61-62TG基因)，将该质粒送测序。因质粒上含有氯霉素抗性标记，可以通过氯霉素来筛选质粒是否转化到菌株中。
PCR反应体系为：10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTP Mixture(各2.5mM)4μL，Mg2+(25mM)4μL，引物(10pM)各2μL，Ex Taq(5U/μL)0.25μL，总体积50μL。
PCR反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s；52℃退火30s；72℃延伸60s(30个循环)，72℃过度延伸10min。
将测序正确的pXMJ19-BBD29_05105和pXMJ19-BBD29_05105GC61-62TG质粒分别电转化入谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21220及野生型谷氨酸棒杆菌菌株ATCC13869中，在培养基中进行培养，培养基成分和培养条件参见表1，对培养产生的单菌落通过引物M13R(-48)(5'AGCGGATAAC AATTTCACACAGGA 3')/P18不含点突变的序列如SEQ ID No.15所示，含点突变的含点突变的第364-365位GC突变为TG，其余序列如SEQ ID No.15)进行PCR鉴定，PCR扩增出含有大小1609bp片段的为阳性菌株，以CGMCC No.21220为出发菌获得的菌株分别命名为YPG-064(不含突变点)和YPG-065(含突变点)，以ATCC13869为出发菌获得的菌株分别命名为G05105-4(不含突变点)和G05105-5(含突变点)。
重组菌YPG-064和G05105-4含有SEQ ID No.1所示的BBD29_05105基因；
重组菌YPG-065和G05105-5含有SEQ ID No.3所示的突变的BBD29_05105GC61-62TG基因。
实施例5缺失BBD29_05105基因工程菌株的构建
采用NEBuilder重组技术进行载体构建，根据NCBI公布的谷氨酸棒杆菌ATCC13869的基因组序列，合成两对扩增BBD29_05105基因编码区两端片段的引物，作为上下游同源臂片段。引物设计如下(上海invitrogen公司合成)：
P195'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGTTTGACGATTTCGTCGACGA3'，
P20:5'ATGTCCATGATTTTTATCTCGGATACCTCCGAAGTTAA3'，
P21:5'TTAACTTCGGAGGTATCCGAGATAAAAATCATGGACAT3'，
P225'CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCCATGATCACAGCGCCCTTCA3'。
构建方法：以谷氨酸棒杆菌ATCC13869为模板，分别以引物P19/20和P21/P22进行PCR扩增，获得BBD29_05105的上游同源臂片段794bp及BBD29_05105的下游同源臂片段806bp。
对扩增的产物进行电泳并采用柱式DNA凝胶回收试剂盒进行纯化，回收的DNA片段与经过Xbal I/BamH I酶切后纯化的pK18mobsacB质粒(购自Addgene公司，该质粒上含有卡那霉素抗性作为筛选标记)用NEBuilder酶(购自NEB公司)50℃连接30min，连接产物转化后长出的单克隆用M13引物经PCR鉴定获得阳性敲除载体pK18-ΔBBD29_05105，此重组质粒pK18-ΔBBD29_05105中包含ΔBBD29_05105的Up-Down DNA 1562bp(序列如SEQ ID No.16所示)。
将该质粒送测序，将测序正确的敲除质粒pK18-ΔBBD29_05105电转化入谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21220及野生型谷氨酸棒杆菌菌株ATCC13869，在培养基中进行培养，培养基成分和培养条件参见表1，对培养产生的单菌落通过如下引物(上海invitrogen公司合成)进行PCR鉴定：
P23:5'AGATGATGTGTGCATGCAGC3'(对应于谷氨酸棒杆菌CGMCCNo.21220BBD29_05100编码区)，
P24:5'GATAAACCGGCAGAACCGAC3'(对应于谷氨酸棒杆菌CGMCCNo.21220BBD29_05110编码区)。
上述PCR同时扩增出大小558bp及1830bp的条带的菌株为阳性菌株，只扩增出1830bp条带的菌株为原菌。阳性菌株在15％蔗糖培养基上筛选后分别在含有卡那霉素和不含卡那霉素的培养基上培养，选择在不含卡那霉素的培养基上生长，而在含卡那霉素的培养基上不生长的菌株进一步采用P23/P24引物进行PCR鉴定，扩增出大小为558bp条带的菌株为BBD29_05105基因编码区被敲除的阳性菌株BBD29_05105。再次通过P23/P24引物PCR扩增阳性菌株BBD29_05105片段，并连接到pMD19-T载体进行测序，将测序正确的菌株命名为YPG-066(谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21220上的基因组上的BBD29_05105基因被敲除)和G05105-6(野生型谷氨酸棒杆菌ATCC13869基因组上的BBD29_05105基因被敲除)。
实施例6L-谷氨酸发酵实验
将上述实施例构建的菌株和原始菌株谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21220和ATCC13869在BLBIO-5GC-4-H型号的发酵罐(购自上海百仑生物科技有限公司)中以表3所示的培养基和表4所示的控制工艺进行发酵实验。发酵液通过生物传感仪(生物传感仪40C，来自山东省科学院生物研究所)检测L-谷氨酸含量。每个菌株重复三次，结果如表5和表6所示。
结果如表5和表6所示，在谷氨酸棒杆菌中对BBD29_05105基因编码区进行点突变BBD29_05105GC61-62TG及过表达，有助于L-谷氨酸产量及转化率的提高，而对基因进行敲除或弱化，不利于L-谷氨酸的积累。
表3发酵培养基配方
试剂名称 配比
葡萄糖 5.0g/L
磷酸 0.38g/L
硫酸镁 1.85g/L
氯化钾 1.6g/L
生物素 550μg/L
维生物素B1 300μg/L
硫酸亚铁 10mg/L
硫酸锰 10g/dl
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> 2.8g/L
维生素C 0.75mg/L
维生素B12 2.5μg/L
对氨基苯甲酸 0.75mg/L
消泡剂 0.0015ml/dl
甜菜碱 1.5g/L
甘蔗糖蜜 7ml/L
玉米浆 77ml/L
天冬氨酸 1.7g/L
毛发粉 2g/L
表4发酵控制工艺
Figure BDA0003718818270000121
表5 L-谷氨酸发酵实验结果
Figure BDA0003718818270000131
表6 L-谷氨酸发酵实验结果
Figure BDA0003718818270000132
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 内蒙古伊品生物科技有限公司
<120> 与L-谷氨酸产量相关的蛋白及其相关生物材料和应用
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1272
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgtcccgtc caatcgttaa acaagcattc accgtcaccg ccgtcaccgc gatggctttt 60
gccctggcat catgcacccg cgcagtggat gcaacctccg caggtggaac cgcgagcaac 120
accgcagctt cctgtgtgga tacatccggc gactccatca aaatcggctt catcaactcc 180
ctgtccggca cgatggctat ctctgaaacc acggtgaacc aatccctgca catggcagcc 240
gatgaaatca acgcagccgg cggcgttttg ggcaagcagt tggagatctc tgaagaagac 300
ggcgccagcg aacccgccac cttcgccgag cgctcccaac gcctcatcca gcaggaatgc 360
gttgcagccg tgtttggtgg atggacctcc gcctcccgca aagcaatgct ccccgtcttt 420
gagggcaata actccctgct gttctacccg gtgcagtacg agggcatgga atcctcgccg 480
aatattttct acaccggtgc caccaccaac cagcagatca tcccggctct tgattacctg 540
cgtgaaaacg gcctgaaccg ccttttcctt gtcggttccg attatgtttt cccacgcact 600
gcaaattcca tcatcaagga ctacgccgaa gccaatggta tggaaatcgt cggcgaagac 660
tacgcgccgt tgggatccac cgacttcacc accatcgcca accgcatgcg tgactccaac 720
gcagatgccg tgttcaacac tttgaatggc gattccaacg tggcgttctt ccgccagtac 780
aacagcctcg gcttcaatgc agacaccctt ccggtgatgt cagtatccat tgcggaagaa 840
gaagtcggag gcatcggcac cgcaaatatt gagggccagc tggtggcgtg ggactactac 900
caaaccatcg acaccccaga aaacgagacc ttcgtggaga atttcaagga cctctacggc 960
caggacaaag tgacctccga cccgatggaa gctgcttaca ctagcctcta cctctggaaa 1020
gaaatggtag agaaggccga ttcctttgat gtcgccgcaa ttcaagcagc cgccgacgga 1080
accacttttg atgcaccaga aggaaccgtg gtggttgacg gcgataacca ccacatctcc 1140
aaaacgccgc gcatcggtcg aatccgcccg gatggattga tcgacaccat ttgggaaacc 1200
gattccccag ttgatccgga cccatacctg tcttcctatg actgggccaa gaccaccgct 1260
gcaacttcct aa 1272
<210> 2
<211> 423
<212> PRT
<213> 谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)
<400> 2
Met Ser Arg Pro Ile Val Lys Gln Ala Phe Thr Val Thr Ala Val Thr
1 5 10 15
Ala Met Ala Phe Ala Leu Ala Ser Cys Thr Arg Ala Val Asp Ala Thr
20 25 30
Ser Ala Gly Gly Thr Ala Ser Asn Thr Ala Ala Ser Cys Val Asp Thr
35 40 45
Ser Gly Asp Ser Ile Lys Ile Gly Phe Ile Asn Ser Leu Ser Gly Thr
50 55 60
Met Ala Ile Ser Glu Thr Thr Val Asn Gln Ser Leu His Met Ala Ala
65 70 75 80
Asp Glu Ile Asn Ala Ala Gly Gly Val Leu Gly Lys Gln Leu Glu Ile
85 90 95
Ser Glu Glu Asp Gly Ala Ser Glu Pro Ala Thr Phe Ala Glu Arg Ser
100 105 110
Gln Arg Leu Ile Gln Gln Glu Cys Val Ala Ala Val Phe Gly Gly Trp
115 120 125
Thr Ser Ala Ser Arg Lys Ala Met Leu Pro Val Phe Glu Gly Asn Asn
130 135 140
Ser Leu Leu Phe Tyr Pro Val Gln Tyr Glu Gly Met Glu Ser Ser Pro
145 150 155 160
Asn Ile Phe Tyr Thr Gly Ala Thr Thr Asn Gln Gln Ile Ile Pro Ala
165 170 175
Leu Asp Tyr Leu Arg Glu Asn Gly Leu Asn Arg Leu Phe Leu Val Gly
180 185 190
Ser Asp Tyr Val Phe Pro Arg Thr Ala Asn Ser Ile Ile Lys Asp Tyr
195 200 205
Ala Glu Ala Asn Gly Met Glu Ile Val Gly Glu Asp Tyr Ala Pro Leu
210 215 220
Gly Ser Thr Asp Phe Thr Thr Ile Ala Asn Arg Met Arg Asp Ser Asn
225 230 235 240
Ala Asp Ala Val Phe Asn Thr Leu Asn Gly Asp Ser Asn Val Ala Phe
245 250 255
Phe Arg Gln Tyr Asn Ser Leu Gly Phe Asn Ala Asp Thr Leu Pro Val
260 265 270
Met Ser Val Ser Ile Ala Glu Glu Glu Val Gly Gly Ile Gly Thr Ala
275 280 285
Asn Ile Glu Gly Gln Leu Val Ala Trp Asp Tyr Tyr Gln Thr Ile Asp
290 295 300
Thr Pro Glu Asn Glu Thr Phe Val Glu Asn Phe Lys Asp Leu Tyr Gly
305 310 315 320
Gln Asp Lys Val Thr Ser Asp Pro Met Glu Ala Ala Tyr Thr Ser Leu
325 330 335
Tyr Leu Trp Lys Glu Met Val Glu Lys Ala Asp Ser Phe Asp Val Ala
340 345 350
Ala Ile Gln Ala Ala Ala Asp Gly Thr Thr Phe Asp Ala Pro Glu Gly
355 360 365
Thr Val Val Val Asp Gly Asp Asn His His Ile Ser Lys Thr Pro Arg
370 375 380
Ile Gly Arg Ile Arg Pro Asp Gly Leu Ile Asp Thr Ile Trp Glu Thr
385 390 395 400
Asp Ser Pro Val Asp Pro Asp Pro Tyr Leu Ser Ser Tyr Asp Trp Ala
405 410 415
Lys Thr Thr Ala Ala Thr Ser
420
<210> 3
<211> 1272
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgtcccgtc caatcgttaa acaagcattc accgtcaccg ccgtcaccgc gatggctttt 60
tgcctggcat catgcacccg cgcagtggat gcaacctccg caggtggaac cgcgagcaac 120
accgcagctt cctgtgtgga tacatccggc gactccatca aaatcggctt catcaactcc 180
ctgtccggca cgatggctat ctctgaaacc acggtgaacc aatccctgca catggcagcc 240
gatgaaatca acgcagccgg cggcgttttg ggcaagcagt tggagatctc tgaagaagac 300
ggcgccagcg aacccgccac cttcgccgag cgctcccaac gcctcatcca gcaggaatgc 360
gttgcagccg tgtttggtgg atggacctcc gcctcccaca aagcaatgct ccccgtcttt 420
gagggcaata actccctgct gttctacccg gtgcagtacg agggcatgga atcctcgccg 480
aatattttct acaccggtgc caccaccaac cagcagatca tcccggctct tgattacctg 540
cgtgaaaacg gcctgaaccg ccttttcctt gtcggttccg attatgtttt cccacgcact 600
gcaaattcca tcatcaagga ctacgccgaa gccaatggta tggaaatcgt cggcgaagac 660
tacgcgccgt tgggatccac cgacttcacc accatcgcca accgcatgcg tgactccaac 720
gcagatgccg tgttcaacac tttgaatggc gattccaacg tggcgttctt ccgccagtac 780
aacagcctcg gcttcaatgc agacaccctt ccggtgatgt cagtatccat tgcggaagaa 840
gaagtcggag gcatcggcac cgcaaatatt gagggccagc tggtggcgtg ggactactac 900
caaaccatcg acaccccaga aaacgagacc ttcgtggaga atttcaagga cctctacggc 960
caggacaaag tgacctccga cccgatggaa gctgcttaca ctagcctcta cctctggaaa 1020
gaaatggtag agaaggccga ttcctttgat gtcgccgcaa ttcaagcagc cgccgacgga 1080
accacttttg atgcaccaga aggaaccgtg gtggttgacg gcgataacca ccacatctcc 1140
aaaacgccgc gcatcggtcg aatccgcccg gatggattga tcgacaccat ttgggaaacc 1200
gattccccag ttgatccgga cccatacctg tcttcctatg actgggccaa gaccaccgct 1260
gcaacttcct aa 1272
<210> 4
<211> 423
<212> PRT
<213> 谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)
<400> 4
Met Ser Arg Pro Ile Val Lys Gln Ala Phe Thr Val Thr Ala Val Thr
1 5 10 15
Ala Met Ala Phe Cys Leu Ala Ser Cys Thr Arg Ala Val Asp Ala Thr
20 25 30
Ser Ala Gly Gly Thr Ala Ser Asn Thr Ala Ala Ser Cys Val Asp Thr
35 40 45
Ser Gly Asp Ser Ile Lys Ile Gly Phe Ile Asn Ser Leu Ser Gly Thr
50 55 60
Met Ala Ile Ser Glu Thr Thr Val Asn Gln Ser Leu His Met Ala Ala
65 70 75 80
Asp Glu Ile Asn Ala Ala Gly Gly Val Leu Gly Lys Gln Leu Glu Ile
85 90 95
Ser Glu Glu Asp Gly Ala Ser Glu Pro Ala Thr Phe Ala Glu Arg Ser
100 105 110
Gln Arg Leu Ile Gln Gln Glu Cys Val Ala Ala Val Phe Gly Gly Trp
115 120 125
Thr Ser Ala Ser His Lys Ala Met Leu Pro Val Phe Glu Gly Asn Asn
130 135 140
Ser Leu Leu Phe Tyr Pro Val Gln Tyr Glu Gly Met Glu Ser Ser Pro
145 150 155 160
Asn Ile Phe Tyr Thr Gly Ala Thr Thr Asn Gln Gln Ile Ile Pro Ala
165 170 175
Leu Asp Tyr Leu Arg Glu Asn Gly Leu Asn Arg Leu Phe Leu Val Gly
180 185 190
Ser Asp Tyr Val Phe Pro Arg Thr Ala Asn Ser Ile Ile Lys Asp Tyr
195 200 205
Ala Glu Ala Asn Gly Met Glu Ile Val Gly Glu Asp Tyr Ala Pro Leu
210 215 220
Gly Ser Thr Asp Phe Thr Thr Ile Ala Asn Arg Met Arg Asp Ser Asn
225 230 235 240
Ala Asp Ala Val Phe Asn Thr Leu Asn Gly Asp Ser Asn Val Ala Phe
245 250 255
Phe Arg Gln Tyr Asn Ser Leu Gly Phe Asn Ala Asp Thr Leu Pro Val
260 265 270
Met Ser Val Ser Ile Ala Glu Glu Glu Val Gly Gly Ile Gly Thr Ala
275 280 285
Asn Ile Glu Gly Gln Leu Val Ala Trp Asp Tyr Tyr Gln Thr Ile Asp
290 295 300
Thr Pro Glu Asn Glu Thr Phe Val Glu Asn Phe Lys Asp Leu Tyr Gly
305 310 315 320
Gln Asp Lys Val Thr Ser Asp Pro Met Glu Ala Ala Tyr Thr Ser Leu
325 330 335
Tyr Leu Trp Lys Glu Met Val Glu Lys Ala Asp Ser Phe Asp Val Ala
340 345 350
Ala Ile Gln Ala Ala Ala Asp Gly Thr Thr Phe Asp Ala Pro Glu Gly
355 360 365
Thr Val Val Val Asp Gly Asp Asn His His Ile Ser Lys Thr Pro Arg
370 375 380
Ile Gly Arg Ile Arg Pro Asp Gly Leu Ile Asp Thr Ile Trp Glu Thr
385 390 395 400
Asp Ser Pro Val Asp Pro Asp Pro Tyr Leu Ser Ser Tyr Asp Trp Ala
405 410 415
Lys Thr Thr Ala Ala Thr Ser
420
<210> 5
<211> 1454
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cagtgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctagttcg aggcctttgg cggcgtcgat 60
aagcatgact gctgcgtcga cggccatgag gacgcggtag gtgtcttcgg agaagtcggc 120
gtggcctggg gtgtccacga ggttgatcat gaagggctcg cctgcgtggc cttctggtgc 180
gtactcgaat tggagtgcgg aggaggcgat ggagattccg cggtcttttt ccatttccat 240
ccagtcggaa acggtggctt tgcggcctgc tttgccgtgg gtggcgccgg cttcggagat 300
gatgtgtgca tgcagcgcca atgcctcggt gagggtggat ttaccggcgt cggggtgtgc 360
gattacggcg aatgttctgc ggcgatgtgc ctcggcggcg gtggtgtcgg gattggcgtt 420
gctcatgggt attaagaata gcgggttgtg ggcgctgggc catagtcgcc ccagctcagc 480
gaagttgtac gccggcgttg cctgcttgtc gacgtttttt gccacttccc ttaattcggg 540
ggtggctgaa atgtaagaca cgtcactaca tttaagctca aaaacaacta cctataggct 600
gacagaaact ctaaaaacta tagagctata gaaaccttaa cttcggaggt atccatgtcc 660
cgtccaatcg ttaaacaagc attcaccgtc accgccgtca ccgcgatggc tttttgcctg 720
gcatcatgca cccgcgcagt ggatgcaacc tccgcaggtg gaaccgcgag caacaccgca 780
gcttcctgtg tggatacatc cggcgactcc atcaaaatcg gcttcatcaa ctccctgtcc 840
ggcacgatgg ctatctctga aaccacggtg aaccaatccc tgcacatggc agccgatgaa 900
atcaacgcag ccggcggcgt tttgggcaag cagttggaga tctctgaaga agacggcgcc 960
agcgaacccg ccaccttcgc cgagcgctcc caacgcctca tccagcagga atgcgttgca 1020
gccgtgtttg gtggatggac ctccgcctcc cacaaagcaa tgctccccgt ctttgagggc 1080
aataactccc tgctgttcta cccggtgcag tacgagggca tggaatcctc gccgaatatt 1140
ttctacaccg gtgccaccac caaccagcag atcatcccgg ctcttgatta cctgcgtgaa 1200
aacggcctga accgcctttt ccttgtcggt tccgattatg ttttcccacg cactgcaaat 1260
tccatcatca aggactacgc cgaagccaat ggtatggaaa tcgtcggcga agactacgcg 1320
ccgttgggat ccaccgactt caccaccatc gccaaccgca tgcgtgactc caacgcagat 1380
gccgtgttca acactttgaa tggcgattcc aacgtggggt accgagctcg aattcgtaat 1440
catggtcata gctg 1454
<210> 6
<211> 1461
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cagtgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctagttcg aggcctttgg cggcgtcgat 60
aagcatgact gctgcgtcga cggccatgag gacgcggtag gtgtcttcgg agaagtcggc 120
gtggcctggg gtgtccacga ggttgatcat gaagggctcg cctgcgtggc cttctggtgc 180
gtactcgaat tggagtgcgg aggaggcgat ggagattccg cggtcttttt ccatttccat 240
ccagtcggaa acggtggctt tgcggcctgc tttgccgtgg gtggcgccgg cttcggagat 300
gatgtgtgca tgcagcgcca atgcctcggt gagggtggat ttaccggcgt cggggtgtgc 360
gattacggcg aatgttctgc ggcgatgtgc ctcggcggcg gtggtgtcgg gattggcgtt 420
gctcatgggt attaagaata gcgggttgtg ggcgctgggc catagtcgcc ccagctcagc 480
gaagttgtac gccggcgttg cctgcttgtc gacgtttttt gccacttccc ttaattcggg 540
ggtggctgaa atgtaagaca cgtcactaca tttaagctca aaaacaacta cctataggct 600
gacagaaact ctaaaaacta tagagctata gaaaccttaa cttcggaggt atccatgtcc 660
cgtccaatcg ttaaacaagc attcaccgtc accgccgtca ccgcgatggc tttttgcctg 720
gcatcatgca cccgcgcagt ggatgcaacc tccgcaggtg gaaccgcgag caacaccgca 780
gcttcctgtg tggatacatc cggcgactcc atcaaaatcg gcttcatcaa ctccctgtcc 840
ggcacgatgg ctatctctga aaccacggtg aaccaatccc tgcacatggc agccgatgaa 900
atcaacgcag ccggcggcgt tttgggcaag cagttggaga tctctgaaga agacggcgcc 960
agcgaacccg ccaccttcgc cgagcgctcc caacgcctca tccagcagga atgcgttgca 1020
gccgtgtttg gtggatggac ctccgcctcc cacaaagcaa tgctccccgt ctttgagggc 1080
aataactccc tgctgttcta cccggtgcag tacgagggca tggaatcctc gccgaatatt 1140
ttctacaccg gtgccaccac caaccagcag atcatcccgg ctcttgatta cctgcgtgaa 1200
aacggcctga accgcctttt ccttgtcggt tccgattatg ttttcccacg cactgcaaat 1260
tccatcatca aggactacgc cgaagccaat ggtatggaaa tcgtcggcga agactacgcg 1320
ccgttgggat ccaccgactt caccaccatc gccaaccgca tgcgtgactc caacgcagat 1380
gccgtgttca acactttgaa tggcgattcc aacgtggggt accgagctcg aattcgtaat 1440
catggtcata gctgtttcct g 1461
<210> 7
<211> 806
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cagtgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctaggacc cgcttgccat acgaagtcct 60
ggagaagatc tccacccgca tcaccaacga agttccagac gtaaaccgcg tggttttgga 120
cgtaacctcc aagccaccag gaaccatcga atgggagtag gccttaaatg agccttcgtt 180
aagcggcaat caccttatcg gtgattgccg ctttcccatt tctccgggtt ttctggaact 240
ttttgggcgt atgctgggaa tgatcttatt attttgattt cagaaagcag gagagaccag 300
atgagcgaaa tccttgaaac ctactgggca ccccacttcg gaaacaccga tgaagccgca 360
gcactcgttt catacttggc acaagcttcc ggtgatccta ttgaggttca caccctgttc 420
ggggatttag gtttagacgg actctctgga aactacaccg acactgagat cgacggctac 480
ggcgacgcat tcctgctggt tgcagcacta gcagtgttga tggctgaaaa caaagcatcc 540
ggcggcgtga atctgggtga agttggggga gctgataaat cgatccggct gcatgttgaa 600
tccaaggaaa acacccagat caacaccgca ttgaagtact ttgcgctttc cccagaagac 660
cacgcagcgg cagatcgctt cgatgaggat gacctgtctg agcttgccaa cttgagtgaa 720
gagctgcgcg gacagctgga ctaattgctg cccgtttaag gagtccgatt cttcagatga 780
gtagatgggt attaagaata gcgggt 806
<210> 8
<211> 1540
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gattcttcag atgagtagat gggtattaag aatagcgggt tgtgggcgct gggccatagt 60
cgccccagct cagcgaagtt gtacgccggc gttgcctgct tgtcgacgtt ttttgccact 120
tcccttaatt cgggggtggc tgaaatgtaa gacacgtcac tacatttaag ctcaaaaaca 180
actacctata ggctgacaga aactctaaaa actatagagc tatagaaacc ttaacttcgg 240
aggtatccat gtcccgtcca atcgttaaac aagcattcac cgtcaccgcc gtcaccgcga 300
tggcttttgc cctggcatca tgcacccgcg cagtggatgc aacctccgca ggtggaaccg 360
cgagcaacac cgcagcttcc tgtgtggata catccggcga ctccatcaaa atcggcttca 420
tcaactccct gtccggcacg atggctatct ctgaaaccac ggtgaaccaa tccctgcaca 480
tggcagccga tgaaatcaac gcagccggcg gcgttttggg caagcagttg gagatctctg 540
aagaagacgg cgccagcgaa cccgccacct tcgccgagcg ctcccaacgc ctcatccagc 600
aggaatgcgt tgcagccgtg tttggtggat ggacctccgc ctcccgcaaa gcaatgctcc 660
ccgtctttga gggcaataac tccctgctgt tctacccggt gcagtacgag ggcatggaat 720
cctcgccgaa tattttctac accggtgcca ccaccaacca gcagatcatc ccggctcttg 780
attacctgcg tgaaaacggc ctgaaccgcc ttttccttgt cggttccgat tatgttttcc 840
cacgcactgc aaattccatc atcaaggact acgccgaagc caatggtatg gaaatcgtcg 900
gcgaagacta cgcgccgttg ggatccaccg acttcaccac catcgccaac cgcatgcgtg 960
actccaacgc agatgccgtg ttcaacactt tgaatggcga ttccaacgtg gcgttcttcc 1020
gccagtacaa cagcctcggc ttcaatgcag acacccttcc ggtgatgtca gtatccattg 1080
cggaagaaga agtcggaggc atcggcaccg caaatattga gggccagctg gtggcgtggg 1140
actactacca aaccatcgac accccagaaa acgagacctt cgtggagaat ttcaaggacc 1200
tctacggcca ggacaaagtg acctccgacc cgatggaagc tgcttacact agcctctacc 1260
tctggaaaga aatggtagag aaggccgatt cctttgatgt cgccgcaatt caagcagccg 1320
ccgacggaac cacttttgat gcaccagaag gaaccgtggt ggttgacggc gataaccacc 1380
acatctccaa aacgccgcgc atcggtcgaa tccgcccgga tggattgatc gacaccattt 1440
gggaaaccga ttccccagtt gatccggacc catacctgtc ttcctatgac tgggccaaga 1500
ccaccgctgc aacttcctaa ttcgtgggca ctctggtttg 1540
<210> 9
<211> 1540
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gattcttcag atgagtagat gggtattaag aatagcgggt tgtgggcgct gggccatagt 60
cgccccagct cagcgaagtt gtacgccggc gttgcctgct tgtcgacgtt ttttgccact 120
tcccttaatt cgggggtggc tgaaatgtaa gacacgtcac tacatttaag ctcaaaaaca 180
actacctata ggctgacaga aactctaaaa actatagagc tatagaaacc ttaacttcgg 240
aggtatccat gtcccgtcca atcgttaaac aagcattcac cgtcaccgcc gtcaccgcga 300
tggctttttg cctggcatca tgcacccgcg cagtggatgc aacctccgca ggtggaaccg 360
cgagcaacac cgcagcttcc tgtgtggata catccggcga ctccatcaaa atcggcttca 420
tcaactccct gtccggcacg atggctatct ctgaaaccac ggtgaaccaa tccctgcaca 480
tggcagccga tgaaatcaac gcagccggcg gcgttttggg caagcagttg gagatctctg 540
aagaagacgg cgccagcgaa cccgccacct tcgccgagcg ctcccaacgc ctcatccagc 600
aggaatgcgt tgcagccgtg tttggtggat ggacctccgc ctcccacaaa gcaatgctcc 660
ccgtctttga gggcaataac tccctgctgt tctacccggt gcagtacgag ggcatggaat 720
cctcgccgaa tattttctac accggtgcca ccaccaacca gcagatcatc ccggctcttg 780
attacctgcg tgaaaacggc ctgaaccgcc ttttccttgt cggttccgat tatgttttcc 840
cacgcactgc aaattccatc atcaaggact acgccgaagc caatggtatg gaaatcgtcg 900
gcgaagacta cgcgccgttg ggatccaccg acttcaccac catcgccaac cgcatgcgtg 960
actccaacgc agatgccgtg ttcaacactt tgaatggcga ttccaacgtg gcgttcttcc 1020
gccagtacaa cagcctcggc ttcaatgcag acacccttcc ggtgatgtca gtatccattg 1080
cggaagaaga agtcggaggc atcggcaccg caaatattga gggccagctg gtggcgtggg 1140
actactacca aaccatcgac accccagaaa acgagacctt cgtggagaat ttcaaggacc 1200
tctacggcca ggacaaagtg acctccgacc cgatggaagc tgcttacact agcctctacc 1260
tctggaaaga aatggtagag aaggccgatt cctttgatgt cgccgcaatt caagcagccg 1320
ccgacggaac cacttttgat gcaccagaag gaaccgtggt ggttgacggc gataaccacc 1380
acatctccaa aacgccgcgc atcggtcgaa tccgcccgga tggattgatc gacaccattt 1440
gggaaaccga ttccccagtt gatccggacc catacctgtc ttcctatgac tgggccaaga 1500
ccaccgctgc aacttcctaa ttcgtgggca ctctggtttg 1540
<210> 10
<211> 788
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ccaccgctgc aacttcctaa ttcgtgggca ctctggtttg gttaccagga tgggttagtc 60
attctgatca gcgaattcca cgttcacatc gccaattcca gagttcacaa ccagattcag 120
cattggacct tctagatcag cattgtgggc ggtgagatct ccaacatcac agcgcgctgt 180
gcccacaccg gcggtacaac ttaggctcac gggcacatca tcgggcaggg tgaccatgac 240
ttcgccgatc cctgaggtga tttggatgtt ttgttcctga tccaattggg tgaggtggct 300
gaaatcgagg ttcatttcac ccacgccaga ggtgtagctg ctgaggagtt catcgttggt 360
ggggatgaga ttgacatcgc cgattccagg gtcgtcttca aagtagatgg gatcgatatt 420
tgaaataaac aggcctgcga gggcgctcat gacaactccg gtaccaacta caccgccgac 480
aatccatggc cacacatggc gctttttctg aggcttttgt ggagggactt gtacatccca 540
ggtgttgtat tggttttggg caagtggatc ccaatgaggc gcttcggggg tttgttgcgc 600
gaagggtgca tagtagccct caacgggggt gatagtgctt agatctggtt ggggttgtgg 660
gtagagatct tcgtttttca tggtggcatc ctcagaaaca gtgaattcag tggtgagtag 720
tccgcggggt ggaagtggtt gtttcttatg gggtaccgag ctcgaattcg taatcatggt 780
catagctg 788
<210> 11
<211> 1580
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gtccaaggtg acggccgcac ctacggacac ccaatcgtgc tgcgcccagt atcttccgaa 60
gacgcaatga ccgccgactg gacccgcttg ccatacgaag tcctggagaa gatctccacc 120
cgcatcacca acgaagttcc agacgtaaac cgcgtggttt tggacgtaac ctccaagcca 180
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atcggtgatt gccgctttcc catttctccg ggttttctgg aactttttgg gcgtatgctg 300
ggaatgatct tattattttg atttcagaaa gcaggagaga ccagatgagc gaaatccttg 360
aaacctactg ggcaccccac ttcggaaaca ccgatgaagc cgcagcactc gtttcatact 420
tggcacaagc ttccggtgat cctattgagg ttcacaccct gttcggggat ttaggtttag 480
acggactctc tggaaactac accgacactg agatcgacgg ctacggcgac gcattcctgc 540
tggttgcagc actagcagtg ttgatggctg aaaacaaagc atccggcggc gtgaatctgg 600
gtgaagttgg gggagctgat aaatcgatcc ggctgcatgt tgaatccaag gaaaacaccc 660
agatcaacac cgcattgaag tactttgcgc tttccccaga agaccacgca gcggcagatc 720
gcttcgatga ggatgacctg tctgagcttg ccaacttgag tgaagagctg cgcggacagc 780
tggactaatt gctgcccgtt taaggagtcc gattcttcag atgagtagat gggtattaag 840
aatagcgggt tgtgggcgct gggccatagt cgccccagct cagcgaagtt gtacgccggc 900
gttgcctgct tgtcgacgtt ttttgccact tcccttaatt cgggggtggc tgaaatgtaa 960
gacacgtcac tacatttaag ctcaaaaaca actacctata ggctgacaga aactctaaaa 1020
actatagagc tatagaaacc ttaacttcgg aggtatccat gtcccgtcca atcgttaaac 1080
aagcattcac cgtcaccgcc gtcaccgcga tggcttttgc cctggcatca tgcacccgcg 1140
cagtggatgc aacctccgca ggtggaaccg cgagcaacac cgcagcttcc tgtgtggata 1200
catccggcga ctccatcaaa atcggcttca tcaactccct gtccggcacg atggctatct 1260
ctgaaaccac ggtgaaccaa tccctgcaca tggcagccga tgaaatcaac gcagccggcg 1320
gcgttttggg caagcagttg gagatctctg aagaagacgg cgccagcgaa cccgccacct 1380
tcgccgagcg ctcccaacgc ctcatccagc aggaatgcgt tgcagccgtg tttggtggat 1440
ggacctccgc ctcccgcaaa gcaatgctcc ccgtctttga gggcaataac tccctgctgt 1500
tctacccggt gcagtacgag ggcatggaat cctcgccgaa tattttctac accggtgcca 1560
ccaccaacca gcagatcatc 1580
<210> 12
<211> 1750
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cccgccacct tcgccgagcg ctcccaacgc ctcatccagc aggaatgcgt tgcagccgtg 60
tttggtggat ggacctccgc ctcccgcaaa gcaatgctcc ccgtctttga gggcaataac 120
tccctgctgt tctacccggt gcagtacgag ggcatggaat cctcgccgaa tattttctac 180
accggtgcca ccaccaacca gcagatcatc ccggctcttg attacctgcg tgaaaacggc 240
ctgaaccgcc ttttccttgt cggttccgat tatgttttcc cacgcactgc aaattccatc 300
atcaaggact acgccgaagc caatggtatg gaaatcgtcg gcgaagacta cgcgccgttg 360
ggatccaccg acttcaccac catcgccaac cgcatgcgtg actccaacgc agatgccgtg 420
ttcaacactt tgaatggcga ttccaacgtg gcgttcttcc gccagtacaa cagcctcggc 480
ttcaatgcag acacccttcc ggtgatgtca gtatccattg cggaagaaga agtcggaggc 540
atcggcaccg caaatattga gggccagctg gtggcgtggg actactacca aaccatcgac 600
accccagaaa acgagacctt cgtggagaat ttcaaggacc tctacggcca ggacaaagtg 660
acctccgacc cgatggaagc tgcttacact agcctctacc tctggaaaga aatggtagag 720
aaggccgatt cctttgatgt cgccgcaatt caagcagccg ccgacggaac cacttttgat 780
gcaccagaag gaaccgtggt ggttgacggc gataaccacc acatctccaa aacgccgcgc 840
atcggtcgaa tccgcccgga tggattgatc gacaccattt gggaaaccga ttccccagtt 900
gatccggacc catacctgtc ttcctatgac tgggccaaga ccaccgctgc aacttcctaa 960
ttcgtgggca ctctggtttg gttaccagga tgggttagtc attctgatca gcgaattcca 1020
cgttcacatc gccaattcca gagttcacaa ccagattcag cattggacct tctagatcag 1080
cattgtgggc ggtgagatct ccaacatcac agcgcgctgt gcccacaccg gcggtacaac 1140
ttaggctcac gggcacatca tcgggcaggg tgaccatgac ttcgccgatc cctgaggtga 1200
tttggatgtt ttgttcctga tccaattggg tgaggtggct gaaatcgagg ttcatttcac 1260
ccacgccaga ggtgtagctg ctgaggagtt catcgttggt ggggatgaga ttgacatcgc 1320
cgattccagg gtcgtcttca aagtagatgg gatcgatatt tgaaataaac aggcctgcga 1380
gggcgctcat gacaactccg gtaccaacta caccgccgac aatccatggc cacacatggc 1440
gctttttctg aggcttttgt ggagggactt gtacatccca ggtgttgtat tggttttggg 1500
caagtggatc ccaatgaggc gcttcggggg tttgttgcgc gaagggtgca tagtagccct 1560
caacgggggt gatagtgctt agatctggtt ggggttgtgg gtagagatct tcgtttttca 1620
tggtggcatc ctcagaaaca gtgaattcag tggtgagtag tccgcggggt ggaagtggtt 1680
gtttcttatg caacgcccac cacatggcta aaaggcaaag gtaagtaatg gctgctgctg 1740
ggccgaatat 1750
<210> 13
<211> 1570
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gcttgcatgc ctgcaggtcg actctagagg atccccgggt attaagaata gcgggttgtg 60
ggcgctgggc catagtcgcc ccagctcagc gaagttgtac gccggcgttg cctgcttgtc 120
gacgtttttt gccacttccc ttaattcggg ggtggctgaa atgtaagaca cgtcactaca 180
tttaagctca aaaacaacta cctataggct gacagaaact ctaaaaacta tagagctata 240
gaaaccttaa cttcggaggt atccatgtcc cgtccaatcg ttaaacaagc attcaccgtc 300
accgccgtca ccgcgatggc ttttgccctg gcatcatgca cccgcgcagt ggatgcaacc 360
tccgcaggtg gaaccgcgag caacaccgca gcttcctgtg tggatacatc cggcgactcc 420
atcaaaatcg gcttcatcaa ctccctgtcc ggcacgatgg ctatctctga aaccacggtg 480
aaccaatccc tgcacatggc agccgatgaa atcaacgcag ccggcggcgt tttgggcaag 540
cagttggaga tctctgaaga agacggcgcc agcgaacccg ccaccttcgc cgagcgctcc 600
caacgcctca tccagcagga atgcgttgca gccgtgtttg gtggatggac ctccgcctcc 660
cgcaaagcaa tgctccccgt ctttgagggc aataactccc tgctgttcta cccggtgcag 720
tacgagggca tggaatcctc gccgaatatt ttctacaccg gtgccaccac caaccagcag 780
atcatcccgg ctcttgatta cctgcgtgaa aacggcctga accgcctttt ccttgtcggt 840
tccgattatg ttttcccacg cactgcaaat tccatcatca aggactacgc cgaagccaat 900
ggtatggaaa tcgtcggcga agactacgcg ccgttgggat ccaccgactt caccaccatc 960
gccaaccgca tgcgtgactc caacgcagat gccgtgttca acactttgaa tggcgattcc 1020
aacgtggcgt tcttccgcca gtacaacagc ctcggcttca atgcagacac ccttccggtg 1080
atgtcagtat ccattgcgga agaagaagtc ggaggcatcg gcaccgcaaa tattgagggc 1140
cagctggtgg cgtgggacta ctaccaaacc atcgacaccc cagaaaacga gaccttcgtg 1200
gagaatttca aggacctcta cggccaggac aaagtgacct ccgacccgat ggaagctgct 1260
tacactagcc tctacctctg gaaagaaatg gtagagaagg ccgattcctt tgatgtcgcc 1320
gcaattcaag cagccgccga cggaaccact tttgatgcac cagaaggaac cgtggtggtt 1380
gacggcgata accaccacat ctccaaaacg ccgcgcatcg gtcgaatccg cccggatgga 1440
ttgatcgaca ccatttggga aaccgattcc ccagttgatc cggacccata cctgtcttcc 1500
tatgactggg ccaagaccac cgctgcaact tcctaagttt tggcggatga gagaagattt 1560
tcagcctgat 1570
<210> 14
<211> 1570
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gcttgcatgc ctgcaggtcg actctagagg atccccgggt attaagaata gcgggttgtg 60
ggcgctgggc catagtcgcc ccagctcagc gaagttgtac gccggcgttg cctgcttgtc 120
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tttaagctca aaaacaacta cctataggct gacagaaact ctaaaaacta tagagctata 240
gaaaccttaa cttcggaggt atccatgtcc cgtccaatcg ttaaacaagc attcaccgtc 300
accgccgtca ccgcgatggc tttttgcctg gcatcatgca cccgcgcagt ggatgcaacc 360
tccgcaggtg gaaccgcgag caacaccgca gcttcctgtg tggatacatc cggcgactcc 420
atcaaaatcg gcttcatcaa ctccctgtcc ggcacgatgg ctatctctga aaccacggtg 480
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caacgcctca tccagcagga atgcgttgca gccgtgtttg gtggatggac ctccgcctcc 660
cacaaagcaa tgctccccgt ctttgagggc aataactccc tgctgttcta cccggtgcag 720
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ggtatggaaa tcgtcggcga agactacgcg ccgttgggat ccaccgactt caccaccatc 960
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cagctggtgg cgtgggacta ctaccaaacc atcgacaccc cagaaaacga gaccttcgtg 1200
gagaatttca aggacctcta cggccaggac aaagtgacct ccgacccgat ggaagctgct 1260
tacactagcc tctacctctg gaaagaaatg gtagagaagg ccgattcctt tgatgtcgcc 1320
gcaattcaag cagccgccga cggaaccact tttgatgcac cagaaggaac cgtggtggtt 1380
gacggcgata accaccacat ctccaaaacg ccgcgcatcg gtcgaatccg cccggatgga 1440
ttgatcgaca ccatttggga aaccgattcc ccagttgatc cggacccata cctgtcttcc 1500
tatgactggg ccaagaccac cgctgcaact tcctaagttt tggcggatga gagaagattt 1560
tcagcctgat 1570
<210> 15
<211> 1609
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
agcggataac aatttcacac aggaaacaga attaattaag cttgcatgcc tgcaggtcga 60
ctctagagga tccccgggta ttaagaatag cgggttgtgg gcgctgggcc atagtcgccc 120
cagctcagcg aagttgtacg ccggcgttgc ctgcttgtcg acgttttttg ccacttccct 180
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ctataggctg acagaaactc taaaaactat agagctatag aaaccttaac ttcggaggta 300
tccatgtccc gtccaatcgt taaacaagca ttcaccgtca ccgccgtcac cgcgatggct 360
tttgccctgg catcatgcac ccgcgcagtg gatgcaacct ccgcaggtgg aaccgcgagc 420
aacaccgcag cttcctgtgt ggatacatcc ggcgactcca tcaaaatcgg cttcatcaac 480
tccctgtccg gcacgatggc tatctctgaa accacggtga accaatccct gcacatggca 540
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gactacgcgc cgttgggatc caccgacttc accaccatcg ccaaccgcat gcgtgactcc 1020
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tacaacagcc tcggcttcaa tgcagacacc cttccggtga tgtcagtatc cattgcggaa 1140
gaagaagtcg gaggcatcgg caccgcaaat attgagggcc agctggtggc gtgggactac 1200
taccaaacca tcgacacccc agaaaacgag accttcgtgg agaatttcaa ggacctctac 1260
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<211> 1562
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
cagtgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctagtttg acgatttcgt cgacgagctc 60
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ggctttgcag acgcggaaga gctggagggt ttggggttcg aggcctttgg cggcgtcgat 180
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gtactcgaat tggagtgcgg aggaggcgat ggagattccg cggtcttttt ccatttccat 360
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gaagttgtac gccggcgttg cctgcttgtc gacgtttttt gccacttccc ttaattcggg 660
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gacagaaact ctaaaaacta tagagctata gaaaccttaa cttcggaggt atccgagata 780
aaaatcatgg acattttact caatcagctc gtagccgggc tttcagttgg atcggtcctt 840
ctattggtcg cagtgggatt gtcactgacc tttggacaga tgggcgttat taatatggcg 900
cacggagagt tcatcatggt cggcgcatac accgcatatg tggtgcagct ggtcgtcggt 960
tctgccggtt tatccctact gatcagcatt ccgctggcct ttattatcgg tgggcttttc 1020
ggagttctcc tcgaacaatt cctgctgaag tatctttatc acaggccact agacacgctg 1080
ctggccacat tcggtgtcgg tttgatcctt cagcagctgg cccgaaacat tttcggagct 1140
cccgcagtgg atgtcagggc accggaattt ctccgcggaa acgtcgaagt tctaggcgtc 1200
ttggtgccga ccgcgcgact attcatcctg gtgctggcca tcgcatcagt gactgcacta 1260
gctgtgttcc taaatcgcac tgcctggggc cgacgcatcc gcgccgtggt tctgaaccgc 1320
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accatcggtc agaactacat cgtggatgcc ttccttgttg ttgccgccgg tggcatcggc 1500
cgggtgaagg gcgctgtgat catggggtac cgagctcgaa ttcgtaatca tggtcatagc 1560
tg 1562

Claims (10)

1.蛋白质，其特征在于，所述蛋白质为下述任一种：
A1)氨基酸序列是序列4所示的蛋白质；
A2)将A1)的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有调控L谷氨酸生物合成能力的蛋白质；
A3)在A1)或A2)的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。
2.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于，A2)所述蛋白质为氨基酸序列是序列2所示的蛋白质。
3.与权利要求1或2所述蛋白质相关的生物材料，其特征在于，所述生物材料为下述任一种：
F1)、编码所述蛋白质的核酸分子；
F2)、含有F1)所述核酸分子的表达盒；
F3)、含有F1)所述核酸分子的重组载体、或含有F2)所述表达盒的重组载体；
F4)、含有F1)所述核酸分子的重组微生物、或含有F2)所述表达盒的重组微生物、或含有F3)所述重组载体的重组微生物。
4.应用，其特征在于，所述应用为下述任一种：
C1)权利要求1或2所述的蛋白质或调控所述蛋白质的活性或含量的物质在调控微生物L-谷氨酸的产量中的应用；
C2)权利要求1或2所述的蛋白质或调控所述蛋白质的活性或含量的物质在制备调控微生物L-谷氨酸的产量产品中的应用；
C3)权利要求1或2所述的蛋白质或调控所述蛋白质的活性或含量的物质在构建产L-谷氨酸的重组微生物中的应用。
5.一种构建重组微生物的方法，其特征在于，所述方法包括上调或增强或提高目的微生物中所述蛋白质的编码基因的表达量，得到重组微生物。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述上调或增强或提高目的微生物中所述蛋白质的编码基因的表达量为下述任一种：
E1)向所述目的微生物中导入权利要求1或2所述蛋白质的编码基因；
E2)将所述目的微生物中编码权利要求1所述所述蛋白质的编码基因进行突变，所述突变为将SEQ ID No.1所示DNA分子编码的氨基酸序列的第21位的丙氨酸残基突变为半胱氨酸残基。
7.一种提高微生物L-谷氨酸产量的方法，其特征在于，所述方法包括向微生物中导入权利要求1或2所述的蛋白质的编码基因，以提高所述微生物的L-谷氨酸的产量。
8.一种生产L-谷氨酸的方法，其特征在于，所述方法包括利用权利要求3中所述的任一重组微生物生产L-谷氨酸。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法包括培养所述重组微生物，得到发酵产物，从所述发酵产物中纯化得到L-谷氨酸的步骤。
10.如权利要求3所述的生物材料、权利要求4所述的应用、权利要求5-9所述的方法，其特征在于，所述微生物为如下任一种：
C1)细菌界；
C2)放线菌纲；
C3)棒状杆菌属，
C4)谷氨酸棒状杆菌。
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