BR112020008718A2 - microrganismo geneticamente modificado, e, método de produção de etilenoglicol ou de um precursor de etilenoglicol. - Google Patents

microrganismo geneticamente modificado, e, método de produção de etilenoglicol ou de um precursor de etilenoglicol. Download PDF

Info

Publication number
BR112020008718A2
BR112020008718A2 BR112020008718-1A BR112020008718A BR112020008718A2 BR 112020008718 A2 BR112020008718 A2 BR 112020008718A2 BR 112020008718 A BR112020008718 A BR 112020008718A BR 112020008718 A2 BR112020008718 A2 BR 112020008718A2
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
microorganism
converting
enzyme
enzyme capable
ethylene glycol
Prior art date
Application number
BR112020008718-1A
Other languages
English (en)
Inventor
Michael Koepke
Rasmus Jensen
Original Assignee
Lanzatech, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lanzatech, Inc. filed Critical Lanzatech, Inc.
Publication of BR112020008718A2 publication Critical patent/BR112020008718A2/pt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/18—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic polyhydric
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0008—Oxidoreductases (1.) acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0014—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1096—Transferases (2.) transferring nitrogenous groups (2.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/42—Hydroxy-carboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/44—Polycarboxylic acids
    • C12P7/46—Dicarboxylic acids having four or less carbon atoms, e.g. fumaric acid, maleic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y102/00—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
    • C12Y102/01—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.2.1)
    • C12Y102/01003—Aldehyde dehydrogenase (NAD+) (1.2.1.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y102/00—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
    • C12Y102/01—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.2.1)
    • C12Y102/01021—Glycolaldehyde dehydrogenase (1.2.1.21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/03—Acyl groups converted into alkyl on transfer (2.3.3)
    • C12Y203/03001—Citrate (Si)-synthase (2.3.3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y206/00—Transferases transferring nitrogenous groups (2.6)
    • C12Y206/01—Transaminases (2.6.1)
    • C12Y206/01044—Alanine--glyoxylate transaminase (2.6.1.44)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
    • C12Y401/03—Oxo-acid-lyases (4.1.3)
    • C12Y401/03001—Isocitrate lyase (4.1.3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/30—Fuel from waste, e.g. synthetic alcohol or diesel

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

A invenção fornece microrganismos geneticamente modificados e métodos para a produção biológica de etilenoglicol e precursores de etilenoglicol. Em particular, o microrganismo da invenção produz etilenoglicol ou um precursor de etilenoglicol através de um ou mais de 5,10-metilenotetra-hidrofolato, oxaloacetato, citrato, malato e glicina. A invenção fornece, ainda, composições que compreendem etilenoglicol ou polímeros de etilenoglicol, tais como polietileno tereftalato.

Description

1 / 61 MICRORGANISMO GENETICAMENTE MODIFICADO, E, MÉTODO
DE PRODUÇÃO DE ETILENOGLICOL OU DE UM PRECURSOR DE ETILENOGLICOL ANTECEDENTES DA INVENÇÃO CAMPO DA INVENÇÃO
[001] A presente invenção refere-se a microrganismos geneticamente modificados e a métodos para a produção de etilenoglicol e precursores de etilenoglicol por fermentação microbiana, particularmente por fermentação microbiana de um substrato gasoso.
DESCRIÇÃO DA TÉCNICA RELACIONADA
[002] O etilenoglicol, também conhecido como monoetilenoglicol (MEG), tem um valor de mercado atual de mais de $ 33 bilhões de dólares americanos e é um componente importante de uma enorme variedade de produtos industriais, médicos e de consumo. Atualmente, o etilenoglicol é produzido usando processos de catálise química que requerem grandes quantidades de energia e água, geram vários subprodutos indesejáveis e dependem de matérias-primas petroquímicas. A demanda por materiais sustentáveis levou a alguns avanços tecnológicos, tais como a produção catalítica de etilenoglicol a partir de etanol derivado da cana-de-açúcar.
[003] Os precursores de etilenoglicol também são comercialmente valiosos. Por exemplo, o glicolato é usado em cuidados com a pele, cuidados pessoais, tingimento, bronzeamento e como agente de limpeza. O glioxilato é um intermediário para vanilina, produtos químicos agrícolas, antibióticos, alantoína e agentes complexantes.
[004] No entanto, sabe-se que nenhum microrganismo é capaz de produzir etilenoglicol biologicamente, e nenhuma rota totalmente biológica para a produção de etilenoglicol foi bem estabelecida. Algumas rotas biológicas para o etilenoglicol foram descritas na literatura a partir de açúcares. Por exemplo, Alkim et al., Microb Cell Fact, 14: 127, 2015
2 / 61 demonstraram a produção de etilenoglicol a partir de (D)-xilose em E. coli, mas notaram que eram requeridas condições aeróbicas para alcançar altos rendimentos. Da mesma forma, Pereira et al., Metab Eng, 34: 80 a 87, 2016 alcançaram a produção de etilenoglicol a partir de pentoses em E. coli. Alguns estudos sobre a produção de etilenoglicol a partir de pentoses também foram realizados em S. cerevisiae, mas mostraram resultados inconsistentes. Consultar, por exemplo, Uranukul et al., Metab Eng, 51: 20 a 31, 2018.
[005] A fermentação a gás fornece uma rota para utilizar uma ampla faixa de matérias-primas C1, de baixo custo prontamente disponíveis, tais como gases de resíduos industriais, gás de síntese ou metano reformado em produtos químicos e combustíveis. Visto que o metabolismo de fermentação a gás é significativamente diferente do metabolismo de fermentação de açúcar, o uso das rotas acima mencionadas não é prático, pois essas rotas requereriam a produção de precursores de açúcar a partir de gás por meio de gliconeogênese, um processo energético negativo. Até o momento, nenhuma rota para produzir etilenoglicol a partir de substratos gasosos está disponível.
[006] Em um exercício exploratório, Islam et al., Metab Eng, 41: 173 a 181, 2017 previram centenas de vias hipotéticas para a produção de etilenoglicol a partir de gás de síntese em M. thermoacetia usando ferramentas quiminformáticas. No entanto, não é possível, até mesmo para um versado na técnica, incorporar essas vias em um organismo de fermentação a gás, pois muitas das vias são inviáveis devido a restrições termodinâmicas ou outras. Por exemplo, quase 2.000 reações dependentes de oxigênio ou de radicais de oxigênio foram incluídas em Islam et al., o que não seria viável em um sistema estritamente anaeróbico. As únicas vias hipotéticas identificados por Islam et al. que possuem reações conhecidas requerem gliconeogênese ou etanol como um intermediário. Portanto, permanece a necessidade de sistemas de produção recombinante validados e energeticamente favoráveis que possam produzir altos rendimentos de
3 / 61 etilenoglicol e precursores de etilenoglicol a partir de substratos gasosos.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[007] Tendo em vista o contexto acima, a presente invenção fornece certas vantagens e avanços em relação à técnica anterior.
[008] Embora esta invenção divulgada neste documento não se limite a vantagens ou funcionalidades específicas, a invenção fornece um microrganismo geneticamente modificado capaz de produzir etilenoglicol ou um precursor de etilenoglicol a partir de um substrato gasoso.
[009] Em alguns aspectos do microrganismo divulgado neste documento, o microrganismo produz etilenoglicol ou o precursor de etilenoglicol através de um ou mais intermediários selecionados a partir do grupo que consiste em 5,10-metilenotetra-hidrofolato, oxaloacetato, citrato, malato e glicina.
[0010] Em alguns aspectos do microrganismo divulgado neste documento, o microrganismo compreende uma ou mais dentre uma enzima heteróloga capaz de converter oxaloacetato em citrato, uma enzima heteróloga capaz de converter glicina em glioxilato, uma enzima heteróloga capaz de converter isocitrato em glioxilato e uma enzima heteróloga capaz de converter glicolato em glicoaldeído.
[0011] Em alguns aspectos do microrganismo divulgado neste documento, a enzima heteróloga capaz de converter oxaloacetato em citrato é uma citrato [Si]-sintase [2.3.3.1], uma ATP citrato sintase [2.3.3.8]; ou uma citrato (Re)-sintase[2.3.3.3]; a enzima heteróloga capaz de converter glicina em glioxilato é uma alanina-glioxilato transaminase [2.6.1.44], uma serina- glioxilato transaminase [2.6.1.45], uma serina-piruvato transaminase [2.6.1.51], uma glicina-oxaloacetato transaminase [2.6.1.35], uma glicina transaminase [2.6.1.4], uma glicina desidrogenase [1.4.1.10], uma alanina desidrogenase [1.4.1.1] ou uma glicina desidrogenase [1.4.2.1]; a enzima heteróloga capaz de converter isocitrato em glioxilato é uma isocitrato-liase
4 / 61 [4.1.3.1]; e/ou a enzima heteróloga capaz de converter glicolato em glicolaldeído é uma glicolaldeído desidrogenase [1.2.1.21], uma lactaldeído desidrogenase [1.2.1.22], uma succinato-semialdeído desidrogenase [1.2.1.24], uma 2,5-dioxovalerato desidrogenase [1.2.1.26], uma aldeído desidrogenase [1.2.1.3/4/5], uma betaína-aldeído desidrogenase [1.2.1.8] ou uma aldeído ferredoxina oxidorredutase [1.2.7.5].
[0012] Em alguns aspectos do microrganismo divulgado neste documento, as enzimas heterólogas são derivadas de um gênero selecionado a partir do grupo que consiste em Bacillus, Clostridium, Escherichia, Gluconobacter, Hyphomicrobium, Lysinibacillus, Paenibacillus, Pseudomonas, Sedimenticola, Sporosarcina, Streptomyces, Thermithiobacillus, Thermotoga e Zea.
[0013] Em alguns aspectos do microrganismo divulgado neste documento, uma ou mais das enzimas heterólogas são otimizadas por códon para expressão no microrganismo.
[0014] Em alguns aspectos do microrganismo divulgado neste documento, o microrganismo compreende, ainda, uma ou mais dentre uma enzima capaz de converter acetil-CoA em piruvato; uma enzima capaz de converter piruvato em oxaloacetato; uma enzima capaz de converter piruvato em malato; uma enzima capaz de converter piruvato em fosfenolpiruvato; uma enzima capaz de converter oxaloacetato em citril-CoA; uma enzima capaz de converter citril-CoA em citrato; uma enzima capaz de converter citrato em aconitato e aconitato em isocitrato; uma enzima capaz de converter fosfoenolpiruvato em oxaloacetato; uma enzima capaz de converter fosfoenolpiruvato em 2-fosfo-D-glicerato; uma enzima capaz de converter 2- fosfo-D-glicerato em 3-fosfo-D-glicerato; uma enzima capaz de converter 3- fosfo-D-glicerato em 3-fosfonooxipiruvato; uma enzima capaz de converter 3- fosfonooxipiruvato em 3-fosfo-L-serina; uma enzima capaz de converter 3- fosfo-L-serina em serina; uma enzima capaz de converter serina em glicina;
5 / 61 uma enzima capaz de converter 5,10-metilenotetra-hidrofolato em glicina; uma enzima capaz de converter serina em hidroxipiruvato; uma enzima capaz de converter glicerato D em hidroxipiruvato; uma enzima capaz de converter malato em glioxilato; uma enzima capaz de converter glioxilato em glicolato; uma enzima capaz de converter hidroxipiruvato em glicoaldeído; e/ou uma enzima capaz de converter glicoaldeído em etilenoglicol.
[0015] Em alguns aspectos do microrganismo divulgado neste documento, o microrganismo superexpressa a enzima heteróloga capaz de converter oxaloacetato em citrato, a enzima heteróloga capaz de converter glicina em glioxilato e/ou a enzima heteróloga capaz de converter glicolato em glicoaldeído.
[0016] Em alguns aspectos do microrganismo divulgado neste documento, o microrganismo superexpressa a enzima capaz de converter piruvato em oxaloacetato, a enzima capaz de converter citrato em aconitato e aconitato isocitrato, a enzima capaz de converter fosfoenolpiruvato em oxaloacetato, a enzima capaz de converter serina em glicina, a enzima capaz de converter 5,10-metilenotetra-hidrofolato em glicina, a enzima capaz de converter glioxilato em glicolato; e/ou a enzima capaz de converter glicoaldeído em etilenoglicol.
[0017] Em alguns aspectos do microrganismo divulgado neste documento, o microrganismo compreende uma mutação disruptiva em uma ou mais enzimas selecionadas do grupo que consiste em isocitrato desidrogenase, glicerato desidrogenase, glicolato desidrogenase, glicerato desidrogenase, glicolato desidrogenase, aldeído ferredoxina oxidorredutase e aldeído desidrogenase.
[0018] Em alguns aspectos do microrganismo divulgado neste documento, o microrganismo é um membro de um gênero selecionado a partir do grupo que consiste em Acetobacterium, Alkalibaculum, Blautia, Butyribacterium, Clostridium, Eubacterium, Moorella, Oxobacter,
6 / 61 Sporomusa e Thermoanaerobacter.
[0019] Em alguns aspectos do microrganismo divulgado neste documento, o microrganismo é derivado de um microrganismo parental selecionado a partir do grupo que consiste em cetobacterium woodii, Alkalibaculum bacchii, Blautia producta, Butyribacterium methylotrophicum, Clostridium aceticum, Clostridium autoethanogenum, Clostridium carboxidivorans, Clostridium coskatii, Clostridium drakei, Clostridium formicoaceticum, Clostridium ljungdahlii, Clostridium magnum, Clostridium ragsdalei, Clostridium scatologenes, Eubacterium limosum, Moorella thermautotrophica, Moorella thermoacetica, Oxobacter pfennigii, Sporomusa ovata, Sporomusa silvacetica, Sporomusa sphaeroides e Thermoanaerobacter kiuvi.
[0020] Em alguns aspectos do microrganismo divulgado neste documento, o microrganismo é derivado de uma bactéria parental selecionada a partir do grupo que consiste em Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii, e Clostridium ragsdalei.
[0021] Em alguns aspectos do microrganismo divulgado neste documento, o microrganismo compreende uma via Wood-Ljungdahl nativa ou heteróloga.
[0022] Em alguns aspectos do microrganismo divulgado neste documento, o microrganismo produz glioxilato ou glicolato como um precursor de etilenoglicol.
[0023] A invenção fornece, ainda, um método de produção de etilenoglicol ou um precursor de etilenoglicol que compreende a cultura do microrganismo divulgado neste documento em um meio nutritivo e na presença de um substrato, em que o microrganismo produz etilenoglicol ou o precursor de etilenoglicol.
[0024] Em alguns aspectos do método divulgado neste documento, o substrato compreende um ou mais dentre CO, CO2 e H2.
7 / 61
[0025] Em alguns aspectos do método divulgado neste documento, pelo menos uma porção do substrato é gás residual industrial, gás industrial de saída ou gás de síntese.
[0026] Em alguns aspectos do método divulgado neste documento, o microrganismo produz glioxilato ou glicolato como precursores do etilenoglicol.
[0027] Em alguns aspectos do método divulgado neste documento, o método compreende, ainda, a separação do etilenoglicol ou o precursor de etilenoglicol do meio nutritivo.
[0028] Em alguns aspectos do método divulgado neste documento, o microrganismo produz, ainda, um ou mais dentre etanol, 2,3-butanodiol e succinato.
[0029] A invenção fornece, ainda, uma composição que compreende etilenoglicol produzido pelo método descrito neste documento. Em alguns aspectos, a composição é um anticongelante, um conservante, um agente de desidratação ou um fluido de perfuração.
[0030] A invenção fornece, ainda, um polímero que compreende etilenoglicol produzido pelo método descrito neste documento. Em alguns aspectos, o polímero é um homopolímero ou um copolímero. Em alguns aspectos, o polímero é polietilenoglicol ou polietileno tereftalato.
[0031] A invenção fornece, ainda, uma composição que compreende o polímero descrito neste documento. Em alguns aspectos, a composição é uma fibra, uma resina, um filme ou um plástico.
[0032] Essas e outras características e vantagens da presente invenção serão mais bem compreendidas a partir da descrição detalhada a seguir, obtida em conjunto com as reivindicações anexas. Nota-se que o escopo das reivindicações é definido pelas citações contidas nas mesmas e não pela discussão específica sobre características e vantagens estabelecidas na presente descrição.
8 / 61
DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0033] A descrição detalhada a seguir das modalidades da presente invenção pode ser melhor compreendida quando lida em conjunto com os desenhos a seguir, em que estrutura igual é indicada com referências numéricas iguais e em que:
[0034] A Figura 1 é um esquema que mostra vias para a produção de etilenoglicol, glicolato e glioxilato a partir de um substrato gasoso que compreende CO, CO2 e/ou H2.
[0035] As Figuras 2A a 2E são mapas de plasmídeos utilizados nos Exemplos 1 a 4. A Figura 2A é um mapa de vetor transportador de expressão, pIPL12, conforme descrito no Exemplo 1. A Figura 2B é um mapa do plasmídeo pMEG042, que compreende citrato sintase de B. subtilis, isocitrato liase de E. coli e glicolaldeído desidrogenase de G. oxydans, conforme descrito no Exemplo 1. A Figura 2C é um mapa do plasmídeo pMEG058, que compreende alanina-glioxilato aminotransferase de S. thiotaurini e aldeído desidrogenase de P. fluorescens, conforme descrito no Exemplo 2. A Figura 2D é um mapa do plasmídeo pMEG059, que compreende alanina-glioxilato aminotransferase de S. thiotaurini e aldeído desidrogenase de G. oxydans, conforme descrito no Exemplo 3. A Figura 2E é um mapa do plasmídeo pMEG061, que compreende aminotransferase de classe V de C. acidurici e aldeído desidrogenase de P. fluorescens, conforme descrito no Exemplo 4.
[0036] A Figura 3A mostra os níveis de biomassa (g peso celular seco/l) de C. autoethanogenum expressando pMEG042 (clones 1 a 3) ou C. autoethanogenum compreendendo um vetor vazio (controle negativo). A Figura 3B mostra o etilenoglicol produzido ao longo do tempo em C. autoethanogenum crescendo de modo autótrofo e que carrega o vetor de expressão pMEG042, em comparação com o controle negativo (vetor vazio). A Figura 3C mostra o glicolato produzido ao longo do tempo em C. autoethanogenum crescendo de modo autótrofo e carregando o vetor de
9 / 61 expressão pMEG042. Consultar Exemplo 1.
[0037] A Figura 4A mostra os níveis de biomassa (g peso celular seco/l) de C. autoethanogenum expressando pMEG058 (clones 1 a 2) ou C. autoethanogenum compreendendo um vetor vazio (controle negativo). A Figura 4B mostra o etilenoglicol produzido ao longo do tempo em C. autoethanogenum crescendo de modo autótrofo e carregando o vetor de expressão pMEG058, em comparação com o controle negativo (vetor vazio). Consultar Exemplo 2.
[0038] A Figura 5A mostra os níveis de biomassa (g peso celular seco/l) de C. autoethanogenum expressando pMEG059 (clones 1 a 3) ou C. autoethanogenum compreendendo um vetor vazio (controle negativo). A Figura 5B mostra o etilenoglicol produzido ao longo do tempo em C. autoethanogenum crescendo de modo autótrofo e carregando o vetor de expressão pMEG059, em comparação com o controle negativo (vetor vazio). Consultar Exemplo 3.
[0039] A Figura 6A mostra os níveis de biomassa (g peso celular seco/l) de C. autoethanogenum expressando pMEG061 (clones 1) ou C. autoethanogenum compreendendo um vetor vazio (controle negativo). A Figura 6B mostra o etilenoglicol produzido ao longo do tempo em C. autoethanogenum crescendo de modo autótrofo e carregando o vetor de expressão pMEG061, em comparação com o controle negativo (vetor vazio). Consultar Exemplo 4.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0040] A invenção fornece microrganismos para a produção biológica de etilenoglicol. Um “microrganismo" é um organismo microscópico, especialmente uma bactéria, arquea, vírus ou fungo. Em uma modalidade preferencial, o microrganismo da invenção é uma bactéria.
[0041] O termo "ocorrência não natural", quando usado em referência a um microrganismo, se destina a significar que o microrganismo tem pelo
10 / 61 menos uma modificação genética não encontrada em uma cepa de ocorrência natural da espécie referenciada, incluindo as cepas de tipo selvagem da espécie referenciada. Microrganismos de ocorrência não natural são tipicamente desenvolvidos em um laboratório ou em centros de pesquisa. Os microrganismos da invenção são de ocorrência não natural.
[0042] Os termos "modificação genética", "alteração genética" ou “engenharia genética" se referem amplamente à manipulação do genoma ou ácidos nucleicos de um microrganismo pela mão do homem. Da mesma forma, os termos “geneticamente modificado”, “geneticamente alterado” ou “submetido à engenharia genética” se referem a um microrganismo que contém essa modificação genética, alteração genética ou engenharia genética. Esses termos podem ser usados para diferenciar um microrganismo gerado em laboratório de um microrganismo de ocorrência natural. Os métodos de modificação genética de inclusão, por exemplo, de expressão heteróloga de genes, inserção ou deleção de genes ou promotores, mutação de ácidos nucleicos, expressão ou inativação de genes alterados, engenharia enzimática, evolução direcionada, projeto baseado em conhecimento, métodos de mutagênese aleatória, embaralhamento de genes e otimização de códons. Os microrganismos da invenção são geneticamente modificados.
[0043] "Recombinante" indica que um ácido nucleico, proteína ou microrganismo é o produto de modificação, engenharia ou recombinação genética. De modo geral, o termo “recombinante” refere-se a um ácido nucleico, a uma proteína ou a um microrganismo que contém ou é codificado por material genético derivado de múltiplas fontes, tais como duas ou mais cepas ou espécies diferentes de microrganismos. Os microrganismos da invenção são geralmente recombinantes.
[0044] "Tipo selvagem" refere-se à forma típica de um organismo, cepa, gene ou característica que ocorre na natureza, distinta das formas mutantes ou variantes.
11 / 61
[0045] “Endógeno” refere-se a um ácido nucleico ou a uma proteína que está presente ou é expressa no microrganismo do tipo selvagem ou parental do qual o microrganismo da invenção é derivado. Por exemplo, um gene endógeno é um gene que está presente de forma nativa no microrganismo do tipo selvagem ou parental do qual o microrganismo da invenção é derivado. Em uma modalidade, a expressão de um gene endógeno pode ser controlada por um elemento regulador exógeno, tal como um promotor exógeno.
[0046] "Exógeno" refere-se a um ácido nucleico ou proteína que se origina fora do microrganismo da invenção. Por exemplo, uma enzima ou gene exógeno pode ser criado de forma artificial ou recombinante e introduzido ou expresso no microrganismo da invenção. Um gene ou enzima exógena também pode ser isolada de um microrganismo heterólogo e introduzida ou expressa no microrganismo da invenção. Os ácidos nucleicos exógenos podem ser adaptados para integrar no genoma do microrganismo da invenção ou para permanecer em um estado extracromossômico no microrganismo da invenção, por exemplo, em um plasmídeo.
[0047] "Heterólogo" refere-se a um ácido nucleico ou proteína que não está presente no microrganismo do tipo selvagem ou parental do qual o microrganismo da invenção é derivado. Por exemplo, um gene ou enzima heteróloga pode ser derivada de uma cepa ou espécie diferente e introduzida ou expressa no microrganismo da invenção. O gene ou enzima heteróloga pode ser introduzida ou expressa no microrganismo da invenção na forma em que ocorre nas diferentes cepas ou espécies. Alternativamente, o gene ou enzima heteróloga pode ser modificada de alguma maneira, por exemplo, otimizando o códon para expressão no microrganismo da invenção ou modificando o mesmo para alterar a função, tal como para reverter a direção da atividade enzimática ou para alterar a especificidade de substrato.
[0048] Em particular, um ácido nucleico ou proteína heteróloga
12 / 61 expressa no microrganismo descrito neste documento pode ser derivado de Bacillus, Clostridium, Escherichia, Gluconobacter, Hyphomicrobium, Lysinibacillus, Paenibacillus, Pseudomonas, Sedimenticola, Sporosarcina, Streptomyces, Thermithiobacillus, Thermotoga, Zea, Klebsiella, Mycobacterium, Salmonella, Mycobacteroides, Staphylococcus, Burkholderia, Listeria, Acinetobacter, Shigella, Neisseria, Bordetella, Streptococcus, Enterobacter, Vibrio, Legionella, Xanthomonas, Serratia, Cronobacter, Cupriavidus, Helicobacter, Yersinia, Cutibacterium, Francisella, Pectobacterium, Arcobacter, Lactobacillus, Shewanella, Erwinia, Sulfurospirillum, Peptococcaceae, Thermococcus, Saccharomyces, Pyrococcus, Glycine, Homo, Ralstonia, Brevibacterium, Methylobacterium, Geobacillus, bos, gallus, Anaerococcus, Xenopus, Amblyrhynchus, rattus, mus, sus, Rhodococcus, Rhizobium, Megasphaera, Mesorhizobium, Peptococcus, Agrobacterium, Campylobacter, Acetobacterium, Alkalibaculum, Blautia, Butyribacterium, Eubacterium, Moorella, Oxobacter, Sporomusa, Thermoanaerobacter, Schizosaccharomyces, Paenibacillus, Fictibacillus, Lysinibacillus, Ornithinibacillus, Halobacillus, Kurthia, Lentibacillus, Anoxybacillus, Solibacillus, Virgibacillus, Alicyclobacillus, Sporosarcina, Salimicrobium, Sporosarcina, Planococcus, Corynebacterium, Thermaerobacter, Sulfobacillus ou Symbiobacterium.
[0049] Os termos "polinucleotídeo", "nucleotídeo", "sequência nucleotídica", "ácido nucleico" e "oligonucleotídeo" são usados de forma intercambiável. Os mesmos se referem a uma forma polimérica de nucleotídeos de qualquer comprimento, desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos, ou análogos dos mesmos. Os polinucleotídeos podem ter qualquer estrutura tridimensional e podem desempenhar qualquer função, conhecida ou desconhecida. Os seguintes exemplos não limitativos são exemplos de polinucleotídeos: regiões codificantes ou não codificantes de um gene ou fragmento de gene, loci (locus) definido a partir da análise de ligação,
13 / 61 éxons, íntrons, RNA mensageiro (mRNA), RNA de transferência, RNA ribossômico, RNA de interferências curtas (siRNA), RNA em forma de grampo curto (shRNA), micro-RNA (miRNA), ribozimas, cDNA, polinucleotídeos recombinantes, polinucleotídeos ramificados, plasmídeos, vetores, DNA isolado de qualquer sequência, RNA isolado de qualquer sequência, sondas de ácido nucleico e iniciadores. Um polinucleotídeo pode compreender um ou mais nucleotídeos modificados, tais como nucleotídeos metilados ou análogos de nucleotídeos. Se presente, modificações na estrutura nucleotídica podem ser feitas antes ou após a montagem do polímero. A sequência de nucleotídeos pode ser interrompida por componentes não nucleotídicos. Um polinucleotídeo pode ser adicionalmente modificado após polimerização, tal como por conjugação com um componente de marcação.
[0050] Conforme usado neste documento, "expressão" refere-se ao processo pelo qual um polinucleotídeo é transcrito de um modelo de DNA (tal como para dentro e mRNA ou outra transcrição de RNA) e/ou o processo pelo qual um mRNA transcrito é subsequentemente traduzido em peptídeos, polipeptídeos ou proteínas. Transcrições e polipeptídeos codificados podem ser denominados, coletivamente, "produtos genéticos".
[0051] Os termos "polipeptídeo", "peptídeo" e "proteína" são usados, neste documento, de forma intercambiável para se referir a polímeros de aminoácidos de qualquer comprimento. O polímero pode ser linear ou ramificado, pode compreender aminoácidos modificados e pode ser interrompido por não aminoácidos. Os termos também abrangem um polímero de aminoácido que foi modificado; por exemplo, por formação de ligação de dissulfeto, glicosilação, lipidação, acetilação, fosforilação ou qualquer outra manipulação, tal como conjugação com um componente de marcação. Conforme usado neste documento, o termo "aminoácido" inclui aminoácidos naturais e/ou não naturais ou sintéticos, incluindo glicina e os isômeros ópticos D ou L, e análogos de aminoácidos e peptidomiméticos.
14 / 61
[0052] "Atividade enzimática" ou simplesmente "atividade" refere-se, de maneira ampla, à atividade enzimática, incluindo, porém sem limitação, à atividade de uma enzima, à quantidade de uma enzima ou à disponibilidade de uma enzima para catalisar uma reação. Por conseguinte, "aumentar" a atividade enzimática inclui aumentar a atividade de uma enzima, aumentar a quantidade de uma enzima ou aumentar a disponibilidade de uma enzima para catalisar uma reação. Da mesma forma, "diminuir" a atividade enzimática inclui diminuir a atividade de uma enzima, diminuir a quantidade de uma enzima ou diminuir a disponibilidade de uma enzima para catalisar uma reação.
[0053] “Mutado” refere-se a um ácido nucleico ou proteína que foi modificada no microrganismo da invenção em comparação com o microrganismo do tipo selvagem ou parental do qual o microrganismo da invenção é derivado. Em uma modalidade, a mutação pode ser uma deleção, inserção ou substituição em um gene que codifica uma enzima. Em outra modalidade, a mutação pode ser uma deleção, inserção ou substituição de um ou mais aminoácidos em uma enzima.
[0054] Um "microrganismo parental" é um microrganismo usado para gerar um microrganismo da invenção. O microrganismo parental pode ser um microrganismo de ocorrência natural (isto é, um microrganismo do tipo selvagem) ou um microrganismo que foi modificado previamente (isto é, um microrganismo mutante ou recombinante). O microrganismo da invenção pode ser modificado para expressar ou superexpressar uma ou mais enzimas que não foram expressas ou superexpressas no microrganismo parental. De modo similar, o microrganismo da invenção pode ser modificado para conter um ou mais genes que não estavam contidos no microrganismo parental. O microrganismo da invenção também pode ser modificado para não expressar ou expressar quantidades mais baixas de uma ou mais enzimas que foram expressas no microrganismo parental.
15 / 61
[0055] O microrganismo da invenção pode ser derivado essencialmente de qualquer microrganismo parental. Em uma modalidade, o microrganismo da invenção pode ser derivado de um microrganismo parental selecionado do grupo que consiste em Clostridium acetobutylicum, Clostridium beijerinckii, Escherichia coli e Saccharomyces cerevisiae. Em outras modalidades, o microrganismo é derivado de um microrganismo parental selecionado a partir do grupo que consiste em Acetobacterium woodii, Alkalibaculum bacchii, Blautia product, Butyribacterium methylotrophicum, Clostridium aceticum, Clostridium autoethanogenum, Clostridium carboxidivorans, Clostridium coskatii, Clostridium drakei, Clostridium formicoaceticum, Clostridium ljungdahlii, Clostridium magnum, Clostridium ragsdalei, Clostridium scatologenes, Eubacterium limosum, Moorella thermautotrophica, Moorella thermoacetica, Oxobacter pfennigii, Sporomusa ovata, Sporomusa silvacetica, Sporomusa sphaeroides e Thermoanaerobacter kiuvi. Em uma modalidade preferencial, o microrganismo parental é Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii ou Clostridium ragsdalei. Em uma modalidade especialmente preferencial, o microrganismo parental é o Clostridium autoethanogenum LZ1561, que foi depositado em 7 de junho de 2010 na Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), localizada na Inhoffenstraß 7B, D-38124 Braunschwieg, Alemanha, em 7 de junho de 2010 sob os termos do Tratado de Budapeste e número de acesso concedido DSM23693. Essa cepa é descrita no Pedido de Patente Internacional n° PCT/NZ2011/000144, publicado como WO 2012/015317.
[0056] O termo "derivado de" indica que um ácido nucleico, proteína ou microrganismo é modificado ou adaptado de um ácido nucleico, proteína ou microrganismo diferente (por exemplo, um parental ou do tipo selvagem), de modo a produzir um novo ácido nucleico, proteína ou microrganismo. Tais
16 / 61 modificações ou adaptações incluem tipicamente inserção, deleção, mutação ou substituição de ácidos nucleicos ou genes. Gde modo geral, o microrganismo da invenção é derivado de um microrganismo parental. Em uma modalidade, o microrganismo da invenção é derivado de Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii ou Clostridium ragsdalei. Em uma modalidade preferencial, o microrganismo da invenção é derivado de Clostridium autoethanogenum LZ1561, que é depositado sob o número de acesso DSMZ DSM23693.
[0057] O microrganismo da invenção pode ainda ser classificado com base em características funcionais. Por exemplo, o microrganismo da invenção pode ser ou pode ser derivado de um microrganismo de fixação de C1, um anaeróbio, um acetógeno, um etanológeno, um carboxidotrófico e/ou um metanotrófico.
[0058] A Tabela 1 fornece uma lista representativa de microrganismos e identifica as características funcionais dos mesmos. TABELA 1 Carboxidotrófico Wood-Ljungdahl Fixação de C1 Etanológeno Acetógeno Anaeróbio Autótrofo Acetobacterium woodii + + + + +/- 1 + - Alkalibaculum bacchii + + + + + + + Blautia producta + + + + - + + Butyribacterium methylotrophicum + + + + + + + Clostridium aceticum + + + + - + + Clostridium autoethanogenum + + + + + + + Clostridium carboxidivorans + + + + + + + Clostridium coskatii + + + + + + + Clostridium drakei + + + + - + + Clostridium formicoaceticum + + + + - + + Clostridium ljungdahlii + + + + + + + Clostridium magnum + + + + - + +/- 2 Clostridium ragsdalei + + + + + + + Clostridium scatologenes + + + + - + + Eubacterium limosum + + + + - + + Moorella thermautotrophica + + + + + + + Moorella thermoacetica (anteriormente + + + + -3 + + Clostridium thermoaceticum) Oxobacter pfennigii + + + + - + +
17 / 61 TABELA 1 Carboxidotrófico Wood-Ljungdahl Fixação de C1 Etanológeno Acetógeno Anaeróbio Autótrofo Sporomusa ovata + + + + - + +/- 4 Sporomusa silvacetica + + + + - + +/- 5 Sporomusa sphaeroides + + + + - + +/- 6 Thermoanaerobacter kiuvi + + + + - + - 1 Acetobacterium woodi pode produzir etanol a partir de frutose, mas não a partir de gás. 2 Não foi investigado se o Clostridium magnum pode crescer em CO. 3 Uma cepa de Moorella thermoacetica, Moorella sp. HUC22-1, foi relatada como produtora de etanol a partir de gás. 4 Não foi investigado se Sporomusa ovata pode crescer em CO. 5 Não foi investigado se Sporomusa silvacetica pode crescer em CO. 6 Não foi investigado se Sporomusa sphaeroides pode crescer em CO.
[0059] "Wood-Ljungdahl" refere-se à via de fixação de carbono de Wood-Ljungdahl, conforme descrito, por exemplo, por Ragsdale, Biochim Biophys Acta, 1784: 1.873 a 1.898, 2008. "Microrganismos Wood-Ljungdahl" refere-se, previsivelmente, a microrganismos que contêm a via de Wood- Ljungdahl. Frequentemente, o microrganismo da invenção contém uma via nativa de Wood-Ljungdahl. Neste documento, uma via de Wood-Ljungdahl pode ser uma via de Wood-Ljungdahl nativa e não modificada ou pode ser uma via de Wood-Ljungdahl com algum grau de modificação genética (por exemplo, superexpressão, expressão heteróloga, knockout, etc.), desde que ainda funcione para converter CO, CO2 e/ou H2 em acetil-CoA.
[0060] “C1” refere-se a uma molécula de um carbono, por exemplo, CO, CO2, CH4 ou CH3OH. "C1-oxigenado" refere-se a uma molécula de um carbono que também compreende pelo menos um átomo de oxigênio, por exemplo, CO, CO2 ou CH3OH. "Fonte de carbono C1" refere-se a uma molécula de um carbono que serve como fonte parcial ou única de carbono para o microrganismo da invenção. Por exemplo, uma fonte de carbono C1 pode compreender um ou mais dentre CO, CO2, CH4, CH3OH ou CH2O2. Preferencialmente, a fonte de carbono C1 compreende um ou ambos dentre CO e CO2. Um "microrganismo de fixação C1" é um microrganismo capaz de produzir um ou mais produtos a partir de uma fonte de carbono C1.
18 / 61 Tipicamente, o microrganismo da invenção é uma bactéria de fixação de C1. Em uma modalidade preferencial, o microrganismo da invenção é derivado de um microrganismo de fixação de C1 identificado na Tabela 1.
[0061] Um “anaeróbio” é um microrganismo que não necessita de oxigênio para o crescimento. Um anaeróbio pode reagir negativamente ou até morrer se houver oxigênio acima de um determinado limite. No entanto, alguns anaeróbios são capazes de tolerar baixos níveis de oxigênio (por exemplo, 0,000001 a 5% de oxigênio), por vezes denominados "condições micro-óxicas". Frequentemente, o microrganismo da invenção é um anaeróbio. Em uma modalidade preferencial, o microrganismo da presente invenção é derivado de um anaeróbio identificado na Tabela 1.
[0062] “Acetógenos” são bactérias obrigatoriamente anaeróbicas que usam a via de Wood-Ljungdahl como mecanismo principal para a conservação de energia e para a síntese de acetil-CoA e produtos derivados de acetil-CoA, tais como acetato (Ragsdale, Biochim Biophys Acta, 1.784: 1.873 a 1.898, 2008). Em particular, os acetógenos usam a via de Wood-Ljungdahl como um (1) mecanismo para a síntese redutiva de acetil-CoA a partir de CO2, (2) processo de aceitação de elétrons terminais e de conservação de energia, (3) mecanismo para a fixação (assimilação) de CO2 na síntese de carbono celular (Drake, Prokaryotes Acetogenic, em: The Prokaryotes, 3a edição, página 354, Nova Iorque, NY, 2006). Todos os acetógenos de ocorrência natural são fixadores de C1, anaeróbicos, autótrofos e não metanotróficos. Frequentemente, o microrganismo da invenção é um acetógeno. Em uma modalidade preferencial, o microrganismo da invenção é derivado de um acetógeno identificado na Tabela 1.
[0063] Um “etanológeno” é um microrganismo que produz ou é capaz de produzir etanol. Frequentemente, o microrganismo da presente invenção é um etanológeno. Em uma modalidade preferencial, o microrganismo da invenção é derivado a partir de um etanológeno identificado na Tabela 1.
19 / 61
[0064] Um “autótrofo” é um microrganismo capaz de crescer na ausência de carbono orgânico. Em vez disso, os autótrofos usam fontes inorgânicas de carbono, tais como CO e/ou CO2. Frequentemente, o microrganismo da invenção é um autótrofo. Em uma modalidade preferencial, o microrganismo da invenção é derivado de um autótrofo identificado na Tabela 1.
[0065] Um "carboxidotrófico" é um microrganismo capaz de utilizar o CO como única fonte de carbono e energia. Frequentemente, o microrganismo da invenção é um carboxidotrófico. Em uma modalidade preferencial, o microrganismo da invenção é derivado de um carboxidotrófico identificado na Tabela 1.
[0066] Um “metanotrófico” é um microrganismo capaz de utilizar metano como uma única fonte de carbono e energia. Em certas modalidades, o microrganismo da invenção é um metanotrófico ou é derivado de um metanotrófico. Em outras modalidades, o microrganismo da invenção não é um metanotrófico ou não é derivado de um metanotrófico.
[0067] Em uma modalidade preferencial, o microrganismo da invenção é derivado do agrupamento de Clostridia que compreende as espécies Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii e Clostridium ragsdalei. Essas espécies foram relatadas e caracterizadas pela primeira vez por Abrini, Arch Microbiol, 161: 345 a 351, 1994 (Clostridium autoethanogenum), Tanner, Int J System Bacteriol, 43: 232 a 236, 1993 (Clostridium ljungdahlii), e Huhnke, WO 2008/028055 (Clostridium ragsdalei).
[0068] Essas três espécies têm muitas semelhanças. Em particular, essas espécies são todas membros fixadores de C1, anaeróbios, acetógenos, etanológenos e carboxidotróficos do gênero Clostridium. Essas espécies têm genótipos e fenótipos e modos de conservação de energia e metabolismo fermentativo similares. Além disso, essas espécies estão agrupadas no grupo I
20 / 61 de homologia clostridial de rRNA com o DNA 16S rRNA que é mais de 99% idêntico, têm um teor de DNA G + C de cerca de 22 a 30% em mol, são gram-positivas, têm morfologia e tamanho similares(células de crescimento logarítmico, entre 0,5 e 0,7 x 3a5 μm), são mesófilos (crescem, de maneira ideal, de 30 a37 °C), têm faixas de pH semilares de cerca de 4 a 7,5 (com um pH ideal de cerca de 5,5 a 6), não possuem citocromos e economizam energia por meio de um complexo Rnf. Além disso, a redução de ácidos carboxílicos nos álcoois correspondentes dos mesmos foi demonstrada nessas espécies (Perez, Biotechnol Bioeng, 110: 1.066 a 1.077, 2012). De modo importante, estas espécies também mostram forte crescimento autótrofo em gases contendo CO, produzem etanol e acetato (ou ácido acético) como principais produtos de fermentação e produzem pequenas quantidades de 2,3‐butanodiol e ácido lático sob certas condições.
[0069] No entanto, essas três espécies também apresentam diversas diferenças. Essas espécies foram isoladas de diferentes fontes: Clostridium autoethanogenum de intestino de coelho, Clostridium ljungdahlii de resíduos de galinheiro e Clostridium ragsdalei de sedimentos de água doce. Essas espécies diferem quanto à utilização de vários açúcares (por exemplo, ramnose, arabinose), ácidos (por exemplo, gluconato, citrato), aminoácidos (por exemplo, arginina, histidina) e outros substratos (por exemplo, betaína, butanol). Além disso, essas espécies diferem quanto à auxotrofia de determinadas vitaminas (por exemplo, tiamina, biotina). Essas espécies têm diferenças nas sequências nucleicas e de aminoácidos de genes e proteínas de via Wood-Ljungdahl, embora a organização geral e o número desses genes e proteínas sejam os mesmos em todas as espécies (Köpke, Curr Opin Biotechnol, 22: 320 a 325, 2011).
[0070] Assim, em resumo, muitas das características de Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii ou Clostridium ragsdalei não são específicas dessas espécies, mas são características gerais para este
21 / 61 agrupamento de membros fixadores de C1 anaeróbicos, acetógenos, etanológenos e carboxidotróficos do gênero Clostridium. No entanto, visto que essas espécies são, de fato, distintas, a modificação genética ou a manipulação de uma dessas espécies pode não ter um efeito idêntico em outra dessas espécies. Por exemplo, pode-se observar diferenças no crescimento, desempenho ou produção de produto.
[0071] O microrganismo da invenção também pode ser derivado de um isolado ou mutante de Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii ou Clostridium ragsdalei. Os isolados e mutantes de Clostridium autoethanogenum incluem JA1-1 (DSM10061) (Abrini, Arch Microbiol, 161: 345 a 351, 1994), LBS1560 (DSM19630) (WO 2009/064200) e LZ1561 (DSM23693) (WO 2012/015317). Os isolados e mutantes de Clostridium ljungdahlii incluem ATCC 49587 (Tanner, Int J Syst Bacteriol, 43: 232 a 236, 1993), PETCT (DSM13528, ATCC 55383), ERI‐2 (ATCC 55380) (US 5.593.886), C‐01 (ATCC 55988) (US 6.368.819), O‐52 (ATCC 55989) (US 6.368.819) e OTA‐1 (Tirado‐Acevedo, Production of bioethanol from synthesis gas using Clostridium ljungdahlii, Tese de PhD, Universidade do Estado da Carolina do Norte, 2010). Isolados e mutantes de Clostridium ragsdalei incluem PI 1 (ATCC BAA-622, ATCC PTA-7826) (WO 2008/028055).
[0072] Conforme descrito acima, no entanto, o microrganismo da invenção também pode ser derivado, essencialmente, de qualquer microrganismo parental, tal como um microrganismo parental selecionado do grupo que consiste em Clostridium acetobutylicum, Clostridium beijerinckii, Escherichia coli e Saccharomyces cerevisiae.
[0073] A invenção fornece microrganismos capazes de produzir etilenoglicol, glioxilato e glicolato, bem como métodos de produção de etilenoglicol, glioxilato e glicolato que compreendem a cultura do microrganismo da invenção na presença de um substrato, pelo qual o
22 / 61 microrganismo produz etilenoglicol.
[0074] Um microrganismo da invenção pode compreender uma enzima que converte acetil-CoA, tal como acetil-CoA produzido pela via Wood-Ljungdahl, em piruvato (reação 1 da Figura 1). Essa enzima pode ser uma piruvato sintase (PFOR) [1.2.7.1] ou uma ATP: piruvato, ortofosfato fosfotransferase [1.2.7.1]. Em algumas modalidades, a enzima que converte acetil-CoA em piruvato é uma enzima endógena.
[0075] Um microrganismo da invenção pode compreender uma enzima que converte piruvato em oxaloacetato (reação 2 da Figura 1). Essa enzima pode ser um piruvato: dióxido de carbono ligase [formação de ADP] [6.4.1.1]. Em algumas modalidades, a enzima que converte piruvato em oxaloacetato é uma enzima endógena. Em algumas modalidades, a enzima que converte piruvato em oxaloacetato é superexpressa.
[0076] Um microrganismo da invenção pode compreender uma enzima que converte oxaloacetato em citril-CoA (reação 3 da Figura 1). Essa enzima pode ser uma citril-CoA liase [4.1.3.34]. Em algumas modalidades, a enzima que converte oxaloacetato em citril-CoA é uma enzima endógena.
[0077] Um microrganismo da invenção pode compreender uma enzima que converte citril-CoA em citrato (reação 4 da Figura 1). Esta enzima pode ser uma citrato-CoA transferase [2.8.3.10]. Em algumas modalidades, a enzima que converte citril-CoA em citrato é uma enzima endógena.
[0078] Um microrganismo da invenção pode compreender uma enzima que converte oxaloacetato em citrato (reação 5 da Figura 1). Essa enzima pode ser uma citrato de [Si]-sintase [2.3.3.1], uma ATP citrato sintase [2.3.3.8] ou uma citrato (Re)-sintase [2.3.3.3]. Em algumas modalidades, a enzima que converte oxaloacetato em citrato é uma enzima endógena. Em outras modalidades, a enzima que converte oxaloacetato em citrato é uma enzima heteróloga. Por exemplo, em algumas modalidades, um microrganismo da invenção compreende citrato sintase 1 [EC 2.3.3.16] a
23 / 61 partir de B. subtilis, de modo que o microrganismo compreenda uma sequência nucleotídica estabelecida na SEQ ID NO: 1, que codifica a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, um microrganismo da invenção compreende citrato (Re)-sintase a partir de C. kluyveri, de modo que o microrganismo compreenda uma sequência nucleotídica estabelecida na SEQ ID NO: 3, que codifica a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 4. Em algumas modalidades, um microrganismo da invenção compreende citrato (Si)-sintase a partir de Clostridium sp., de modo que o microrganismo compreenda uma sequência nucleotídica estabelecida na SEQ ID NO: 5, que codifica a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 6. Em algumas modalidades, um microrganismo da invenção compreende citrato sintase 2 a partir de B. subtilis, de modo que o microrganismo compreenda uma sequência nucleotídica estabelecida na SEQ ID NO: 7, que codifica a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 8. Em algumas modalidades, a enzima que converte oxaloacetato em citrato é superexpressa.
[0079] Um microrganismo da invenção pode compreender uma enzima que converte citrato em aconitato e aconitato em isocitrato (reações 6 da Figura 1). Esta enzima pode ser uma aconitato hidratase [4.2.1.3]. Em algumas modalidades, a enzima que converte citrato em aconitato e aconitato em isocitrato é uma enzima endógena. Em algumas modalidades, a enzima que converte citrato em aconitato e aconitato em isocitrato é superexpressa.
[0080] Um microrganismo da invenção pode compreender uma enzima que converte isocitrato em glioxilato (reação 7 da Figura 1). Essa enzima pode ser uma isocitrato liase [4.1.3.1]. Em algumas modalidades, um microrganismo da invenção compreende isocitrato liase a partir de Z. mays, de modo que o microrganismo compreenda uma sequência nucleotídica estabelecida na SEQ ID NO: 9, que codifica a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades, um
24 / 61 microrganismo da invenção compreende isocitrato liase a partir de E. coli, de modo que o microrganismo compreenda uma sequência de nucleotídeos estabelecida na SEQ ID NO: 11, que codifica a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 12. Em algumas modalidades
[0081] Um microrganismo da invenção pode compreender uma enzima que converte glioxilato em glicolato (reação 8 da Figura 1). Esta enzima pode ser uma glicerato desidrogenase [1.1.1.29], uma glioxilato redutase [1.1.1.26/79] ou uma glicolato desidrogenase [1.1.99.14]. Em algumas modalidades, a enzima que converte glioxilato em glicolato é uma enzima endógena. Em algumas modalidades, a enzima que converte glioxilato em glicolato é superexpressa.
[0082] Um microrganismo da invenção pode compreender uma enzima que converte glicolato em glicoaldeído (reação 9 da Figura 1). Essa enzima pode ser uma glicolaldeído desidrogenase [1.2.1.21], uma lactaldeído desidrogenase [1.2.1.22], uma succinato-semialdeído desidrogenase [1.2.1.24], uma 2,5-dioxovalerato desidrogenase [1.2.1.26], uma aldeído desidrogenase [1.2.1.3/4/5], uma betaína-aldeído desidrogenase [1.2.1.8] ou uma aldeído ferredoxina oxidorredutase [1.2.7.5]. Em algumas modalidades, a enzima que converte glicolato em glicoaldeído é uma enzima endógena. Em outras modalidades, a enzima que converte glicolato em glicoaldeído é uma enzima heteróloga. Por exemplo, em algumas modalidades, um microrganismo da invenção compreende uma gama-aminobutiraldeído desidrogenase a partir de E. coli, de modo que o microrganismo compreenda uma sequência de nucleotídeos estabelecida na SEQ ID NO: 49, que codifica a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 50. Em algumas modalidades, um microrganismo da invenção compreende uma aldeído desidrogenase a partir de E. coli, de modo que o microrganismo compreenda uma sequência nucleotídica estabelecida na SEQ ID NO: 51, que codifica a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 52. Em algumas
25 / 61 modalidades, um microrganismo da invenção compreende uma succinato- semialdeído desidrogenase I dependente de NADP a partir de E. coli, de modo que o microrganismo compreenda uma sequência nucleotídica estabelecida na SEQ ID NO: 53, que codifica a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 54. Em algumas modalidades, um microrganismo da invenção compreende uma lactaldeído desidrogenase/glicolaldeído desidrogenase a partir de G. oxydans, de modo que o microrganismo compreenda uma sequência nucleotídica estabelecida na SEQ ID NO: 55, que codifica a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 56. Em algumas modalidades, um microrganismo da invenção compreende uma aldeído desidrogenase A a partir de P. fluorescens, de modo que o microrganismo compreenda uma sequência nucleotídica estabelecida na SEQ ID NO: 57 ou SEQ ID NO: 59, que codifica a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 58 ou SEQ ID NO: 60, respectivamente. Exemplos adicionais não limitativos de enzimas que convertem glicolato em glicolaldeído podem ser encontrados nos acessos do GenBank Nos. WP_003202098, WP_003182567, ACT39044, ACT39074, WP_041112005 e ACT40170. Em algumas modalidades, a enzima que converte glicolato em glicoaldeído é superexpressa.
[0083] Um microrganismo da invenção pode compreender uma enzima que converte glicoaldeído em etilenoglicol (reação 10 da Figura 1). Essa enzima pode ser uma lactaldeído redutase [1.1.1.77], uma álcool desidrogenase [1.1.1.1], uma álcool desidrogenase (NADP+) [1.1.1.2], uma glicerol desidrogenase [1.1.1.72], uma glicerol-3-fosfato desidrogenase [1.1.1.8] ou uma aldeído redutase [1.1.1.21]. Em algumas modalidades, a enzima que converte glicoaldeído em etilenoglicol é uma enzima endógena. Em algumas modalidades, a enzima endógena que converte glicoaldeído em etilenoglicol é superexpressa. Em outras modalidades, a enzima que converte glicoaldeído em etilenoglicol é uma enzima heteróloga. Em algumas
26 / 61 modalidades, um microrganismo da invenção compreende uma lactaldeído redutase a partir de C. saccharoperbutilacetonicum, de modo que o microrganismo compreenda uma sequência nucleotídica estabelecida na SEQ ID NO: 61, que codifica a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 62. Em algumas modalidades, um microrganismo da invenção compreende uma lactaldeído redutase a partir de C. ljungdahlii, de modo que o microrganismo compreenda uma sequência de nucleotídeos estabelecida na SEQ ID NO: 63, que codifica a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 64. Em algumas modalidades, um microrganismo da invenção compreende uma lactaldeído redutase a partir de E. coli, de modo que o microrganismo compreenda uma sequência nucleotídica estabelecida na SEQ ID NO: 65, que codifica a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 66. Em algumas modalidades, um microrganismo da invenção compreende uma lactaldeído redutase a partir de C. beijerinckii, de modo que o microrganismo compreenda uma sequência de nucleotídeos estabelecida na SEQ ID NO: 67, que codifica a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 68. Em algumas modalidades, a enzima heteróloga que converte glicoaldeído em etilenoglicol é superexpressa.
[0084] Um microrganismo da invenção pode compreender uma enzima que converte piruvato em malato (reação 11 da Figura 1). Essa enzima pode ser uma malato desidrogenase [1.1.1.37], uma malato desidrogenase (oxaloacetato-descarboxilado) [1.1.1.38], uma malato desidrogenase (descarboxilação) [1.1.1.39], uma malato desidrogenase (oxaloacetato- descarboxilado) (NADP+) [1.1.1.40], uma malato desidrogenase (NADP+) [1.1.1.82], uma D-malato desidrogenase (descarboxilação) [1.1.1.83], uma dimetilmalato desidrogenase [1.1.1.84], uma 3-isopropilmalato desidrogenase [1.1.1.85], uma malato desidrogenase [NAD(P)+] [1.1.1.299] ou uma malato desidrogenase (quinona) [1.1.5.4]. Em algumas modalidades, a enzima que converte piruvato em malato é uma enzima endógena. Em outras
27 / 61 modalidades, a enzima que converte piruvato em malato é uma enzima heteróloga. Por exemplo, em algumas modalidades, um microrganismo da invenção compreende uma malato desidrogenase a partir de C. autoethanogenum, de modo que o microrganismo compreenda uma sequência de nucleotídeos estabelecida na SEQ ID NO: 23, que codifica a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 24. Em algumas modalidades, um microrganismo da invenção compreende uma enzima málica dependente de NAD de C. autoethanogenum, de modo que o microrganismo compreenda uma sequência de nucleotídeos estabelecida na SEQ ID NO: 25, que codifica a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 26.
[0085] Um microrganismo da invenção pode compreender uma enzima que converte malato em glioxilato (reação 12 da Figura 1). Essa enzima pode ser uma malato sintase [2.3.3.9] ou uma isocitrato liase [4.1.3.1]. Em algumas modalidades, a enzima que converte malato em glioxilato é uma enzima heteróloga. Por exemplo, em algumas modalidades, um microrganismo da invenção compreende uma malato sintase G a partir de Sporosarcina sp., de modo que o microrganismo compreenda uma sequência nucleotídica estabelecida na SEQ ID NO: 27 ou SEQ ID NO: 33, que codifica a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 28 ou SEQ ID NO: 34, respectivamente. Em algumas modalidades, um microrganismo da invenção compreende uma malato sintase G a partir de Bacillus sp., de modo que o microrganismo compreenda uma sequência nucleotídica estabelecida na SEQ ID NO: 29 ou SEQ ID NO: 35, que codifica a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 30 ou SEQ ID NO: 36, respectivamente. Em algumas modalidades, um microrganismo da invenção compreende uma malato sintase a partir de S. coelicolor, de modo que o microrganismo compreenda uma sequência nucleotídica estabelecida na SEQ ID NO: 31, que codifica a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 32. Em algumas modalidades, um microrganismo da invenção compreende uma
28 / 61 malato sintase G a partir de B. infantis, de modo que o microrganismo compreenda uma sequência nucleotídica estabelecida na SEQ ID NO: 37, que codifica a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 38. Em algumas modalidades, um microrganismo da invenção compreende uma malato sintase a partir de C. cochlearium, de modo que o microrganismo compreenda uma sequência nucleotídica estabelecida na SEQ ID NO: 39, que codifica a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 40. Em algumas modalidades, um microrganismo da invenção compreende uma malato sintase G a partir de B. megaterium, de modo que o microrganismo compreenda uma sequência de nucleotídeos estabelecida na SEQ ID NO: 41, que codifica a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 42. Em algumas modalidades, um microrganismo da invenção compreende uma malato sintase a partir de Paenibacillus sp., de modo que o microrganismo compreenda uma sequência de nucleotídeos estabelecida na SEQ ID NO: 43, que codifica a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 44. Em algumas modalidades, um microrganismo da invenção compreende uma malato sintase a partir de Lysinibacillus sp., de modo que o microrganismo compreenda uma sequência de nucleotídeos estabelecida na SEQ ID NO: 45, que codifica a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 46. Em algumas modalidades, um microrganismo da invenção compreende uma malato sintase a partir de B. cereus, de modo que o microrganismo compreenda uma sequência nucleotídica estabelecida na SEQ ID NO: 47, que codifica a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 48.
[0086] Um microrganismo da invenção pode compreender uma enzima que converte piruvato em fosfoenolpiruvato (reação 13 da Figura 1). Essa enzima pode ser uma piruvato quinase [2.7.1.40], uma piruvato, fosfato diquinase [2.7.9.1] ou uma piruvato, água diquinase [2.7.9.2]. Em algumas modalidades, a enzima que converte piruvato em fosfoenolpiruvato é uma enzima endógena.
29 / 61
[0087] Um microrganismo da invenção pode compreender uma enzima que converte fosfoenolpiruvato em 2-fosfo-D-glicerato (reação 14 da Figura 1). Esta enzima pode ser uma fosfopiruvato hidratase [4.2.1.11]. Em algumas modalidades, a enzima que converte fosfoenolpiruvato em 2-fosfo- D-glicerato é uma enzima endógena.
[0088] Um microrganismo da invenção pode compreender uma enzima que converte 2-fosfo-D-glicerato em 3-fosfo-D-glicerato (reação 15 da Figura 1). Essa enzima pode ser uma fosfoglicerato mutase [5.4.2.11/12]. Em algumas modalidades, a enzima que converte 2-fosfo-D-glicerato em 3- fosfo-D-glicerato é uma enzima endógena.
[0089] Um microrganismo da invenção pode compreender uma enzima que converte 3-fosfo-D-glicerato em 3-fosfonooxipiruvato (reação 16 da Figura 1). Esta enzima pode ser uma fosfoglicerato desidrogenase [1.1.1.95]. Em algumas modalidades, a enzima que converte 3-fosfo-D- glicerato em 3-fosfonooxipiruvato é uma enzima endógena.
[0090] Um microrganismo da invenção pode compreender uma enzima que converte 3-fosfonooxipiruvato em 3-fosfo-L-serina (reação 17 da Figura 1). Essa enzima pode ser uma fosfoserina transaminase [2.6.1.52]. Em algumas modalidades, a enzima que converte 3-fosfonooxipiruvato em 3- fosfo-L-serina é uma enzima endógena.
[0091] Um microrganismo da invenção pode compreender uma enzima que converte 3-fosfo-L-serina em serina (reação 18 da Figura 1). Essa enzima pode ser uma fosfoserina fosfatase [3.1.3.3]. Em algumas modalidades, a enzima que converte 3-fosfo-L-serina em serina é uma enzima endógena.
[0092] Um microrganismo da invenção pode compreender uma enzima que converte serina em glicina (reação 19 da Figura 1). Essa enzima pode ser uma glicina hidroximetiltransferase [2.1.2.1]. Em algumas modalidades, a enzima que converte serina em glicina é uma enzima
30 / 61 endógena. Em algumas modalidades, a enzima que converte serina em glicina é superexpressa.
[0093] Um microrganismo da invenção pode compreender uma enzima que converte glicina em glioxilato (reação 20 da Figura 1). Essa enzima pode ser uma alanina-glioxilato aminotransferase/transaminase [2.6.1.44], uma serina-glioxilato aminotransferase/transaminase [2.6.1.45], uma serina-piruvato aminotransferase/transaminase [2.6.1.51], uma glicina- oxaloacetase aminotransferase/transaminase [2.6.1.35], uma glicina transaminase [2.6.1.4], uma glicina desidrogenase [1.4.1.10], uma alanina desidrogenase [1.4.1.1] ou uma glicina desidrogenase [1.4.2.1]. Em algumas modalidades, a enzima que converte glicina em glioxilato é uma enzima endógena. Em outras modalidades, a enzima que converte glicina em glioxilato é uma enzima heteróloga. Por exemplo, em algumas modalidades, um microrganismo da invenção compreende serina-glioxilato aminotransferase a partir de H. methylovorum, de modo que o microrganismo compreenda uma sequência de nucleotídeos estabelecida na SEQ ID NO: 13, que codifica a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 14. Em algumas modalidades, um microrganismo da invenção compreende alanina- glioxilato aminotransferase a partir de S. thiotaurini, de modo que o microrganismo compreenda uma sequência de nucleotídeos estabelecida na SEQ ID NO: 15, que codifica a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 16. Em algumas modalidades, um microrganismo da invenção compreende alanina-glioxilato aminotransferase a partir de T. tepidarius, de modo que o microrganismo compreenda uma sequência de nucleotídeos estabelecida na SEQ ID NO: 17, que codifica a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 18. Em algumas modalidades, um microrganismo da invenção compreende uma aminotransferase de Classe V a partir de C. acidurici, de modo que o microrganismo compreenda uma sequência de nucleotídeos estabelecida na SEQ ID NO: 19, que codifica a
31 / 61 sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 20. Em algumas modalidades, um microrganismo da invenção compreende uma serina- piruvato aminotransferase a partir de T. maritima, de modo que o microrganismo compreenda uma sequência nucleotídica estabelecida na SEQ ID NO: 21, que codifica a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 22. Em algumas modalidades, a enzima que converte glicina em glioxilato é superexpressa.
[0094] Um microrganismo da invenção pode compreender uma enzima que converte serina em hidroxipiruvato (reação 21 da Figura 1). Essa enzima pode ser uma serina-piruvato transaminase [2.6.1.51], uma serina- glicoxilato transaminase [2.6.1.45], uma alanina desidrogenase [1.4.1.1], uma L-aminoácido desidrogenase [1.4.1.5], uma serina 2-desidrogenase [1.4.1.7], uma alanina transaminase [2.6.1.2], uma glutamina-piruvato transaminase [2.6.1.15], uma D-aminoácido transaminase [2.6.1.21], uma alanina-glioxilato transaminase [2.6.1.44], ou uma serina-piruvato transaminase [2.6.1.51]. Em algumas modalidades, a enzima que converte serina em hidroxipiruvato é uma enzima endógena. Em outras modalidades, a enzima que converte serina em hidroxipiruvato é uma enzima heteróloga. Exemplos não limitativos de enzimas capazes de converter serina em hidroxipiruvato podem ser encontrados nos Acessos do GenBank Nos. WP_009989311 e NP_511062.1. Em algumas modalidades, a enzima que converte serina em hidroxipiruvato é superexpressa.
[0095] Um microrganismo da invenção pode compreender uma enzima que converte hidroxipiruvato em glicoaldeído (reação 22 da Figura 1). Esta enzima pode ser uma hidroxipiruvato descarboxilase [4.1.1.40] ou uma piruvato descarboxilase [4.1.1.1]. Essa enzima também pode ser qualquer outra descarboxilase [4.1.1.-]. Em algumas modalidades, a enzima que converte hidroxipiruvato em glicoaldeído é uma enzima heteróloga. Exemplos não limitativos de enzimas capazes de converter hidroxipiruvato em
32 / 61 glicoaldeído podem ser encontrados nos Acesso do GenBank Nos. CCG28866, SVF98953, PA0096, CAA54522, KRU13460 e KLA26356.
[0096] Um microrganismo da invenção pode compreender uma enzima que converte D-glicerato em hidroxipiruvato (reação 23 da Figura 1). Esta enzima pode ser uma glioxilato redutase [EC 1.1.1.26], uma glicerato desidrogenase [EC 1.1.1.29] ou uma hidroxipiruvato redutase [EC 1.1.1.81]. Em algumas modalidades, a enzima que converte D-glicerato em hidroxipiruvato é uma enzima heteróloga. Exemplos não limitativos de enzimas capazes de converter D-glicerato em hidroxipiruvato podem ser encontrados em Acessos do GenBank Nos. SUK16841, RPK22618, KPA02240, AGW90762, CAC11987, Q9CA90 e Q9UBQ7.
[0097] Um microrganismo da invenção pode compreender um complexo de enzimas que converte 5,10-metilenotetra-hidrofolato em glicina (reação 24 da Figura 1). O 5,10-metilenotetra-hidrofolato é um cofator na ramificação redutora da via Wood-Ljungdahl e atua como arcabouço na produção de acetil-CoA. Este complexo pode ser um sistema de clivagem de glicina que compreende uma glicina desidrogenase [1.4.4.2], uma di- hidrolipoil desidrogenase [1.8.1.4] e uma aminometiltransferase (glicina sintase) [2.1.2.10]. Em algumas modalidades, as enzimas do complexo que converte 5,10-metilenotetra-hidrofolato em glicina são enzimas endógenas. Em algumas modalidades, as enzimas do sistema de clivagem de glicina são superexpressas.
[0098] Um microrganismo da invenção pode compreender uma enzima que converte fosfoenolpiruvato em oxaloacetato (reação 25 da Figura 1). Essa enzima pode ser uma fosfoenolpiruvato carboxiquinase (ATP) [4.1.1.49] ou (GTP) [4.1.1.32]. Em algumas modalidades, a enzima que converte fosfoenolpiruvato em oxaloacetato é uma enzima endógena. Em outras modalidades, a enzima que converte fosfoenolpiruvato em oxaloacetato é uma enzima heteróloga. Em algumas modalidades, a enzima que converte
33 / 61 fosfoenolpiruvato em oxaloacetato é superexpressa.
[0099] Em algumas modalidades, um microrganismo que compreende uma enzima que converte acetil-CoA em piruvato (reação 1 da Figura 1), uma enzima que converte piruvato em oxaloacetato (reação 2 da Figura 1), uma enzima que converte oxaloacetato em citrato (reação 5 de Figura 1), uma enzima que converte citrato em aconitato e aconitato em isocitrato (reações 6 da Figura 1), uma enzima que converte isocitrato em glioxilato (reação 7 da Figura 1), uma enzima que converte glioxilato em glicolato (reação 8 da Figura 1), uma enzima que converte glicolato em glicoaldeído (reação 9 da Figura 1) e uma enzima que converte glicoaldeído em etilenoglicol (reação 10 da Figura 1) produz etilenoglicol. Em um exemplo não limitativo, a enzima que converte oxaloacetato em citrato pode ser uma citrato sintase a partir de B. subtilis (SEQ ID NOs: 1 a 2). Em um exemplo não limitativo, a enzima que converte isocitrato em glioxilato pode ser uma isocitrato liase a partir de E. coli (SEQ ID NOs: 11 a 12). Em um exemplo não limitativo, a enzima que converte glicolato em glicolaldeído pode ser uma glicolaldeído desidrogenase a partir de G. oxydans (SEQ ID NOs: 55 a 56) ou uma aldeído desidrogenase a partir de P. fluorescens (SEQ ID NOs: 57 a 58). Uma ou mais enzimas que catalisam as reações 2, 5, 6, 8, 9 e 10, conforme mostrado na Figura 1, podem ser superexpressas. Consultar, por exemplo, o Exemplo 1 e a Figura 3B.
[00100] Em algumas modalidades, um microrganismo que compreende uma enzima que converte acetil-CoA em piruvato (reação 1 da Figura 1), uma enzima que converte piruvato em fosfoenolpiruvato (reação 13 da Figura 1), uma enzima que converte fosfoenolpiruvato em 2-fosfo-D-glicerato (reação 14 da Figura 1), uma enzima que converte 2-fosfo-D-glicerato em 3-fosfo-D- glicerato (reação 15 da Figura 1), uma enzima que converte 3-fosfo-D- glicerato em 3-fosfonooxipiruvato (reação 16 da Figura 1), uma enzima que converte 3-fosfonooxipiruvato em 3-fosfo-L-serina (reação 17 da Figura 1), uma enzima que converte 3-fosfo-L-serina em serina (reação 18 de Figura 1),
34 / 61 uma enzima que converte serina em glicina (reação 19 da Figura 1), uma enzima que converte glicina em glioxilato (reação 20 da Figura 1), uma enzima que converte glioxilato em glicolato (reação 8 da Figura 1), uma enzima que converte glicolato em glicoaldeído (reação 9 da Figura 1) e uma enzima que converte glicoaldeído em etilenoglicol (reação 10 da Figura 1) produz etilenoglicol. Em um exemplo não limitativo, a enzima que converte glicina em glioxilato pode ser uma alanina-glioxilato aminotransferase a partir de S. thiotaurini (SEQ ID NOs: 15 a 16) ou uma aminotransferase classe V a partir de C. acidurici (SEQ ID NOs: 19 a 20). Em um exemplo não limitativo, a enzima que converte glicolato em glicolaldeído pode ser uma glicolaldeído desidrogenase a partir de G. oxydans (SEQ ID NOs: 55 a 56) ou uma aldeído desidrogenase a partir de P. fluorescens (SEQ ID NOs: 57 a 58). Uma ou mais enzimas que catalisam as reações das etapas 19, 20, 8, 9 e 10, conforme mostrado na Figura 1, podem ser superexpressas. Consultar, por exemplo, os Exemplos 2 a 4 e as Figuras 4B, 5B e 6B.
[00101] Em algumas modalidades, um microrganismo que compreende uma enzima que converte acetil-CoA em piruvato (reação 1 da Figura 1), uma enzima que converte piruvato em oxaloacetato (reação 2 da Figura 1), uma enzima que converte oxaloacetato em citril-CoA (reação 3 da Figura 1), uma enzima que converte citril-CoA em citrato (reação 4 da Figura 1), uma enzima que converte citrato em aconitato e aconitato em isocitrato (reações 6 da Figura 1), uma enzima que converte isocitrato em glioxilato (reação 7 da Figura 1), uma enzima que converte glioxilato em glicolato (reação 8 da Figura 1), uma enzima que converte glicolato em glicoaldeído (reação 9 da Figura 1) e uma enzima que converte glicoaldeído em etilenoglicol (reação 10 da Figura 1) produz etilenoglicol. Em um exemplo não limitativo, a enzima que converte isocitrato em glioxilato pode ser uma isocitrato liase a partir de E. coli (SEQ ID NOs: 11 a 12). Em um exemplo não limitativo, a enzima que converte isocitrato em glioxilato pode ser uma isocitrato liase a partir de E.
35 / 61 coli (SEQ ID NOs: 11 a 12). Em um exemplo não limitativo, a enzima que converte glicolato em glicolaldeído pode ser uma glicolaldeído desidrogenase a partir de G. oxydans (SEQ ID NOs: 55 a 56) ou uma aldeído desidrogenase a partir de P. fluorescens (SEQ ID NOs: 57 a 58). Uma ou mais enzimas que catalisam as reações 2, 6, 8, 9 e 10, conforme mostrado na Figura 1, podem ser superexpressas.
[00102] Em algumas modalidades, um microrganismo que compreende uma enzima que converte acetil-CoA em piruvato (reação 1 da Figura 1), uma enzima que converte piruvato em malato (reação 11 da Figura 1), uma enzima que converte malato em glioxilato (reação 12 de Figura 1), uma enzima que converte glioxilato em glicolato (reação 8 da Figura 1), uma enzima que converte glicolato em glicoaldeído (reação 9 da Figura 1) e uma enzima que converte glicoaldeído em etilenoglicol (reação 10 da Figura 1) produz etilenoglicol. Em um exemplo não limitativo, a enzima que converte glicolato em glicolaldeído pode ser uma glicolaldeído desidrogenase a partir de G. oxydans (SEQ ID NOs: 55 a 56) ou uma aldeído desidrogenase a partir de P. fluorescens (SEQ ID NOs: 57 a 58). Uma ou mais das enzimas que catalisam as reações das etapas 8, 9 e 10, conforme mostrado na Figura 1, podem ser superexpressas.
[00103] Em algumas modalidades, um microrganismo que compreende um complexo de enzimas que converte 5,10-metilenotetra-hidrofolato em glicina (reação 24 da Figura 1), uma enzima que converte glicina em glioxilato (reação 20 da Figura 1), uma enzima que converte glioxilato em glicolato (reação 8 da Figura 1), uma enzima que converte glicolato em glicoaldeído (reação 9 da Figura 1) e uma enzima que converte glicoaldeído em etilenoglicol (reação 10 da Figura 1) produz etilenoglicol. Em um exemplo não limitativo, a enzima que converte glicina em glioxilato pode ser uma alanina-glioxilato aminotransferase a partir de S. thiotaurini (SEQ ID NOs: 15 a 16) ou uma aminotransferase classe V a partir de C. acidurici (SEQ
36 / 61 ID NOs: 19 a 20). Em um exemplo não limitativo, a enzima que converte glicolato em glicolaldeído pode ser uma glicolaldeído desidrogenase a partir de G. oxydans (SEQ ID NOs: 55 a 56) ou uma aldeído desidrogenase a partir de P. fluorescens (SEQ ID NOs: 57 a 58). Uma ou mais enzimas que catalisam as reações das etapas 8, 9, 10, 20 e 24 podem ser superexpressas.
[00104] Em algumas modalidades, um microrganismo que compreende uma enzima que converte acetil-CoA em piruvato (reação 1 da Figura 1), uma enzima que converte piruvato em fosfoenolpiruvato (reação 13 da Figura 1), uma enzima que converte fosfoenolpiruvato em oxaloacetato (reação 25 de Figura 1), uma enzima que converte oxaloacetato em citril-CoA (reação 3 da Figura 1), uma enzima que converte citril-CoA em citrato (reação 4 da Figura 1), uma enzima que converte citrato em aconitato e aconitato em isocitrato (reações 6 da Figura 1), uma enzima que converte isocitrato em glioxilato (reação 7 da Figura 1), uma enzima que converte glioxilato em glicolato (reação 8 da Figura 1), uma enzima que converte glicolato em glicoaldeído (reação 9 de Figura 1) e uma enzima que converte glicoaldeído em etilenoglicol (reação 10 da Figura 1) produz etilenoglicol. Em um exemplo não limitativo, a enzima que converte isocitrato em glioxilato pode ser uma isocitrato liase a partir de E. coli (SEQ ID NOs: 11 a 12). Em um exemplo não limitativo, a enzima que converte glicolato em glicolaldeído pode ser uma glicolaldeído desidrogenase a partir de G. oxydans (SEQ ID NOs: 55 a 56) ou uma aldeído desidrogenase a partir de P. fluorescens (SEQ ID NOs: 57 a 58). Uma ou mais enzimas que catalisam as reações 2, 6, 8, 9, 10 e 25, conforme mostrado na Figura 1, podem ser superexpressas.
[00105] Em algumas modalidades, um microrganismo compreendendo uma enzima que converte acetil-CoA em piruvato (reação 1 da Figura 1), uma enzima que converte piruvato em fosfoenolpiruvato (reação 13 da Figura 1), uma enzima que converte fosfoenolpiruvato em oxaloacetato (reação 25 de Figura 1), uma enzima que converte oxaloacetato em citrato (reação 5 da
37 / 61 Figura 1), uma enzima que converte citrato em aconitato e aconitato em isocitrato (reações 6 da Figura 1), uma enzima que converte isocitrato em glioxilato (reação 7 da Figura 1), uma enzima que converte glioxilato em glicolato (reação 8 da Figura 1), uma enzima que converte glicolato em glicoaldeído (reação 9 da Figura 1) e uma enzima que converte glicoaldeído em etilenoglicol (reação 10 da Figura 1) produz etilenoglicol. Em um exemplo não limitativo, a enzima que converte oxaloacetato em citrato pode ser uma citrato sintase a partir de B. subtilis (SEQ ID NOs: 1 a 2). Em um exemplo não limitativo, a enzima que converte isocitrato em glioxilato pode ser uma isocitrato liase a partir de E. coli (SEQ ID NOs: 11 a 12). Em um exemplo não limitativo, a enzima que converte glicolato em glicolaldeído pode ser uma glicolaldeído desidrogenase a partir de G. oxydans (SEQ ID NOs: 55 a 56) ou uma aldeído desidrogenase a partir de P. fluorescens (SEQ ID NOs: 57 a 58). Uma ou mais enzimas que catalisam as reações 5, 6, 8, 9, 10 e 25, conforme mostrado na Figura 1, podem ser superexpressas.
[00106] Em algumas modalidades, um microrganismo que compreende uma enzima que converte acetil-CoA em piruvato (reação 1 da Figura 1), uma enzima que converte piruvato em fosfoenolpiruvato (reação 13 da Figura 1), uma enzima que converte fosfoenolpiruvato em 2-fosfo-D-glicerato (reação 14 da Figura 1), uma enzima que converte 2-fosfo-D-glicerato em 3-fosfo-D- glicerato (reação 15 da Figura 1), uma enzima que converte 3-fosfo-D- glicerato em 3-fosfonooxipiruvato (reação 16 da Figura 1), uma enzima que converte 3-fosfonooxipiruvato em 3-fosfo-L-serina (reação 17 da Figura 1), uma enzima que converte 3-fosfo-L-serina em serina (reação 18 da Figura 1) compreende uma enzima que converte serina em hidroxipiruvato (reação 21 da Figura 1), uma enzima que converte hidroxipiruvato em glicoaldeído (reação 22 da Figura 1) e uma enzima que converte glicoaldeído em etilenoglicol (reação 10 da Figura 1) produz etilenoglicol. A enzima que catalisa a conversão de glicoaldeído em etilenoglicol pode ser superexpressa.
38 / 61
[00107] Em algumas modalidades, um microrganismo que compreende uma enzima que converte D-glicerato em hidroxipiruvato (reação 23 da Figura 1), uma enzima que converte hidroxipiruvato em glicoaldeído (reação 22 da Figura 1) e uma enzima que converte glicoaldeído em etilenoglicol (reação 10 da Figura 1) produz etilenoglicol. A enzima que catalisa a conversão de glicoaldeído em etilenoglicol pode ser superexpressa.
[00108] As enzimas da invenção podem ser otimizadas com códon para expressão no microrganismo da invenção. A “otimização com códon" refere- se à mutação de um ácido nucleico, tal como um gene, para tradução otimizada ou aprimorada do ácido nucleico em uma cepa ou espécie específica. A otimização com códon pode resultar em taxas de tradução mais rápidas ou maior precisão na tradução. Em uma modalidade preferencial, os genes da invenção são otimizados com códon para expressão no microrganismo da invenção. Embora a otimização com códons se refira à sequência genética subjacente, a otimização com códons geralmente resulta em melhor tradução e, portanto, melhor expressão de enzimas. Por conseguinte, as enzimas da invenção também podem ser descritas como sendo otimizadas com códons.
[00109] Uma ou mais das enzimas da invenção podem ser superexpressas. "Superexpressa" refere-se a um aumento na expressão de um ácido nucleico ou proteína no microrganismo da invenção em comparação com o microrganismo de tipo selvagem ou parental a partir do qual o microrganismo da invenção é derivado. A superexpressão pode ser alcançada por qualquer meio conhecido na técnica, incluindo a modificação do número de cópias de genes, taxa de transcrição de genes, taxa de tradução de genes ou taxa de degradação de enzimas. Conforme descrito acima, uma ou mais das enzimas que catalisam as reações 2, 5, 6, 8, 9, 10, 19, 20, 24 ou 25 da Figura 1 podem ser superexpressas.
[00110] As enzimas da invenção podem compreender uma mutação
39 / 61 disruptiva. Uma “mutação disruptiva” se refere a uma mutação que reduz ou elimina (isto é, “interrompe”) a expressão ou atividade de um gene ou enzima. A mutação disruptiva pode inativar parcialmente, inativar totalmente, ou deletar o gene ou enzima. A mutação disruptiva pode ser uma mutação por knockout (KO). A mutação disruptiva pode ser qualquer mutação que reduza, previna ou bloqueie a biossíntese de um produto produzido por uma enzima. A mutação disruptiva pode incluir, por exemplo, uma mutação em um gene que codifica uma enzima, uma mutação em um elemento regulatório genético envolvido na expressão de um gene que codifica uma enzima, a introdução de um ácido nucleico que produz uma proteína que reduz ou inibe a atividade de uma enzima, ou a introdução de um ácido nucleico (por exemplo, RNA antissentido, siRNA, CRISPR) ou proteína que inibe a expressão de uma enzima. A mutação disruptiva pode ser introduzida com o uso de qualquer método conhecido na técnica.
[00111] Em algumas modalidades, o microrganismo da invenção compreende uma mutação disruptiva em isocitrato desidrogenase [1.1.1.41]. A isocitrato desidrogenase converte isocitrato em 2-oxoglutarato. A disrupção de isocitrato desidrogenase, tal como pela deleção de isocitrato desidrogenase, resulta em níveis aumentados de isocitrato.
[00112] Em algumas modalidades, o microrganismo da invenção compreende uma mutação disruptiva na glicerato desidrogenase [1.1.1.29]. A glicerato desidrogenase converte glioxilato em glicolato. A disrupção de glicerato desidrogenase, tal como pela deleção de isocitrato desidrogenase, resulta em níveis aumentados de glioxilato.
[00113] Em algumas modalidades, o microrganismo da invenção compreende uma mutação disruptiva na glicolato desidrogenase [1.1.99.14]. A glicolato desidrogenase converte glioxilato em glicolato. A disrupção de glicolato desidrogenase, tal como pela deleção de glicolato desidrogenase, resulta em níveis aumentados de glioxilato.
40 / 61
[00114] Em algumas modalidades, o microrganismo da invenção compreende uma mutação disruptiva na aldeído ferredoxina oxidorredutase [1.2.7.5]. A aldeído ferredoxina oxidorredutase converte glicolato em glicoaldeído. A disrupção de aldeído ferredoxina oxidorredutase, tal como pela deleção de aldeído ferredoxina oxidorredutase, resulta em níveis aumentados de glicolato.
[00115] Em algumas modalidades, o microrganismo da invenção compreende uma mutação disruptiva naaldeído desidrogenase [1.2.1.3/1.2.3.4/1.2.3.5]. A aldeído desidrogenase converte glicolato em glicoaldeído. A disrupção de aldeído desidrogenase, tal como pela deleção de aldeído desidrogenase, resulta em níveis aumentados de glicolato.
[00116] A introdução de uma mutação disruptiva resulta em um microrganismo da invenção que não produz produto-alvo ou substancialmente nenhum produto-alvo ou uma quantidade reduzida de produto-alvo em comparação com o microrganismo parental do qual o microrganismo da invenção é derivado. Por exemplo, o microrganismo da invenção pode não produzir produto-alvo ou pelo menos cerca de 1%, 3%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 95% menos produto-alvo do que o microrganismo parental. Por exemplo, o microrganismo da invenção pode produzir menos que cerca de 0,001, 0,01, 0,10, 0,30, 0,50 ou 1,0 g/l de produto-alvo.
[00117] Embora sequências e fontes exemplificativas de enzimas sejam fornecidas neste documento, a invenção não é, de forma alguma, limitada a essas sequências e fontes - a mesma também abrange variantes. O termo "variantes" inclui ácidos nucleicos e proteínas cuja sequência varia da sequência de um ácido nucleico e proteína de referência, tal como uma sequência de um ácido nucleico e proteína de referência divulgados na técnica anterior ou exemplificados neste documento. A invenção pode ser colocada em prática utilizando ácidos nucleicos ou proteínas variantes que
41 / 61 desempenham substancialmente a mesma função que o ácido nucleico ou proteína de referência. Por exemplo, uma proteína variante pode desempenhar substancialmente a mesma função ou catalisar substancialmente a mesma reação que uma proteína de referência. Um gene variante pode codificar a mesma ou substancialmente a mesma proteína que um gene de referência. Um promotor variante pode ter substancialmente a mesma capacidade de promover a expressão de um ou mais genes que um promotor de referência.
[00118] Tais ácidos nucleicos ou proteínas podem ser denominados, neste documento, "variantes funcionalmente equivalentes". A título de exemplo, variantes funcionalmente equivalentes de um ácido nucleico podem incluir variantes alélicas, fragmentos de um gene, genes mutados, polimorfismos e similares. Genes homólogos de outros microrganismos também são exemplos de variantes funcionalmente equivalentes. Esses incluem genes homólogos em espécies, tais como Clostridium acetobutylicum, Clostridium beijerinckii ou Clostridium ljungdahlii, cujos detalhes estão disponíveis publicamente em sites da web como o Genbank ou o NCBI. Variantes funcionalmente equivalentes também incluem ácidos nucleicos cuja sequência varia como resultado de otimização de códons para um microrganismo específico. Uma variante funcionalmente equivalente de um ácido nucleico terá, de preferência, pelo menos aproximadamente 70%, aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente95%, aproximadamente 98% ou mais de identidade de sequência de ácido nucleico(homologia percentual) com o ácido nucleico referenciado. Uma variante funcionalmente equivalente de uma proteína terá, de preferência, pelo menos aproximadamente70%, aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95%, aproximadamente 98%, ou mais de identidade de aminoácidos (homologia percentual) com a proteína referenciada. A equivalência funcional de um ácido nucleico ou proteína variante pode ser avaliada com o uso de qualquer
42 / 61 método conhecido na técnica.
[00119] Os ácidos nucleicos podem ser entregues a um microrganismo da invenção com o uso de qualquer método conhecido na técnica. Por exemplo, os ácidos nucleicos podem ser entregues como ácidos nucleicos nus ou podem ser formulados com um ou mais agentes, tais como lipossomas. Os ácidos nucleicos podem ser DNA, RNA, cDNA ou combinações dos mesmos, conforme apropriado. Inibidores de restrição podem ser utilizados em certas modalidades. Vetores adicionais podem incluir plasmídeos, vírus, bacteriófagos, cosmídeos e cromossomos artificiais. Em uma modalidade preferencial, os ácidos nucleicos são entregues ao microrganismo da invenção com o uso de um plasmídeo. A título de exemplo, a transformação (incluindo transdução ou transfecção) pode ser alcançada por meio de eletroporação, ultrassom, transformação mediada por polietilenoglicol, competência química ou natural, transformação de protoplastos, indução de prófago ou conjugação. Em certas modalidades que têm sistemas de enzimas de restrição ativos, pode ser necessário metilar um ácido nucleico antes da introdução do ácido nucleico em um microrganismo.
[00120] Além disso, os ácidos nucleicos podem ser projetados para compreender um elemento regulador, tal como um promotor, para aumentar ou, de outra forma, controlar a expressão de um ácido nucleico específico. O promotor pode ser um promotor constitutivo ou um promotor induzível. Idealmente, o promotor é um promotor de via Wood-Ljungdahl, um promotor de ferredoxina, um promotor de piruvato ferredoxina oxidorredutase, um promotor de operão de complexo de Rnf, um promotor de operão de ATP sintase ou um promotor de operão de fosfotransacetilase/acetato quinase.
[00121] "Substrato" refere-se a uma fonte de carbono e/ou energia para o microrganismo da invenção. Frequentemente, o substrato é gasoso e compreende uma fonte de carbono C1, por exemplo, CO, CO2 e/ou CH4. Preferencialmente, o substrato compreende uma fonte de carbono C1 de CO
43 / 61 ou CO + CO2. O substrato pode compreender, ainda, outros componentes diferentes de carbono, tais como H2, N2 ou elétrons. Em outras modalidades, no entanto, o substrato pode ser um carboidrato, tal como açúcar, amido, fibra, lignina, celulose ou hemicelulose ou uma combinação dos mesmos. Por exemplo, o carboidrato pode ser frutose, galactose, glicose, lactose, maltose, sacarose, xilose ou alguma combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, o substrato não compreende (D)-xilose (Alkim, Microb Cell Fact, 14: 127, 2015). Em algumas modalidades, o substrato não compreende uma pentose, tal como a xilose (Pereira, Metab Eng, 34: 80 a 87, 2016). Em algumas modalidades, o substrato pode compreender tanto os substratos gasosos quanto de carboidratos (fermentação mixotrófica).
[00122] O substrato gasoso compreende, de modo geral, pelo menos uma certa quantidade de CO, tal como cerca de 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100% em mol de CO. O substrato gasoso pode compreender uma faixa de CO, tal como cerca de 20 a 80, 30 a 70 ou 40 a 60% em mol de CO. Preferencialmente, o substrato gasoso compreende cerca de 40 a 70% em mol de CO (por exemplo, gás de usina siderúrgica ou de alto-forno), cerca de 20 a 30% em mol de CO (por exemplo, gás básico em forno de oxigênio) ou cerca de 15 a 45% em mol de CO (por exemplo, gás de síntese). Em algumas modalidades, o substrato gasoso pode compreender uma quantidade relativamente baixa de CO, tal como cerca de 1 a 10 ou 1 a 20% em mol de CO. O microrganismo da invenção tipicamente converte pelo menos uma porção do CO no substrato gasoso em um produto. Em algumas modalidades, o substrato gasoso compreende nenhum ou substancialmente nenhum (<1% em mol) CO.
[00123] O substrato gasoso pode compreender uma certa quantidade de H2. Por exemplo, o substrato gasoso pode compreender cerca de 1, 2, 5, 10, 15, 20 ou 30% em mol de H2. Em algumas modalidades, o substrato gasoso pode compreender uma quantidade relativamente elevada de H2, tal como
44 / 61 cerca de 60, 70, 80 ou 90% em mol de H2. Em outras modalidades, o substrato gasoso compreende nenhum ou substancialmente nenhum (<1% em mol) H2.
[00124] O substrato gasoso pode compreender uma certa quantidade de CO2. Por exemplo, o substrato gasoso pode compreender cerca de 1 a 80 ou 1 a 30% em mol de CO2. Em algumas modalidades, o substrato gasoso pode compreender menos que cerca de 20, 15, 10 ou 5% em mol de CO2. Em outra modalidade, o substrato gasoso compreende nenhum ou substancialmente nenhum (<1% em mol) CO2.
[00125] O substrato gasoso também pode ser fornecido em formas alternativas. Por exemplo, o substrato gasoso pode ser dissolvido em um líquido ou adsorvido em um suporte sólido.
[00126] O substrato gasoso e/ou a fonte de carbono C1 pode ser um gás residual ou um gás obtido como subproduto de um processo industrial ou de alguma outra fonte, tal como gases de exaustão de automóveis ou gaseificação de biomassa. Em certas modalidades, o processo industrial é selecionado a partir do grupo que consiste na fabricação de produtos de metais ferrosos, tal como uma fabricação de aço, fabricação de produtos não ferrosos, refino de petróleo, gaseificação de carvão, produção de energia elétrica, produção de negro de carbono, produção de amônia, produção de metanol e fabricação de coque. Nessas modalidades, o substrato gasoso e/ou a fonte de carbono C1 podem ser capturados do processo industrial antes de serem emitidos na atmosfera, com o uso de qualquer método conveniente.
[00127] O substrato gasoso e/ou a fonte de carbono C1 podem ser gás de síntese, tal como gás de síntese obtido por gaseificação de resíduos de carvão ou de refinaria, gaseificação de biomassa ou material lignocelulósico ou reforma de gás natural. Em outra modalidade, o gás de síntese pode ser obtido a partir da gaseificação de resíduos sólidos urbanos ou resíduos sólidos industriais.
45 / 61
[00128] A composição do substrato gasoso pode ter um impacto significativo na eficiência e/ou custo da reação. Por exemplo, a presença de oxigênio (O2) pode reduzir a eficiência de um processo de fermentação anaeróbica. Dependendo da composição do substrato, pode ser desejável tratar, esfregar ou filtrar o substrato para remover quaisquer impurezas indesejadas, tais como toxinas, componentes indesejados ou partículas de poeira e/ou aumentar a concentração de componentes desejáveis.
[00129] Em certas modalidades, a fermentação é realizada na ausência de substratos de carboidratos, tais como açúcar, amido, fibra, lignina, celulose ou hemicelulose.
[00130] Em algumas modalidades, a energia global de CO e H2 para etilenoglicol (MEG), é preferencial para a de glicose para etilenoglicol, conforme mostrado abaixo, em que quanto mais negativa a energia livre de Gibbs, ΔrG'm, os valores de COe H2 indicam uma força motriz maior para etilenoglicol. Os cálculos de delta G de reação geral para a comparação de glicose versus CO como substrato foram realizados usando o equilibrador (http://equilibrator.weizmann.ac.il/), que é um método padrão para avaliar a viabilidade geral de uma via ou etapas individuais em vias em sistemas biológicos (Flamholz, E. Noor, A. Bar-Even, R. Milo (2012) eQuilibrator - the biochemical thermodynamics calculator Nucleic Acids Res 40: D770 a 775; Noor, A. Bar-Even, A. Flamholz, Y. Lubling, D. Davidi, R. Milo (2012) An integrated open framework for thermodynamics of reactions that combines accuracy and coverageBioinformatics 28: 2.037 a 2.044; Noor, H.S. Haraldsdóttir, R. Milo, R.M.T. Fleming (2013) Consistent Estimation of Gibbs Energy Using Component Contributions PLoS Comput Biol 9(7): e1003098; Noor, A. Bar-Even, A. Flamholz, E. Reznik, W. Liebermeister, R. Milo (2014) Pathway Thermodynamics Highlights Kinetic Obstacles in Central Metabolism PLoS Comput Biol 10(2): e1003483). Os cálculos são os seguintes:
46 / 61 Glicose(aq) + 3 NADH(aq) ⇌ 3 MEG(aq) + 3 NAD+(aq) ΔrG'm -104 kJ/mol 6 CO(aq) + 3 H2(aq) + 6 NADH(aq) ⇌ 3 MEG(aq) + 6 NAD+(aq) ΔrG'm -192 kJ/mol
[00131] Condições fisiológicas: Glicose(aq) + 3 NADH(aq) ⇌ 3 MEG(aq) + 3 NAD+(aq) ΔrG'm -70 kJ/mol 6 CO(aq) + 3 H2(aq) + 6 NADH(aq) ⇌ 3 MEG(aq) + 6 NAD+(aq) ΔrG'm -295 kJ/mol
[00132] Além do etilenoglicol, glioxilato e/ou glicolato, o microrganismo da invenção pode ser cultivado para produzir um ou mais coprodutos. Por exemplo, o microrganismo da invenção pode produzir ou pode ser geneticamente modificado para produzir etanol (documento WO 2007/117157), acetato (documento WO 2007/117157), butanol (documentos WO 2008/115080 e WO 2012/053905), butirato (documento WO 2008/115080), 2,3-butanodiol (documentos WO 2009/151342 e WO 2016/094334), lactato (documento WO 2011/112103), buteno (documento WO 2012/024522), butadieno (documento WO 2012/024522), metil etil cetona (2-butanona) (documentos WO 2012/024522 e WO 2013/185123), etileno (documento WO 2012/026833), acetona (documento WO 2012/115527), isopropanol (documento WO 2012/115527), lipídios (documento WO 2013/036147), 3-hidroxipropionato (3-HP) (documento WO 2013/180581), isopreno (documento WO 2013/180584), ácidos graxos (documento WO 2013/191567), 2-butanol (documento WO 2013/185123), 1,2-propanodiol (documento WO 2014/036152), 1-propanol (documento WO 2014/0369152), produtos derivados de corismato (documento WO 2016/191625), 3-hidroxibutirato (documento WO 2017/066498) e 1,3-butanodiol (documento WO 2017/0066498). Em algumas modalidades, além de etilenoglicol, o microrganismo da invenção
47 / 61 também produz etanol, 2,3-butanodiol e/ou succinato. Em certas modalidades, a própria biomassa microbiana pode ser considerada um produto.
[00133] Um “produto nativo” é um produto produzido por um microrganismo não geneticamente modificado. Por exemplo, etanol, acetato e 2,3-butanodiol são produtos nativos de Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii e Clostridium ragsdalei. Um "produto não nativo" é um produto produzido por um microrganismo geneticamente modificado, mas não é produzido por um microrganismo não geneticamente modificado a partir do qual o microrganismo geneticamente modificado é derivado. Etilenoglicol não é conhecido por ser produzido por qualquer microrganismo de ocorrência natural, de modo que seja um produto não nativo de todos os microrganismos.
[00134] "Seletividade" refere-se à razão entre a produção de um produto-alvo e a produção de todos os produtos de fermentação produzidos por um microrganismo. O microrganismo da invenção pode ser geneticamente modificado para produzir produtos com uma determinada seletividade ou com uma seletividade mínima. Em uma modalidade, um produto-alvo, tal como etilenoglicol, é responsável por pelo menos cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 50% ou 75% de todos os produtos de fermentação produzidos pelo microrganismo da invenção. Em uma modalidade, o produto-alvo é responsável por pelo menos 10% de todos os produtos de fermentação produzidos pelo microrganismo da invenção, de modo que o microrganismo da invenção tenha uma seletividade para etilenoglicol de pelo menos 10%. Em uma modalidade, o etilenoglicol representa pelo menos 30% de todos os produtos de fermentação produzidos pelo microrganismo da invenção, de modo que o microrganismo da invenção tenha uma seletividade para etilenoglicol de pelo menos 30%.
[00135] Frequentemente, a cultura é realizada em um biorreator. O termo "biorreator" inclui um dispositivo de cultura/fermentação que consiste
48 / 61 em um ou mais vasos, torres ou arranjos de tubulação, tais como um reator de tanque agitado contínuo (CSTR), reator de célula imobilizada (ICR), reator de leito gota a gota (TBR), coluna de bolha, fermentador de elevação a gás, misturador estático ou outro vaso ou outro dispositivo adequado para contato gás-líquido. Em algumas modalidades, o biorreator pode compreender um primeiro reator de crescimento e um segundo reator de cultura/fermentação. O substrato pode ser fornecido para um ou ambos os reatores. Conforme usado neste documento, os termos "cultura" e "fermentação" são usados de forma intercambiável. Esses termos abrangem tanto a fase de crescimento quanto a fase de biossíntese de produto do processo de cultura/fermentação.
[00136] A cultura é geralmente mantida em um meio de cultura aquoso que contém nutrientes, vitaminas e/ou minerais suficientes para permitir crescimento do microrganismo. Preferencialmente, o meio de cultura aquoso é um meio de crescimento microbiano anaeróbico, tal como um meio de crescimento microbiano anaeróbico mínimo. Meios adequados são bem conhecidos na técnica.
[00137] A cultura/fermentação deve ser realizada, de modo desejável, em condições apropriadas para a produção de etilenogicol. Se necessário, a cultura/fermentação é realizada sob condições anaeróbicas. As condições de reação a serem consideradas incluem pressão (ou pressão parcial), temperatura, taxa de vazão de gás, taxa de vazão de líquido, pH do meio, potencial redox do meio, taxa de agitação (se com o uso de um reator de tanque agitado contínuo), nível de inóculo, concentrações máximas de substrato de gás para garantir que esse gás na fase líquida não se torne limitante e as concentrações máximas de produto para evitar a inibição de produto. Em particular, a taxa de introdução do substrato pode ser controlada para garantir que a concentração de gás na fase líquida não se torne limitante.
[00138] Operar um biorreator a pressões elevadas permite um aumento na taxa de transferência de massa de gás da fase gasosa para a fase líquida.
49 / 61 Por conseguinte, é geralmente preferível realizar a cultura/fermentação a pressões superiores à pressão atmosférica. Além disso, uma vez que uma determinada taxa de conversão de gás é, em parte, uma função do tempo de retenção de substrato e o tempo de retenção dita o volume necessário de um biorreator, o uso de sistemas pressurizados pode reduzir bastante o volume necessário do biorreator e, consequentemente, o custo de capital do equipamento de cultura/fermentação. Isso, por sua vez, significa que o tempo de retenção, definido como o volume de líquido no biorreator dividido pela taxa de vazão de entrada de gás, pode ser reduzido quando os biorreatores são mantidos sob pressão elevada em vez de pressão atmosférica. As condições otimizadas de reação dependerão parcialmente do microrganismo específico usado. No entanto, em geral, é preferível operar a fermentação a uma pressão superior à pressão atmosférica. Além disso, uma vez que uma determinada taxa de conversão de gás é, em parte, uma função de tempo de retenção de substrato e o alcance de um tempo de retenção desejado, por sua vez, dita o volume necessário de um biorreator, o uso de sistemas pressurizados pode reduzir bastante o volume necessário do biorreator e, consequentemente, o custo de capital do equipamento de fermentação.
[00139] Em certas modalidades, a fermentação é realizada na ausência de luz ou na presença de uma quantidade de luz insuficiente para atender aos requisitos energéticos de microrganismos fotossintéticos. Em certas modalidades, o microrganismo da invenção é um microrganismo não fotossintético.
[00140] O método da invenção pode compreender, ainda, a separação do etilenoglicol do caldo de fermentação. O etilenoglicol pode ser separado ou purificado a partir de um caldo de fermentação com o uso de qualquer método ou combinação de métodos conhecidos na técnica, incluindo, por exemplo, destilação, processos de leito móvel simulado, tratamento de membrana, evaporação, pervaporação, remoção de gás, separação de fases,
50 / 61 troca de íons ou fermentação extrativa, incluindo, por exemplo, extração líquido-líquido.
Em uma modalidade, o etilenoglicol pode ser concentrado a partir do caldo de fermentação usando osmose reversa e/ou pervaporação (documento US 5.552.023). A água pode ser removida por destilação e o fundo (contendo uma alta proporção de etilenoglicol) pode, então, ser recuperado usando destilação ou destilação a vácuo para produzir uma corrente de etilenoglicol de alta pureza.
Alternativamente, com ou sem concentração por osmose reversa e/ou pervaporação, o etilenoglicol pode ser ainda mais purificado por destilação reativa com um aldeído (Atul, Chem Eng Sci, 59: 2.881 a 2.890, 2004) ou destilação azeotrópica com o uso de um hidrocarboneto (documento US 2.218.234). Em outra abordagem, o etilenoglicol pode ser retido em um carvão ativado ou polímero absorvente a partir de solução aquosa (com ou sem osmose reversa e/ou pervaporação) e recuperado com o uso de um solvente orgânico de baixa ebulição (Chinn, rRecovery of Glycols, Sugars, and Related Multiple -OH Compounds from Dilute-Aqueous Solution by Regenerable Adsorption onto Activated Carbons, University of California Berkeley, 1999). O etilenoglicol pode ser, então, recuperado do solvente orgânico por destilação.
Em certas modalidades, o etilenoglicol é recuperadodo caldo de fermentação removendo-se, continuamente, uma porção do caldo do biorreator, separando-se as células microbianas do caldo (convenientemente por filtração) e recuperando- seetilenoglicol do caldo.
Os coprodutos, tais como álcoois ou ácidos, também podem ser separados ou purificados a partir do caldo.
Os álcoois podem ser recuperados, por exemplo, por destilação.
Os ácidos podem ser recuperados, por exemplo, por adsorção em carvão ativado.
As células microbianas separadas podem ser devolvidas ao biorreator em certas modalidades.
O permeado livre de células remanescente após a remoção de produtos-alvo também é devolvido, de modo preferencial, ao biorreator, no todo ou em parte.
Nutrientes adicionais (tais como vitaminas do complexo B) podem ser
51 / 61 adicionados ao permeado livre de células para reabastecer o meio antes de retornar ao biorreator.
[00141] A recuperação de dióis de meios aquosos foi demonstrada de diversas maneiras. A tecnologia de leito móvel simulado (SMB) foi usada para recuperar o 2,3-butaendiol de uma mistura aquosa de etanol e oxigenados associados (Patente No US 8.658.845). A separação reativa também foi demonstrada para uma recuperação eficaz de diol. Em algumas modalidades, a recuperação de etilenoglicol é conduzida pela reação da corrente contendo diol com aldeídos, fracionamento e regeneração do diol, fracionamento final para recuperar uma corrente de diol concentrada. Consultar, por exemplo, a Patente No US 7.951.980.
[00142] A invenção fornece composições que compreendem etilenoglicol produzido pelos microrganismos e de acordo com os métodos descritos neste documento. Por exemplo, a composição que compreende etilenoglicol pode ser um anticongelante, conservante, agente de desidratação ou fluido de perfuração.
[00143] A invenção também fornece polímeros que compreendem etilenoglicol produzido pelos microrganismos e de acordo com os métodos descritos neste documento. Tais polímeros podem ser, por exemplo, homopolímeros, tais como polietilenoglicol ou copolímeros, tais como polietileno tereftalato. Os métodos para a síntese destes polímeros são bem conhecidos na técnica. Consultar, por exemplo, Herzberger et al., Chem Rev., 116 (4): 2.170 a 2.243 (2016) e Xiao et al., Ind Eng Chem Res. 54 (22): 5.862 a 5.869 (2015).
[00144] A invenção fornece, ainda, composições que compreendem polímeros que compreendem etilenoglicol produzido pelos microrganismos e de acordo com os métodos descritos neste documento. Por exemplo, a composição pode ser uma fibra, resina, filme ou plástico.
EXEMPLOS
52 / 61
[00145] Os exemplos a seguir ilustram, de modo adicional, a invenção, mas, obviamente, não devem ser interpretados de modo a limitar, de forma alguma, o escopo da mesma. Exemplo 1: Construção de vetor de expressão heteróloga que compreende citrato sintase de B. subtilis, isocitrato liase de E. coli e glicolaldeído desidrogenase de G. oxydans para a produção de etilenoglicol a partir de CO e/ou CO2 e H2 em C. autoethanogenum.
[00146] Genes que codificam a citrato sintase a partir de B. subtilis (citZ; SEQ ID NOs: 1 a 2), isocitrato liase a partir de E. coli (icl; SEQ ID NOs: 11 a 12) e glicolaldeído desidrogenase a partir de G. oxydans (aldA1; SEQ ID NOs: 55 a 56) foram adaptados com códon e sintetizados para expressão em C. autoetanogenum. Os genes adaptados foram clonados em um vetor transportador de expressão, pIPL12, usando um kit de clonagem BsaI golden gate padrão (New England Biolabs, Ipswich, MA). O pIPL12 compreende uma origem de replicação para E. coli e C. autoethanogenum, permitindo que o mesmo se replique e seja mantido em ambas as espécies; o pIPL12 também funciona na maioria dos Clostridia. O pIPL12 compreende, ainda, 23S rRNA (adenina(2058)-N(6))-metiltransferase Erm(B) que confere resistência à eritromicina/claritromicina para seleção positiva, TraJ para transferência conjugativa de E. coli e um promotor para expressão heteróloga de genes. Consultar a Figura 2A. O vetor de expressão criado após a clonagem de citZ, icl e aldA1 no pIPL12 é denominado, neste documento, pMEG042 (Figura 2B).
53 / 61 TABELA 2: OLIGOS UTILIZADOS PARA CONSTRUIR O VETOR DE EXPRESSÃO PMEG042.
[00147] A construção de pMEG042 foi transformada em C. autoethanogenum por meio de conjugação. O vetor de expressão foi introduzido pela primeira vez na cepa doadora conjugada E. coli HB101+R702 (CA434) (Williams et al. 1990) (a doadora), com uso de transformação padrão de choque térmico. As células doadoras foram recuperadas em meio SOC a 37 °C por 1 hora antes de serem plaqueadas em placas de meio LB que compreendem100 µg/ml de espectinomicina e 500 µg/ml de eritromicina e incubadas a 37 °C durante a noite. No dia seguinte, alíquotas de 5 ml de LB compreendendo 100 µg/ml de espectinomicina e 500 µg/ml de eritromicina foram inoculadas com várias colônias doadoras e incubadas a 37 °C, agitando por aproximadamente 4 horas ou até que a cultura ficasse visivelmente densa, mas não entrasse ainda em fase estacionária. 1,5 ml da cultura doadora foi coletado por centrifugação a 4.000 rpm e 20 a 25 °C por 2 minutos, e o sobrenadante foi descartado. As células doadoras foram delicadamente ressuspensas em 500 µl de tampão de PBS estéril e centrifugadas a 4.000 rpm por 2 minutos e o sobrenadante de PBS foi descartado.
[00148] O grânulo foi introduzido em uma câmara anaeróbica e delicadamente ressuspenso em 200 µl durante a fase exponencial tardia de uma cultura de C. autoethanogenum (o receptor). DSM10061 e DSM23693 (um derivado de DSM10061) de C. autoethanogenum foram obtidos de
54 / 61 DSMZ (The German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Inhoffenstraße 7B, 38124 Braunschweig, Alemanha). As cepas foram cultivadas a 37 °C em meio PETC (Consultar a Patente No. US 9.738.875) a pH 5,6 utilizando técnicas anaeróbicas padrão (Hungate 1969; Wolfe 1971).
[00149] A mistura de conjugação (a mistura de células doadoras e receptoras) foi colocada em placas de ágar de PETC-MES + frutose e deixada para secar. Quando as manchas não estavam mais visivelmente molhadas, as placas foram introduzidas em um frasco de pressão, pressurizado com gás de síntese (50% de CO, 10% de N2, 30% de CO2, 10% de H2) a 172,4 a 206,8 kPa (25 a 30 psi), e incubadas a 37 °C por cerca de 24 horas. A mistura de conjugação foi, então, removida das placas por raspagem suave com o uso de uma alça de inoculação de 10 µl. A mistura removida foi suspensa em 200 a 300 µl de meio PETC. Alíquotas de 100 µl da mistura de conjugação foram plaqueadas em placas de ágar de meio PETC suplementadas com 5 µg/ml de claritromicina para selecionar os transformantes portadores do plasmídeo.
[00150] Três colônias distintas de C. autoethanogenum portadoras do plasmídeo pMEG042 foram inoculadas em meios de 2 ml de PETC-MES com 5 µg/ml de claritromicina e cultivadas autotroficamente a 37 °C com 50% de CO, 10% de N2, 30% de CO2,10% de H2 e 100 rpm, com agitação orbital durante três dias. As culturas foram diluídas para OD600 de 0,05 em 10 ml de meio de PETC-MES com 5 µg/ml de claritromicina em garrafas de soro e cultivadas autotroficamente a 37 °C com 50% de CO, 10% de N2, 30% de CO2, 10% de H2 e agitação orbital de 100 rpm por até 20 dias, com amostragem diária para medir biomassa e metabólitos (Figuras 3A e 3B). A produção de etilenoglicol foi medida com uso de espectrometria de massa por cromatografia gasosa (GC-MS) e outros metabólitos foram medidos com o uso de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), conforme descrito abaixo.
[00151] As concentrações de etilenoglicol foram medidas com um
55 / 61 Thermo Scientific ISQ LT GCMS equipado com uma coluna Agilent VF- WAXms (15 m × 0,25 µm × 0,25 µm) e autoamostrador de RSH. As amostras foram preparadas diluindo-se 200 µl de caldo com 200 µl de metanol. As amostras foram agitadas em vórtex e depois centrifugadas por 3 minutos a
14.000 rpm; 200 µl do sobrenadante foram transferidos para um frasco de vidro com inserção. As amostras foram transferidas para um autoamostrador para análise com uso de uma injeção de 1,0 µl, uma razão de divisão de 5 para 1 e uma temperatura de entrada de 240 °C. A cromatografia foi realizada com um programa de forno de 80 °C com uma espera de 0,5 minutos a uma rampa de 10 °C/min a 150 °C a uma rampa de 25 °C/min a 220 °C com uma espera final de 3 minutos. A taxa de vazão de coluna foi de 4,0 ml/min com uma espera de 0,5 minuto e subsequente queda para 1,5 ml/min a uma taxa de 100 ml/min/min com uso de hélio como gás transportador. A fonte de íons MS foi mantida a 260 °C com a linha de transferência ajustada em 240 °C. A quantificação foi realizada usando uma calibração externa linear padrão com uso de 33,0 m/z como o pico de quantificação e 31,0 + 62,0 m/z como os picos de confirmação.
[00152] As concentrações de etanol, acetato, 2,3-butanodiol, glioxilato e glicolato foram medidas por HPLC em uma Infinity LC Agilent 1260 com detecção de Índice de Refracção (RI) a 35°C. As amostras foram preparadas por aquecimento durante 5 minutos a 80°C, seguido por uma centrifugação de 3 minutos a 14.000 rpm; o sobrenadante foi transferido para um frasco de vidro para análise. A separação foi realizada com uma injeção de 10 µl em uma coluna Phenomenex RezexTM ROA-Organic Acid H+ (8%) (300 mm x 7,8 mm x 8 mm), a 0,7 ml/min e 35°C sob condições isocráticas, com uso de 5mM de fase móvel de ácido sulfúrico.
[00153] Após aproximadamente 3 dias de crescimento autótrofo, foi observado o precursor glicolato de etilenoglicol e, após 10 dias, foi observada a produção de etilenoglicol (Figura 3B).
56 / 61 Exemplo 2: Construção de vetor de expressão heteróloga que compreende alanina-glioxilato aminotransferase de S. thiotaurini e aldeído desidrogenase de P. fluorescens para a produção de etilenoglicol a partir de CO e/ou CO2 e H2 em C. autoethanogenum.
[00154] Os genes que codificam uma alanina-glioxilato aminotransferase de S. thiotaurini (pucG; SEQ ID NOs: 15 a 16) e aldeído desidrogenase de P. fluorescens Q8r1-96 (aldA1; SEQ ID NOs: 57 a 58) foram adaptados ao códon para expressão em C. autoethanogenum. Os genes adaptados com códon foram clonados em pIPL12 (Figura 2A) e o vetor de expressão resultante, pMEG058, foi introduzido em C. autoethanogenum, conforme descrito no Exemplo 1. Consultar a Figura 2C. TABELA 3: OLIGOS UTILIZADOS PARA CONSTRUIR O VETOR DE EXPRESSÃO PMEG058.
[00155] Duas colônias distintas de C. autoethanogenum portadoras do plasmídeo pMEG058 foram inoculadas em 2 ml de meio PETC-MES com 5 µg/ml de claritromicina e cresceram de modo autótrofo, conforme descrito no Exemplo 1. Consulte a Figura 4A. Após aproximadamente 3 dias de crescimento autótrofo, foi observado glicolato e, após 8 dias, foi observada produção de etilenoglicol (Figura 4B). Exemplo 3: Construção de vetor de expressão heteróloga que compreende S. thiotaurini alanina-glioxilato aminotransferase e G. oxydans glicolaldeído desidrogenase para a produção de etilenoglicol a partir de CO e/ou CO2 e H2 em C. autoethanogenum.
[00156] Genes que codificam uma alanina-glioxilato aminotransferase a partir de S. thiotaurini (pucG; SEQ ID NOs: 15 a 16) e glicolaldeído
57 / 61 desidrogenase a partir de G. oxydans (aldA1; SEQ ID NOs: 55 a 56) foram adaptados com códon e sintetizados para expressão em C. autoethanogenum. Os genes adaptados com códon foram clonados em pIPL12 (Figura 2A) e o vetor de expressão resultante, pMEG059, foi introduzido em C. autoethanogenum, conforme descrito no Exemplo 1. Consultar a Figura 2D. TABELA 4: OLIGOS UTILIZADOS PARA CONSTRUIR O VETOR DE EXPRESSÃO PMEG059.
[00157] Duas colônias distintas de C. autoethanogenum portadoras do plasmídeo pMEG059 foram inoculadas em 2 ml de meio PETC-MES com 5 µg/ml de claritromicina e cultivadas de modo autótrofo, conforme descrito no Exemplo 1. Consultar a Figura 5A. Após aproximadamente 3 dias de crescimento autótrofo, observou-se glicolato e, após 10 dias, observou-se produção de etilenoglicol (Figura 5B). Exemplo 4: Construção de vetor de expressão heteróloga que compreende alanina-glioxilato aminotransferase e aldeído desidrogenase para a produção de etilenoglicol a partir de CO e/ou CO2 e H2 em C. autoethanogenum.
[00158] Genes que codificam aminotransferase classe V a partir de C. acidurici (SgA; SEQ ID NOs: 19, 20) e o aldeído desidrogenase a partir de P. fluorescens Q8r1-96 (aldA1; SEQ ID NOs: 57 a 58) foram adaptados com códon e sintetizados para expressão em C. autoethanogenum. Os genes adaptados com códon foram clonados em pIPL12 (Figura 2A) e o vetor resultante, pMEG061, foi introduzido em C. autoethanogenum, conforme descrito no Exemplo 1. Consultar a Figura 2E. TABELA 5: OLIGOS UTILIZADOS PARA CONSTRUIR O VETOR DE
58 / 61 EXPRESSÃO PMEG061.
[00159] Três colônias distintas de C. autoethanogenum portadoras do plasmídeo pMEG061 foram inoculadas em 2 ml de meio PETC-MES com 5 µg/ml de claritromicina e cultivadas de modo autótrofo, conforme descrito no Exemplo 1. Consultar a Figura 6A. Após aproximadamente 3 dias de crescimento autótrofo, observou-se glicolato e, após 16 dias, observou-se produção de etilenoglicol (Figura 6B). Exemplo 5: Modelagem de rendimentos máximos de diferentes rotas para o etilenoglicol
[00160] Um modelo metabólico em escala de genoma de Clostridium autoethanogenum assim como o descrito por Marcellin, Green Chem, 18:
3.020 a 3.028, 2016 foi utilizado para prever rendimentos máximos de diferentes rotas para o etilenoglicol. Reações metabólicas heterólogas foram adicionadas à estrutura de modelo Clostridium autoethanogenum do tipo selvagem para representar a incorporação da via de produção de compostos não nativos. Embora o modelo usado para o trabalho experimental descrito neste documento seja baseado em Clostridium autoethanogenum, é razoável esperar que os resultados se apliquem a outros microrganismos de Wood- Ljungdahl, devido a similaridades no metabolismo.
[00161] A produção de etilenoglicol foi simulada usando técnicas de modelagem computacional baseadas em restrições, análise de balanço de fluxo (FBA) e minimização linear de ajuste metabólico (LMOMA) (Maia, Proceedings of Genetic and Evolutionary Computation Conference Companion em - GECCO '17, New York, New York, ACM Press, 1.661 a
59 / 61
1.668, 2017) com uso de cobrapy versão 0.8.2 (Ebrahim., COBRApy: COnstraints-Based Reconstruction and Analysis for Python, BMC Syst Biol, 7: 74, 2013), com optlang versão 1.2.3 (Jensen, Optlang: An Algebraic Modeling Language for Mathematical Optimization,” The Journal of Open Source Software, 2, doi:10.21105/joss.00139, 2017) como a interface de solucionador e Gurobi Optimizer versão 7.0.2 como o solucionador de otimização.
[00162] A modelagem divulgou um rendimento previsto de 0,37 mol de etilenoglicol/mol de CO pelas vias descritas neste documento nos Exemplos 1 a 4. Isso é mais que o dobro do rendimento previsto pelas vias hipotéticas descritas por Islam et al. Metab Eng, 41: 173 a 181, 2017, que requerem gliconeogênese; verificou-se que os maiores rendimentos previstos eram cerca de 0,44 g de etilenoglicol/g de CO, o que equivale a cerca de 0,18 mol de etilenoglicol/mol de CO.
[00163] Todas as referências, incluindo publicações, pedidos de patentes e patentes citadas neste documento, são igualmente incorporadas neste documento a título de referência como se cada referência fosse individual e especificamente indicada para ser incorporada a título de referência e fosse estabelecida em sua totalidade neste documento. A referência a qualquer técnica anterior neste relatório descritivo não é, e não deve ser considerada, um reconhecimento de que essa técnica anterior faça parte do conhecimento geral comum no campo de atuação em qualquer país.
[00164] O uso dos termos “um" e “uma" e “o/a" e referentes similares no contexto da descrição da invenção (especialmente no contexto das reivindicações a seguir) deve ser interpretado de modo a abranger tanto o singular quanto o plural, a menos que indicado de outra forma neste documento ou claramente contradito pelo contexto. Os termos "compreendendo", "tendo", "incluindo" e "contendo" devem ser interpretados como termos abrangentes (isto é, significando "incluindo, porém sem
60 / 61 limitação"), a menos que indicado de outra forma. O termo "consistindo essencialmente em" limita o escopo de uma composição, processo ou método aos materiais ou etapas especificados, ou àqueles que não afetam materialmente as características básicas e inovadoras da composição, processo ou método. O uso da alternativa (por exemplo, “ou”) deve ser entendido como significando uma, ambas ou qualquer combinação das alternativas. Conforme usado neste documento, o termo “cerca de” significa ±20% da faixa, valor ou estrutura indicados, a menos que indicado de outra forma.
[00165] A citação de faixas de valores neste documento visa apenas servir como um método mais simples para se referir individualmente a cada valor separado dentro da faixa, a menos que indicado de outra forma neste documento, e cada valor separado é incorporado ao relatório descritivo como se fosse citado individualmente neste documento. Por exemplo, qualquer faixa de concentração, faixa percentual, faixa de proporção, faixa inteira, faixa de tamanho ou faixa de espessura deve ser entendida como incluindo o valor de qualquer número inteiro dentro da faixa citada e, quando apropriado, frações do mesmo (tais como um décimo e um centésimo de um número inteiro), salvo indicação em contrário.
[00166] Todos os métodos descritos neste documento podem ser realizados em qualquer ordem adequada, a menos que indicado de outra forma neste documento ou claramente contradito pelo contexto. O uso de quaisquer e todos os exemplos, ou linguagem exemplificativa (por exemplo, "tal como") fornecidos nesse documento se destina apenas a iluminar melhor a invenção e não constitui uma limitação ao escopo da invenção, a menos que reivindicado de outro modo. Nenhuma linguagem, no relatório descritivo, deve ser interpretada como indicando qualquer elemento não reivindicado como essencial para a prática da invenção.
[00167] As modalidades preferenciais desta invenção são descritas
61 / 61 neste documento.
As variações dessas modalidades preferenciais podem se tornar evidentes para os versados na técnica mediante leitura da descrição anterior.
Os inventores esperam que os versados na técnica utilizem tais variações, conforme apropriado, e os inventores esperam que a invenção seja colocada em prática de outro modo que não especificamente descrito neste documento.
Consequentemente, esta invenção inclui todas as modificações e equivalentes da matéria citada nas reivindicações anexas, conforme permitido por lei aplicável.
Além disso, qualquer combinação dos elementos descritos acima em todas as variações possíveis dos mesmos é abrangida pela invenção, a menos que indicado de outro modo neste documento ou, de outro modo, claramente contradito pelo contexto.

Claims (20)

REIVINDICAÇÕES
1. Microrganismo geneticamente modificado caracterizado pelo fato de que é capaz de produzir etilenoglicol ou um precursor de etilenoglicol a partir de um substrato gasoso.
2. Microrganismo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o microrganismo produz etilenoglicol ou o precursor de etilenoglicol por meio de um ou mais intermediários selecionados a partir do grupo que consiste em 5,10-metilenotetra-hidrofolato, oxaloacetato, citrato, malato e glicina.
3. Microrganismo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o microrganismo compreende um ou mais dentre: a. uma enzima heteróloga capaz de converter oxaloacetato em citrato; b. uma enzima heteróloga capaz de converter glicina em glioxilato; c. uma enzima heteróloga capaz de converter isocitrato em glioxilato; e d. uma enzima heteróloga capaz de converter glicolato em glicoaldeído.
4. Microrganismo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que: a. a enzima heteróloga capaz de converter oxaloacetato em citrato é uma citrato [Si]-sintase [2.3.3.1], uma ATP citrato sintase [2.3.3.8]; ou uma citrato (Re)-sintase [2.3.3.3]; b. a enzima heteróloga capaz de converter glicina em glioxilato é uma alanina-glioxilato transaminase [2.6.1.44], uma serina- glioxilato transaminase [2.6.1.45], uma serina-piruvato transaminase [2.6.1.51], uma glicina-oxaloacetato transaminase [2.6.1.35], uma glicina transaminase [2.6.1.4], uma glicina desidrogenase [1.4.1.10], uma alanina desidrogenase [1.4.1.1] ou uma glicina desidrogenase [1.4.2.1]; c. a enzima heteróloga capaz de converter isocitrato em glioxilato é uma isocitrato liase [4.1.3.1]; e/ou d. a enzima heteróloga capaz de converter glicolato em glicolaldeído é uma glicolaldeído desidrogenase [1.2.1.21], uma lactaldeído desidrogenase [1.2.1.22], uma succinato-semialdeído desidrogenase [1.2.1.24], uma 2,5-dioxovalerato desidrogenase [1.2.1.26], uma aldeído desidrogenase [1.2.1.3/4/5], uma betaína-aldeído desidrogenase [1.2.1.8] ou uma aldeído ferredoxina oxidorredutase [1.2.7.5].
5. Microrganismo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que uma ou mais dentre as enzimas heterólogas são derivadas de um gênero selecionado a partir do grupo que consiste em Bacillus, Clostridium, Escherichia, Gluconobacter, Hyphomicrobium, Lysinibacillus, Paenibacillus, Pseudomonas, Sedimenticola, Sporosarcina, Streptomyces, Thermithiobacillus, Thermotoga e Zea.
6. Microrganismo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que uma ou mais dentre as enzimas heterólogas são otimizadas por códon para expressão no microrganismo.
7. Microrganismo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o microrganismo compreende, ainda, uma ou mais dentre uma enzima capaz de converter acetil-CoA em piruvato; uma enzima capaz de converter piruvato em oxaloacetato; uma enzima capaz de converter piruvato em malato; uma enzima capaz de converter piruvato em fosfenolpiruvato; uma enzima capaz de converter oxaloacetato em citril-CoA; uma enzima capaz de converter citril-CoA em citrato; uma enzima capaz de converter citrato em aconitato e aconitato em isocitrato; uma enzima capaz de converter fosfoenolpiruvato em oxaloacetato; uma enzima capaz de converter fosfoenolpiruvato em 2-fosfo-D-glicerato; uma enzima capaz de converter 2-
fosfo-D-glicerato em 3-fosfo-D-glicerato; uma enzima capaz de converter 3- fosfo-D-glicerato em 3-fosfonooxipiruvato; uma enzima capaz de converter 3- fosfonooxipiruvato em 3-fosfo-L-serina; uma enzima capaz de converter 3- fosfo-L-serina em serina; uma enzima capaz de converter serina em glicina; uma enzima capaz de converter 5,10-metilenotetra-hidrofolato em glicina; uma enzima capaz de converter serina em hidroxipiruvato; uma enzima capaz de converter D-glicerato em hidroxipiruvato; uma enzima capaz de converter malato em glioxilato; uma enzima capaz de converter glioxilato em glicolato; uma enzima capaz de converter hidroxipiruvato em glicoaldeído; e uma enzima capaz de converter glicoaldeído em etilenoglicol.
8. Microrganismo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o microrganismo superexpressa: a. a enzima heteróloga capaz de converter oxaloacetato em citrato; b. a enzima heteróloga capaz de converter glicina em glioxilato; e/ou c. a enzima heteróloga capaz de converter glicolato em glicoaldeído.
9. Microrganismo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o microrganismo superexpressa: a. a enzima capaz de converter piruvato em oxaloacetato; b. a enzima capaz de converter citrato em aconitato e aconitato em isocitrato; c. a enzima capaz de converter fosfoenolpiruvato em oxaloacetato; d. a enzima capaz de converter serina em glicina; e. a enzima capaz de converter 5,10-metilenotetra-hidrofolato em glicina; f. a enzima capaz de converter glioxilato em glicolato; e/ou g. a enzima capaz de converter glicoaldeído em etilenoglicol.
10. Microrganismo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o microrganismo compreende uma mutação disruptiva em uma ou mais dentre isocitrato desidrogenase, glicerato desidrogenase, glicolato desidrogenase, glicerato desidrogenase, glicolato desidrogenase, aldeído ferredoxina oxidorredutase e aldeído desidrogenase.
11. Microrganismo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o microrganismo é um membro de um gênero selecionado a partir do grupo que consiste em Acetobacterium, Alkalibaculum, Blautia, Butyribacterium, Clostridium, Eubacterium, Moorella, Oxobacter, Sporomusa e Thermoanaerobacter.
12. Microrganismo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o microrganismo é derivado de um microrganismo parental selecionado a partir do grupo que consiste em Acetobacterium woodii, Alkalibaculum bacchii, Blautia producta, Butyribacterium methylotrophicum, Clostridium aceticum, Clostridium autoethanogenum, Clostridium carboxidivorans, Clostridium coskatii, Clostridium drakei, Clostridium formicoaceticum, Clostridium ljungdahlii, Clostridium magnum, Clostridium ragsdalei, Clostridium scatologenes, Eubacterium limosum, Moorella thermautotrophica, Moorella thermoacetica, Oxobacter pfennigii, Sporomusa ovata, Sporomusa silvacetica, Sporomusa sphaeroides e Thermoanaerobacter kiuvi.
13. Microrganismo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o microrganismo é derivado de uma bactéria parental selecionada a partir do grupo que consiste em Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii e Clostridiumragsdalei.
14. Microrganismo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o microrganismo compreende uma via Wood- Ljungdahl nativa ou heteróloga.
15. Microrganismo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o precursor do etilenoglicol é glioxilato ou glicolato.
16. Método de produção de etilenoglicol ou de um precursor de etilenoglicol, caracterizado pelo fato de que compreende a cultura do microrganismo de acordo com a reivindicação 1, em um meio nutritivo na presença de um substrato gasoso, em que o microrganismo produz etilenoglicol ou o precursor de etilenoglicol.
17. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o substrato gasoso compreende um ou mais dentre CO, CO2 e H2.
18. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o precursor de etilenoglicol é glioxilato ou glicolato.
19. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que compreende, ainda, a separação do etilenoglicol ou do precursor de etilenoglicol do meio nutritivo.
20. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o microrganismo produz, ainda, um ou mais dentre etanol, 2,3-butanodiol e succinato.
BR112020008718-1A 2017-12-19 2018-12-19 microrganismo geneticamente modificado, e, método de produção de etilenoglicol ou de um precursor de etilenoglicol. BR112020008718A2 (pt)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762607446P 2017-12-19 2017-12-19
US62/607446 2017-12-19
US201862683454P 2018-06-11 2018-06-11
US62/683454 2018-06-11
PCT/US2018/066619 WO2019126400A1 (en) 2017-12-19 2018-12-19 Microorganisms and methods for the biological production of ethylene glycol

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BR112020008718A2 true BR112020008718A2 (pt) 2020-11-24

Family

ID=66815024

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR112020008718-1A BR112020008718A2 (pt) 2017-12-19 2018-12-19 microrganismo geneticamente modificado, e, método de produção de etilenoglicol ou de um precursor de etilenoglicol.

Country Status (11)

Country Link
US (2) US11555209B2 (pt)
EP (1) EP3728614A4 (pt)
JP (2) JP7304859B2 (pt)
KR (1) KR20200091458A (pt)
CN (1) CN111936631A (pt)
AU (2) AU2018393075B2 (pt)
BR (1) BR112020008718A2 (pt)
CA (1) CA3079761C (pt)
MY (1) MY196897A (pt)
WO (1) WO2019126400A1 (pt)
ZA (1) ZA202004080B (pt)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MY196897A (en) * 2017-12-19 2023-05-09 Lanzatech Inc Microorganisms and methods for the biological production of ethylene glycol
CN112955560A (zh) 2019-07-11 2021-06-11 朗泽科技有限公司 优化气体利用的方法
BR112022024652B1 (pt) 2020-06-06 2024-01-16 Lanzatech, Inc Micro-organismo geneticamente modificado, e, método para a produção de um produto
JP2023532782A (ja) * 2020-07-09 2023-07-31 エボニック オペレーションズ ゲーエムベーハー グアニジノ酢酸の発酵産生方法
BR112022026755A2 (pt) * 2020-07-09 2023-01-24 Evonik Operations Gmbh Micro-organismo, método para a produção fermentativa de ácido acético de guanidino (gaa) e para a produção fermentativa de creatina
CN114574529A (zh) * 2020-12-01 2022-06-03 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种乙醇酸在酶的作用下生成目标产物的方法
KR20230051629A (ko) 2021-02-08 2023-04-18 란자테크, 인크. 재조합 미생물 및 이의 용도
TW202307202A (zh) 2021-08-06 2023-02-16 美商朗澤科技有限公司 用於改良乙二醇之生物產生的微生物及方法

Family Cites Families (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2218234A (en) 1937-12-09 1940-10-15 Eastman Kodak Co Process for the recovery of ethylene glycol from aqueous solutions
US5593886A (en) 1992-10-30 1997-01-14 Gaddy; James L. Clostridium stain which produces acetic acid from waste gases
US5552023A (en) 1993-12-15 1996-09-03 Alliedsignal Inc. Recovery of spent deicing fluid
UA72220C2 (uk) 1998-09-08 2005-02-15 Байоенджініерінг Рісорсиз, Інк. Незмішувана з водою суміш розчинник/співрозчинник для екстрагування оцтової кислоти, спосіб одержання оцтової кислоти (варіанти), спосіб анаеробного мікробного бродіння для одержання оцтової кислоти (варіанти), модифікований розчинник та спосіб його одержання
NZ546496A (en) 2006-04-07 2008-09-26 Lanzatech New Zealand Ltd Gas treatment process
US7704723B2 (en) 2006-08-31 2010-04-27 The Board Of Regents For Oklahoma State University Isolation and characterization of novel clostridial species
NZ553984A (en) 2007-03-19 2009-07-31 Lanzatech New Zealand Ltd Alcohol production process
US20200048665A1 (en) 2007-10-28 2020-02-13 Lanzatech New Zealand Limited Carbon capture in fermentation
US8222013B2 (en) 2007-11-13 2012-07-17 Lanzatech New Zealand Limited Bacteria and methods of use thereof
US8691553B2 (en) * 2008-01-22 2014-04-08 Genomatica, Inc. Methods and organisms for utilizing synthesis gas or other gaseous carbon sources and methanol
US20110144393A1 (en) 2008-06-09 2011-06-16 Lanza Tech New Zealand Limited Production of butanediol by anaerobic microbial fermentation
DE102008044440B4 (de) 2008-08-18 2011-03-03 Lurgi Zimmer Gmbh Verfahren und Vorrichtung zur Rückgewinnung von Ethylenglykol bei der Polyethylenterephthalatherstellung
US8039239B2 (en) * 2008-12-16 2011-10-18 Coskata, Inc. Recombinant microorganisms having modified production of alcohols and acids
SG10201508849PA (en) 2009-01-26 2015-11-27 Xyleco Inc Processing biomass
US8445244B2 (en) * 2010-02-23 2013-05-21 Genomatica, Inc. Methods for increasing product yields
CN102791869B (zh) 2010-03-10 2015-08-19 朗泽科技新西兰有限公司 通过发酵的酸产生
WO2011130378A1 (en) * 2010-04-13 2011-10-20 Genomatica, Inc. Microorganisms and methods for the production of ethylene glycol
EP2598630B1 (en) 2010-07-28 2015-11-25 Lanzatech New Zealand Limited Novel bacteria and methods of use thereof
WO2012024522A2 (en) 2010-08-19 2012-02-23 Lanzatech New Zealand Limited A process for producing chemicals using microbial fermentation of substrates comprising carbon monoxide
TW201224151A (en) 2010-08-26 2012-06-16 Lanzatech New Zealand Ltd A process
US20110236941A1 (en) 2010-10-22 2011-09-29 Lanzatech New Zealand Limited Recombinant microorganism and methods of production thereof
US9410130B2 (en) 2011-02-25 2016-08-09 Lanzatech New Zealand Limited Recombinant microorganisms and uses therefor
US9914947B2 (en) * 2011-07-27 2018-03-13 Alliance For Sustainable Energy, Llc Biological production of organic compounds
CN103781912A (zh) 2011-09-08 2014-05-07 新西兰郎泽科技公司 一种发酵方法
KR101351879B1 (ko) 2012-02-06 2014-01-22 명지대학교 산학협력단 에탄―１，２―디올 생산 미생물 및 이를 이용한 에탄―１，２―디올 생산 방법
US8658845B2 (en) 2012-05-23 2014-02-25 Orochem Technologies, Inc. Process and adsorbent for separating ethanol and associated oxygenates from a biofermentation system
CA2874832C (en) 2012-05-30 2016-02-02 Lanzatech New Zealand Limited Recombinant microorganisms and uses therefor
US20130323820A1 (en) 2012-06-01 2013-12-05 Lanzatech New Zealand Limited Recombinant microorganisms and uses therefor
JP6381525B2 (ja) * 2012-06-08 2018-08-29 ランザテク・ニュージーランド・リミテッド 組換え微生物およびその使用
US9347076B2 (en) 2012-06-21 2016-05-24 Lanzatech New Zealand Limited Recombinant microorganisms that make biodiesel
WO2014004625A1 (en) * 2012-06-26 2014-01-03 Genomatica, Inc. Microorganisms for producing ethylene glycol using synthesis gas
WO2014036152A1 (en) 2012-08-28 2014-03-06 Lanzatech New Zealand Limited Recombinant microorganisms and uses therefor
CN107002028A (zh) 2014-12-08 2017-08-01 朗泽科技新西兰有限公司 呈现通过发酵路径的增大的通量的重组微生物
JP6871870B2 (ja) 2015-05-27 2021-05-19 ランザテク・ニュージーランド・リミテッド コリスミ酸誘導産物生成のための遺伝子組換え微生物（関連出願の相互参照）
WO2017059236A1 (en) * 2015-10-02 2017-04-06 Massachusetts Institute Of Technology Microbial production of renewable glycolate
KR20210037002A (ko) 2015-10-13 2021-04-05 란자테크 뉴질랜드 리미티드 에너지-생성 발효 경로를 포함하는 유전자 조작된 박테리아
AU2017231728B2 (en) 2016-03-09 2021-12-16 Braskem S.A. Microorganisms and methods for the co-production of ethylene glycol and three carbon compounds
MY196897A (en) * 2017-12-19 2023-05-09 Lanzatech Inc Microorganisms and methods for the biological production of ethylene glycol

Also Published As

Publication number Publication date
CN111936631A (zh) 2020-11-13
MY196897A (en) 2023-05-09
CA3079761A1 (en) 2019-06-27
AU2018393075A1 (en) 2020-07-30
US20190185888A1 (en) 2019-06-20
US20230084118A1 (en) 2023-03-16
ZA202004080B (en) 2023-12-20
EP3728614A1 (en) 2020-10-28
EP3728614A4 (en) 2021-11-24
US11555209B2 (en) 2023-01-17
AU2024201435A1 (en) 2024-03-21
KR20200091458A (ko) 2020-07-30
JP7304859B2 (ja) 2023-07-07
WO2019126400A1 (en) 2019-06-27
JP2021506247A (ja) 2021-02-22
AU2018393075B2 (en) 2024-03-21
CA3079761C (en) 2023-09-19
JP2023123701A (ja) 2023-09-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2018393075B2 (en) Microorganisms and methods for the biological production of ethylene glycol
JP6905518B2 (ja) エネルギー発生発酵経路を含む遺伝子操作細菌
Chua et al. Characterization of a butanol–acetone-producing Clostridium strain and identification of its solventogenic genes
BR122023023164A2 (pt) Bactéria geneticamente modificada fixadora de c1 capaz de produzir pelo menos um produto derivado de corismato, e, método de fabricação de um produto de fermentação
KR20200050470A (ko) 우드-륭달 미생물에서 유전자 녹아웃
TWI824995B (zh) 用於改良氣體醱酵產乙酸菌之效率的精胺酸增補
BR112020006120A2 (pt) micro-organismo de wood-ljungdahl de ocorrência não natural, e, método para produzir poli-hidroxibutirato
KR20190017790A (ko) 알데히드:페레독신 옥시도리덕타제 활성이 변경된 미생물 및 관련 방법
US20210292732A1 (en) Fermentative production of 2-phenylethanol from gaseous substrates
US10358661B2 (en) Microorganism with modified hydrogenase activity
EA042922B1 (ru) Микроорганизмы и способы для биологического производства этиленгликоля
US11952607B2 (en) Microorganisms and methods for improved biological production of ethylene glycol
EP4381076A1 (en) Microorganisms and methods for improved biological production of ethylene glycol
BRPI0709758A2 (pt) organismos termofÍlicos para conversço de biomassa lignocelulàsica em etanol
BR112022024652B1 (pt) Micro-organismo geneticamente modificado, e, método para a produção de um produto
CN117693588A (zh) 用于改进乙二醇的生物产生的微生物和方法
JP2014161252A (ja) 組換え細胞
EA044562B1 (ru) Получение полигидроксибутирата в микроорганизме вуда-льюнгдаля
TW201816109A (zh) 包括產能醱酵路徑之經基因工程改造之細菌

Legal Events

Date Code Title Description
B350 Update of information on the portal [chapter 15.35 patent gazette]