CN116096908A - 发酵制备胍基乙酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物，所述微生物用L‑精氨酸:甘氨酸脒基转移酶和还原的苹果酸合酶以及乙醛酸氨基转移酶转化以能够制备胍基乙酸(GAA)，和涉及使用此类微生物用于GAA的发酵制备的方法。本发明还涉及用于肌酸的发酵制备的方法。
Description
技术领域
本发明涉及被转化以能够制备胍基乙酸(GAA)的微生物，和涉及使用此类微生物用于GAA的发酵制备的方法。本发明还涉及用于肌酸的发酵制备的方法。
背景技术
GAA是用作动物饲料添加剂的有机化合物(US 2011257075 A1)。GAA是肌酸的天然前体(例如Humm et al.,Biochem.J.(1997)322,771-776)。因此，GAA的补充允许在生物体中的肌酸的最佳供应。
本发明涉及通过发酵方法使用工业原料(例如含氨、铵盐和葡萄糖或糖类的基质)作为起始材料制备GAA的方法。在生物系统中，GAA和L-鸟氨酸由精氨酸和甘氨酸作为起始材料通过L-精氨酸:甘氨酸-脒基转移酶(AGAT；EC 2.1.4.1)的催化作用而形成，这是在肌酸生物合成中的第一步：
L-精氨酸+甘氨酸 AGAT ＞L-鸟氨酸+GAA
Guthmiller等人(J Biol Chem.1994Jul 1；269(26):17556-60)通过克隆和在大肠杆菌(Escherichia coli)(E.coli)中异源表达该酶，已表征了大鼠肾脏AGAT。Muenchhoff等人(FEBS Journal 277(2010)3844–3860)报道来自原核生物的AGAT的首次表征，这也是通过克隆和在大肠杆菌中异源表达该酶。Sosio等人(Cell Chemical Biology25,540–549,May 17,2018)说明了在链霉菌属的某一未知物种(Streptomyces sp.)中的pseudouridimycin的生物合成途径。他们将通过L-精氨酸与甘氨酸的反应形成GAA和L-鸟氨酸描述为中间反应，该反应通过PumN，即一种L-精氨酸:甘氨酸-脒基转移酶(AGAT)催化。
从文献中还已知几种用于在微生物特别是细菌中增大在GAA合成中的起始材料之一即L-精氨酸的产量的方法。Park等人(NATURE COMMUNICATIONS|DOI:10.1038/ncomms5618)提供用于L-精氨酸制备的谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)(C.glutamicum)的代谢工程的综述。他们提出对已制备L-精氨酸的谷氨酸棒状杆菌菌株例如ATCC 21831的L-精氨酸生产菌株(producer)的随机诱变和筛选(NakayamaandYoshida1974,US3849250 A)，并且基于代谢全系统分析的逐步合理的代谢工程化产生在整个菌株工程步骤中L-精氨酸产量的逐渐增大。Yim等人(J Ind Microbiol Biotechnol(2011)38:1911–1920)可显示出，通过破坏在谷氨酸棒状杆菌中的染色体argR基因，argR，即编码控制L-精氨酸生物合成途径的中心阻遏蛋白ArgR的基因的失活，实现改善的制备精氨酸的菌株。Ginesy等人(Microbial Cell Factories(2015)14:29)报道大肠杆菌的成功工程化，以用于提高的精氨酸的产量。其中，他们提出了argR阻遏基因的缺失。
Suga等人(US20070031946 A1)已报道了使用基因重组菌株的方法，其中使抑制精氨酸-生物合成的操纵子的表达的基因argR失活。特别地，控制精氨酸操纵子的argR的缺失已被认为是精氨酸制备中的重要因素。
Fan Wenchao公开通过非致病性微生物例如谷氨酸棒状杆菌的发酵制备肌酸的方法(CN106065411 A)。该微生物具有以下生物转化功能：将葡萄糖转化为L-谷氨酸；L-谷氨酸至N-乙酰基-L-谷氨酸的转化；N-乙酰基-L-谷氨酸至N-乙酰基-L-谷氨酸半醛的转化；N-乙酰基-L-谷氨酸半醛至N-乙酰基-L-鸟氨酸的转化；N-乙酰基-L-鸟氨酸至L-鸟氨酸的转化；L-鸟氨酸至L-瓜氨酸的转化；L-瓜氨酸至精氨基-琥珀酸的转化；精氨基-琥珀酸至L-精氨酸的转化；L-精氨酸至胍基乙酸的转化；和最后地，胍基乙酸至肌酸的转化。Fan Wenchao提出微生物过表达一种或多种选自以下的酶：N-乙酰谷氨酸-合酶、N-乙酰鸟氨酸-δ-氨基转移酶、N-乙酰鸟氨酸酶、鸟氨酸-氨甲酰基转移酶、精氨基琥珀酸合成酶、甘氨酸脒基-转移酶(EC:2.1.4.1)和胍基乙酸N-甲基转移酶(EC:2.1.1.2)。微生物优选地过表达甘氨酸脒基转移酶(L-精氨酸:甘氨酸脒基转移酶)和胍基乙酸N-甲基转移酶。
至于GAA生物合成的第二种起始材料，理想的会是增大甘氨酸的供应，以便于改善在微生物中的GAA生物合成，该微生物天然地提供有编码具有L-精氨酸:甘氨酸脒基转移酶(AGAT)功能的蛋白质的同源基因，或已经提供有编码具有L-精氨酸:甘氨酸脒基转移酶(AGAT)功能的蛋白质的异源基因。
所谓的乙醛酸分流途径，天然地存在于微生物例如大肠杆菌或谷氨酸棒状杆菌中，是三羧酸(TCA)循环(克雷布斯循环(Krebs cycle))的副反应，并包括通过异柠檬酸裂合酶由异柠檬酸形成乙醛酸(glyoxylate)和琥珀酸，和通过苹果酸合酶由乙醛酸和乙酰辅酶A形成苹果酸(
et al.,Applied Microbiology and Biotechnology(2019)103:2525–2535)。
在氨基酸供体例如氨基酸，和乙醛酸转氨酶的存在下，乙醛酸可用作用于甘氨酸的形成的起始材料。
为了改善在谷氨酸棒状杆菌中的乙醇酸的产量，Zahoor等人(Journal ofBiotechnology 192(2014)366–375)尤其通过苹果酸合酶基因aceB的缺失实现了乙醛酸前体的供应的增大。
乙醛酸转氨酶催化氨基从氨基酸至乙醛酸的转移。此类转移的产物是甘氨酸和相应的α-酮酸。几种乙醛酸氨基转移酶是已知的，并且它们相对于氨基供体的底物特异性不同(参见例如Kameya et al.FEBS Journal 277(2010)1876-1885；Liepman and Olsen,Plant Physiol.Vol.131,2003,215-227；Sakuraba et al.,JOURNAL OF BACTERIOLOGY,Aug.2004,p.5513-5518；Takada and Noguchi,Biochem.J.(1985)231,157-163)。由于此类乙醛酸氨基转移酶中的大多数能够使用不同的氨基酸作为氨基供体，因此它们通常用不同的EC编号来注释。然而，所有此类转氨酶的共同点在于它们使用乙醛酸作为受体分子，或在逆反应的情况下，使用甘氨酸作为供体分子。
具有乙醛酸氨基转移酶功能的蛋白质的实例如下：
甘氨酸转氨酶(EC 2.6.1.4)催化反应：L-谷氨酸+乙醛酸<＝＞α-酮戊二酸+甘氨酸。
甘氨酸:草酰乙酸转氨酶(EC 2.6.1.35)催化反应：L-天冬氨酸+乙醛酸<＝>草酰乙酸+甘氨酸。
丙氨酸:乙醛酸转氨酶(EC 2.6.1.44)催化反应：L-丙氨酸+乙醛酸<＝>丙酮酸+甘氨酸。
丝氨酸:乙醛酸转氨酶(EC 2.6.1.45)催化反应：L-丝氨酸+乙醛酸<＝>3-羟基-丙酮酸+甘氨酸。
甲硫氨酸:乙醛酸转氨酶(EC 2.6.1.73)催化反应：L-甲硫氨酸+乙醛酸<＝>4-(甲硫基(methylsulfanyl))-2-酮基-丁酸(butanoate)+甘氨酸。
芳族氨基酸:乙醛酸转氨酶(EC 2.6.1.60)催化反应：芳族氨基酸+乙醛酸<＝>芳族酮基-酸+甘氨酸。
犬尿氨酸:乙醛酸转氨酶(EC 2.6.1.63)催化反应：犬尿氨酸+乙醛酸<＝>4-(2-氨基苯基)-2,4-二酮基-丁酸+甘氨酸。
(S)-脲基甘氨酸:乙醛酸转氨酶(EC 2.6.1.112)催化反应：(S)-脲基-甘氨酸+乙醛酸<＝<N-氨甲酰基-2-酮基-甘氨酸+甘氨酸。
本发明要解决的问题是提供被转化以能够制备胍基乙酸(GAA)的微生物，特别是具有改善的提供甘氨酸作为GAA生物合成的起始材料的能力的微生物，和使用此类微生物用于GAA的发酵制备的方法。
发明内容
该问题通过这样的微生物来解决，所述微生物包含至少一种编码具有L-精氨酸:甘氨酸脒基转移酶功能的蛋白质的基因，和其中，与在野生型微生物中的相应活性相比，具有苹果酸合酶功能的蛋白质的活性减小。
通过将具有苹果酸合酶功能的蛋白质突变至与野生型蛋白质相比具有更小酶活性的蛋白质，通过与在野生型微生物中的相应基因的表达相比减弱编码具有苹果酸合酶功能的酶的基因的表达，通过减小翻译的效率例如通过将ATG起始密码子改变至GTG，通过将二级结构引入至mRNA的5’非翻译区，或通过减弱密码子使用，或通过缺失编码具有苹果酸合酶功能的酶的基因，可减小具有苹果酸合酶功能的蛋白质的活性。
优选地，在根据本发明的微生物中，与在野生型微生物中的相应基因的表达相比，编码具有苹果酸合酶功能的蛋白质的基因的表达减弱，或编码具有苹果酸合酶功能的蛋白质的基因缺失。
在本发明的一个另外的实施方案中，与在野生型微生物中的相应酶活性相比，本发明的微生物另外包含增大的具有乙醛酸氨基转移酶功能的酶的活性。
根据本发明的微生物优选地包含至少一种编码具有乙醛酸氨基转移酶的酶活性的蛋白质的基因。
在本发明的微生物中，至少一种编码具有乙醛酸氨基转移酶的酶活性的蛋白质的基因是同源的或异源的。
在本发明的另外一个实施方案中，在本发明的微生物中，至少一种编码具有乙醛酸氨基转移酶的酶活性的蛋白质的基因是过表达的。
优选地，与野生型微生物的制备L-精氨酸的能力相比，本发明的微生物具有增大的制备L-精氨酸的能力。
具体实施方式
在本发明的上下文中，具有增大的制备L-精氨酸的能力的微生物是指制备超过它自身需要的L-精氨酸的微生物。此类制备L-精氨酸的微生物的实例为例如谷氨酸棒状杆菌ATCC 21831或由Park等人(NATURE COMMUNICATIONS|DOI:10.1038/ncomms5618)公开的那些或由Ginesy等人(Microbial Cell Factories(2015)14:29)公开的那些。
在本发明的一个具体实施方案中，与在野生型微生物中的相应酶活性相比，该微生物具有增大的具有氨甲酰基磷酸合酶(EC 6.3.4.16)功能的酶的活性。
与在野生型微生物中的相应酶活性相比，在根据本发明的微生物中的具有精氨基琥珀酸裂合酶(E.C.4.3.2.1)功能的酶的活性可增大。
此外，与在野生型微生物中的相应酶活性相比，在根据本发明的微生物中，具有鸟氨酸氨甲酰基转移酶(EC 2.1.3.3)功能的酶的活性可增大。
与在野生型微生物中的相应酶活性相比，在根据本发明的微生物中，具有精氨基琥珀酸合成酶(E.C.6.3.4.5)功能的酶的活性也可增大。
例如通过相应的内源基因的突变，可以实现在微生物中的增大的酶活性。增大酶活性的另外方式可以是稳定化编码酶的mRNA。通过过表达编码各自酶的基因，也可实现上述酶的增大的活性。
根据本发明的微生物优选地还包含至少一种或多种过表达的基因，所述至少一种或多种过表达的基因选自：编码具有鸟氨酸氨甲酰基转移酶(EC2.1.3.3)功能的蛋白质的基因(例如argF/argF2/argI)、编码具有精氨基琥珀酸合成酶(E.C.6.3.4.5)功能的蛋白质的基因(例如argG)和编码具有精氨基琥珀酸裂合酶(E.C.4.3.2.1)功能的蛋白质的基因(例如argH)。
另外，在根据本发明的微生物中，精氨酸操纵子(argCJBDFR)可以是过表达的。
可替换地，在根据本发明的微生物中，编码精氨酸响应性阻遏蛋白ArgR的argR基因可减弱或缺失。
在本发明的另外一个实施方案中，并且任选地除了上述修饰之外，还在根据本发明的微生物中过表达至少一种或多种编码L-精氨酸的生物合成途径的酶的基因，所述基因包括分别编码谷氨酸脱氢酶、鸟氨酸乙酰基转移酶(ornithine acetyltransferase)、乙酰谷氨酸激酶、乙酰谷氨酰磷酸还原酶和乙酰鸟氨酸氨基转移酶的gdh、argJ、argB、argC和/或argD。
表1示出涉及或促进在不同物种，即大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌和恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)(P.putida)中的精氨酸生物合成的酶的不同名称。
通常，基因的过表达通过增大该基因的拷贝数，和/或通过将该基因与强启动子功能性连接，和/或通过增强核糖体结合位点，和/或通过起始密码子的密码子使用优化或整个基因的密码子使用优化或包括上述所有方法中的选择的组合或上述所有方法的组合来实现。
在本发明的微生物的另外一个实施方案中，编码具有L-精氨酸:甘氨酸脒基转移酶功能的蛋白质的基因是异源的。
异源基因是指该基因已被插入至天然不具有该基因的宿主生物中。在宿主中的异源基因的插入通过重组DNA技术来进行。已经经历重组DNA技术的微生物被称为转基因的、遗传修饰的或重组的。
异源蛋白质是指不是天然存在于微生物中的蛋白质。
同源或内源基因是指包含它的功能本身的基因或该基因的核苷酸序列在微生物中天然地存在或在微生物中是“天然的”。
同源或天然蛋白质是指在微生物中天然存在的蛋白质。
具有L-精氨酸:甘氨酸脒基转移酶(AGAT)功能的蛋白质属于脒基转移酶家族。脒基转移酶家族包含甘氨酸(EC:2.1.4.1)脒基转移酶和肌醇胺(EC:2.1.4.2)脒基转移酶，即分别涉及肌酸和链霉素生物合成的酶。该家族还包括精氨酸脱亚胺酶，EC:3.5.3.6。此类酶催化以下反应：精氨酸+H2O<＝>瓜氨酸+NH3。在该家族中还发现了链球菌抗肿瘤糖蛋白。具有L-精氨酸:甘氨酸-脒基转移酶(AGAT)活性的酶或蛋白质也被描述为具有属于PFAM家族的保守结构域(conserved domain)：Amidinotransf(PF02274)(:Marchler-Bauer Aet al.(2017),"CDD/SPARCLE:functional classification of proteins via subfamilydomain architectures.",Nucleic Acids Res.45(D1):D200-D203.)，也如以下出版物中所述：Pissowotzki K et al.,Mol Gen Genet 1991；231:113-123(PUBMED:1661369EPMC:1661369)；D'Hooghe I et al.,J Bacteriol1997；179:7403-7409(PUBMED:9393705EPMC:9393705)；Kanaoka M et al.,Jpn J Cancer Res 1987；78:1409-1414(PUBMED:3123442EPMC:3123442)。
在本发明的微生物中，编码具有L-精氨酸:甘氨酸脒基转移酶功能的蛋白质的基因可进一步过表达。通常，基因的过表达通过增大该基因的拷贝数，和/或通过将该基因与强启动子功能性连接，和/或通过增强核糖体结合位点，和/或通过起始密码子的密码子使用优化或整个基因的密码子使用优化或包括上述所有方法中的选择的组合或上述所有方法的组合来实现。
在本发明的微生物中的具有L-精氨酸:甘氨酸脒基转移酶功能的蛋白质可包含与根据SEQ ID NO:11的氨基酸序列至少80％同源的，优选地至少90％同源的氨基酸序列。在本发明的一个另外的实施方案中，L-精氨酸:甘氨酸脒基转移酶的氨基酸序列与根据SEQID NO:11的氨基酸序列相同。
在本发明的一个具体实施方案中，在根据本发明的微生物中具有乙醛酸氨基转移酶的酶活性的蛋白质包含与根据SEQ ID NO:2、根据SEQ IDNO:5或根据SEQ ID:8的氨基酸序列至少80％同源的氨基酸序列。
本发明的微生物可属于棒状杆菌(Corynebacterium)属，优选地谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)，或属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)属，优选地大肠杆菌(E.coli)，或属于假单胞菌(Pseudomonas)属，优选地恶臭假单胞菌(P.putida)。
与在野生型微生物中的相应活性相比，在微生物中，特别是在本发明的微生物中的蛋白质的增大的酶活性，可以例如通过该蛋白质的突变，特别是通过将反馈抗性例如针对酶-催化反应的产物的反馈抗性赋予该蛋白质的突变，或通过与在野生型微生物中的相应基因的表达相比编码具有该酶活性的该蛋白质的基因的增加的表达来实现。
与在野生型微生物中的相应活性相比，在微生物中，特别是在本发明的微生物中的基因的增加的表达或过表达，可以通过增大该基因的拷贝数，和/或通过调节因子的增强例如通过将该基因与强启动子功能性连接，和/或通过增强核糖体结合位点，和/或通过起始密码子的密码子使用优化或该整个基因的密码子使用优化来实现。此类积极影响基因表达的调节因子的增强，可以例如通过修饰结构基因上游处的启动子序列以便于增大该启动子的有效性，或通过用更有效的或所谓的强启动子完全替换所述启动子来实现。启动子位于该基因的上游处。启动子是由约40至50个碱基对组成的DNA序列，并且它构成RNA聚合酶全酶的结合位点和转录起始点，由此可以影响受控的多核苷酸或基因的表达强度。通常，通过选择强启动子，例如通过用强的天然的(最初分配给其它基因)启动子替换原始启动子，或通过将给定的天然的启动子的某些区域(例如它的所谓的-10和-35区域)修饰朝向共有序列，例如由M.Patek等人(Microbial Biotechnology 6(2013),103-117)对于谷氨酸棒状杆菌所教导的，可实现在细菌中的基因的过表达或表达的增加。“强”启动子的实例为超氧化物歧化酶(sod)启动子(“Psod”；Z.Wang et al.,Eng.Life Sci.2015,15,73–82)。“功能性连接”应理解为是指启动子与基因的顺序排列(sequential arrangement)，这引起该基因的转录。
遗传密码是简并的，这意味着某些氨基酸可由许多不同的三联体来编码。术语“密码子使用”是指这样的观察，某种生物通常不会以相同的频率使用某种氨基酸的每个可能的密码子。相反，生物通常会对特定的密码子表现出某些偏好，这意味着此类密码子在生物的转录基因的编码序列中更频繁地被发现。如果对未来宿主来说是外来的某种基因，即来自不同物种的某种基因应该在该未来宿主生物中表达，则应将所述基因的编码序列调整至所述未来宿主生物的密码子使用(即密码子使用优化)。
上述问题另外通过用于胍基乙酸(GAA)的发酵制备的方法来解决，该方法包含以下步骤：a)在合适的条件下在合适的培养基中培养如上限定的根据本发明的微生物，和b)积累在所述培养基中的GAA以形成含GAA的发酵液。
本发明的方法可另外包括从所述发酵液中分离GAA的步骤。
根据本发明的方法可另外包括将所述含GAA的发酵液干燥和/或造粒的步骤。
本发明另外涉及如上限定的微生物，所述微生物另外包含编码具有胍基乙酸N-甲基转移酶(EC:2.1.1.2)的活性的酶的基因。优选地，所述编码具有胍基乙酸N-甲基转移酶的活性的酶的基因是过表达的。
本发明还涉及用于肌酸的发酵制备的方法，所述方法包括以下步骤：a)在合适的条件下在合适的培养基中培养包含编码具有胍基乙酸N-甲基转移酶活性的酶的基因的根据本发明的微生物，和b)积累在所述培养基中肌酸以形成含肌酸的发酵液。
优选地，所述方法另外包括从所述含肌酸的发酵液中分离肌酸。肌酸可通过等电点法和/或离子交换法从发酵液中提取。可替代地，肌酸可以通过在水中的重结晶的方法来进一步纯化。
实验部分
A)材料和方法
化学品
来自卡那霉素链霉菌(Streptomyces kanamyceticus)的卡那霉素溶液购自SigmaAldrich(美国圣路易斯，Cat.no.K0254)。IPTG(异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷)(Isopropylβ-D-l-thiogalactopyranoside)购自Carl-Roth(Karlsruhe，德国，Cat.no.2316.4.)。如果未另行说明，则所有其它化学品均购自默克(Darmstadt，德国)、Sigma Aldrich(美国圣路易斯)或Carl-Roth(Karlsruhe，德国)，分析纯。
用于细胞增殖的培养
如果未另行说明，则培养/孵育程序在本文中如下进行：
a.使用来自默克的LB肉汤(MILLER)(Darmstadt，德国，Cat.no.110285)以在液体培养基中培养大肠杆菌菌株。将液体培养物(10ml的液体培养基/具有3个挡板的100ml锥形瓶)在来自Infors GmbH(Bottmingen，瑞士)的Infors HT Multitron标准孵育摇床中在30℃和200rpm下孵育。
b.使用来自默克的LB琼脂(MILLER)(Darmstadt，德国，Cat.no.110283)用于在琼脂平板上的大肠杆菌菌株的培养。将该琼脂平板在来自VWR(Radnor，美国)的
微型培养箱中在30℃下孵育。
c.使用来自默克的脑心浸液肉汤(BHI)(Darmstadt，德国，Cat.no.110493)以在液体培养基中培养谷氨酸棒状杆菌菌株。将液体培养物(10ml液体培养基/具有3个挡板的100ml锥形瓶)在来自Infors GmbH(Bottmingen，瑞士)的Infors HT Multitron标准孵育摇床中在30℃和200rpm下孵育。
d.使用来自默克的脑心浸液琼脂(Brain heart agar)(BHI-琼脂)(Darmstadt，德国，Cat.no.113825)用于在琼脂平板上的谷氨酸棒状杆菌菌株的培养。将该琼脂平板在来自Heraeus Instruments的具有
温度控制器(Hanau，德国)的培养箱中在30℃下孵育。
e.为了在电穿孔后培养谷氨酸棒状杆菌，向BHI-琼脂(默克，Darmstadt，德国，Cat.no.113825)补充134g/l的山梨糖醇(Carl Roth GmbH+Co.KG，Karlsruhe，德国)，2.5g/l的酵母提取物(Oxoid/ThermoFisher Scientific，Waltham，美国，Cat.no.LP0021)和25mg/l的卡那霉素。将该琼脂平板在来自Heraeus Instruments的具有
温度控制器(Hanau,Germany)的培养箱中在30℃下孵育。
测定细菌悬液的光密度
a.使用来自Eppendorf AG(Hamburg，德国)的BioPhotometer，在600nm(OD600)下测定了在摇瓶培养物中的细菌悬液的光密度。
b.用来自Tecan Group AG(
瑞士)的GENiosTM孔板读数仪(platereader)，在660nm(OD660)下测定了在Wouter Duetz(WDS)微发酵系统(24-孔板)中产生的细菌悬液的光密度。
离心
a.使用Eppendorf 5417R台式离心机，在1.5ml或2ml反应管(例如
3810X)中将具有2ml的最大体积的细菌悬液离心(5分钟，13.000rpm)。
b.使用Eppendorf 5810R台式离心机，在15ml或50ml离心管(例如FalconTM 50mlConical Centrifuge Tubes)中将具有50ml的最大体积的细菌悬液在4.000rpm下离心10分钟。
DNA分离
根据制造商的使用说明，使用来自Qiagen的QIAprep Spin Miniprep Kit(Hilden，德国，Cat.No.27106)，从大肠杆菌细胞中分离了质粒DNA。
聚合酶链反应(PCR)
使用了具有校读(高保真)的聚合酶的PCR，以扩增所需的DNA片段用于桑格测序或DNA组装。使用了非校读的聚合酶试剂盒，以用于测定直接来自大肠杆菌或谷氨酸棒状杆菌菌落的所需DNA片段的存在或不存在。
a.根据制造商的使用说明(见表2)，使用了来自New England BioLabs Inc.的
高保真DNA聚合酶试剂盒(Phusion Kit)(Ipswich，美国，Cat.No.M0530)，以用于对选定的DNA区域的模板校正扩增(template-correct amplification)。
表2：用New England BioLabs Inc.的
高保真DNA聚合酶试剂盒的PCR的热循环条件
b.使用了来自Qiagen的Taq PCR Core Kit(Taq Kit)(Hilden，德国，Cat.No.201203)，以扩增所需的DNA片段以便于证实它的存在。根据制造商的使用说明，使用了该试剂盒(参见表3)。
表3：用来自Qiagen的Taq PCR Core Kit(Taq Kit)的PCR的热循环条件。
c.根据制造商的使用说明(见表4)，使用来自Takara Bio Inc的
Fast PCR Master Mix(Sapphire Mix)(Takara Bio Europe S.A.S.，Saint-Germain-en-Laye，法国，Cat.No.RR350A/B)作为替代品，以确认在取自大肠杆菌或谷氨酸棒状杆菌菌落的细胞中的所需DNA片段的存在。
表4：用来自Takara Bio Inc.的
Fast PCR Master Mix(SapphireMix)的PCR的热循环条件
d.所有低聚核苷酸引物由Eurofins Genomics GmbH(Ebersberg，德国)使用由McBride and Caruthers(1983)描述的亚磷酰胺法来合成。
e.作为PCR模板，使用了或者经分离的质粒DNA的适当稀释的溶液，或者从液体培养物中分离的总DNA或在细菌菌落中含有的总DNA(菌落PCR)的适当稀释的溶液。对于所述菌落PCR，通过用牙签从在琼脂平板上的菌落中取出细胞材料并将该细胞材料直接放至所述PCR反应管中，制备了模板。在来自SEVERIN
GmbH(Sundern，德国)的Mikrowave&Grill型微波炉中，以800W加热该细胞材料持续10秒，然后将PCR试剂添加至在所述PCR反应管中的模板中。
f.所有PCR反应在来自Eppendorf AG(Hamburg，德国)的Mastercycler或Mastercycler nexus梯度型的PCR循环仪中进行。
DNA的限制性酶消化
对于限制性酶消化(restriction enzyme digestion)，使用了或者“FastDigest限制性内切酶(FD)”(ThermoFisher Scientific，Waltham美国)或者来自New EnglandBioLabs Inc.(Ipswich，美国)的限制性内切酶。根据制造商手册的使用说明进行了反应。
测定DNA片段的尺寸
a.小DNA片段的尺寸(<1000bps)通常使用来自Qiagen(Hilden，德国)的QIAxcel通过自动毛细管电泳来测定。
b.如果需要分离DNA片段或如果DNA片段＞1000bps，则DNA通过TAE琼脂糖凝胶电泳来分离，并用
Nucleic Acid Gel Stain(Biotium,Inc.，Fremont，加拿大)来染色。经染色的DNA在302nm处可见。
PCR扩增产物和限制性片段的纯化
根据制造商的使用说明，使用来自Qiagen的QIAquick PCR Purification Kit(Hilden，德国；Cat.No.28106)，清理了PCR扩增产物(amplificate)和限制性片段。用30μl的10mM Tris*HCl(pH 8.5)洗脱了DNA。
测定DNA浓度
使用来自PEQLAB Biotechnologie GmbH的自2015VWR品牌开始的NanoDrop分光光度计ND-1000(Erlangen,Germany)，测量了DNA浓度。
组装克隆
使用购自New England BioLabs Inc.的“NEBuilder HiFi DNA AssemblyCloning Kit”(Ipswich,USA,Cat.No.E5520)，组装了质粒载体。将含有线性载体和至少一个DNA插入物的反应混合物在50℃下孵育60分钟。对于每次转化实验，使用了0.5μl的组装混合物。
大肠杆菌的化学转化
对于质粒克隆，根据制造商的方案转化了化学感受态的“
StableCompetent E.coli(High Efficiency)”(New England BioLabs Inc.，Ipswich，美国，Cat.No.C3040)。在补充有25mg/l的卡那霉素的LB琼脂上选择了成功转化的细胞。
谷氨酸棒状杆菌的转化
使用“Gene Pulser Xcell”(Bio-Rad Laboratories GmbH，Feldkirchen，德国)通过电穿孔，进行了用质粒-DNA对谷氨酸棒状杆菌的转化，如Ruan etal.(2015)所述。在1mm电穿孔比色皿(Bio-Rad Laboratories GmbH，Feldkirchen，德国)中，在1.8kV和设定至5ms的固定时间常数下，进行了电穿孔。在含有134g/l的山梨糖醇、2.5g/l的酵母提取物和25mg/l的卡那霉素的BHI-琼脂上，选择了转化的细胞。
确定核苷酸序列
DNA分子的核苷酸序列由Eurofins Genomics GmbH(Ebersberg，德国)通过循环测序，使用Sanger et al.(Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74,5463-5467,1977)的双脱氧链终止法来确定。使用了来自Scientific&EducationalSoftware(Denver,USA)的Clonemanager Professional9软件，以可视化和评估序列。
大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌菌株的甘油储备
为了大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌菌株的长期保存，制备了甘油储备(glycerolstock)。在补充有2g/l的葡萄糖的10ml的LB培养基中，培养了选定的大肠杆菌克隆。在补充有2g/l的葡萄糖的10ml的两倍浓缩的BHI培养基中，培养了选定的谷氨酸棒状杆菌克隆。用于生长含质粒的大肠杆菌菌株的培养基和用于生长含质粒的谷氨酸棒状杆菌菌株的培养基，补充有25mg/l的卡那霉素。将该所述培养基装在具有3个挡板的100ml锥形瓶中。用取自菌落的细胞的环对该培养基接种。然后，将培养物在30℃和200rpm下孵育18h。在所述孵育期后，将1.2ml的85％(v/v)无菌甘油加入至该培养物中。然后，将所得含甘油的细胞悬液等分成2ml部分，并在-80℃下储存。
在毫升规模培养中的GAA产量
根据Duetz(2007)的毫升规模培养系统用于评估所述菌株的GAAch含量。为此目的，使用了来自EnzyScreen BV的24深孔微板(24孔WDS板)(Heemstede，荷兰，Cat.no.CR1424))，每孔装有2.5ml培养基。
在10ml种子培养基(SM)中完成了所述菌株的预培养。将该培养基装在具有3个挡板的100ml锥形瓶中。用100μl的甘油储备培养物对该培养基接种，并将该培养物在30℃和200rpm下孵育24h。在表5中示出了该种子培养基(SM)的组成。
表5：种子培养基(SM)
| 组分 | 浓度(g/l) |
| 酵母提取物FM902(安琪酵母股份有限公司，中国湖北) | 10 |
| 尿素 | 1.5 |
| <![CDATA[KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>]]> | 0.5 |
| <![CDATA[K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>]]> | 0.5 |
| <![CDATA[MgSO<sub>4</sub>*7H<sub>2</sub>O]]> | 1 |
| 生物素 | 0.0001 |
| 盐酸硫胺素 | 0.0001 |
| <![CDATA[FeSO<sub>4</sub>*7H<sub>2</sub>O]]> | 0.01 |
| <![CDATA[MnSO<sub>4</sub>*H<sub>2</sub>O]]> | 0.01 |
| 葡萄糖 | 20 |
| 卡那霉素 | 0.025 |
| pH＝7.0 |
在所述孵育期后，测定了该预培养物的光密度OD600。从该预培养物中取样了体积，所述体积是对2.5ml的生产型培养基(PM)接种至0.1的OD600所需的，离心(在8000g下，1分钟)并弃去了上清液。然后，将细胞重悬于100μl的生产型培养基中。
通过用各自100μl的来自所述预培养物的所述重悬细胞对所述含2.4ml的生产型培养基(PM)的所述24孔WDS-板的孔接种，开始了主要培养。在表6示出该生产型培养基(PM)的组成。
表6：生产型培养基(PM)
| 组分 | 浓度(g/l) |
| 3-(N-吗啉基)丙磺酸(MOPS) | 40 |
| 酵母提取物FM902(安琪酵母股份有限公司，中国湖北) | 1.5 |
| <![CDATA[(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>]]> | 10 |
| <![CDATA[NH<sub>4</sub>Cl]]> | 15 |
| <![CDATA[柠檬酸三钠*2H<sub>2</sub>O]]> | 10 |
| 尿素 | 1 |
| <![CDATA[KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>]]> | 0.5 |
| <![CDATA[K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>]]> | 0.5 |
| 乙酸铵 | 7.7 |
| <![CDATA[MgSO<sub>4</sub>*7H<sub>2</sub>O]]> | 1 |
| 生物素 | 0.0001 |
| 盐酸硫胺素 | 0.0001 |
| <![CDATA[FeSO<sub>4</sub>*7H<sub>2</sub>O]]> | 0.01 |
| <![CDATA[MnSO<sub>4</sub>*H<sub>2</sub>O]]> | 0.01 |
| <![CDATA[ZnSO<sub>4</sub>*7H<sub>2</sub>O]]> | 0.000015 |
| <![CDATA[CuSO<sub>4</sub>*5H<sub>2</sub>O]]> | 0.0004 |
| Antifoam XFO-1501(Ivanhoe Industries Inc.，Zion，美国) | 0.5 |
| 葡萄糖 | 40 |
| IPTG(异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷) | 1mM |
| 卡那霉素 | 0.025 |
| pH＝7.2 |
在来自Infors GmbH的Infors HT Multitron标准孵育摇床(Bottmingen，瑞士)中，在30℃和300rpm下孵育了该主要培养物72h，直至葡萄糖的完全消耗。用来自LifeScan的OneTouch
血糖仪(Johnson&Johnson Medical GmbH，Neuss，德国)，分析了在该悬液中的葡萄糖浓度。
在培养后，将该培养物悬液转移至深孔微板中。适当稀释了该培养物悬液的一部分，以测量OD660。将该培养物的另一部分离心，并如下所述分析了在上清液中的GAA的浓度。
酵母蛋白胨FM902中的L-精氨酸和甘氨酸含量的测定
由于酵母提取物FM902(安琪酵母股份有限公司，中国湖北)含有各种肽和氨基酸，如下测量了它的L-精氨酸和甘氨酸的含量。
为了测量游离氨基酸，通过将1g的酵母提取物溶解在20ml的水中，制备了样品。用水将该溶液填充至25ml的总体积，充分混合并使用0.2μM尼龙注射器过滤器过滤。
为了测量总氨基酸(游离氨基酸加结合在肽中的氨基酸)，通过将1g的酵母提取物溶解在10ml 6M HCl中并将它们在110℃下孵育24h，制备了样品。然后，加水至25ml的总体积。将该溶液充分混合并使用0.2μM尼龙注射器过滤器过滤。
使用来自SYKAM Vertriebs GmbH的SYKAM S433氨基酸分析仪(Fürstenfeldbruck，德国)通过离子交换色谱法，测定了在所述样品中的L-精氨酸和甘氨酸的浓度。使用了来自SYKAM的具有球形的基于聚苯乙烯的阳离子交换剂(Peek LCA N04/Na，尺寸150x 4.6mm)的柱子作为固相。取决于L-氨基酸，在使用缓冲液A和缓冲液B的混合物的等度洗脱运行中，或通过使用所述缓冲液的梯度洗脱，进行分离。含有263g的柠檬酸三钠，120g的柠檬酸，1100ml的甲醇，100ml的37％HCl和2ml的辛酸的20l的水溶液(最终pH 3.5)用作缓冲液A。含有392g的柠檬酸三钠，100g的硼酸和2ml的辛酸的20l的水溶液(最终pH10.2)用作缓冲液B。游离氨基酸用茚三酮通过柱后衍生化来染色，并在570nm处进行光度检测。
表7显示出在酵母提取物FM902(安琪酵母股份有限公司，中国湖北)中测定的游离的和总的L-精氨酸和甘氨酸的含量，以及得到的在生产型培养基(PM)中的量。
表7：在酵母提取物(YE)FM902中的L-精氨酸和甘氨酸的含量和得到的在含1.5g/l的YE的生产型培养基(PM)中的浓度
GAA的定量
用来自Agilent的分析系统分析了所述样品，该分析系统由HPLC“Infinity 1260”联用质谱仪“Triple Quad 6420”组成(Agilent Technologies Inc.，SantaClara，美国)。在Atlantis HILIC Silica柱，4,6X250 mm，5μm(Waters Corporation，Milford，美国)上，在35℃下完成了色谱分离。流动相A为含10mM的甲酸铵和0.2％的甲酸的水。流动相B为90％的乙腈和10％的水的混合物，将10mM的甲酸铵加入至该混合物中。该HPLC系统用100％的B开始，随后通过线性梯度22分钟和0.6mL/分钟的恒定流速至66％的B。该质谱仪以ESI正离子化模式来操作。对于GAA的检测，通过使用MRM片段[M+H]+118–76，监测了m/z值。将GAA的定量限(LOQ)固定至7ppm。
B)实验结果
实施例1：来自拟南芥的编码乙醛酸氨基转移酶的基因GGT1的克隆
拟南芥(Arabidopsis thaliana)的基因GGT1(Genbank登记号NM_102180，SEQ IDNO:1)编码谷氨酸:乙醛酸氨基转移酶(Genbank登记号NP_564192，SEQ ID NO:2)。该蛋白质已显示出可以催化下列反应：乙醛酸+L-丙氨酸＝甘氨酸+丙酮酸(pyruvate)(EC2.6.1.44)，2-酮戊二酸+L-丙氨酸＝L-谷氨酸+丙酮酸(EC 2.6.1.2)，和2-酮戊二酸+甘氨酸＝乙醛酸+L-谷氨酸(EC 2.6.1.4；Liepman AH,Olsen LJ.,Plant Physiol.2003Jan；131(1):215-27.doi:10.1104/pp.011460)。
使用软件工具“Codon Optimization Tool”(Integrated DNA TechnologiesInc.，Coralville，Iowa，美国)，将该GGT1蛋白的氨基酸序列翻译回至针对谷氨酸棒状杆菌的密码子使用所优化的DNA序列中。将Shine-Dalgarno-Sequenz直接添加至开放阅读框的上游(AGGAAAGGAGAGGATTG；Shi,2018)，并用基序扩增了所得序列的末端以用于随后的亚克隆。所得DNA序列AtGGT1_opt_RBS(SEQ ID NO:3)从Eurofins Genomics GmbH(Ebersberg，德国)订购以用于基因合成，并将它作为赋予对氨苄青霉素的抗性的克隆质粒(命名为pEX-A258-AtGGT1_opt_RBS)的部分来递送。
实施例2：来自拟南芥的编码乙醛酸氨基转移酶的基因GGT2的克隆
拟南芥的基因AOAT2(同物异名：GGT2)(Genbank登记号NM_001036185，SEQ ID NO:4)编码丙氨酸-2-酮戊二酸氨基转移酶2(Genbank登记号NP_001031262，SEQ ID NO:5)。该蛋白质已显示出可以催化下列反应：乙醛酸+L-丙氨酸＝甘氨酸+丙酮酸(EC 2.6.1.44)，2-酮戊二酸+L-丙氨酸＝L-谷氨酸+丙酮酸(EC 2.6.1.2)，和2-酮戊二酸+甘氨酸＝乙醛酸+L-谷氨酸(EC 2.6.1.4；Liepman AH,Olsen LJ.,Plant Physiol.2003Jan；131(1):215-27.doi:10.1104/pp.011460)。
使用软件工具“Codon Optimization Tool”(Integrated DNA TechnologiesInc.，Coralville，Iowa，美国)，将该GGT2蛋白的氨基酸序列翻译回至针对谷氨酸棒状杆菌的密码子使用所优化的DNA序列中。将Shine-Dalgarno-Sequenz直接添加至开放阅读框的上游(AGGAAAGGAGAGGATTG；Shi,2018)，并用基序扩增了所得序列的末端以用于随后的亚克隆。所得DNA序列AtGGT2_opt_RBS(SEQ ID NO：6)从Eurofins Genomics GmbH(Ebersberg，德国)订购以用于基因合成，并将它作为赋予对氨苄青霉素的抗性的克隆质粒(命名为pEX-A258-AtGGT2_opt_RBS)的部分来递送。
实施例3：来自Thermococcus litoralis的编码乙醛酸氨基转移酶的基因agt的克隆
Thermococcus litoralis的基因agt(Genbank登记号AB033996，SEQ IDNO:7)编码丙氨酸:乙醛酸氨基转移酶(Genbank登记号BAB40321，SEQ IDNO:8)。该蛋白质已显示出可以催化下列反应：乙醛酸+L-丙氨酸＝甘氨酸+丙酮酸(EC 2.6.1.44)，和乙醛酸+L-丝氨酸＝甘氨酸+3-羟基丙酮酸(EC2.6.1.45；Sakuraba,2004)。
使用软件工具“Codon Optimization Tool”(Integrated DNA TechnologiesInc.，Coralville，Iowa，美国)，将Agt蛋白的氨基酸序列翻译回至针对谷氨酸棒状杆菌的密码子使用所优化的DNA序列中。将Shine-Dalgarno-Sequenz直接添加至开放阅读框的上游(AGGAAAGGAGAGGATTG；Shi,2018)，并用基序扩增了所得序列的末端以用于随后的亚克隆。所得DNA序列(SEQ ID NO:9)从Eurofins Genomics GmbH(Ebersberg，德国)订购以用于基因合成，并将它作为赋予对氨苄青霉素的抗性的克隆质粒(命名为pEX-A258-AGT_Tl_opt_RBS)的部分递送。
实施例4：来自Moorea producens的编码L-精氨酸:甘氨酸脒基转移酶(AGAT，EC2.1.4.1)的基因AGAT_Mp的克隆
Moorea producens是丝状蓝细菌(cyanobacterium)。由Leao等人发表了Mooreaproducens菌株PAL-8-15-08-1的基因组(Leao T,
G,Korobeynikov A,MonroeEA,Podell S,Glukhov E,Allen EE,Gerwick WH,Gerwick L,Proc Natl Acad Sci U SA.2017Mar 21；114(12):3198-3203.doi:10.1073/pnas.1618556114；Genbank登记号CP017599.1)。它含有开放阅读框，该开放阅读框推定地编码L-精氨酸:甘氨酸脒基转移酶(AGAT，EC2.1.4.1；在SEQ ID NO:10中示出的locus_tag BJP34_00300)。SEQ ID NO:11显示出衍生的氨基酸序列(Genbank登记号WP_070390602)。
使用软件工具“GeneOptimizer”(Geneart/ThermoFisher Scientific，Waltham，美国)，将该氨基酸序列翻译回至针对谷氨酸棒状杆菌的密码子使用所优化的DNA序列中。它的末端用序列扩增了以组装克隆，并在该开放阅读框的上游的5个碱基对处添加了Shine-Dalgarno-Sequenz(AGGA)。所得DNA序列(SEQ ID NO:12)从Invitrogen/Geneart(Thermo Fisher Scientific，Waltham，美国)订购以用于基因合成，并将它作为克隆质粒(命名为pMA-T_AGAT_Mp)的部分来递送。
实施例5：将AGAT_Mp克隆至表达质粒pEC-XK99E中
使用限制性内切核酸酶SmaI消化了大肠杆菌-谷氨酸棒状杆菌穿梭质粒pEC-XK99E(Genbank登记号AY219682)。使用“FastAP Thermosensitive AlkalinePhosphatase”(Thermo Fisher Scientific，Waltham，美国)，去除了末端磷酸(phosphate)。然后，用“QIAquick PCR Purification Kit”(Qiagen GmbH，Hilden，德国)纯化了该DNA。
用MluI+AatII消化了克隆质粒pMA-T_AGAT_Mp，并使用“Fast DNA End RepairKit”(Thermo Fisher Scientific，Waltham，美国)将所得片段钝化(blunt)。通过琼脂糖凝胶电泳(在TAE缓冲液中的0.8％琼脂糖)，分离了它们，并切下了对应于“AGAT_Mp”(1174bp)的条带。使用“QIAquick Gel Extraction Kit”(Qiagen GmbH，Hilden，德国)，纯化了它的DNA。
使用“Ready-To-Go T4 DNA ligase”(GE Healthcare Europe GmbH，Freiburg，德国)，连接了AGAT_Mp片段和线性化的pEC-XK99E。将连接产物转化至“NEB StableCompetent E.coli(High Efficiency)”((New England Biolabs，Ipswich，美国)中，并在含有25mg/l的卡那霉素的LB琼脂上生长该细胞。通过限制酶消化和DNA测序，识别了合适的克隆。所得质粒命名为pEC-XK99E_AGAT_Mp。
实施例6：将乙醛酸氨基转移酶基因克隆至表达质粒pEC-XK99E_AGAT_Mp中
使用限制性内切核酸酶BamHI，消化了质粒pEC-XK99E_AGAT_Mp，并使用“FastAPThermosensitive Alkaline Phosphatase”(Thermo Fisher Scientific,Waltham,USA)，去除了末端磷酸(phosphate)。然后，使用“QIAquick Gel Extraction Kit”(Qiagen GmbH，Hilden，德国)，纯化了消化的DNA。
用BamHI和BsaI各自消化了克隆质粒pEX-A258-AtGGT1_opt_RBS、pEX-A258-AtGGT2_opt_RBS和pEX-A258-AGT_Tl_opt_RBS。使用“QIAquick PCR Purification Kit”(Qiagen GmbH，Hilden，德国)，纯化了切割的质粒。
使用“Ready-To-Go T4 DNA ligase”(GE Healthcare Europe GmbH，Freiburg，德国)，将消化的pEC-XK99E_AGAT_Mp与各个所述消化的克隆质粒连接。将连接产物转化至“NEB Stable Competent E.coli(High Efficiency)”(New England Biolabs，Ipswich，美国)中，并且该细胞在含有25mg/l的卡那霉素的LB琼脂上生长。通过限制酶消化和DNA测序，识别了合适的克隆。
所得质粒在表8中示出。它们在强IPTG可诱导的trc-启动子的控制下在类似操纵子的结构中提供AGAT_Mp基因和各自的乙醛酸氨基转移酶。
表8：用于基因表达的大肠杆菌-谷氨酸棒状杆菌穿梭质粒
实施例7：在ATCC13032中的carAB操纵子上游处的sod启动子的染色体插入
为了提高L-精氨酸的产量，将强sod-启动子插入至ATCC13032的基因组中的carAB操纵子的上游处。因此，如下构建了质粒pK18mobsacB_Psod-carAB。使用EcoRI+HindIII，切割了pK18mobsacB(
1994)，并从琼脂糖凝胶上切出了线性化的载体DNA(5670bp)。使用“QIAquick PCR Purification Kit”(Qiagen GmbH，Hilden，德国)，提取了该DNA。
为了构建插入物，用以下引物对(ATCC13032的基因组DNA作为模板)，通过PCR产生了三个DNA片段：
PsodcarAB-LA-F(SEQ ID NO:13)+PsodcarAB-LA-R(SEQ ID NO:14)＝左同源臂(1025bp)
PsodcarAB-F(SEQ ID NO:15)+PsodcarAB-R(SEQ ID NO:16)＝sod-启动子(250bp)
PsodcarAB-RA-F(SEQ ID NO:17)+PsodcarAB-RA-R(SEQ ID NO:18)＝右同源臂(944bp)
使用“QIAquick PCR Purification Kit”(Qiagen GmbH，Hilden，德国)，纯化了产物DNA。然后，使用“NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit”(New England BioLabsInc.，Ipswich，美国，Cat.No.E5520)，组装了该线性化的质粒和该PCR产物。通过限制性消化和DNA测序，识别了合适的质粒克隆。
然后，通过电穿孔将所得质粒pK18mobsacB_Psod-carAB转化至ATCC13032中。通过在补充有134g/l的山梨糖醇、2.5g/l的酵母提取物和25mg/l的卡那霉素的BHI琼脂上铺板，选择了染色体整合(由第一重组事件得到)。将该琼脂平板在33℃下孵育48h。
将单个菌落转移至新鲜琼脂平板(含25mg/l的卡那霉素)上，并在33℃下孵育24h。在具有3个挡板的100ml锥形瓶中所含有的10ml的BHI培养基中，将此类克隆的液体培养物在33℃下培养了24h。为了分离已经历第二重组事件的克隆，从各个液体培养物中取出了等分试样，适当地稀释并在补充有10％的蔗糖的BHI琼脂上铺板(通常100至200μl)。将这些琼脂平板在33℃下孵育了48h。然后，对在所述含蔗糖的琼脂平板上生长的菌落检测了卡那霉素敏感性。为此，使用牙签以从该菌落中取出细胞材料并将它转移至含25mg/l的卡那霉素的BHI琼脂上和至含10％的蔗糖的BHI琼脂上。将该琼脂平板在33℃下孵育60h。通过PCR和DNA测序，检测了被证明对卡那霉素敏感和对蔗糖有抗性的克隆，以用于所述sod启动子的适当整合。所得菌株命名为ATCC13032_Psod-carAB。
实施例8：在谷氨酸棒状杆菌ATCC13032中的基因aceB(NCgl2247)的染色体缺失
为了减少乙醛酸至L-苹果酸的代谢通量，在菌株ATCC13032中缺失了编码苹果酸合酶(EC 2.3.3.9)的基因aceB(NCgl2247)。
因此，如下构建了质粒pK18mobsacB_DaceB。使用XbaI切割了质粒pK18mobsacB(
1994)，并使用“QIAquick Gel Extraction Kit”(Qiagen GmbH，Hilden，德国)，纯化了该线性化的载体DNA(5721bp)。
为了构建插入物，用以下引物对(ATCC13032的基因组DNA作为模板)，通过PCR产生了两个DNA片段：
1f-aceB-D2_vec(SEQ ID NO:19)+1r-aceB-D2_aceB(SEQ ID NO:20)
＝左同源臂(1065bp)
2f-aceB-D2_aceB(SEQ ID NO:21)+2r-aceB_D2_Vec(SEQ ID NO:22)
＝左同源臂(1080bp)
使用“QIAquick PCR Purification Kit”(Qiagen GmbH，Hilden，德国)，纯化了产物DNA。
然后，使用“NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit”(New EnglandBioLabs Inc.，Ipswich，美国，Cat.No.E5520)，组装了该线性化的质粒和该PCR产物。得到的缺失载体命名为pK18mobsacB_DaceB。通过限制酶消化和DNA测序对它进行了验证。
为了缺失该aceB基因，通过电穿孔将pK18mobsacB_DaceB转化至ATCC13032中。通过在补充有134g/l的山梨糖醇、2.5g/l的酵母提取物和25mg/l的卡那霉素的BHI琼脂上铺板，选择了染色体整合(由第一重组事件得到)。将该琼脂平板在33℃下孵育48h。
将单个菌落转移至新鲜琼脂平板(含25mg/l的卡那霉素)上并在33℃下孵育了24h。在具有3个挡板的100ml锥形瓶中所含有的10ml的BHI培养基中，将此类克隆的液体培养物在33℃下培养24h。为了分离已经历第二重组事件的克隆，从各个液体培养物中取出等分试样，适当地稀释并在补充有10％的蔗糖的BHI琼脂上铺板(通常100至200μl)。将这些琼脂平板在33℃下孵育48h。然后，对在该含蔗糖的琼脂平板上生长的菌落检测了卡那霉素敏感性。为此，使用牙签以从该菌落中取出细胞材料并将它转移至含25mg/l的卡那霉素的BHI琼脂上和至含10％的蔗糖的BHI琼脂上。将琼脂平板在33℃下孵育了60h。通过PCR和DNA测序，检测了被证明对卡那霉素敏感且对蔗糖有抗性的克隆，以用于所述sod启动子的适当整合。所得菌株命名为ATCC13032_DaceB。
实施例9：在谷氨酸棒状杆菌ATCC13032_Psod-carAB中的基因aceB(NCgl2247)的染色体缺失
为了减小乙醛酸至L-苹果酸的代谢通量，在菌株ATCC13032_Psod-carAB中缺失了编码苹果酸合酶(EC 2.3.3.9)的基因aceB(NCgl2247)。
为了缺失aceB基因，通过电穿孔将pK18mobsacB_DaceB转化至ATCC13032_Psod-carAB中。通过在补充有134g/l的山梨糖醇、2.5g/l的酵母提取物和25mg/l的卡那霉素的BHI琼脂上铺板，选择了染色体整合(由第一重组事件得到)。将该琼脂平板在33℃下孵育了48h。
将单个菌落转移至新鲜琼脂平板(含25mg/l的卡那霉素)上，并在33℃下孵育了24h。在具有3个挡板的100ml锥形瓶中所含有的10ml的BHI培养基中，将此类克隆的液体培养物在33℃下培养了24h。为了分离已经历第二重组事件的克隆，从各个液体培养物中取出了等分试样，适当地稀释并在补充有10％的蔗糖的BHI琼脂上铺板(通常100至200μl)。将这些琼脂平板在33℃下孵育了48h。然后，对在该含蔗糖的琼脂平板上生长的菌落检测了卡那霉素敏感性。为此，使用牙签以从该菌落中取出细胞材料并将它转移至含25mg/l的卡那霉素的BHI琼脂上和至含10％的蔗糖的BHI琼脂上。将该琼脂平板在33℃下孵育了60h。通过PCR和DNA测序，检测了被证明对卡那霉素敏感且对蔗糖有抗性的克隆，以用于所述sod启动子的适当整合。所得菌株命名为ATCC13032_Psod-carAB_DaceB。
表9：菌株的列表
*)Kinoshita S,Udaka S,Shimono M.,J.Gen.Appl.Microbiol.1957；3(3):193-205.
实施例10：用各种表达质粒对谷氨酸棒状杆菌菌株的转化
通过电穿孔用质粒转化了以下谷氨酸棒状杆菌的菌株(表10)。用25mg/l的卡那霉素选择了含质粒的细胞。
·谷氨酸棒状杆菌ATCC13032：常用的野生型菌株(Kinoshita et al.,J.Gen.Appl.Microbiol.1957；3(3):193-205)
·谷氨酸棒状杆菌ATCC13032_DaceB：由于在ATCC13032中的aceB基因的染色体缺失所导致的减小的苹果酸合酶活性
·谷氨酸棒状杆菌ATCC13032_Psod-carAB_DaceB：由于aceB基因的染色体缺失所导致的减小的苹果酸合成酶活性，和由于在ATCC13032中的carAB上游处的强sod启动子的染色体整合所导致的增大的制备L-精氨酸的能力
表10：含质粒的谷氨酸棒状杆菌菌株的列表
实施例11：减小的苹果酸合酶活性对GAA产量的影响
为了评估减小的苹果酸合酶的酶活性对GAA产量的影响，在Wouter Duetz系统中培养了菌株ATCC13032/pEC-XK99E、ATCC13032/pEC-XK99E_AGAT_Mp和ATCC13032_DaceB/pEC-XK99E_AGAT_Mp，并测定了所得GAA效价(titer)。生产型培养基(PM)含有40g/l的D-葡萄糖和1.90g/L的L-精氨酸，但不含额外的甘氨酸。
表11：在1.90g/L的L-精氨酸的存在下减小的苹果酸合酶活性对GAA产量的影响
| 菌株 | GAA |
| ATCC13032/pEC-XK99E | 不可检测的 |
| ATCC13032/pEC-XK99E_AGAT_Mp | 122mg/L |
| ATCC13032_DaceB/pEC-XK99E_AGAT_Mp | 155mg/L |
如在表11中所示，菌株ATCC13032/pEC-XK99E未制备可检测的量的GAA。
菌株ATCC13032/pEC-XK99E_AGAT_Mp制备了122mg/L的GAA，所述菌株具有编码来自Moorea producens的AGAT的多核苷酸。
菌株ATCC13032_DaceB/pEC-XK99E_AGAT_Mp制备了155mg/L的GAA，所述菌株具有编码来自Moorea producens的AGAT的多核苷酸和缺失的aceB基因。
我们得出结论，在AGAT酶活性的存在下，苹果酸合酶的酶活性的减小改善GAA产量。
实施例12：与增大的乙醛酸氨基转移酶活性组合的减小的苹果酸合酶活性对GAA产量的影响
为了评估与增大的乙醛酸氨基转移酶活性组合的减小的苹果酸合酶的酶活性对GAA产量的影响，在Wouter Duetz系统中培养了菌株ATCC13032_DaceB/pEC-XK99E_AGAT_Mp_AtGGT1、菌株ATCC13032_DaceB/pEC-XK99E_AGAT_Mp_AtGGT2和菌株ATCC13032_DaceB/pEC-XK99E_AGAT_Mp_AGT_Tl，并测定了所得GAA效价。生产型培养基(PM)含有40g/l的D-葡萄糖和1.90g/L的L-精氨酸，但不含额外的甘氨酸。
表12：在1.90g/L的L-精氨酸的存在下减小的苹果酸合酶活性和增大的乙醛酸氨基转移酶活性对GAA产量的影响
| 菌株 | GAA |
| ATCC13032_DaceB/pEC-XK99E_AGAT_Mp | 155mg/L |
| ATCC13032_DaceB/pEC-XK99E_AGAT_Mp_AtGGT1 | 236mg/L |
| ATCC13032_DaceB/pEC-XK99E_AGAT_Mp_AtGGT2 | 242mg/L |
| ATCC13032_DaceB/pEC-XK99E_AGAT_Mp_AGT_Tl | 180mg/L |
如在表12中所示，菌株ATCC13032_DaceB/pEC-XK99E_AGAT_Mp产生了155mg/L的GAA，所述菌株具有编码来自Moorea producens的AGAT的多核苷酸和缺失的aceB基因。
菌株ATCC13032_DaceB/pEC-XK99E_AGAT_Mp_AtGGT1、菌株ATCC13032_DaceB/pEC-XK99E_AGAT_Mp_AtGGT2和菌株ATCC13032_DaceB/pEC-XK99E_AGAT_Mp_AGT_Tl也具有编码来自Moorea producens的AGAT的多核苷酸和缺失的aceB基因。此外，各个菌株具有编码乙醛酸氨基转移酶的多核苷酸。这些菌株分别制备了236mg/l、242mg/l和180mg/l的GAA。
我们得出结论，在AGAT酶活性的存在下，减小的苹果酸合成酶活性和增大的乙醛酸氨基转移酶活性的组合提高GAA的产量。
实施例13：与增大的制备L-精氨酸的能力组合的减小的苹果酸合酶活性对GAA产量的影响
为了评估与增大的制备L-精氨酸的能力组合的减小的苹果酸合酶的酶活性对GAA产量的影响，在Wouter Duetz系统中培养了菌株ATCC13032_DaceB/pEC-XK99E_AGAT_Mp和菌株ATCC13032_Psod-carAB_DaceB/pEC-XK99E_AGAT_Mp，并测定了所得GAA效价。由于在染色体基因carA和carB上游处的所述强sod-启动子的插入，后一菌株具有改善的制备L-精氨酸的能力。生产型培养基(PM)含有40g/l的D-葡萄糖和1.90g/L的L-精氨酸，但不含额外的甘氨酸。
表13：在1.90g/L的L-精氨酸的存在下减小的苹果酸合酶活性和增大的制备L-精氨酸的能力对GAA产量的影响
| 菌株 | GAA |
| ATCC13032_DaceB/pEC-XK99E_AGAT_Mp | 155mg/L |
| ATCC13032_Psod-carAB_DaceB/pEC-XK99E_AGAT_Mp | 243mg/L |
如在表13中所示，菌株ATCC13032_DaceB/pEC-XK99E_AGAT_Mp制备了155mg/L的GAA，所述菌株具有编码来自Moorea producens的AGAT的多核苷酸和缺失的aceB基因。
菌株ATCC13032_Psod-carAB_DaceB/pEC-XK99E_AGAT_Mp还具有编码来自Mooreaproducens的AGAT的多核苷酸和缺失的aceB基因。此外，它具有增大的制备L-精氨酸的能力。该菌株制备了243mg/l的GAA。
我们得出结论，在酶AGAT活性的存在下，减小的苹果酸合成酶活性和增大的制备L-精氨酸的能力改善GAA的产量。
实施例14：减小的苹果酸合酶活性、增大的乙醛酸氨基转移酶活性和增大的制备L-精氨酸的能力对GAA产量的组合影响
为了评估减小的苹果酸合酶活性、增大的乙醛酸转氨酶活性和增大的制备L-精氨酸的能力对GAA产量的组合影响，在Wouter Duetz系统中培养了菌株ATCC13032_DaceB/pEC-XK99E_AGAT_Mp_AtGGT1、菌株ATCC13032_DaceB/pEC-XK99E_AGAT_Mp_AtGGT2、菌株ATCC13032_DaceB/pEC-XK99E_AGAT_Mp_AGT_Tl、菌株ATCC13032_Psod-carAB_DaceB/pEC-XK99E_AGAT_Mp_AtGGT1、菌株ATCC13032_Psod-carAB_DaceB/pEC-XK99E_AGAT_Mp_AtGGT2和菌株ATCC13032_Psod-carAB_DaceB/pEC-XK99E_AGAT_Mp_AGT_Tl，并测定了所得GAA效价。由于在染色体基因carA和carB上游处的所述强sod-启动子的插入，后三种菌株具有改善的制备L-精氨酸的能力。生产型培养基(PM)含有40g/l的D-葡萄糖和1.90g/L的L-精氨酸，但不含额外的甘氨酸。
表14：在1.90g/L的L-精氨酸的存在下，减小的苹果酸合酶活性、增大的乙醛酸氨基转移酶活性和增大的制备L-精氨酸的能力对GAA产量的组合影响
| 菌株 | GAA |
| ATCC13032_DaceB/pEC-XK99E_AGAT_Mp_AtGGT1 | 236mg/L |
| ATCC13032_DaceB/pEC-XK99E_AGAT_Mp_AtGGT2 | 242mg/L |
| ATCC13032_DaceB/pEC-XK99E_AGAT_Mp_AGT_Tl | 180mg/L |
| ATCC13032_Psod-carAB_DaceB/pEC-XK99E_AGAT_Mp_AtGGT1 | 362mg/L |
| ATCC13032_Psod-carAB_DaceB/pEC-XK99E_AGAT_Mp_AtGGT2 | 354mg/L |
| ATCC13032_Psod-carAB_DaceB/pEC-XK99E_AGAT_Mp_AGT_Tl | 331mg/L |
如在表14中所示，菌株ATCC13032_DaceB/pEC-XK99E_AGAT_Mp_AtGGT1、ATCC13032_DaceB/pEC-XK99E_AGAT_Mp_AtGGT2和ATCC13032_DaceB/pEC-XK99E_AGAT_Mp_AGT_Tl分别制备了236mg/l、242mg/l和180mg/l的GAA，所述菌株具有编码来自Mooreaproducens的AGAT的多核苷酸、缺失的aceB基因和编码乙醛酸氨基转移酶的多核苷酸。
菌株ATCC13032_Psod-carAB_DaceB/pEC-XK99E_AGAT_Mp_AtGGT1、ATCC13032_Psod-carAB_DaceB/pEC-XK99E_AGAT_Mp_AtGGT2和ATCC13032_Psod-carAB_DaceB/pEC-XK99E_AGAT_Mp_AGT_Tl也具有编码来自Moorea producens的AGAT的多核苷酸、缺失的aceB基因和编码乙醛酸氨基转移酶的多核苷酸。此外，它们具有增大的制备L-精氨酸的能力。这些菌株分别制备了362mg/l、354mg/l和331mg/l的GAA。
我们得出结论，AGAT酶活性、减小的苹果酸合酶活性、增大的乙醛酸氨基转移酶活性和增大的制备L-精氨酸的能力的组合改善GAA产量。
序列表
<110> 赢创运营有限公司
<120> 发酵制备胍基乙酸的方法
<130> 202000177
<160> 23
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2205
<212> DNA
<213> 拟南芥
<220>
<221> CDS
<222> (425)..(1870)
<223> GGT1
<400> 1
ctcttcgtct ggaatctcca ccacattttt attctcttca aaaattatct gcttctattt 60
ttataattaa gcaagaacgg tcttcgtagc ataaaaacga gacacggata tagagatatc 120
gtgaattgac ttttgtctga caaatcctct tcgtcaattt cagtggctct gctgcttcct 180
ttgttgtgaa gccacataga ttagattgag gaatgatcca aactcatgtc atacacacat 240
ttgtaatctg ctacacaaaa tacttttaaa atcacacaca ctaatatttt aactctcccc 300
actctttgcc ttgcccttgg ctctagaacc gaacgtgact ctccagatag acttttggag 360
tcacaacatt gagtttgaag aggagggaag aagtgagcta gggattggtt cagagtgaac 420
ataa atg gct ctc aag gca tta gac tac gat act ctg aat gaa aac gtc 469
Met Ala Leu Lys Ala Leu Asp Tyr Asp Thr Leu Asn Glu Asn Val
1 5 10 15
aag aag tgt cag tat gcc gta aga ggt gaa ctt tat ctc cga gct tct 517
Lys Lys Cys Gln Tyr Ala Val Arg Gly Glu Leu Tyr Leu Arg Ala Ser
20 25 30
gag ctg cag aaa gaa ggc aaa aag att att ttc aca aac gtt ggg aac 565
Glu Leu Gln Lys Glu Gly Lys Lys Ile Ile Phe Thr Asn Val Gly Asn
35 40 45
cct cat gct tta gga cag aag cca ttg aca ttt cct cgc cag gtg gtt 613
Pro His Ala Leu Gly Gln Lys Pro Leu Thr Phe Pro Arg Gln Val Val
50 55 60
gcg ctt tgc caa gct ccg ttt cta cta gat gac cca aat gtt gga atg 661
Ala Leu Cys Gln Ala Pro Phe Leu Leu Asp Asp Pro Asn Val Gly Met
65 70 75
cta ttt cca gct gat gct att gca aga gct aaa cat tat ctt tcc ttg 709
Leu Phe Pro Ala Asp Ala Ile Ala Arg Ala Lys His Tyr Leu Ser Leu
80 85 90 95
act tca ggc ggt tta ggt gct tac agt gat tca aga ggc ctt cca gga 757
Thr Ser Gly Gly Leu Gly Ala Tyr Ser Asp Ser Arg Gly Leu Pro Gly
100 105 110
gtt agg aaa gag gtt gct gag ttc att caa cgg cgt gat ggg tat cca 805
Val Arg Lys Glu Val Ala Glu Phe Ile Gln Arg Arg Asp Gly Tyr Pro
115 120 125
agt gac cca gaa ctc atc ttt ctc act gat gga gct agc aaa ggt gtg 853
Ser Asp Pro Glu Leu Ile Phe Leu Thr Asp Gly Ala Ser Lys Gly Val
130 135 140
atg caa atc ttg aat tgt gtt ata cgc ggt aat gga gat ggg att cta 901
Met Gln Ile Leu Asn Cys Val Ile Arg Gly Asn Gly Asp Gly Ile Leu
145 150 155
gtt ccg gtt cca cag tat cca ctt tac tca gct acc ata tca ctg tta 949
Val Pro Val Pro Gln Tyr Pro Leu Tyr Ser Ala Thr Ile Ser Leu Leu
160 165 170 175
ggt ggt act ctt gtt cct tac tat ctt gat gag tct gaa aac tgg gga 997
Gly Gly Thr Leu Val Pro Tyr Tyr Leu Asp Glu Ser Glu Asn Trp Gly
180 185 190
ctt gat gtt gct aac ctt cga caa tcc gtt gct cag gct cgt tct caa 1045
Leu Asp Val Ala Asn Leu Arg Gln Ser Val Ala Gln Ala Arg Ser Gln
195 200 205
ggg ata aca gta agg gca atg gtg atc att aac cct ggg aac cca act 1093
Gly Ile Thr Val Arg Ala Met Val Ile Ile Asn Pro Gly Asn Pro Thr
210 215 220
ggc cag tgt cta agc gaa gct aac ata aga gag ata ttg aag ttc tgt 1141
Gly Gln Cys Leu Ser Glu Ala Asn Ile Arg Glu Ile Leu Lys Phe Cys
225 230 235
tat aac gag aaa ctg gtt ctt ctg gga gac gag gtt tat cag cag aac 1189
Tyr Asn Glu Lys Leu Val Leu Leu Gly Asp Glu Val Tyr Gln Gln Asn
240 245 250 255
ata tac cag gat gag cgt ccc ttt atc agc tcc aag aag gtt ttg atg 1237
Ile Tyr Gln Asp Glu Arg Pro Phe Ile Ser Ser Lys Lys Val Leu Met
260 265 270
gaa atg ggt tcg ccg ttc agc aag gaa gtt cag ctt gta tct ttt cac 1285
Glu Met Gly Ser Pro Phe Ser Lys Glu Val Gln Leu Val Ser Phe His
275 280 285
aca gtc tct aaa gga tat tgg ggt gaa tgt gga cag cga ggt gga tac 1333
Thr Val Ser Lys Gly Tyr Trp Gly Glu Cys Gly Gln Arg Gly Gly Tyr
290 295 300
ttt gag atg acc aac ctc cct cca agg gtt gtt gag gag ata tac aag 1381
Phe Glu Met Thr Asn Leu Pro Pro Arg Val Val Glu Glu Ile Tyr Lys
305 310 315
gtt gca tca att gcc ctc agc cct aat gtc tct gcg caa atc ttt atg 1429
Val Ala Ser Ile Ala Leu Ser Pro Asn Val Ser Ala Gln Ile Phe Met
320 325 330 335
ggt ttg atg gtt aat cct cca aag cct gga gac att tca tat gac cag 1477
Gly Leu Met Val Asn Pro Pro Lys Pro Gly Asp Ile Ser Tyr Asp Gln
340 345 350
ttc gcc cgt gaa agc aag ggg att ctt gaa tct ttg aga aga aga gca 1525
Phe Ala Arg Glu Ser Lys Gly Ile Leu Glu Ser Leu Arg Arg Arg Ala
355 360 365
agg ctc atg aca gat gga ttc aac agc tgc aaa aac gtc gtg tgc aat 1573
Arg Leu Met Thr Asp Gly Phe Asn Ser Cys Lys Asn Val Val Cys Asn
370 375 380
ttc aca gaa ggt gca atg tat tcg ttt cct caa ata cgg tta cca acg 1621
Phe Thr Glu Gly Ala Met Tyr Ser Phe Pro Gln Ile Arg Leu Pro Thr
385 390 395
gga gct ctc caa gct gca aaa caa gct gga aaa gtg cca gac gtt ttc 1669
Gly Ala Leu Gln Ala Ala Lys Gln Ala Gly Lys Val Pro Asp Val Phe
400 405 410 415
tac tgt ctc aag ctc tta gaa gcc aca gga atc tcc aca gta cct ggc 1717
Tyr Cys Leu Lys Leu Leu Glu Ala Thr Gly Ile Ser Thr Val Pro Gly
420 425 430
tct gga ttt gga cag aaa gaa ggt gtg ttc cat ctg agg aca aca atc 1765
Ser Gly Phe Gly Gln Lys Glu Gly Val Phe His Leu Arg Thr Thr Ile
435 440 445
ctg cca gca gaa gat gag atg ccg gag atc atg gat agc ttc aag aag 1813
Leu Pro Ala Glu Asp Glu Met Pro Glu Ile Met Asp Ser Phe Lys Lys
450 455 460
ttc aac gac gag ttc atg act cag tat gat aat aac ttt ggt tat tcg 1861
Phe Asn Asp Glu Phe Met Thr Gln Tyr Asp Asn Asn Phe Gly Tyr Ser
465 470 475
aaa atg tga ttacttcttc ttctgaacga ctattgtgtt ctgctacact 1910
Lys Met
480
ctttaaagct aaatctctgt agtacactct ttctctttgc cctattctat aaaccatatc 1970
tctctctttg tgtctctttt ttttgggtgt aaactctctc ttgtgtctct atttctattt 2030
tcaattggaa actgattaag atcttttctc aatgaaatga agtttaggcc atagattatt 2090
ttttttaatc aacggtgata gccttttttt agtgtggcaa tgtgaaattt gtaattatgc 2150
taattatatt aaagaaaata ataataatcc atgtcctagt ttgtttttga ttatg 2205
<210> 2
<211> 481
<212> PRT
<213> 拟南芥
<400> 2
Met Ala Leu Lys Ala Leu Asp Tyr Asp Thr Leu Asn Glu Asn Val Lys
1 5 10 15
Lys Cys Gln Tyr Ala Val Arg Gly Glu Leu Tyr Leu Arg Ala Ser Glu
20 25 30
Leu Gln Lys Glu Gly Lys Lys Ile Ile Phe Thr Asn Val Gly Asn Pro
35 40 45
His Ala Leu Gly Gln Lys Pro Leu Thr Phe Pro Arg Gln Val Val Ala
50 55 60
Leu Cys Gln Ala Pro Phe Leu Leu Asp Asp Pro Asn Val Gly Met Leu
65 70 75 80
Phe Pro Ala Asp Ala Ile Ala Arg Ala Lys His Tyr Leu Ser Leu Thr
85 90 95
Ser Gly Gly Leu Gly Ala Tyr Ser Asp Ser Arg Gly Leu Pro Gly Val
100 105 110
Arg Lys Glu Val Ala Glu Phe Ile Gln Arg Arg Asp Gly Tyr Pro Ser
115 120 125
Asp Pro Glu Leu Ile Phe Leu Thr Asp Gly Ala Ser Lys Gly Val Met
130 135 140
Gln Ile Leu Asn Cys Val Ile Arg Gly Asn Gly Asp Gly Ile Leu Val
145 150 155 160
Pro Val Pro Gln Tyr Pro Leu Tyr Ser Ala Thr Ile Ser Leu Leu Gly
165 170 175
Gly Thr Leu Val Pro Tyr Tyr Leu Asp Glu Ser Glu Asn Trp Gly Leu
180 185 190
Asp Val Ala Asn Leu Arg Gln Ser Val Ala Gln Ala Arg Ser Gln Gly
195 200 205
Ile Thr Val Arg Ala Met Val Ile Ile Asn Pro Gly Asn Pro Thr Gly
210 215 220
Gln Cys Leu Ser Glu Ala Asn Ile Arg Glu Ile Leu Lys Phe Cys Tyr
225 230 235 240
Asn Glu Lys Leu Val Leu Leu Gly Asp Glu Val Tyr Gln Gln Asn Ile
245 250 255
Tyr Gln Asp Glu Arg Pro Phe Ile Ser Ser Lys Lys Val Leu Met Glu
260 265 270
Met Gly Ser Pro Phe Ser Lys Glu Val Gln Leu Val Ser Phe His Thr
275 280 285
Val Ser Lys Gly Tyr Trp Gly Glu Cys Gly Gln Arg Gly Gly Tyr Phe
290 295 300
Glu Met Thr Asn Leu Pro Pro Arg Val Val Glu Glu Ile Tyr Lys Val
305 310 315 320
Ala Ser Ile Ala Leu Ser Pro Asn Val Ser Ala Gln Ile Phe Met Gly
325 330 335
Leu Met Val Asn Pro Pro Lys Pro Gly Asp Ile Ser Tyr Asp Gln Phe
340 345 350
Ala Arg Glu Ser Lys Gly Ile Leu Glu Ser Leu Arg Arg Arg Ala Arg
355 360 365
Leu Met Thr Asp Gly Phe Asn Ser Cys Lys Asn Val Val Cys Asn Phe
370 375 380
Thr Glu Gly Ala Met Tyr Ser Phe Pro Gln Ile Arg Leu Pro Thr Gly
385 390 395 400
Ala Leu Gln Ala Ala Lys Gln Ala Gly Lys Val Pro Asp Val Phe Tyr
405 410 415
Cys Leu Lys Leu Leu Glu Ala Thr Gly Ile Ser Thr Val Pro Gly Ser
420 425 430
Gly Phe Gly Gln Lys Glu Gly Val Phe His Leu Arg Thr Thr Ile Leu
435 440 445
Pro Ala Glu Asp Glu Met Pro Glu Ile Met Asp Ser Phe Lys Lys Phe
450 455 460
Asn Asp Glu Phe Met Thr Gln Tyr Asp Asn Asn Phe Gly Tyr Ser Lys
465 470 475 480
Met
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<211> 1560
<212> DNA
<213> 合成DNA
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ggtctcccaa gcttgcatgc ctgcaggtcg actctagagg atccgacgtc aggaaaggag 60
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ccaatatgct gtgcggggcg agttgtatct tcgtgcctcc gagctgcaaa aagagggcaa 180
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tatgttgttc ccggctgacg cgattgcccg ggctaagcat tacctgtctc tgacttcggg 360
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tgcttctaaa ggtgtaatgc aaattctcaa ctgtgtgatt cgcggtaatg gagatggtat 540
ccttgtcccg gtcccacagt atccactgta ctccgcgact atttctcttc tcggcggaac 600
gctggttccg tattatttgg acgaatcgga gaattggggc ctcgacgtag ccaaccttcg 660
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cccgggaaac ccgactggac aatgcttgag cgaagcaaat attcgtgaga tccttaaatt 780
ttgctacaac gagaagctgg tactcctcgg agatgaggtt taccaacaaa acatttatca 840
ggatgaacgg ccttttatct cgtcaaagaa ggtactgatg gagatgggtt ctcctttcag 900
caaagaagta cagctggtca gcttccatac tgtctctaag ggttattggg gtgaatgtgg 960
ccagcgcggc ggctacttcg aaatgactaa cctcccccct cgcgtcgtgg aagagatcta 1020
taaggttgca tctattgctt tgtcgcccaa cgtatcggcc cagatcttta tgggactgat 1080
ggtaaacccc cctaaacctg gagacattag ctacgaccag ttcgcgcgtg aatctaaggg 1140
tatccttgaa tcccttcgtc gccgcgcgcg tctgatgact gacggattca attcatgtaa 1200
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aaccggtgca ctccaggctg ctaagcaggc gggaaaggtg cccgatgtgt tttattgtct 1320
caaattgttg gaggcgaccg gcatctccac tgttccaggc agcggctttg gacagaagga 1380
gggagttttt catctgcgta cgactatcct tcctgccgag gatgagatgc ctgaaattat 1440
ggattctttc aagaagttta acgacgagtt catgactcaa tatgacaata atttcggata 1500
ctccaaaatg taataaggat ccccgggtac cgagctcgaa ttcactggcc gtcggagacc 1560
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<211> 1817
<212> DNA
<213> 拟南芥
<220>
<221> CDS
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<223> GGT2
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Met Ser Leu Lys Ala Leu Asp Tyr Glu
1 5
tcc ttg aat gaa aac gtg aag aat tgt cag tat gca gtc aga ggt gaa 222
Ser Leu Asn Glu Asn Val Lys Asn Cys Gln Tyr Ala Val Arg Gly Glu
10 15 20 25
ctt tat ctt cgt gct tct gag ctt cag aaa gaa ggc aaa aag att att 270
Leu Tyr Leu Arg Ala Ser Glu Leu Gln Lys Glu Gly Lys Lys Ile Ile
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ttc aca aat gtt gga aac cct cat gct tta gga cag aaa cct ctg act 318
Phe Thr Asn Val Gly Asn Pro His Ala Leu Gly Gln Lys Pro Leu Thr
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ttt cct cgt cag gtg gtt tct tta tgc caa gca cca ttt ctg tta gat 366
Phe Pro Arg Gln Val Val Ser Leu Cys Gln Ala Pro Phe Leu Leu Asp
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gat cca aat gtt ggt atg ata ttc cca gca gat gct att gca aga gct 414
Asp Pro Asn Val Gly Met Ile Phe Pro Ala Asp Ala Ile Ala Arg Ala
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aag cat tat ctt tcc ttg act tct ggt ggt ctt ggt gct tac agt gac 462
Lys His Tyr Leu Ser Leu Thr Ser Gly Gly Leu Gly Ala Tyr Ser Asp
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tca aga ggt ctt ccg gga gtt cgg aaa gaa gtc gct gag ttc att gaa 510
Ser Arg Gly Leu Pro Gly Val Arg Lys Glu Val Ala Glu Phe Ile Glu
110 115 120
cgg cgt gat gga tat cca agc gat cca gaa ctc ata ttt cta act gat 558
Arg Arg Asp Gly Tyr Pro Ser Asp Pro Glu Leu Ile Phe Leu Thr Asp
125 130 135
gga gcg agc aaa ggt gtg atg caa atc ttg aat tgt gtc ata cgc ggt 606
Gly Ala Ser Lys Gly Val Met Gln Ile Leu Asn Cys Val Ile Arg Gly
140 145 150
cag aaa gac gga att ctg gtt cca gtt cca cag tat cca ctc tac tcg 654
Gln Lys Asp Gly Ile Leu Val Pro Val Pro Gln Tyr Pro Leu Tyr Ser
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gct act ata tct ctg tta ggt ggt act ctt gtt cct tac tat ctt gaa 702
Ala Thr Ile Ser Leu Leu Gly Gly Thr Leu Val Pro Tyr Tyr Leu Glu
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gag tct gaa aac tgg gga ctt gat gtt aac aac ctt cgc caa tct gtt 750
Glu Ser Glu Asn Trp Gly Leu Asp Val Asn Asn Leu Arg Gln Ser Val
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gct caa gct cgc tct caa gga ata aca gta agg gca atg gtg att att 798
Ala Gln Ala Arg Ser Gln Gly Ile Thr Val Arg Ala Met Val Ile Ile
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aac ccc gga aac cca act ggc cag tgt ctt agc gaa gct aac ata aga 846
Asn Pro Gly Asn Pro Thr Gly Gln Cys Leu Ser Glu Ala Asn Ile Arg
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gag ata cta cgg ttc tgt tgt gat gag aga tta gtt ctt ctc gga gac 894
Glu Ile Leu Arg Phe Cys Cys Asp Glu Arg Leu Val Leu Leu Gly Asp
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gaa gtg tat cag caa aat ata tac caa gat gaa cgt ccc ttt atc agt 942
Glu Val Tyr Gln Gln Asn Ile Tyr Gln Asp Glu Arg Pro Phe Ile Ser
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tcc aag aag gtt ttg atg gat atg gga gca ccg atc agc aag gaa gtt 990
Ser Lys Lys Val Leu Met Asp Met Gly Ala Pro Ile Ser Lys Glu Val
270 275 280
cag ctc ata tct ttc cac acc gtt tcc aaa gga tac tgg ggc gaa tgt 1038
Gln Leu Ile Ser Phe His Thr Val Ser Lys Gly Tyr Trp Gly Glu Cys
285 290 295
ggg caa cgg gga ggt tac ttt gag atg aca aat atc cct ccc agg acc 1086
Gly Gln Arg Gly Gly Tyr Phe Glu Met Thr Asn Ile Pro Pro Arg Thr
300 305 310
gtt gag gag ata tac aag gtg gcc tct ata gct ctc agc ccc aac gtc 1134
Val Glu Glu Ile Tyr Lys Val Ala Ser Ile Ala Leu Ser Pro Asn Val
315 320 325
tct gcg cag ata ttt atg ggt tta atg gtt agc cca cca aag cct gga 1182
Ser Ala Gln Ile Phe Met Gly Leu Met Val Ser Pro Pro Lys Pro Gly
330 335 340 345
gac att tca tat gac caa ttc gtt cgt gag agc aag gga ata cta gaa 1230
Asp Ile Ser Tyr Asp Gln Phe Val Arg Glu Ser Lys Gly Ile Leu Glu
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tca ctg aga aga aga gca agg atg atg act gat gga ttc aac agc tgc 1278
Ser Leu Arg Arg Arg Ala Arg Met Met Thr Asp Gly Phe Asn Ser Cys
365 370 375
aaa aac gtc gtc tgt aat ttc aca gaa ggt gct atg tat tca ttc cct 1326
Lys Asn Val Val Cys Asn Phe Thr Glu Gly Ala Met Tyr Ser Phe Pro
380 385 390
caa ata aag ttg ccg tcg aaa gca atc caa gca gca aaa caa gcc gga 1374
Gln Ile Lys Leu Pro Ser Lys Ala Ile Gln Ala Ala Lys Gln Ala Gly
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aaa gtc cct gac gtt ttc tac tgc ctt aag ctc tta gaa gcc aca gga 1422
Lys Val Pro Asp Val Phe Tyr Cys Leu Lys Leu Leu Glu Ala Thr Gly
410 415 420 425
atc tcc aca gtt cca ggc tct gga ttt gga caa aaa gaa ggg gtg ttt 1470
Ile Ser Thr Val Pro Gly Ser Gly Phe Gly Gln Lys Glu Gly Val Phe
430 435 440
cat tta agg aca aca att ctg cca gca gaa gaa gaa atg cca gag att 1518
His Leu Arg Thr Thr Ile Leu Pro Ala Glu Glu Glu Met Pro Glu Ile
445 450 455
atg gac agt ttc aaa aag ttc aat gat gag ttt atg tct cag tac gct 1566
Met Asp Ser Phe Lys Lys Phe Asn Asp Glu Phe Met Ser Gln Tyr Ala
460 465 470
gat aac ttt ggt tac tcc aga atg tga aaaagaaagg acttagagtc 1613
Asp Asn Phe Gly Tyr Ser Arg Met
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agagtcagag atcacttctt cttctttcac gacattatta ttgtctattc acactcttaa 1673
aaagcaataa gtactggtcc tactctgtgt caaactcttc ttggtgctct taaaaccttt 1733
gtatctattg ttaccaattt gtgtgactca cacacacaca cacacaaatc tctaatgttc 1793
aattatatgg taaatggttt attt 1817
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<211> 481
<212> PRT
<213> 拟南芥
<400> 5
Met Ser Leu Lys Ala Leu Asp Tyr Glu Ser Leu Asn Glu Asn Val Lys
1 5 10 15
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Leu Gln Lys Glu Gly Lys Lys Ile Ile Phe Thr Asn Val Gly Asn Pro
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His Ala Leu Gly Gln Lys Pro Leu Thr Phe Pro Arg Gln Val Val Ser
50 55 60
Leu Cys Gln Ala Pro Phe Leu Leu Asp Asp Pro Asn Val Gly Met Ile
65 70 75 80
Phe Pro Ala Asp Ala Ile Ala Arg Ala Lys His Tyr Leu Ser Leu Thr
85 90 95
Ser Gly Gly Leu Gly Ala Tyr Ser Asp Ser Arg Gly Leu Pro Gly Val
100 105 110
Arg Lys Glu Val Ala Glu Phe Ile Glu Arg Arg Asp Gly Tyr Pro Ser
115 120 125
Asp Pro Glu Leu Ile Phe Leu Thr Asp Gly Ala Ser Lys Gly Val Met
130 135 140
Gln Ile Leu Asn Cys Val Ile Arg Gly Gln Lys Asp Gly Ile Leu Val
145 150 155 160
Pro Val Pro Gln Tyr Pro Leu Tyr Ser Ala Thr Ile Ser Leu Leu Gly
165 170 175
Gly Thr Leu Val Pro Tyr Tyr Leu Glu Glu Ser Glu Asn Trp Gly Leu
180 185 190
Asp Val Asn Asn Leu Arg Gln Ser Val Ala Gln Ala Arg Ser Gln Gly
195 200 205
Ile Thr Val Arg Ala Met Val Ile Ile Asn Pro Gly Asn Pro Thr Gly
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Gln Cys Leu Ser Glu Ala Asn Ile Arg Glu Ile Leu Arg Phe Cys Cys
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Asp Glu Arg Leu Val Leu Leu Gly Asp Glu Val Tyr Gln Gln Asn Ile
245 250 255
Tyr Gln Asp Glu Arg Pro Phe Ile Ser Ser Lys Lys Val Leu Met Asp
260 265 270
Met Gly Ala Pro Ile Ser Lys Glu Val Gln Leu Ile Ser Phe His Thr
275 280 285
Val Ser Lys Gly Tyr Trp Gly Glu Cys Gly Gln Arg Gly Gly Tyr Phe
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Glu Met Thr Asn Ile Pro Pro Arg Thr Val Glu Glu Ile Tyr Lys Val
305 310 315 320
Ala Ser Ile Ala Leu Ser Pro Asn Val Ser Ala Gln Ile Phe Met Gly
325 330 335
Leu Met Val Ser Pro Pro Lys Pro Gly Asp Ile Ser Tyr Asp Gln Phe
340 345 350
Val Arg Glu Ser Lys Gly Ile Leu Glu Ser Leu Arg Arg Arg Ala Arg
355 360 365
Met Met Thr Asp Gly Phe Asn Ser Cys Lys Asn Val Val Cys Asn Phe
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Thr Glu Gly Ala Met Tyr Ser Phe Pro Gln Ile Lys Leu Pro Ser Lys
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Ala Ile Gln Ala Ala Lys Gln Ala Gly Lys Val Pro Asp Val Phe Tyr
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Cys Leu Lys Leu Leu Glu Ala Thr Gly Ile Ser Thr Val Pro Gly Ser
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Gly Phe Gly Gln Lys Glu Gly Val Phe His Leu Arg Thr Thr Ile Leu
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Pro Ala Glu Glu Glu Met Pro Glu Ile Met Asp Ser Phe Lys Lys Phe
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Asn Asp Glu Phe Met Ser Gln Tyr Ala Asp Asn Phe Gly Tyr Ser Arg
465 470 475 480
Met
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<211> 1560
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<213> 合成DNA
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caaggaggtc cagcttatct catttcacac tgtttcgaag ggctactggg gcgaatgcgg 960
tcagcggggt ggttacttcg aaatgacgaa tatcccccca cgtaccgtgg aagagattta 1020
taaggttgcc tcgattgcac tttcgccaaa cgtatccgcg cagattttta tgggcctgat 1080
ggtatctccc ccaaagcccg gtgacatttc ctacgatcaa ttcgtgcggg aatcaaaagg 1140
aattcttgaa tcattgcgcc ggcgcgcccg tatgatgact gatggcttca atagctgcaa 1200
aaacgttgta tgcaacttta ccgagggtgc aatgtattct ttccctcaga ttaagctccc 1260
ttcgaaggct atccaggcgg cgaagcaagc gggaaaagtg ccagatgtct tttactgcct 1320
caaactgctg gaagcgaccg gaatctccac ggtcccgggc tctggattcg gccaaaagga 1380
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<212> DNA
<213> Thermococcus litoralis
<220>
<221> CDS
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<400> 7
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Leu Gln Lys Lys Gly Val Lys Leu Ile Ser Leu Ala Ala Gly Asp Pro
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gat ccg gag tta att cca aga gct gtt ctt ggg gaa ata gca aaa gaa 375
Asp Pro Glu Leu Ile Pro Arg Ala Val Leu Gly Glu Ile Ala Lys Glu
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gga gca ttg gat ctt ctt gga agg gtt ttg ata gac cct gga gat gtc 567
Gly Ala Leu Asp Leu Leu Gly Arg Val Leu Ile Asp Pro Gly Asp Val
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gtg ata aca gag aac cca tcg tac ata aac aca tta ttg gca ttt gaa 615
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cag ttg gga gcc aaa att gag ggg gtt cca gtt gat aac gat ggg atg 663
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145 150 155
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cag aaa gtt aag ctg atc tac acc atc ccg act ggt cag aat cca atg 759
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Gly Val Thr Met Ser Met Glu Arg Arg Lys Ala Leu Leu Glu Ile Ala
190 195 200
tct aaa tac gac ctc cta ata att gag gac act gct tat aat ttc atg 855
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aga tat gaa gga ggg gat ata gtc ccc tta aag gct ttg gac aat gaa 903
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gga aga gtt atc gtg gcg gga acg ctc agc aaa gtc ctt gga aca gga 951
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ctc atg cag aaa cag cca att gac ttc tgt gct cca gct att tcc caa 1047
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tac att gcc cta gaa tac tta aag agg ggc tat ttt gag aag tat cac 1095
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ttg gaa gga gca ctg ctc ggt tat aaa gag aag agg gac atc atg ctg 1143
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aag gct ctt gaa aat cac ttg cca aat gca gaa ttt aca aag cca ata 1191
Lys Ala Leu Glu Asn His Leu Pro Asn Ala Glu Phe Thr Lys Pro Ile
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gcg gga atg ttt gtt atg ttt ttc ctt cca gag gga gca gat ggc atc 1239
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350 355 360
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Gly Lys Pro Phe Tyr Thr Asp Glu Ser Gly Lys Asn Ala Ile Arg Leu
365 370 375 380
aac ttc tca agg cca agc aag gaa gaa att cca ata gga atc aag aaa 1383
Asn Phe Ser Arg Pro Ser Lys Glu Glu Ile Pro Ile Gly Ile Lys Lys
385 390 395
ctt gct aag ctt tat aag gaa aag ttt ggc gag tga attctttgtt 1429
Leu Ala Lys Leu Tyr Lys Glu Lys Phe Gly Glu
400 405
tttacatttt cttctgggcc atcacattct cgatggagag aaggttagtt tgtttttaat 1489
gcactcagaa aagttctttt tggtgcgggg gcggggattt gaaccccgga acccctacgg 1549
gacgggaccc tcaatcccgc gcctttgacc aggctcggca acccccgcaa gagcgccgtt 1609
tatttgtctt cttagtttgt ttataaattt ttctgtcccc tttaaccggg gcgtgtttat 1669
agtaaccttt attagggttt ttgctgaatt ctttcaggtg gttgtcgtga tccccagatg 1729
ggatcacaaa ctcaaagacc ctgaaagcgt ggcattcata atcctcgacg ttttagcaga 1789
cttcgaatca gaaggaaagc tgaagaacct gccaaaaatc caaaaaattt ccagtaaaaa 1849
caatactggc aatactcctc tttaaacaat actacaacct acccctcaga gacgcccagc 1909
actacggcag aaaattcttc ggagcaaaca ttcactactc aaccctccac aactgggaga 1969
aaaagctgaa cctcgaagaa ctgacaaacc acctcctgaa aaaactccag aaattaccct 2029
acgccagcac tcaagcagac tcaaccatta tcacaaataa aaaaaggaca gaatagaagt 2089
tcaggcaata acgagaatcc tgccgggttt actgtatccg gttgctgtga agatcacaac 2149
ttctgagaac gagctgattg aactcctgcc ggagggttct gggaattttt atgctgatgg 2209
ggcttatgat tcaaagaaag ttctgaacac tgtggtggaa aagggttatc ggccgattgt 2269
taagaaaact aagaaccctc caggtggttt tggtagtaag aagagagata gagtgttttc 2329
tgaagaagag tacaggcata ggaatcctca tgaggggttc tggggtgcgt ttacaacgtg 2389
gtttggcagt aggatcc 2406
<210> 8
<211> 407
<212> PRT
<213> Thermococcus litoralis
<400> 8
Met Asp Tyr Thr Lys Tyr Leu Ala Gly Arg Ala Asn Trp Ile Lys Gly
1 5 10 15
Ser Ala Leu Ala Asp Val Met Lys Lys Ala Ser Glu Leu Gln Lys Lys
20 25 30
Gly Val Lys Leu Ile Ser Leu Ala Ala Gly Asp Pro Asp Pro Glu Leu
35 40 45
Ile Pro Arg Ala Val Leu Gly Glu Ile Ala Lys Glu Val Leu Glu Lys
50 55 60
Glu Pro Lys Ser Val Met Tyr Thr Pro Ala Asn Gly Ile Pro Glu Leu
65 70 75 80
Arg Glu Glu Leu Ala Ala Phe Leu Lys Lys Tyr Asp His Leu Glu Val
85 90 95
Ser Pro Glu Asn Ile Val Ile Thr Ile Gly Gly Thr Gly Ala Leu Asp
100 105 110
Leu Leu Gly Arg Val Leu Ile Asp Pro Gly Asp Val Val Ile Thr Glu
115 120 125
Asn Pro Ser Tyr Ile Asn Thr Leu Leu Ala Phe Glu Gln Leu Gly Ala
130 135 140
Lys Ile Glu Gly Val Pro Val Asp Asn Asp Gly Met Arg Val Asp Leu
145 150 155 160
Leu Glu Glu Lys Ile Lys Glu Leu Lys Ala Lys Gly Gln Lys Val Lys
165 170 175
Leu Ile Tyr Thr Ile Pro Thr Gly Gln Asn Pro Met Gly Val Thr Met
180 185 190
Ser Met Glu Arg Arg Lys Ala Leu Leu Glu Ile Ala Ser Lys Tyr Asp
195 200 205
Leu Leu Ile Ile Glu Asp Thr Ala Tyr Asn Phe Met Arg Tyr Glu Gly
210 215 220
Gly Asp Ile Val Pro Leu Lys Ala Leu Asp Asn Glu Gly Arg Val Ile
225 230 235 240
Val Ala Gly Thr Leu Ser Lys Val Leu Gly Thr Gly Phe Arg Ile Gly
245 250 255
Trp Ile Ile Ala Glu Gly Glu Ile Leu Lys Lys Val Leu Met Gln Lys
260 265 270
Gln Pro Ile Asp Phe Cys Ala Pro Ala Ile Ser Gln Tyr Ile Ala Leu
275 280 285
Glu Tyr Leu Lys Arg Gly Tyr Phe Glu Lys Tyr His Leu Glu Gly Ala
290 295 300
Leu Leu Gly Tyr Lys Glu Lys Arg Asp Ile Met Leu Lys Ala Leu Glu
305 310 315 320
Asn His Leu Pro Asn Ala Glu Phe Thr Lys Pro Ile Ala Gly Met Phe
325 330 335
Val Met Phe Phe Leu Pro Glu Gly Ala Asp Gly Ile Ser Phe Ala Asn
340 345 350
Glu Leu Met Glu Arg Glu Gly Val Val Val Val Pro Gly Lys Pro Phe
355 360 365
Tyr Thr Asp Glu Ser Gly Lys Asn Ala Ile Arg Leu Asn Phe Ser Arg
370 375 380
Pro Ser Lys Glu Glu Ile Pro Ile Gly Ile Lys Lys Leu Ala Lys Leu
385 390 395 400
Tyr Lys Glu Lys Phe Gly Glu
405
<210> 9
<211> 1338
<212> DNA
<213> 合成DNA
<400> 9
ggtctcccaa gcttgcatgc ctgcaggtcg actctagagg atccgacgtc aggaaaggag 60
aggattgatg gactatacca aatatcttgc gggccgggct aattggatta agggctctgc 120
actcgcggac gtaatgaaaa aagcatccga attgcagaaa aagggcgtca aacttatttc 180
gctcgccgcc ggtgatcctg accccgaact gattccccgt gcagtgttgg gcgagattgc 240
aaaggaggtc ctcgaaaaag aacctaagtc ggtaatgtac actcccgcca acggcattcc 300
ggagcttcgg gaggagttgg ccgcttttct caagaagtat gaccaccttg aagtgtctcc 360
tgagaacatc gtcatcacca ttggcggtac tggtgcactc gatctgcttg gacgtgtact 420
gatcgatcct ggcgacgtag tcatcacgga aaatccatcg tacattaaca ccctcctcgc 480
tttcgaacaa ctcggagcaa aaattgaggg agtaccggtg gataacgacg gcatgcgggt 540
tgaccttctg gaagagaaga tcaaagagtt gaaggctaag ggtcaaaaag tgaaactgat 600
ttatacgatt ccaaccggac aaaatccaat gggtgtaacg atgtcaatgg aacggcgtaa 660
ggcgttgctg gagatcgcct caaaatacga tttgctgatc attgaggaca ctgcgtacaa 720
cttcatgcgg tacgaaggtg gtgatattgt cccgctcaag gcgttggata atgagggacg 780
tgtgatcgtg gccggaaccc tttcaaaggt actcggcact ggttttcgta ttggctggat 840
tatcgccgaa ggcgagattt tgaagaaggt tctcatgcag aaacaaccta tcgatttctg 900
cgcgcccgcg atttcgcagt atattgcgct cgaatatctg aagcgtggat acttcgagaa 960
gtaccacctt gagggtgcat tgttgggata taaggagaaa cgcgacatca tgctgaaggc 1020
ccttgagaat catctcccga acgcagaatt caccaagccc atcgcgggta tgttcgtcat 1080
gttcttcctg ccagaaggtg cggacggcat ctcctttgcg aacgagctca tggagcgcga 1140
gggcgtagtc gttgtccccg gaaaaccttt ctacactgac gaatccggta aaaacgccat 1200
tcggctgaat ttctcccgcc cttcaaaaga agagattccc attggaatta aaaaacttgc 1260
taaactgtat aaagaaaaat tcggtgagta ataaggatcc ccgggtaccg agctcgaatt 1320
cactggccgt cggagacc 1338
<210> 10
<211> 1146
<212> DNA
<213> Moorea producens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1143)
<400> 10
atg tcg gaa aaa att gtt aat tcc tgg aat gaa tgg gat gaa ttg gaa 48
Met Ser Glu Lys Ile Val Asn Ser Trp Asn Glu Trp Asp Glu Leu Glu
1 5 10 15
gaa atg gtg gta gga att gca gac tat gct agc ttt gaa cca aaa gaa 96
Glu Met Val Val Gly Ile Ala Asp Tyr Ala Ser Phe Glu Pro Lys Glu
20 25 30
cca ggg aat cat ccg aaa tta aga aat caa aat tta gcg gaa atc att 144
Pro Gly Asn His Pro Lys Leu Arg Asn Gln Asn Leu Ala Glu Ile Ile
35 40 45
cct ttc ccc agt gga cct aaa gac cct aaa gtc ctt gaa aaa gct aat 192
Pro Phe Pro Ser Gly Pro Lys Asp Pro Lys Val Leu Glu Lys Ala Asn
50 55 60
gaa gaa tta aat gga ctg gct tat tta tta aaa gac cac gat gtg ata 240
Glu Glu Leu Asn Gly Leu Ala Tyr Leu Leu Lys Asp His Asp Val Ile
65 70 75 80
gta aga aga ccc gaa aaa att gat ttt act aaa tct cta aaa aca cct 288
Val Arg Arg Pro Glu Lys Ile Asp Phe Thr Lys Ser Leu Lys Thr Pro
85 90 95
tac ttt gaa gtt gca aat caa tac tgt gga gtc tgt cct cgg gat gtc 336
Tyr Phe Glu Val Ala Asn Gln Tyr Cys Gly Val Cys Pro Arg Asp Val
100 105 110
atg att acc ttt ggg aat gaa atc atg gaa gcg act atg tcg aag aga 384
Met Ile Thr Phe Gly Asn Glu Ile Met Glu Ala Thr Met Ser Lys Arg
115 120 125
gct aga ttt ttt gaa tac tta cct tac cgg aaa ttg gtc tat gaa tat 432
Ala Arg Phe Phe Glu Tyr Leu Pro Tyr Arg Lys Leu Val Tyr Glu Tyr
130 135 140
tgg aat aaa gac gag cat atg att tgg aat gct gcg cct aaa ccg act 480
Trp Asn Lys Asp Glu His Met Ile Trp Asn Ala Ala Pro Lys Pro Thr
145 150 155 160
atg cag gat agt atg tat cta gag aat ttc tgg gag ctg tct tta gaa 528
Met Gln Asp Ser Met Tyr Leu Glu Asn Phe Trp Glu Leu Ser Leu Glu
165 170 175
gaa cga ttt aag cgt atg cat gat ttt gaa ttt tgt att aca caa gat 576
Glu Arg Phe Lys Arg Met His Asp Phe Glu Phe Cys Ile Thr Gln Asp
180 185 190
gaa gta att ttt gat gcg gct gac tgt agc aga tta gga aag gat ata 624
Glu Val Ile Phe Asp Ala Ala Asp Cys Ser Arg Leu Gly Lys Asp Ile
195 200 205
tta gtt cag gaa tcg atg aca aca aat aga aca gga att cgg tgg tta 672
Leu Val Gln Glu Ser Met Thr Thr Asn Arg Thr Gly Ile Arg Trp Leu
210 215 220
aaa aag cac cta gaa cca aga gga ttt cgg gtt cac cct gtt cat ttt 720
Lys Lys His Leu Glu Pro Arg Gly Phe Arg Val His Pro Val His Phe
225 230 235 240
ccc ctt gat ttt ttc ccc tca cac att gac tgt acg ttt gtt cct ttg 768
Pro Leu Asp Phe Phe Pro Ser His Ile Asp Cys Thr Phe Val Pro Leu
245 250 255
cga cca ggt ctt att ttg aca aac cct gaa aga cct ata cgg gaa gag 816
Arg Pro Gly Leu Ile Leu Thr Asn Pro Glu Arg Pro Ile Arg Glu Glu
260 265 270
gag gag aag att ttt aaa gag aat ggc tgg gag ttg atc aca gtt cct 864
Glu Glu Lys Ile Phe Lys Glu Asn Gly Trp Glu Leu Ile Thr Val Pro
275 280 285
caa ccg act tgc tcg aat gat gaa atg cca atg ttt tgc cag tcc agt 912
Gln Pro Thr Cys Ser Asn Asp Glu Met Pro Met Phe Cys Gln Ser Ser
290 295 300
aag tgg ttg tca atg aat gtt ctg agt ata tca ccg aca aag gtt atc 960
Lys Trp Leu Ser Met Asn Val Leu Ser Ile Ser Pro Thr Lys Val Ile
305 310 315 320
tgt gag gaa aga gaa aaa cct ctc caa gaa ttg ttg gat aag cat gga 1008
Cys Glu Glu Arg Glu Lys Pro Leu Gln Glu Leu Leu Asp Lys His Gly
325 330 335
ttt gag gtt ttt cct tta ccc ttt aga cat gtc ttt gaa ttt ggg ggg 1056
Phe Glu Val Phe Pro Leu Pro Phe Arg His Val Phe Glu Phe Gly Gly
340 345 350
tct ttt cat tgt gca act tgg gat att cgc cga aaa ggt gag tgt gaa 1104
Ser Phe His Cys Ala Thr Trp Asp Ile Arg Arg Lys Gly Glu Cys Glu
355 360 365
gat tat tta cca aat tta aac tat caa ccg att tgt ggt taa 1146
Asp Tyr Leu Pro Asn Leu Asn Tyr Gln Pro Ile Cys Gly
370 375 380
<210> 11
<211> 381
<212> PRT
<213> Moorea producens
<400> 11
Met Ser Glu Lys Ile Val Asn Ser Trp Asn Glu Trp Asp Glu Leu Glu
1 5 10 15
Glu Met Val Val Gly Ile Ala Asp Tyr Ala Ser Phe Glu Pro Lys Glu
20 25 30
Pro Gly Asn His Pro Lys Leu Arg Asn Gln Asn Leu Ala Glu Ile Ile
35 40 45
Pro Phe Pro Ser Gly Pro Lys Asp Pro Lys Val Leu Glu Lys Ala Asn
50 55 60
Glu Glu Leu Asn Gly Leu Ala Tyr Leu Leu Lys Asp His Asp Val Ile
65 70 75 80
Val Arg Arg Pro Glu Lys Ile Asp Phe Thr Lys Ser Leu Lys Thr Pro
85 90 95
Tyr Phe Glu Val Ala Asn Gln Tyr Cys Gly Val Cys Pro Arg Asp Val
100 105 110
Met Ile Thr Phe Gly Asn Glu Ile Met Glu Ala Thr Met Ser Lys Arg
115 120 125
Ala Arg Phe Phe Glu Tyr Leu Pro Tyr Arg Lys Leu Val Tyr Glu Tyr
130 135 140
Trp Asn Lys Asp Glu His Met Ile Trp Asn Ala Ala Pro Lys Pro Thr
145 150 155 160
Met Gln Asp Ser Met Tyr Leu Glu Asn Phe Trp Glu Leu Ser Leu Glu
165 170 175
Glu Arg Phe Lys Arg Met His Asp Phe Glu Phe Cys Ile Thr Gln Asp
180 185 190
Glu Val Ile Phe Asp Ala Ala Asp Cys Ser Arg Leu Gly Lys Asp Ile
195 200 205
Leu Val Gln Glu Ser Met Thr Thr Asn Arg Thr Gly Ile Arg Trp Leu
210 215 220
Lys Lys His Leu Glu Pro Arg Gly Phe Arg Val His Pro Val His Phe
225 230 235 240
Pro Leu Asp Phe Phe Pro Ser His Ile Asp Cys Thr Phe Val Pro Leu
245 250 255
Arg Pro Gly Leu Ile Leu Thr Asn Pro Glu Arg Pro Ile Arg Glu Glu
260 265 270
Glu Glu Lys Ile Phe Lys Glu Asn Gly Trp Glu Leu Ile Thr Val Pro
275 280 285
Gln Pro Thr Cys Ser Asn Asp Glu Met Pro Met Phe Cys Gln Ser Ser
290 295 300
Lys Trp Leu Ser Met Asn Val Leu Ser Ile Ser Pro Thr Lys Val Ile
305 310 315 320
Cys Glu Glu Arg Glu Lys Pro Leu Gln Glu Leu Leu Asp Lys His Gly
325 330 335
Phe Glu Val Phe Pro Leu Pro Phe Arg His Val Phe Glu Phe Gly Gly
340 345 350
Ser Phe His Cys Ala Thr Trp Asp Ile Arg Arg Lys Gly Glu Cys Glu
355 360 365
Asp Tyr Leu Pro Asn Leu Asn Tyr Gln Pro Ile Cys Gly
370 375 380
<210> 12
<211> 1248
<212> DNA
<213> 合成DNA
<400> 12
cgtctctgtg gataactgag cggataagtt cctagtacgc gtgcgagcag gaagaacatg 60
agcgagaaaa ttgtgaacag ctggaatgaa tgggatgaac tggaagaaat ggttgttggt 120
attgcagatt atgcaagctt tgaaccgaaa gaaccgggta atcatccgaa actgcgtaat 180
cagaatctgg cagaaattat tccgtttccg agcggtccga aagatccgaa agttctggaa 240
aaagcaaatg aagaactgaa tggtctggcc tatctgctga aagatcatga tgttattgtt 300
cgccgtccgg aaaaaatcga ctttaccaaa agcctgaaaa ccccgtattt cgaagttgcc 360
aatcagtatt gtggtgtttg tccgcgtgat gttatgatta cctttggcaa cgaaattatg 420
gaagccacca tgagcaaacg tgcccgtttt tttgaatatc tgccgtatcg taaactggtg 480
tatgagtatt ggaacaaaga tgagcatatg atctggaatg cagcaccgaa accgaccatg 540
caggatagca tgtatctgga aaacttttgg gaactgagcc tggaagaacg ttttaaacgt 600
atgcacgatt ttgagttttg catcacccag gatgaagtga tttttgatgc agcagattgt 660
agccgtctgg gtaaagatat tctggttcaa gaaagcatga ccaccaatcg taccggtatt 720
cgttggctga aaaaacatct ggaaccgcgt ggttttcgtg ttcatccggt tcattttccg 780
ctggattttt ttccgagcca tattgattgt acctttgttc cgctgcgtcc gggtctgatt 840
ctgaccaatc cggaacgtcc gattcgtgaa gaagaagaga aaatcttcaa agagaatggc 900
tgggagctga ttaccgttcc gcagccgacc tgtagcaatg atgaaatgcc gatgttttgt 960
cagagcagca aatggctgag catgaatgtt ctgagcatta gcccgaccaa agttatttgt 1020
gaagaacgtg aaaaaccgct gcaagaactg ctggataaac atggttttga agtgtttccg 1080
ctgccgtttc gtcatgtttt tgaatttggt ggtagctttc attgtgccac ctgggatatt 1140
cgtcgtaaag gtgaatgtga agattatctg ccgaatctga attatcagcc gatttgtggt 1200
taataagacg tccgcgaggg ccgtgttgcc ggtttcttca gagagacg 1248
<210> 13
<211> 46
<212> DNA
<213> 合成的低聚核苷酸
<400> 13
ggaaacagct atgacatgat tacgcggtta tcgcggaatc cgtatg 46
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> 合成的低聚核苷酸
<400> 14
ttaagcgttt tgtgcaactc cgtct 25
<210> 15
<211> 50
<212> DNA
<213> 合成的低聚核苷酸
<400> 15
agacggagtt gcacaaaacg cttaaaccct acttagctgc caattattcc 50
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<211> 50
<212> DNA
<213> 合成的低聚核苷酸
<400> 16
ggtaggtggt ggtgtcttta ctcatgggta aaaaatcctt tcgtaggttt 50
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<212> DNA
<213> 合成的低聚核苷酸
<400> 17
atgagtaaag acaccaccac ctacc 25
<210> 18
<211> 46
<212> DNA
<213> 合成的低聚核苷酸
<400> 18
gttgtaaaac gacggccagt gccaccggtg atgtggttct tcactg 46
<210> 19
<211> 51
<212> DNA
<213> 合成的低聚核苷酸
<400> 19
gaattcgagc tcggtacccg gggatcctct ttcatacctt aacgcagtag t 51
<210> 20
<211> 37
<212> DNA
<213> 合成的低聚核苷酸
<400> 20
gcgttgacgc gggctcgagc agtggtcgtc gacaagc 37
<210> 21
<211> 37
<212> DNA
<213> 合成的低聚核苷酸
<400> 21
cgacgaccac tgctcgagcc cgcgtcaacg cgttcgg 37
<210> 22
<211> 48
<212> DNA
<213> 合成的低聚核苷酸
<400> 22
caagcttgca tgcctgcagg tcgactttgg aacggagttc gctgggta 48
<210> 23
<211> 17
<212> DNA
<213> 合成的低聚核苷酸
<220>
<221> RBS
<222> (1)..(17)
<223> Shi F, Luan M, Li Y, AMB Express. 2018 Apr 18;8(1):61. doi:
10.1186/s13568-018-0595-2
<400> 23
aggaaaggag aggattg 17
202000177A 3
Claims (28)
1.微生物，其包含至少一种编码具有L-精氨酸:甘氨酸脒基转移酶功能的蛋白质的基因，和其中，与在野生型微生物中的相应活性相比，具有苹果酸合酶功能的蛋白质的活性减小。
2.根据权利要求1所述的微生物，其中，与在野生型微生物中的相应基因的表达相比，编码所述具有苹果酸合酶功能的蛋白质的基因的表达减弱，或其中编码所述具有苹果酸合酶功能的蛋白质的基因缺失。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的微生物，所述微生物另外包含与在野生型微生物中的相应酶活性相比增大的具有乙醛酸氨基转移酶功能的酶的活性。
4.根据权利要求1至3中的任意一项所述的微生物，所述微生物包含至少一种编码具有乙醛酸氨基转移酶的酶活性的蛋白质的基因，所述基因是过表达的。
5.根据前述权利要求中的任意一项所述的微生物，其中，与野生型微生物的制备L-精氨酸的能力相比，所述微生物具有增大的制备L-精氨酸的能力。
6.根据权利要求5所述的微生物，其中，与在野生型微生物中的相应酶活性相比，所述微生物具有增大的具有氨甲酰基磷酸合酶功能的酶的活性。
7.根据权利要求5或6所述的微生物，其中，与在野生型微生物中的相应酶活性相比，所述微生物另外包含具有精氨基琥珀酸裂合酶功能的具有增大的活性的酶。
8.根据权利要求5至7中的任意一项所述的微生物，其中，与在野生型微生物中的相应酶活性相比，所述微生物另外包含具有鸟氨酸氨甲酰基转移酶功能的具有增大的活性的酶。
9.根据权利要求5至8中的任意一项所述的微生物，其中，相比于在野生型微生物中的相应酶活性，所述微生物另外包含具有精氨基琥珀酸合成酶功能的具有增大的活性的酶。
10.根据权利要求5至9中的任意一项所述的微生物，其中所述酶的增大的活性通过过表达所述编码相应酶的基因来实现。
11.根据权利要求5至10中的任意一项所述的微生物，其中精氨酸操纵子(argCJBDFR)是过表达的。
12.根据权利要求5至10中的任意一项所述的微生物，其中，编码精氨酸响应性阻遏蛋白ArgR的argR基因的表达与在野生型微生物中的所述argR基因的表达相比减弱，或其中所述argR基因缺失。
13.根据权利要求5至10或12中的任意一项所述的微生物，其中至少一种或多种编码L-精氨酸生物合成途径的酶的基因是过表达的，所述基因包括分别编码谷氨酸脱氢酶、鸟氨酸乙酰基转移酶、乙酰谷氨酸激酶、乙酰谷氨酰磷酸还原酶和编码乙酰鸟氨酸氨基转移酶的gdh、argJ、argB、argC和/或argD。
14.根据前述权利要求中的任意一项所述的微生物，其中所述编码具有L-精氨酸:甘氨酸脒基转移酶功能的蛋白质的基因是异源的。
15.根据前述权利要求中的任意一项所述的微生物，其中所述编码具有L-精氨酸:甘氨酸脒基转移酶功能的蛋白质的基因是过表达的。
16.根据前述权利要求中的任意一项所述的微生物，其中，所述具有乙醛酸氨基转移酶的酶活性的蛋白质包含与根据SEQ ID NO:2、根据SEQ ID NO:5或根据SEQ ID NO:8的氨基酸序列至少80％同源的氨基酸序列。
17.根据前述权利要求中的任意一项所述的微生物，其中所述具有L-精氨酸:甘氨酸脒基转移酶功能的蛋白质包含与根据SEQ ID NO:11的氨基酸序列至少80％同源的氨基酸序列。
18.根据前述权利要求中的任意一项所述的微生物，其中，所述微生物属于棒状杆菌属(genus Corynebacterium)，属于肠杆菌科属(genus Enterobacteriaceae)或属于假单胞菌属(genus Pseudomonas)。
19.根据权利要求18所述的微生物，其中所述微生物是谷氨酸棒状杆菌。
20.根据权利要求18所述的微生物，其中所述微生物是大肠杆菌。
21.根据权利要求18所述的微生物，其中所述微生物是恶臭假单胞菌。
22.用于胍基乙酸(GAA)的发酵制备的方法，其包括以下步骤：a)在合适的条件下在合适的培养基中培养如前述权利要求中的任意一项所述的微生物，和b)积累在所述培养基中的GAA以形成含GAA的发酵液。
23.根据权利要求22所述的方法，所述方法另外包括从所述含GAA的发酵液中分离GAA。
24.根据权利要求22或23所述的方法，所述方法另外包括将所述含GAA的发酵液干燥和/或造粒。
25.根据权利要求1至21中的任意一项所述的微生物，所述微生物另外包含编码具有胍基乙酸N-甲基转移酶活性的酶的基因。
26.根据权利要求27所述的微生物，其中所述编码具有胍基乙酸N-甲基转移酶活性的酶的基因是过表达的。
27.用于肌酸的发酵制备的方法，其包括以下步骤：a)在合适的条件下在合适的培养基中培养如权利要求27或28所述的微生物，和b)积累在所述培养基中的肌酸以形成含肌酸的发酵液。
28.根据权利要求29所述的方法，所述方法另外包括从所述含肌酸的发酵液中分离肌酸。
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