BR112020006120A2 - micro-organismo de wood-ljungdahl de ocorrência não natural, e, método para produzir poli-hidroxibutirato - Google Patents

Abstract

A presente invenção se refere a micro-organismos e métodos para a produção de poli-hidroxibutirato (PHB) a partir de substratos gasosos. Em particular, a invenção fornece um micro-organismo de Wood-Ljungdahl de ocorrência não natural que compreende (a) uma enzima que converte acetil-CoA em acetoacetil-CoA, (b) uma enzima que converte acetoacetil-CoA em 3-hidroxibutiril-CoA e (c) uma enzima que converte 3-hidroxibutiril-CoA em poli-hidroxibutirato, e métodos relacionados ao mesmo.

Description

1 / 43 MICRO-ORGANISMO DE WOOD-LJUNGDAHL DE OCORRÊNCIA NÃO NATURAL, E, MÉTODO PARA PRODUZIR POLI-

HIDROXIBUTIRATO REFERÊNCIA CRUZADA A UM PEDIDO RELACIONADO

[001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente nº U.S. 62/568.127 depositado em 04 de outubro de 2017, cuja totalidade é incorporada ao presente documento a título de referência.

CAMPO DA INVENÇÃO

[002] A presente invenção refere-se a micro-organismos modificados por engenharia genética e métodos para a produção de poli- hidroxibutirato (PHB) por fermentação microbiana, particularmente por fermentação microbiana de um substrato gasoso.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[003] Os plásticos derivados de petróleo se tornaram essenciais para a vida moderna, em grande parte devido à sua leveza, robustez, durabilidade e resistência à degradação. No entanto, a dependência de plásticos derivados de petróleo resultou em uma série de problemas sérios, incluindo depleção de petróleo bruto, poluição e acúmulo de aterros. Para diminuir os impactos ambientais dos plásticos, esforços estão em andamento para substituir os polímeros derivados de petróleo convencionais por biopolímeros, tais como polilactídeo, polissacarídeos, poliésteres alifáticos e poli-hidroxialcanoatos que possuem propriedades físico-químicas similares às dos plásticos convencionais (Anjum, Int J Biol Macromol, 89: 161 a 174, 2016). No entanto, os micro-organismos e os métodos para a produção de tais biopolímeros ainda são pouco desenvolvidos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[004] A invenção fornece um micro-organismo modificado por engenharia genética com capacidade para produzir PHB. Em particular, a invenção fornece um micro-organismo de Wood-Ljungdahl de ocorrência

2 / 43 natural que compreende (a) uma enzima que converte acetil-CoA em acetoacetil-CoA, (b) uma enzima que converte acetoacetil-CoA em 3- hidroxibutiril-CoA, e (c) uma enzima que converte 3-hidroxibutiril-CoA em PHB.

[005] Em uma modalidade, a enzima que converte acetil-CoA em acetoacetil-CoA é uma acetil-CoA C-acetiltransferase (EC 2.3.1.9). Por exemplo, a acetil-CoA C-acetiltransferase pode ser derivada de Acinetobacter baumannii, Aeromonas hydrophilia, Alcaligenes latus, Arthrospira platensis, Bacillus subtilis, Burkholderia cepacia, Clostridium acetobutylicum, Cupriavidus necator, Escherichia coli, Haloferax mediterranei, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas mandelii, Pseudomonas oleovorans, Pseudomonas putida, ou Streptomyces coelicolor.

[006] Em uma modalidade, a enzima que converte acetoacetil-CoA em 3-hidroxibutiril-CoA é uma acetoacetil-CoA redutase (EC 1.1.1.36) ou uma 3-hidroxibutiril-CoA desidrogenase (EC 1.1.1.157). Por exemplo, a acetoacetil-CoA redutase pode ser derivada a partir de Acinetobacter baumannii, Aeromonas hydrophilia, Alcaligenes latus, Arthrospira platensis, Bacillus subtilis, Burkholderia cepacia, Cupriavidus necator, Haloferax mediterranei, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas mandelii, Pseudomonas oleovorans, Pseudomonas putida ou Streptomyces coelicolor. Em outro exemplo, a 3-hidroxibutiril-CoA desidrogenase pode ser derivada de Clostridium beijerinckii, Clostridium acetobutylicum ou Clostridium kluyveri.

[007] Em uma modalidade, a enzima que converte 3-hidroxibutiril- CoA em poli-hidroxibutirato é uma poli-hidroxialcanoato sintase (EC 2.3.1.-). Por exemplo, a poli-hidroxialcanoato sintase pode ser derivada de Acinetobacter baumannii, Aeromonas caviae, Aeromonas hydrophilia, Alcaligenes latus, Arthrospira platensis, Bacillus subtilis, Burkholderia cepacia, Cupriavidus necator, Haloferax mediterranei, Pseudomonas

3 / 43 aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas mandelii, Pseudomonas oleovorans, Pseudomonas putida, Pseudomonas sp. 61-3, Rhodospirillum rubrum ou Streptomyces coelicolor.

[008] Em uma modalidade, o micro-organismo é um membro de um gênero selecionado a partir do grupo que consiste em Acetobacterium, Alkalibaculum, Blautia, Butyribacterium, Clostridium, Eubacterium, Moorella, Oxobacter, Sporomusa e Thermoanaerobacter. Por exemplo, o micro-organismo pode ser derivado de um micro-organismo parental selecionado a partir do grupo que consiste em Acetobacterium woodii, Alkalibaculum bacchii, Blautia producta, Butyribacterium methylotrophicum, Clostridium aceticum, Clostridium autoethanogenum, Clostridium carboxidivorans, Clostridium coskatii, Clostridium drakei, Clostridium formicoaceticum, Clostridium ljungdahlii, Clostridium magnum, Clostridium ragsdalei, Clostridium scatologenes, Eubacterium limosum, Moorella thermautotrophica, Moorella thermoacetica, Oxobacter pfennigii, Sporomusa ovata, Sporomusa silvacetica, Sporomusa sphaeroides e Thermoanaerobacter kiuvi. Em uma modalidade preferencial, o micro-organismo é derivado de uma bactéria parental selecionada a partir do grupo que consiste em Clostridium autoethanogenum, Clostridium coskatii, Clostridium ljungdahlii e Clostridium ragsdalei.

[009] Em uma modalidade, o micro-organismo consome substratos gasosos que compreendem um ou mais dentre CO, CO2 e H2. Em outra modalidade, o micro-organismo é anaeróbico. Em ainda outra modalidade, o micro-organismo não tem capacidade para degradar o PHB.

[0010] A invenção fornece adicionalmente um método para produzir PHB que compreende a cultura do micro-organismo da invenção na presença de um substrato gasoso. Por exemplo, o substrato gasoso pode compreender um ou mais dentre CO, CO2 e H2. Em uma modalidade, a cultura é realizada sob condições anaeróbicas. Em outra modalidade, a cultura é realizada na

4 / 43 ausência de substratos de carboidratos. Em ainda outra modalidade, a cultura é realizada na ausência de luz.

[0011] Essas e outras características e vantagens da presente invenção serão mais bem compreendidas a partir da descrição detalhada a seguir, tomada em conjunto com as reivindicações anexas. Verifica-se que o escopo das reivindicações é definido pelas recitações contidas no presente documento e não pela discussão específica sobre características e vantagens estabelecidas na presente descrição.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0012] A Figura 1 é um diagrama que mostra uma via enzimática para a produção de poli-hidroxibutirato (PHB).

[0013] A Figura 2 é um mapa plasmídico de pPHB_01.

[0014] A Figura 3 é um gráfico que mostra a produção de PHB em C. autoethanogenum que transporta um plasmídeo com uma via de biossíntese de PHB (pPHB_01) ou um plasmídeo vazio (pMTL83157) como controle negativo. As bactérias foram cultivadas anaerobicamente em frascos pressurizados com apenas CO e CO2 como fontes de carbono. O rendimento de PHB (expresso como % em peso de massa de célula seca) foi determinado por HPLC. Os valores representam médias de triplicados biológicos mais ou menos os desvios padrão sobre essas médias. O PHB não foi detectado em amostras que compreendem o plasmídeo pMTL83157 (vazio).

[0015] As Figuras 4A a 4D são gráficos que mostram o crescimento de C. autoethanogenum sob várias condições de crescimento. As bactérias compreendiam um plasmídeo vazio (pMTL83157) ou um plasmídeo que compreende a via de síntese de PHB (pPHB_01). Cada gráfico representa um conjunto diferente de condições. A Figura 4A (condição 1) mostra uma repetição de condições utilizadas para gerar os dados observados na Figura 3, utilizando uma mistura de gás que compreende 50/18/3/29 de CO/CO2/H2/N2 como a fonte de carbono exclusiva. A Figura 4B (condição 2) mostra

5 / 43 condições idênticas à condição 1, mas com um novo substrato de gás (50/30/10/10 de CO/CO2/H2/N2). A Figura 4C (condição 3) mostra condições idênticas à condição 2, mas com um tempo de incubação prolongado. A Figura 4D (condição 4) mostra condições idênticas à condição 3, mas com atualização periódica do substrato de gás. Os valores representam médias de triplicados biológicos mais ou menos os desvios padrão sobre essas médias.

[0016] A Figura 5 é um gráfico que mostra a produção de PHB em C. autoethanogenum sob as condições 1 a 4, conforme descrito em conexão com as Figuras 4A a 4D. Os valores representam médias de triplicados biológicos mais ou menos os desvios padrão sobre essas médias. O PHB não foi detectado em amostras que compreendem o plasmídeo pMTL83157 (vazio).

[0017] A Figura 6 é um gráfico que mostra a produção de PHB em C. autoethanogenum a partir de fontes gasosas de carbono em uma fermentação contínua. As bactérias foram conjugadas com o plasmídeo pPHB_01 que compreende uma via de síntese de PHB. O PHB foi medido na conclusão da fermentação. Substratos de gás compreendiam 20% de hidrogênio ou 2% de hidrogênio como parte de suas misturas 50/20/20/10 de CO/CO2/H2/Ar ou 50/20/2/28 de CO/CO2/H2/N2, respectivamente. Um pH de 5 foi mantido. Os valores representam médias de fermentações duplicadas, mais ou menos os desvios padrão sobre essas médias.

[0018] A Figura 7 é um gráfico que mostra a produção aprimorada de PHB em C. autoethanogenum a partir de fontes gasosas de carbono em uma fermentação contínua. As bactérias foram conjugadas com o plasmídeo pPHB_01 que compreende uma via de síntese de PHB. O PHB foi medido na conclusão da fermentação. Substratos de gás compreendiam 20% de hidrogênio ou 2% de hidrogênio como parte de suas misturas 50/20/20/10 de CO/CO2/H2/Ar ou 50/20/2/28 de CO/CO2/H2/N2, respectivamente. 20% de hidrogênio, baixo teor de biomassa teve uma concentração reduzida de biomassa em comparação com as outras execuções. 20% de hidrogênio, o pH

6 / 43 variado começou com um pH de 6 e foi, então, reduzido para 5,5. Foi mantido hidrogênio a 20%, pH 6 durante toda a fermentação até as culturas diminuírem. Os valores representam médias de fermentações duplicadas, mais ou menos os desvios padrão sobre essas médias.

[0019] A Figura 8 é um gráfico que mostra os valores de PHB para simulações que usam reconstruções de modelos metabólicos em escala de genoma (GEM). O PHB detectado experimentalmente foi comparado aos níveis de PHB previstos pelo GEM com o uso da maximização de rendimento de PHB. A maximização do rendimento de PHB também foi testada com uma absorção de 2 mmols/gDCW/h de NADH, NADPH, Fdvermelha ou ATP. As condições testadas foram PHB20 (controle); PHBLowB (baixo teor de biomassa) e PHBpH5.5 (pH 5,5). Verificou-se que o ATP limitava mais o PHB (maior valor de PHB alcançado), seguido por Fdvermelha, NADPH e depois NADH. Os dados representam um erro de média ± padrão de dois quimiostatos replicados biológicos.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[0020] Há muito tempo se reconhece que processos catalíticos, tal como o processo de Fischer-Tropsch, podem ser usados para converter gases que compreendem dióxido de carbono (CO2), monóxido de carbono (CO) e/ou hidrogênio (H2), tal como gás residual industrial ou gás de síntese, em uma variedade de combustíveis e produtos químicos. Recentemente, no entanto, a fermentação de gás surgiu como uma plataforma alternativa para a fixação biológica desses gases. Em particular, micro-organismos acetogênicos (isto é, Wood-Ljungdahl) demonstraram converter gases que compreendem CO, CO2 e/ou H2 em produtos, tais como etanol e 2,3-butanodiol. A conveniência para produzir moléculas poliméricas mais complexas, tal como PHB, a partir desses gases está bem-documentada (Drzyzga, J. Chem Technol Biotechnol, 90: 1.735 a 1.751, 2015). No entanto, a via de Wood-Ljungdahl opera na borda termodinâmica da vida (Schuchmann, Nat Rev Microbiol, 12:

7 / 43 809-821, 2014), o que dificulta que os micro-organismos de Wood-Ljungdahl acumulem carbono suficiente para o crescimento e a manutenção de células, muito menos produzam produtos de carbono complexos. Esses desafios metabólicos são agravados por má dissolução de substratos gasosos (por exemplo, CO, CO2 e/ou H2) em meios de fermentação em comparação com substratos de carboidratos ou de açúcar. Portanto, parece improvável que os micro-organismos Wood-Ljungdahl possam ser manipulados para sintetizar o PHB ou outros poli-hidroxialcanoatos, especialmente uma vez que esses polímeros são originalmente produzidos por espécies, tais como Rhodospirillum rubrum e Cupriavidus necator, como um meio para armazenar o excesso de carbono. De fato, até à data, as tentativas para manipular micro-organismos acetogênicos para produzir PHB de CO, CO2 e/ou H2 foram mal sucedidas (The European SYNPOL Project, Biopolymers from syngas fermentation, 2.012 a 2.017).

[0021] Após esforços diligentes de pesquisa e modificação genética, no entanto, os inventores alcançaram a primeira síntese de PHB em micro- organismos de Wood-Ljungdahl. Isso representa um marco importante no caminho para a produção de biopolímeros renováveis e sustentáveis.

[0022] Em um primeiro aspecto, a invenção fornece um micro- organismo de Wood-Ljungdahl com capacidade para produzir PHB. Em um segundo aspecto, a invenção fornece um método de produção de PHB cultivando-se o micro-organismo de Wood-Ljungdahl acima mencionado na presença de um substrato gasoso.

VIA

[0023] Uma vez que os micro-organismos de Wood-Ljungdahl não produzem PHB de forma nativa, a produção de PHB em um micro-organismo de Wood-Ljungdahl exige a introdução de pelo menos uma enzima heteróloga. O micro-organismo da invenção geralmente compreende três enzimas heterólogas, a saber (a) uma enzima que converte acetil-CoA em

8 / 43 acetoacetil-CoA, (b) uma enzima que converte acetoacetil-CoA em 3- hidroxibutiril-CoA e (c) uma enzima que converte 3-hidroxibutiril-CoA em poli-hidroxibutirato. Essa via é mostrada na Figura 1. (1) CONVERSÃO DE ACETIL-CoA EM ACETOACETIL-CoA

[0024] A conversão de acetil-CoA em acetoacetil-CoA pode ser catalisada por qualquer enzima adequada. Embora seja possível que a atividade nativa dessa reação possa estar presente em determinadas bactérias acetogênicas, geralmente, é necessário introduzir uma enzima heteróloga (isto é, não nativa) para catalisar essa reação. Em uma modalidade preferencial, a enzima é acetil-CoA C-acetiltransferase (também conhecida como tiolase ou 3-cetotiolase), que tem atividade definida por EC 2.3.1.9 (isto é, 2 acetil-CoA ↔ CoA + acetoacetil-CoA). A acetil-CoA C-acetiltransferase pode ser derivada de qualquer micro-organismo hospedeiro adequado, tal como Acinetobacter baumannii, Aeromonas hydrophilia, Alcaligenes latus, Arthrospira platensis, Bacillus subtilis, Burkholderia cepacia, Clostridium acetobutylicum, Cupriavidus necator, Escherichia coli, Haloferax mediterranei, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas mandelii, Pseudomonas oleovorans, Pseudomonas putida ou Streptomyces coelicolor.

[0025] Em particular, a acetil-CoA-C-acetiltransferase pode ser ou pode ser derivada a partir de Acinetobacter baumannii PhaA (SCZ16966), Aeromonas hydrophilia PhaA (WP_043162470), Alcaligenes latus PhaA (AAC83659), Arthrospira platensis PhaA (WP_006617472), Bacillus subtilis PhaA (CUB52080), Burkholderia cepacia PhaA (WP_043187452), Clostridium acetobutylicum Thla (WP_0109661571), Cupriavidus necator PhaA (WP_013956452.1), Cupriavidus necator BktB (WP_011615089.1), Cupriavidus necator PhaA (WP_010810132.1), Escherichia coli AtoB (NP_416728.1), Haloferax mediterranei PhaA (WP_004059344), Pseudomonas aeruginosa PhaA (WP_038823536), Pseudomonas fluorescens

9 / 43 PhaA (WP_073525707), Pseudomonas mandelii PhaA (WP_019582144), Pseudomonas oleovorans PhaA (WP_074859314), Pseudomonas putida PhaA (WP_058540218) ou Streptomyces coelicolor PhaA (WP_011030221). (2) CONVERSÃO DE ACETOACETIL-CoA EM 3-HIDROXIBUTIRIL- CoA

[0026] A conversão de acetoacetil-CoA em 3-hidroxibutiril-CoA pode ser catalisada por qualquer enzima adequada. Embora seja possível que a atividade nativa dessa reação possa estar presente em determinadas bactérias acetogênicas, geralmente, é necessário introduzir uma enzima heteróloga (isto é, não nativa) para catalisar essa reação. Em uma modalidade preferencial, a enzima é acetoacetil-CoA redutase, que tem atividade definida por EC 1.1.1.36 (isto é, (R)-3-hidroxiacil-CoA + NADP+ ↔ 3-oxoacil-CoA + NADPH + H+). A acetoacetil-CoA redutase pode ser derivada de qualquer micro-organismo hospedeiro adequado, tais como Acinetobacter baumannii, Aeromonas hydrophilia, Alcaligenes latus, Arthrospira platensis, Bacillus subtilis, Burkholderia cepacia, Cupriavidus necator, Haloferax mediterranei, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas mandelii, Pseudomonas oleovorans, Pseudomonas putida ou Streptomyces coelicolor. Em particular, a acetoacetil-CoA redutase pode ser Acinetobacter baumannii PhaB (WP_095389464), Aeromonas hydrophilia PhaB (WP_041216919), Alcaligenes latus PhaB (AAC83660), Arthrospira platensis PhaB (WP_043469113), Bacillus subtilis PhaB (WP_070548955), Burkholderia cepacia PhaB (WP_059234032), Cupriavidus necator PhaB (WP_010810131.1), Haloferax mediterranei PhaB (WP_004572392), Pseudomonas aeruginosa PhaB (WP_031690879), Pseudomonas fluorescens PhaB (WP_030141425), Pseudomonas mandelii PhaB (WP_094467462), Pseudomonas oleovorans PhaB (WP_074858624), Pseudomonas putida PhaB (BAB96554) ou Streptomyces coelicolor PhaB (WP_011027734). Em outra modalidade preferencial, a enzima é 3-hidroxibutiril-CoA desidrogenase, que

10 / 43 tem atividade definida por EC 1.1.1.157 (isto é, (S)-3-hidroxibutanoil-CoA + NADP+ = 3-acetoacetil-CoA + NADPH + H+). A 3-hidroxibutiril-CoA desidrogenase pode ser ou pode ser derivada de qualquer micro-organismo hospedeiro, tal como Clostridium beijerinckii, Clostridium acetobutylicum ou Clostridium kluyveri. Em particular, a 3-hidroxibutiril-CoA desidrogenase pode ser Clostridium beijerinckii Hbd (WP_011967675.1), Clostridium acetobutylicum Hbd (NP_349314.1) ou Clostridium kluyveri Hbd1 (WP_011989027.1).

[0027] De preferência, a enzima que converte acetoacetil-CoA em 3- hidroxibutiril-CoA é (R)-específica, isto é, produz (R)-3-hidroxibutiril-CoA, uma vez que (R)-3-hidroxibutiril-CoA é o substrato típico para a produção enzimática de PHB. No entanto, em alguns casos, a enzima que converte acetoacetil-CoA em 3-hidroxibutiril-CoA é (S)-específica, isto é, produz (S)- 3-hidroxibutiril-CoA. Sem desejar estar vinculado a qualquer teoria específica, os inventores acreditam que a atividade de epimerase nativa ou introduzida em bactérias acetogênicas pode permitir a interconversão de (S)- e (R)-3-hidroxibutiril-CoA, tal como (S)-3-hidroxibutiril-CoA pode ser convertido em (R)-3-hidroxibutiril-CoA, o qual pode ser, então, convertido em PHB. (3) CONVERSÃO DE 3-HIDROXIBUTIRIL-CoA EM PHB

[0028] A conversão de 3-hidroxibutiril-CoA em PHB pode ser catalisada por qualquer enzima adequada. Embora seja possível que a atividade nativa dessa reação possa estar presente em determinadas bactérias acetogênicas, geralmente, é necessário introduzir uma enzima heteróloga (isto é, não nativa) para catalisar essa reação. Em uma modalidade preferencial, a enzima é poli-hidroxialcanoato sintase, que tem atividade definida por EC 2.3.1.-, tal como EC 2.3.1.B2 (tipo I) (isto é, 3-hidroxibutiril-CoA + [(R)- 3-hidroxibutanoato]n = [(R)-3-hidroxibutanoato]n+1 + CoA), EC 2.3.1.B3 (tipo II) (isto é, 3-hidroxiacil-CoA + [(R)-3-hidroxiacil]n = [(R)-3-hidroxiacil]n+1 +

11 / 43 CoA) ou EC 2.3.1.B4 (tipo III) (isto é, 3-hidroxiacil-CoA + [(R)-3- hidroxiacil]n = [(R)-3-hidroxiacil]n+1 + CoA). Essa enzima pode também ser denominada polioxi-hidroxialcanoato polimerase, poli-hidroxibutirato sintase, poli-hidroxibutirato polimerase e similares. A poli-hidroxialcanoato sintase pode ser derivada de qualquer micro-organismo hospedeiro adequado, tal como Acinetobacter baumannii, Aeromonas caviae, Aeromonas hydrophilia, Alcaligenes latus, Arthrospira platensis, Bacillus subtilis, Burkholderia cepacia, Cupriavidus necator, Haloferax mediterranei, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas mandelii, Pseudomonas oleovorans, Pseudomonas putida, Pseudomonas sp. 61-3, Rhodospirillum rubrum ou Streptomyces coelicolor. Em particular, a poli-hidroxialcanoato sintase pode ser ou pode ser derivada de Acinetobacter baumannii PhaC (SCY71072), Aeromonas caviae PhaC (WP_045524574), Aeromonas hydrophilia PhaC1 (WP_017780191) ou PhaC2 (AAV41872), Alcaligenes latus PhaC (WP_084267317), Arthrospira platensis PhaC (WP_006617456), Bacillus subtilis PhaC (CUB58881), Burkholderia cepacia PhaC (WP_027784567), Cupriavidus necator PhaC (WP_011615085 ou WP_013956451.1), Haloferax mediterranei PhaC (WP_004056138), Pseudomonas aeruginosa PhaC1 (WP_038823539) ou PhaC2 (WP_025271419), Pseudomonas fluorescens PhaC1 (WP_057399292) ou PhaC2 (WP_030141001), Pseudomonas mandelii PhaC1 (WP_094467460) ou PhaC2 (WP_010465951), Pseudomonas oleovorans PhaC1 (AAL17611) ou PhaC2 (WP_037049875), Pseudomonas putida PhaC1 (BAB96552) ou PhaC2 (WP_029886362), Pseudomonas sp. 61-3 PhaC1 (BAA36198) ou PhaC2 (BAA36202), Rhodospirillum rubrum PhaC1 (WP_011388028), PhaC2 (WP_011390166), ou PhaC3 (WP_011398569), ou Streptomyces coelicolor PhaC.

[0029] Em determinadas modalidades, uma ou mais mutações disruptivas podem ser introduzidas em uma ou mais enzimas endógenas para

12 / 43 reduzir ou eliminar a competição com enzimas heterólogas introduzidas. Em particular, uma “mutação disruptiva” é uma mutação que reduz ou elimina (isto é, “interrompe”) a expressão ou atividade de um gene ou enzima. A mutação disruptiva pode inativar parcialmente, inativar totalmente, ou deletar o gene ou a enzima. A mutação disruptiva pode ser uma mutação por nocaute (KO). A mutação disruptiva pode ser qualquer mutação que reduza, previna ou bloqueie a biossíntese de um produto produzido por uma enzima. A mutação disruptiva pode incluir, por exemplo, uma mutação em um gene que codifica uma enzima, uma mutação em um elemento regulatório genético envolvido na expressão de um gene que codifica uma enzima, a introdução de um ácido nucleico que produz uma proteína que reduz ou inibe a atividade de uma enzima, ou a introdução de um ácido nucleico (por exemplo, RNA antissenso, siRNA, RNA-guia) e/ou proteína (por exemplo, uma proteína Cas) que inibe a expressão de uma enzima. A mutação disruptiva pode ser introduzida com o uso de qualquer método conhecido na técnica.

[0030] Por exemplo, o micro-organismo da invenção pode ter uma mutação disruptiva em uma enzima tioesterase endógena. Três tioesterases putativas foram identificadas em Clostridium autoethanogenum: (1) “tioesterase 1” (AGY74947.1; anotada como palmitoil-CoA hidrolase), (2) “tioesterase 2” (AGY75747.1; anotada como 4-hidroxibenzoil-CoA tioesterase) e (3) “tioesterase 3” (AGY75999.1; anotada como tioesterase putativa). Três tioesterases putativas foram identificadas em Clostridium ljungdahlii: (1) “tioesterase 1” (ADK15695.1; anotada, conforme acil-CoA tioesterase prevista 1), (2) “tioesterase 2” (ADK16655.1; anotada como tioesterase prevista) e (3) “tioesterase 3” (ADK16959.1; anotada como tioesterase prevista). A mutação disruptiva pode afetar qualquer uma dessas tioesterases ou quaisquer outras tioesterases que podem ser endógenas ao micro-organismo da invenção. MICRO-ORGANISMO

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[0031] Um “micro-organismo” é um organismo microscópico, especialmente uma bactéria, Archea, vírus ou fungo. O micro-organismo da invenção é tipicamente uma bactéria. Conforme usado no presente documento, a recitação de “micro-organismo” deve ser tomada para abranger “bactéria”.

[0032] O micro-organismo da invenção é de ocorrência não natural. O termo "ocorrência não natural", quando usado em referência a um micro- organismo, significa que o micro-organismo possui pelo menos uma modificação genética não encontrada em uma cepa de ocorrência natural das espécies referenciadas, incluindo as cepas do tipo selvagem das espécies referenciadas. Micro-organismos de ocorrência não natural são tipicamente desenvolvidos em um laboratório ou centro de pesquisa. Em contraste, o “tipo selvagem” se refere à forma típica de um organismo, cepa, gene ou característica, conforme ocorrência quanto à natureza.

[0033] Os termos “modificação genética”, “alteração genética” ou “manipulação genética” se referem amplamente à manipulação do genoma ou ácidos nucleicos de um micro-organismo. Da mesma forma, os termos “geneticamente modificado”, “geneticamente alterado” ou “modificado por engenharia genética” se referem a um micro-organismo que compreende essa modificação genética, alteração genética ou engenharia genética. Esses termos podem ser usados para diferenciar um micro-organismo gerado em laboratório a partir de um micro-organismo de ocorrência natural. Os métodos de modificação genética incluem, por exemplo, expressão de genes heterólogos, inserção ou exclusão de genes ou promotores, mutação de ácidos nucleicos, expressão ou inativação de genes alterados, engenharia de enzimas, evolução direcionada, projeto baseado em conhecimento, métodos de mutagênese aleatórios, transposição de genes e otimização de códons.

[0034] "Recombinante" indica que um ácido nucleico, proteína ou micro-organismo é o produto de modificação, engenharia ou recombinação

14 / 43 genética. Geralmente, o termo "recombinante" se refere a um ácido nucleico, proteína ou micro-organismo que compreende ou é codificado por material genético derivado de múltiplas fontes, tais como duas ou mais cepas ou espécies diferentes de micro-organismos. O micro-organismo da invenção é tipicamente recombinante.

[0035] O termo "derivado de" indica que um ácido nucleico, proteína ou micro-organismo é modificado ou adaptado a partir de um ácido nucleico, proteína ou micro-organismo diferente (por exemplo, um do tipo parental ou do tipo selvagem), de modo a produzir um novo ácido nucleico, proteína ou micro-organismo. Tais modificações ou adaptações incluem tipicamente inserção, deleção, mutação ou substituição de ácidos nucleicos ou genes. Geralmente, o micro-organismo da invenção é derivado de um “micro- organismo parental", que é um micro-organismo usado para gerar um micro- organismo da invenção. O micro-organismo parental pode ser um micro- organismo de ocorrência natural (isto é, um micro-organismo do tipo selvagem) ou um micro-organismo que foi modificado anteriormente (isto é, um micro-organismo mutante ou recombinante). O micro-organismo da invenção pode ser modificado para expressar ou superexpressar uma ou mais enzimas que não foram expressas ou superexpressas no micro-organismo parental. Do mesmo modo, o micro-organismo da invenção pode ser modificado para compreender um ou mais genes que não foram compreendidos pelo micro-organismo parental. O micro-organismo da invenção também pode ser modificado para não expressar ou para expressar quantidades mais baixas de uma ou mais enzimas que foram expressas no micro-organismo parental. Em uma modalidade, o micro-organismo da presente invenção é derivado de um micro-organismo parental selecionado a partir do grupo que consiste em Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii ou Clostridium ragsdalei. Em uma modalidade preferencial, o micro-organismo da invenção é derivado do micro-organismo parental

15 / 43 Clostridium autoethanogenum LZ1561, que foi depositado em 07 de junho de 2010 com Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) localizada em Inhoffenstraß 7B, D-38124 Braunschwieg, Alemanha em 07 de junho de 2010 sob os termos do Tratado de Budapeste e que recebeu o número de acesso DSM23693. Essa cepa é descrita no Pedido de Patente Internacional nº PCT/NZ2011/000144, publicado como WO 2012/015317.

[0036] O micro-organismo da invenção pode ser ainda classificado com base em características funcionais. Por exemplo, o micro-organismo da presente invenção pode ser ou pode ser derivado de um micro-organismo de Wood-Ljungdahl, um micro-organismo que fixa C1, um anaeróbio, um acetógeno, uma produção de etanol e/ou um carboxidotrófico. A Tabela 1 fornece uma lista representativa de micro-organismos e identifica suas características funcionais. TABELA 1 Wood-Ljungdahl Carboxidotrófico Fixação de C1 Etanológeno Autotrófico Acetógeno Anaeróbio Acetobacterium woodii + + + + +/-1 + - Alkalibaculum bacchii + + + + + + + Blautia producta + + + + - + + Butyribacterium methylotrophicum + + + + + + + Clostridium aceticum + + + + - + + Clostridium autoethanogenum + + + + + + + Clostridium carboxidivorans + + + + + + + Clostridium coskatii + + + + + + + Clostridium drakei + + + + - + + Clostridium formicoaceticum + + + + - + + Clostridium ljungdahlii + + + + + + + Clostridium magnum + + + + - + +/-2 Clostridium ragsdalei + + + + + + + Clostridium scatologenes + + + + - + + Eubacterium limosum + + + + - + + Moorella thermautotrophica + + + + + + + Moorella thermoacetica (anteriormente Clostridium thermoaceticum) + + + + -3 + + Oxobacter pfennigii + + + + - + + Sporomusa ovata + + + + - + +/-4 Sporomusa silvacetica + + + + - + +/-5 Sporomusa sphaeroides + + + + - + +/-6 Thermoanaerobacter kiuvi + + + + - + - 1 Acetobacterium woodi pode produzir etanol a partir de frutose, mas não a partir de gás. 2 Não investigou-se se Clostridium magnum pode crescer com CO. 3 Uma cepa de Moorella thermoacetica, Moorella sp. HUC22-1, foi relatada como produtora de etanol a partir de gás. 4 Não investigou-se se Sporomusa ovata pode crescer em CO. 5 Não investigou-se se Sporomusa silvacetica pode crescer em CO. 6 Não investigou-se se Sporomusa sphaeroides pode crescer em CO.

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[0037] "Wood-Ljungdahl" se refere à via de fixação de carbono de Wood-Ljungdahl, conforme descrito, por exemplo, por Ragsdale, Biochim Biophys Acta, 1784: 1.873 a 1.898, 2008. “Micro-organismos de Wood- Ljungdahl" se refere, de modo previsível, a micro-organismos que compreendem a via de Wood-Ljungdahl. Geralmente, o micro-organismo da invenção compreende uma via nativa de Wood-Ljungdahl. No presente documento, uma via de Wood-Ljungdahl pode ser uma via de Wood- Ljungdahl nativa e não modificada ou pode ser uma via de Wood-Ljungdahl com algum grau de modificação genética (por exemplo, superexpressão, expressão heteróloga, nocaute etc.), enquanto ainda funções para converter CO, CO2 e/ou H2 a acetil-CoA.

[0038] “C1” se refere a uma molécula de um carbono, por exemplo, CO, CO2 ou CH3OH. “oxigenado com C1" se refere a uma molécula de um carbono que também compreende pelo menos um átomo de oxigênio, por exemplo, CO, CO2 ou CH3OH. "Fonte de carbono C1" se refere a uma molécula de carbono que serve como fonte parcial ou única de carbono para o micro-organismo da invenção. Por exemplo, uma fonte de carbono C1 pode compreender um ou mais dentre CO, CO2, CH3OH ou CH2O2. De preferência, a fonte de carbono C1 compreende um ou ambos de CO e CO2. Um “micro- organismo de fixação C1" é um micro-organismo com capacidade para produzir um ou mais produtos a partir de uma fonte de carbono C1. Tipicamente, o micro-organismo da invenção é uma bactéria de fixação de C1. Em uma modalidade preferencial, o micro-organismo da invenção é derivado de um micro-organismo de fixação de C1 identificado na Tabela 1. Para fins da presente invenção, metano (CH4) pode ser considerado uma fonte de carbono de C1, mas somente se a bactéria da invenção tiver sido modificada por engenharia genética para compreender uma via metabólica de metano, conforme descrito, por exemplo, no documento WO 2016/138050, uma vez que bactérias acetogênicas não são nativamente capazes de usar

17 / 43 metano como uma fonte de carbono.

[0039] Um “anaeróbio” é um micro-organismo que não necessita de oxigênio para o crescimento. Um anaeróbio pode reagir negativamente ou até morrer se houver oxigênio acima de um determinado limite. No entanto, alguns anaeróbios são capazes de tolerar baixos níveis de oxigênio (por exemplo, 0,000001 a 5% de oxigênio). Tipicamente, o micro-organismo da invenção é um anaeróbio. Em uma modalidade preferencial, o micro- organismo da presente invenção é derivado de um anaeróbio identificado na Tabela 1.

[0040] “Acetógenos” são bactérias obrigatoriamente anaeróbicas que usam a via de Wood-Ljungdahl como seu mecanismo principal para a conservação de energia e para a síntese de acetil-CoA e produtos derivados de acetil-CoA, tal como acetato (Ragsdale, Biochim Biophys Acta, 1.784: 1.873 a

1.898, 2008). Acetógenos usam a via de Wood-Ljungdahl como um (1) mecanismo para a síntese redutiva de acetil-CoA a partir de CO2, (2) aceitação de elétron terminal, processo de conservação de energia, (3) mecanismo para a fixação (assimilação) de CO2 na síntese de carbono celular (Drake, Acetogenic Prokaryotes, In: The Prokaryotes, 3ª edição, p. 354, New York, NY, 2006). Todos os acetógenos de ocorrência natural são fixadores de C1, anaeróbicos, autotróficos e não metanotróficos. Tipicamente, o micro- organismo da invenção é um acetógeno. Em uma modalidade preferencial, o micro-organismo da invenção é derivado de um acetógeno identificado na Tabela 1.

[0041] Um “etanológeno” é um micro-organismo que produz ou tem capacidade para produzir etanol. Normalmente, o micro-organismo da presente invenção é um etanológeno. Em uma modalidade preferencial, o micro-organismo da invenção é derivado a partir de um etanológeno identificado na Tabela 1.

[0042] Um “autótrofo” é um micro-organismo capaz de crescer na

18 / 43 ausência de carbono orgânico. Em vez disso, os autotróficos usam fontes de carbono inorgânicas, tais como CO e/ou CO2. Tipicamente, o micro- organismo da invenção é um autotrófico. Em uma modalidade preferencial, o micro-organismo da invenção é derivado de um autótrofo identificado na Tabela 1.

[0043] Um "carboxidotrófico" é um micro-organismo capaz de utilizar CO como única fonte de carbono e energia. Tipicamente, o micro- organismo da invenção é um carboxidotrófico. Em uma modalidade preferencial, o micro-organismo da invenção é derivado de um carboxidotrófico identificado na Tabela 1.

[0044] Mais amplamente, o micro-organismo da invenção pode ser derivado de qualquer gênero ou espécie identificada na Tabela 1. Por exemplo, o micro-organismo pode ser um membro de um gênero selecionado a partir do grupo que consiste em Acetobacterium, Alkalibaculum, Blautia, Butyribacterium, Clostridium, Eubacterium, Moorella, Oxobacter, Sporomusa e Thermoanaerobacter. Em particular, o micro-organismo pode ser derivado de uma bactéria parental selecionada a partir do grupo que consiste em Acetobacterium woodii, Alkalibaculum bacchii, Blautia producta, Butyribacterium methylotrophicum, Clostridium aceticum, Clostridium autoethanogenum, Clostridium carboxidivorans, Clostridium coskatii, Clostridium drakei, Clostridium formicoaceticum, Clostridium ljungdahlii, Clostridium magnum, Clostridium ragsdalei, Clostridium scatologenes, Eubacterium limosum, Moorella thermautotrophica, Moorella thermoacetica, Oxobacter pfennigii, Sporomusa ovata, Sporomusa silvacetica, Sporomusa sphaeroides e Thermoanaerobacter kiuvi.

[0045] Em uma modalidade preferencial, o micro-organismo da invenção é derivado do agrupamento de Clostridia que compreende as espécies de Clostridium autoethanogenum, Clostridium coskatii, Clostridium ljungdahlii e Clostridium ragsdalei. Essas espécies foram primeiramente

19 / 43 relatadas e distinguidas por Abrini, Arch Microbiol, 161: 345 a 351, 1994 (Clostridium autoethanogenum), Tanner, Int J System Bacteriol, 43: 232 a 236, 1993 (Clostridium ljungdahlii), e Huhnke, documento WO 2008/028055 (Clostridium ragsdalei).

[0046] Essas espécies têm muitas semelhanças. Em particular, essas espécies são todos membros de fixação de C1, anaeróbios, acetogênicos, etanologênicos e carboxidotróficos do gênero Clostridium. Essas espécies têm genótipos e fenótipos similares e modos de conservação de energia e metabolismo fermentativo. Além disso, essas espécies são agrupadas no grupo de homologia de rRNA clostridial I com DNA de rRNA 16S que são mais do que 99% idênticos, têm um teor de DNA G + C de cerca de 22 a 30% em mol, são gram-positivas, têm morfologia e tamanho similares (células de crescimento logarítmico entre 0,5 a 0,7 x 3 a 5 μm), são mesofílicas (crescimento de modo ideal a 30 a 37 °C), com faixas de pH similares de cerca de 4 a 7,5 (com um pH ideal de cerca de 5,5 a 6), não possuem citocromos e economizam energia através de um complexo de Rnf. Além disso, a redução de ácidos carboxílicos nos seus álcoois correspondentes foi demonstrada nessas espécies (Perez, Biotechnol Bioeng, 110:1.066 a 1.077, 2012). De modo relevante, essas espécies também demonstram forte crescimento autotrófico sob gases que compreendem CO, produzem etanol e acetato (ou ácido acético) como principais produtos de fermentação, e produzem pequenas quantidades de 2,3-butanodiol e ácido láctico sob determinadas condições.

[0047] No entanto, essas espécies também apresentam diversas diferenças. Essas espécies foram isoladas de diferentes fontes: Clostridium autoethanogenum de intestino de coelho, Clostridium ljungdahlii de resíduos de galinheiro e Clostridium ragsdalei de sedimentos de água doce. Essas espécies diferem quanto à utilização de vários açúcares (por exemplo, ramnose, arabinose), ácidos (por exemplo, gluconato, citrato), aminoácidos

20 / 43 (por exemplo, arginina, histidina) e outros substratos (por exemplo, betaína, butanol). Além disso, essas espécies diferem quanto à auxotrofia de determinadas vitaminas (por exemplo, tiamina, biotina). Essas espécies têm diferenças nas sequências nucleicas e de aminoácidos de genes e proteínas da via de Wood-Ljungdahl, embora a organização geral e o número desses genes e proteínas sejam os mesmos em todas as espécies (Köpke, Curr Opin Biotechnol, 22: 320 a 325, 2011).

[0048] Desse modo, em suma, muitas das características de Clostridium autoethanogenum, Clostridium coskatii, Clostridium ljungdahlii ou Clostridium ragsdalei não são específicas para essas espécies, mas são, em vez disso, características gerais para esse agrupamento de membros de fixação de C1, anaeróbicos, acetogênicos, etanologênicos e carboxidotróficos do gênero Clostridium. No entanto, como essas espécies são, de fato, distintas, a modificação genética ou a manipulação de uma dessas espécies pode não ter um efeito idêntico em outra dessas espécies. Por exemplo, podem ser observadas diferenças no crescimento, desempenho ou produção do produto.

[0049] O micro-organismo da invenção também pode ser derivado de um isolado ou mutante de Clostridium autoethanogenum, Clostridium coskatii, Clostridium ljungdahlii ou Clostridium ragsdalei. Isolados e mutantes de Clostridium autoethanogenum incluem JA1-1 (DSM10061) (Abrini, Arch Microbiol, 161: 345 a 351, 1994), LBS1560 (DSM19630) (WO 2009/064200) e LZ1561 (DSM23693) (WO 2012/015317). Isolados e mutantes de Clostridium ljungdahlii incluem ATCC 49587 (Tanner, Int J Syst Bacteriol, 43: 232 a 236, 1993), PETCT (DSM13528, ATCC 55383), ERI‐2 (ATCC 55380) (US 5.593.886), C‐01 (ATCC 55988) (US 6.368.819), O‐52 (ATCC 55989) (US 6.368.819) e OTA‐1 (Tirado‐Acevedo, Production of bioethanol from synthesis gas using Clostridium ljungdahlii, tese de PhD, North Carolina State University, 2010). Isolados e mutantes de Clostridium

21 / 43 ragsdalei incluem PI 1 (ATCC BAA-622, ATCC PTA-7826) (WO 2008/028055).

[0050] De preferência, o micro-organismo da invenção não é fototrófico ou fotossintético. De preferência, o micro-organismo da invenção não é metanotrófico.

[0051] De preferência, o micro-organismo da invenção não é um membro do gênero Alcaligenes, Azotobacter, Bacillus, Cupriavidus (Ralstonia), Rhizobium, Rhodospirillum ou Pseudomonas. Em particular, o micro-organismo da invenção não é, de preferência, derivado de Rhodospirillum rubrum, Bacillus cereus, Cupriavidus necator (anteriormente Ralstonia eutropha) ou Pseudomonas putida. Em outras modalidades, o micro-organismo da invenção não é, de preferência, derivado de Escherichia coli.

ENZIMAS

[0052] "Endógeno" ou "nativo" se refere a um ácido nucleico ou proteína que está presente ou expressa no micro-organismo do tipo selvagem ou parental do qual o micro-organismo da invenção é derivado. Por exemplo, um gene ou proteína endógena é um gene ou proteína que está presente nativamente no micro-organismo do tipo selvagem ou parental do qual o micro-organismo da invenção é derivado. Em uma modalidade, a expressão de um gene endógeno pode ser controlada por um elemento regulador exógeno, tal como um promotor exógeno.

[0053] "Exógeno" se refere a um ácido nucleico ou proteína que se origina fora do micro-organismo da invenção. Por exemplo, um gene ou enzima exógena pode ser criada de modo artificial ou recombinante e introduzida ou expressa no micro-organismo da invenção. Um gene ou enzima exógena também pode ser isolada de um micro-organismo heterólogo e introduzida ou expressa no micro-organismo da invenção. Os ácidos nucleicos exógenos podem ser adaptados para integrar no genoma do micro-

22 / 43 organismo da invenção ou permanecer em um estado extracromossômico no micro-organismo da invenção, por exemplo, em um plasmídeo.

[0054] "Heterólogo" se refere a um ácido nucleico ou proteína que não está presente no micro-organismo do tipo selvagem ou parental do qual o micro-organismo da invenção é derivado. Por exemplo, um gene ou enzima heteróloga pode ser derivada de uma cepa ou espécie diferente e introduzida ou expressa no micro-organismo da invenção.

[0055] Tipicamente, pelo menos uma das enzimas que (a) converte acetil-CoA em acetoacetil-CoA, (b) converte acetoacetil-CoA em 3- hidroxibutiril-CoA ou (c) converte 3-hidroxibutiril-CoA em PHB é heteróloga (isto é, não nativa) à bactéria. Por exemplo, uma, duas ou todas as três enzimas podem ser heterólogas (isto é, não nativas) à bactéria. Se a bactéria tiver atividade enzimática nativa para uma ou mais dessas etapas, no entanto, pode ser necessário introduzir enzimas heterólogas para catalisar essas etapas.

[0056] Conforme usado no presente documento, “expressão” se refere ao processo pelo qual um polinucleotídeo é transcrito a partir de um modelo de DNA (tal como em mRNA ou outro transcrito de RNA) e/ou ao processo pelo qual um mRNA transcrito é, subsequentemente, traduzido em peptídeos, polipeptídeos ou proteínas.

[0057] “Atividade enzimática” ou simplesmente “atividade” se refere de forma ampla à atividade enzimática, incluindo, mas sem limitação, a atividade de uma enzima, a quantidade de uma enzima ou a disponibilidade de uma enzima para catalisar uma reação. Por conseguinte, “aumentar” a atividade enzimática inclui aumentar a atividade de uma enzima, aumentar a quantidade de uma enzima ou aumentar a disponibilidade de uma enzima para catalisar uma reação. De forma similar, “diminuir” a atividade enzimática inclui diminuir a atividade de uma enzima, diminuir a quantidade de uma enzima ou diminuir a disponibilidade de uma enzima para catalisar uma reação.

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[0058] “Otimização de códon” se refere à mutação de um ácido nucleico, tal como um gene, para tradução otimizada ou aprimorada do ácido nucleico em uma cepa ou espécie específica. A otimização de códon pode resultar em taxas de tradução mais rápidas ou maior precisão na tradução. Em uma modalidade preferencial, os genes da invenção são códon otimizado para a expressão em Clostridium, particularmente, Clostridium autoethanogenum, Clostridium coskatii, Clostridium ljungdahlii ou Clostridium ragsdalei. Conforme usado no presente documento, os termos “otimizado por códon” e “adaptado ao códon” podem ser usados de forma intercambiável.

[0059] O termo "variantes" inclui ácidos nucleicos e proteínas cuja sequência varia da sequência de um ácido nucleico e proteína de referência, tal como uma sequência de um ácido nucleico e proteína de referência divulgada na técnica anterior ou exemplificada no presente documento. A invenção pode ser praticada utilizando-se ácidos nucleicos ou proteínas variantes que executam substancialmente a mesma função que o ácido nucleico ou proteína de referência. Por exemplo, uma proteína variante pode desempenhar substancialmente a mesma função ou catalisar substancialmente a mesma reação que uma proteína de referência. Um gene variante pode codificar a mesma ou substancialmente a mesma proteína que um gene de referência. Um promotor variante pode ter substancialmente a mesma capacidade de promover a expressão de um ou mais genes que um promotor de referência.

[0060] Tais ácidos nucleicos ou proteínas podem ser denominados "variantes funcionalmente equivalentes". A título de exemplo, variantes funcionalmente equivalentes de um ácido nucleico podem incluir variantes alélicas, fragmentos de um gene, genes mutados, polimorfismos e similares. Genes homólogos de outros micro-organismos também são exemplos de variantes funcionalmente equivalentes. Os mesmos podem incluir genes homólogos em espécies, tais como Clostridium acetobutylicum, Clostridium

24 / 43 beijerinckii ou Clostridium ljungdahlii, cujos detalhes estão publicamente disponíveis em sites da web, tal como GenBank ou NCBI. Variantes funcionalmente equivalentes também incluem ácidos nucleicos cuja sequência varia como resultado da otimização de códons para um micro-organismo específico. Uma variante funcionalmente equivalente de um ácido nucleico terá, de preferência, pelo menos aproximadamente 70%, aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95%, aproximadamente 98% ou maior identidade de sequência de ácidos nucleicos (homologia percentual) com o ácido nucleico referenciado. Uma variante funcionalmente equivalente de uma proteína terá, de preferência, pelo menos aproximadamente 70%, aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95%, aproximadamente 98%, ou maior identidade de aminoácidos (homologia percentual) com a proteína referenciada. A equivalência funcional de uma proteína ou ácido nucleico variante pode ser avaliada com o uso de qualquer método conhecido na técnica.

[0061] As enzimas descritas no presente documento são tipicamente expressas a partir de um ácido nucleico que foi introduzido no micro- organismo da invenção. Os ácidos nucleicos podem ser entregues a um micro- organismo da invenção com o uso de qualquer método conhecido na técnica. Por exemplo, os ácidos nucleicos podem ser entregues como ácidos nucleicos puros ou podem ser formulados com um ou mais agentes, tais como lipossomas. Os ácidos nucleicos podem ser DNA, RNA, cDNA ou combinações dos mesmos, conforme apropriado. Inibidores de restrição podem ser utilizados em determinadas modalidades. Vetores adicionais podem incluir plasmídeos, vírus, bacteriófagos, cosmídeos e cromossomos artificiais. Em uma modalidade preferencial, os ácidos nucleicos são entregues ao micro-organismo da invenção com o uso de um plasmídeo. A título de exemplo, a transformação (incluindo transdução ou transfecção)

25 / 43 pode ser realizada por meio de eletroporação, ultrassonografia, transformação mediada por polietileno glicol, competência química ou natural, transformação de protoplastos, indução de prófago ou conjugação. Em determinadas modalidades com sistemas de enzima de restrição ativa, pode ser necessário metilar um ácido nucleico antes da introdução do ácido nucleico em um micro-organismo.

[0062] Além disso, os ácidos nucleicos podem ser projetados de modo a compreender um elemento regulatório, tal como um promotor, para aumentar ou controlar de outro modo a expressão de um ácido nucleico específico. O promotor pode ser um promotor constitutivo ou um promotor induzível. De modo ideal, o promotor é um promotor de via de Wood- Ljungdahl, um promotor de ferredoxina, um promotor de piruvato:ferredoxina oxidorredutase, um promotor de operon de complexo de Rnf, um promotor de operon de sintase de ATP ou um promotor de operon de fosfotransacetilase/acetato quinase.

SUBSTRATOS

[0063] "Substrato" se refere a uma fonte de carbono e/ou energia para o micro-organismo da invenção. Tipicamente, o substrato é gasoso e compreende uma fonte de carbono C1, por exemplo, CO e/ou CO2. De preferência, o substrato compreende uma fonte de carbono C1 de CO ou CO + CO2. O substrato pode compreender adicionalmente outros componentes diferentes de carbono, tais como H2, N2 ou elétrons.

[0064] O substrato compreende, geralmente, pelo menos alguma quantidade de CO, tal como cerca de 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100% em mol de CO. O substrato pode compreender uma faixa de CO, tal como cerca de 20 a 80, 30 a 70 ou 40 a 60% em mol de CO. De preferência, o substrato compreende cerca de 40 a 70% em mol de CO (por exemplo, gás de usina siderúrgica ou de alto forno), cerca de 20 a 30% em mol de CO (por exemplo, gás básico de forno de oxigênio) ou cerca de 15 a 45% em mol de

26 / 43 CO (por exemplo, gás de síntese). Em algumas modalidades, o substrato pode compreender uma quantidade relativamente baixa de CO, tal como cerca de 1 a 10 ou 1 a 20% em mol de CO. O micro-organismo da invenção tipicamente converte pelo menos uma porção do CO no substrato em um produto. Em algumas modalidades, o substrato compreende nenhum ou substancialmente nenhum (< 1% em mol) de CO.

[0065] O substrato pode compreender uma determinada quantidade de H2. Por exemplo, o substrato pode compreender cerca de 1, 2, 5, 10, 15, 20 ou 30% em mol de H2. Em algumas modalidades, o substrato pode compreender uma quantidade relativamente elevada de H2, tal como cerca de 60, 70, 80 ou 90% em mol de H2. De acordo com outras modalidades, o substrato compreende nenhum ou substancialmente nenhum (< 1% em mol de) H2.

[0066] O substrato pode compreender uma determinada quantidade de CO2. Por exemplo, o substrato pode compreender cerca de 1 a 80 ou 1 a 30% em mol de CO2. Em algumas modalidades, o substrato pode compreender menos do que cerca de 20, 15, 10 ou 5% em mol de CO2. Em outra modalidade, o substrato compreende nenhum ou substancialmente nenhum (< 1% em mol de) CO2.

[0067] Em determinadas modalidades, o crescimento de uma cepa que produz PHB é comparado ao de uma cepa de controle (“plasmídeo vazio” ou “EP”) com o uso de duas misturas de gás que contêm CO e CO2 diferentes com 20% de H2 semelhante a gás de síntese (50% de CO, 20% de CO2, 20% de H2, 10% de argônio), denominadas condições “PHB20” e “EP20”, respectivamente, ou 2% de H2 semelhante a gás de usina siderúrgica (50% de CO, 20% de CO2, 2% de H2, 28% de nitrogênio), denominadas condições “PHB2” e “EP2”, respectivamente.

[0068] Embora o substrato seja tipicamente gasoso, o substrato também pode ser fornecido em formas alternativas. Por exemplo, o substrato pode ser dissolvido em um líquido saturado com um gás que compreende CO

27 / 43 com o uso de um gerador de dispersão de microbolhas. A título de exemplo adicional, o substrato pode ser adsorvido em um suporte sólido.

[0069] O substrato e/ou a fonte de carbono C1 pode ser um gás residual obtido como subproduto de um processo industrial ou de alguma outra fonte, tais como gases de escape de automóveis ou gaseificação de biomassa. Em determinadas modalidades, o processo industrial é selecionado a partir do grupo que consiste em fabricação de produtos de metais ferrosos, tais como fabricação de usinas siderúrgicas, fabricação de produtos não ferrosos, refinamento de petróleo, gaseificação de carvão, produção de energia elétrica, produção de negro de fumo, produção de amônia, produção de metanol e fabricação de coque. Nessas modalidades, o substrato e/ou a fonte de carbono C1 podem ser capturados a partir do processo industrial antes de serem emitidos para a atmosfera, utilizando qualquer método conveniente.

[0070] O substrato e/ou a fonte de carbono C1 podem ser gás de síntese, tal como gás de síntese obtido por gaseificação de resíduos de carvão ou refinaria, gaseificação de biomassa ou material lignocelulósico ou reforma de gás natural. Em outra modalidade, o gás de síntese pode ser obtido a partir da gaseificação de resíduos sólidos urbanos ou resíduos sólidos industriais.

[0071] A composição do substrato pode ter um impacto significativo sobre a eficiência e/ou custo da reação. Por exemplo, a presença de oxigênio (O2) pode reduzir a eficiência de um processo de fermentação anaeróbica. Dependendo da composição do substrato, pode ser desejável tratar, esfregar ou filtrar o substrato para remover quaisquer impurezas indesejadas, tais como toxinas, componentes indesejados ou partículas de poeira e/ou aumentar a concentração de componentes desejáveis.

[0072] Em determinadas modalidades, a fermentação ou cultura é realizada na ausência de substratos de carboidratos, tais como açúcar, amido, lignina, celulose ou hemicelulose.

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[0073] Como usado no presente documento, o termo "PHBLowB" é usado com referência a experimentos com uma menor concentração de biomassa no estado estacionário, como uma concentração de biomassa de estado estacionário 3 vezes menor. Conforme usado no presente documento, o termo "PHBpH5.5" é usado com referência a experimentos conduzidos a um pH de 5,5. Consultar a Figura 8.

PRODUTOS

[0074] O micro-organismo da invenção pode ser cultivado para produzir um ou mais produtos. Em particular, o micro-organismo da presente invenção pode produzir PHB ou precursores do mesmo, tais como acetoacetil- CoA ou 3-hidroxibutiril-CoA.

[0075] PHB é um polímero de monômeros de 3-hidroxibutirato. O PHB produzido de acordo com a invenção pode compreender qualquer número de monômeros de 3-hidroxibutirato, por exemplo, cerca de 10 a

1.000.000 de monômeros. Como exemplos adicionais, o PHB pode compreender cerca de 10 a 100.000 monômeros, 100 a 100.000 monômeros, 100 a 10.000 monômeros, 500 a 5.000 monômeros, 1.000 a 10.000 monômeros ou 5.000 a 20.000 monômeros. Em uma modalidade preferencial, o PHB compreende cerca de 100 a 12.000 monômeros.

[0076] O peso molecular de PHB produzido pela bactéria da invenção pode estar na faixa de cerca de 1.000 a 100.000.000 Da. Por exemplo, o peso molecular do PHB pode ser de cerca de 1.000 a 10.000 Da, 10.000 a

1.000.000 Da, 10.000 a 10.000.000 Da ou 10.000.000 a 100.000.000 Da. De preferência, o peso molecular do PHB pode ser de cerca de 10.000 a

1.000.000 Da, como 10.000 a 100.000 Da, 10.000 a 500.000 Da, 100.000 a

500.000 Da, 300.000 a 800.000 Da ou 500.000 a 1.000.000 Da.

[0077] A produção de PHB é frequentemente denominada porcentagem de peso celular seco. O micro-organismo da invenção pode produzir, por exemplo, 0,005 a 0,995% em peso de PHB. De preferência, o

29 / 43 micro-organismo da invenção produz cerca de 0,01% em peso, 0,1% em peso, 0,5% em peso, 1% em peso, 1,5% em peso, 2% em peso, 3% em peso, 5% em peso, 10% em peso, 20% em peso, 30 % em peso, 40% em peso, 50% em peso, 60% em peso, 70% em peso, 80% em peso, 90% em peso ou 95% em peso de PHB.

[0078] As características físicas de PHB são bem conhecidas na técnica. Como uma aproximação estimada, o PHB possui um módulo de Young de 1.497 a 3.500 MPa, uma resistência à tração de 18 a 43 MPa, alongamento para ruptura de 1,9 a 45%, uma cristalinidade de 60 a 80%, uma temperatura de fusão de 162 a 180 °C, uma temperatura de cristalização de 45 a 116 °C e/ou uma temperatura de transição vítrea de -1,2 a 10 °C.

[0079] Além disso, o micro-organismo da invenção também pode produzir ou pode ser modificado por engenharia genética para produzir outros produtos, tais como etanol (WO 2007/117157), acetato (WO 2007/117157), butanol (WO 2008/115080 e WO 2012/053905), butirato (WO 2008/115080), 2,3-butanodiol (WO 2009/151342 e WO 2016/094334), lactato (WO 2011/112103), buteno (WO 2012/024522), butadieno (WO 2012/024522), metil etil cetona (2-butanona) (WO 2012/024522 e WO 2013/185123), etileno (WO 2012/026833), acetona (WO 2012/115527), isopropanol (WO 2012/115527), lipídios (WO 2013/036147), 3-hidroxipropionato (3-HP) (WO 2013/180581), isopreno (WO 2013/180584), ácidos graxos (WO 2013/191567), 2-butanol (WO 2013/185123), 1,2-propanodiol (WO 2014/036152), 1-propanol (WO 2014/0369152) e produtos derivados de corismato (WO 2016/191625). Além de um ou mais produtos-alvo, o micro- organismo da invenção também pode produzir etanol, acetato e/ou 2,3- butanodiol. Em determinadas modalidades, a própria biomassa microbiana pode ser considerada um produto.

[0080] De preferência, o micro-organismo da invenção não é capaz de degradar o PHB. Organismos que produzem de modo nativo PHB e outros

30 / 43 poli-hidroxialcanoatos geralmente sintetizam os polímeros como um material de armazenamento de carbono quando outros nutrientes (por exemplo, nitrogênio e fósforo) são limitantes e carbono está em excesso. Esses organismos podem, então, despolimerizar/degradar os polímeros quando o nutriente limitante é reabastecido para ter acesso ao carbono armazenado. Com o objetivo de maximizar a produção de PHB, produtores não nativos, tais como os micro-organismos da presente invenção, geralmente têm a vantagem de não serem capazes de degradar enzimaticamente os polímeros, uma vez produzidos. Isso bloqueia essencialmente o carbono nos polímeros de modo permanente e pode aumentar o rendimento.

[0081] "Seletividade" se refere à razão entre a produção de um produto-alvo e a produção de todos os produtos de fermentação produzidos por um micro-organismo. O micro-organismo da invenção pode ser modificado por engenharia genética para produzir produtos com uma determinada seletividade ou com uma seletividade mínima. Em uma modalidade, um produto-alvo representa pelo menos cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 50% ou 75% de todos os produtos de fermentação produzidos pelo micro-organismo da invenção. Em uma modalidade, o produto-alvo é responsável por pelo menos 10% de todos os produtos de fermentação produzidos pelo micro-organismo da invenção, de modo que o micro- organismo da invenção tenha uma seletividade para o produto-alvo de pelo menos 10%. Em outra modalidade, o produto-alvo é responsável por pelo menos 30% de todos os produtos de fermentação produzidos pelo micro- organismo da invenção, de modo que o micro-organismo da invenção tenha uma seletividade para o produto-alvo de pelo menos 30%.

FERMENTAÇÃO

[0082] A invenção fornece adicionalmente um método para produzir PHB que compreende a cultura do micro-organismo da invenção, na presença de um substrato gasoso, pelo qual o micro-organismo produz PHB. O

31 / 43 substrato gasoso compreende, geralmente, um ou mais dentre CO, CO2 e H2.

[0083] Tipicamente, a cultura é realizada em um biorreator. O termo "biorreator" inclui um dispositivo de cultura/fermentação que consiste em um ou mais vasos, torres ou arranjos de tubulação, tal como um reator de tanque agitado contínuo (CSTR), reator de célula imobilizada (ICR), reator de leito gotejador (TBR), coluna de bolha, fermentador de elevação a gás, misturador estático ou outro recipiente ou outro dispositivo adequado para contato entre gás e líquido. Em algumas modalidades, o biorreator pode compreender um primeiro reator de crescimento e um segundo reator de cultura/fermentação. O substrato pode ser fornecido para um ou ambos os reatores. Conforme usado no presente documento, os termos "cultura" e "fermentação" são usados de forma intercambiável. Esses termos abrangem tanto a fase de crescimento quanto a fase de biossíntese de produto do processo de cultura/fermentação.

[0084] A cultura é geralmente mantida em um meio de cultura aquoso que compreende nutrientes, vitaminas e/ou minerais suficientes para permitir o crescimento do micro-organismo. De preferência, o meio de cultura aquoso é um meio de crescimento microbiano anaeróbico, tal como um meio de crescimento microbiano anaeróbico mínimo. Meios adequados são bem conhecidos na técnica.

[0085] A cultura deve ser desejavelmente realizada sob condições apropriadas para a produção do produto-alvo. Normalmente, a cultura é realizada sob condições anaeróbicas. As condições de reação a serem consideradas incluem pressão (ou pressão parcial), temperatura, taxa de fluxo de gás, taxa de fluxo de líquido, pH de meios, potencial redox de meios, taxa de agitação (se estiver utilizando um reator de tanque agitado contínuo), nível de inóculo, concentrações máximas de substrato de gás para garantir que esse gás na fase líquida não se torne limitante e as concentrações máximas do produto para evitar a inibição do produto.

[0086] Operar um biorreator a pressões elevadas permite um aumento

32 / 43 na taxa de transferência de massa de gás da fase gasosa para a fase líquida. Consequentemente, pode ser preferível realizar a fermentação a pressões superiores à pressão atmosférica. Além disso, uma dada taxa de conversão de gás é, em parte, uma função do tempo de retenção de substrato e do tempo de retenção dita o volume exigido de um biorreator, o uso de sistemas pressurizados pode reduzir significativamente o volume do biorreator requerido e, consequentemente, o custo de capital do equipamento de fermentação. Isso, por sua vez, significa que o tempo de retenção, definido como o volume de líquido no biorreator dividido pela taxa de fluxo de gás de entrada, pode ser reduzido quando os biorreatores são mantidos à pressão elevada em vez de pressão atmosférica. As condições de reação ideais dependerão parcialmente do micro-organismo específico usado. No entanto, em geral, é preferível operar a fermentação a uma pressão mais alta que a pressão atmosférica. Além disso, como uma determinada taxa de conversão de gás é em parte uma função do tempo de retenção de substrato e a obtenção do tempo de retenção desejado, por sua vez, dita o volume necessário de um biorreator, o uso de sistemas pressurizados pode reduzir bastante o volume do biorreator necessário e, consequentemente, o custo de capital do equipamento de fermentação.

[0087] Em determinadas modalidades, a fermentação é realizada na ausência de luz ou na presença de uma quantidade de luz insuficiente para atender aos requisitos energéticos de micro-organismos fotossintéticos ou fototróficos.

[0088] Os métodos da invenção podem adicionalmente envolver separação ou purificação de PHB. O PHB pode ser separado ou purificado com o uso de qualquer método conhecido na técnica. Por exemplo, as células podem ser coletadas por meio de precipitação (Chen, Appl Microbiol Biotechnol, 57: 50 a 55, 2001) ou separação contínua (Elbahloul, Appl Environ Microbiol, 75: 643 a 651, 2009; Heinrich, AMB Express, 2:59, 2012)

33 / 43 seguida por liofilização. Subsequente à secagem por congelamento, o polímero pode ser removido a partir de células com materiais, tal como acetato de etila (Chen, Appl Microbiol Biotechnol, 57: 50 a 55, 2001), acetona (Elbahloul, Appl Environ Microbiol, 75: 643 a 651, 2009) ou hipoclorito de sódio (Heinrich, AMB Express, 2: 59, 2012). O polímero pode, então, ser removido da massa celular residual/solubilizada. Um grande número de processos alternativos para a purificação de poli-hidroxialcanoatos foram publicados e desenvolvidos, mas ainda não foram estabelecidos para purificação em maior escala (Kunasundari, Express Polym Lett, 5, 620 a 634, 2011).

EXEMPLOS

[0089] Os exemplos a seguir ilustram em mais detalhes a invenção, mas, certamente, não devem ser interpretados de modo a limitar seu escopo de forma alguma. EXEMPLO 1

[0090] Esse exemplo demonstra a construção de um micro-organismo de Wood-Ljungdahl com capacidade para realizar a síntese de PHB.

[0091] Genes da via de PHB (phaC, phaA, and phaB) de C. necator (SEQ ID NOs: 1, 4 e 7) foram introduzidos em C. autoethanogenum, um micro-organismo de Wood-Ljungdahl que não produz nativamente PHB. Verifica-se, essas espécies apresentam diferenças significativas quanto ao conteúdo cromossômico de GC. Especificamente, C. necator tem 66% de teor de GC (Pohlmann, Nat Biotechnol, 24: 1.257 a 1.262, 2006) e C. autoethanogenum tem apenas 31% de teor de GC (Brown, Biotechnol Biofuels, 7: 40, 2014). Antecipando problemas de expressão gênica com base no uso de códons, as sequências genéticas de PHB do C. necator foram adaptadas a códons para se ajustarem melhor a um perfil de expressão mais alto para proteínas em C. autoethanogenum. Os genes, com sequências inovadoras (SEQ ID NOs: 3, 6 e 9) que codificam proteínas idênticas às de C.

34 / 43 necator, foram sintetizados e montados no vetor de expressão pMTL83157 (SEQ ID NO: 10). Esse plasmídeo é semelhante à série pMTL8000 (Heap, J Microbiol Methods, 78: 79 a 85, 2009) com um promotor de Wood-Ljungdahl nativo retirado de C. autoethanogenum para conduzir a transcrição de genes. Os genes foram colocados a jusante do promotor na mesma ordem em que aparecem no genoma de C. necator: phaC, phaA e phaB. Também foi utilizado um marcador de seleção de antibióticos, catP. O plasmídeo resultante foi nomeado pPHB_01 (SEQ ID NO: 11) (Figura 2).

[0092] O pPHB_01 foi inserido em C. autoethanogenum por conjugação bacteriana com o uso de E. coli HB101, conforme descrito em outra parte (Mock, J Bacteriol, 197: 2.965 a 2.980, 2015). Separadamente, um plasmídeo pMTL83157 “vazio” foi inserido em C. autoethanogenum para servir como controle negativo. Essas cepas foram, então, utilizadas para testar a produção de PHB a partir de substratos gasosos.

[0093] Em uma modalidade preferencial, o micro-organismo compreende enzima que converte acetil-CoA em acetoacetil-CoA compreende uma enzima que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com relação à sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 2, a enzima que converte acetoacetil-CoA em 3-hidroxibutiril-CoA compreende uma enzima que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com relação à sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 5, e/ou a enzima que converte 3-hidroxibutiril-CoA em poli-hidroxibutirato compreende uma enzima que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com relação à sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 8. EXEMPLO 2

[0094] Esse exemplo demonstra a produção de PHB a partir de substratos gasosos em frascos Schott.

[0095] As cepas construídas no Exemplo 1 foram cultivadas em pequenos lotes para testar a produção de PHB. Todo o trabalho foi realizado

35 / 43 sob condições anaeróbicas estritas (Hungate, Methods in microbiology, páginas 117 a 132, Academic Press, New York, NY, 1969). Frascos Schott com classificação de pressão que compreendem meios de PETC modificados (Köpke, Appl Environ Microbiol, 77: 5.467 a 5.475, 2011) com tianfenicol para retenção de plasmídio e ácido 2-(N-morfolino) etanossulfônico para tamponamento foram inoculados com as cepas, e gás que compreende CO, CO2, H2 e N2 (a 50, 18, 3 e 29%, respectivamente), visto que a única fonte de carbono foi adicionada aos frascos a 0,144 MPa (21 psi). As culturas foram cultivadas a 37 °C com agitação giratória.

[0096] O crescimento celular foi monitorado periodicamente até que as culturas entrassem na fase estacionária. Após a conclusão do crescimento, as células não eram mais manipuladas sob condições anaeróbicas. As células foram coletadas por centrifugação, seus sobrenadantes descartados, congelados a -20 °C e secos por liofilização.

[0097] O rendimento de PHB foi estimado por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) em uma maneira semelhante à descrita em outros lugares (Karr, Appl Environ Microbiol, 46, 1.339 a 1.344, 1983). Em suma, as células secas foram tratadas com ácido sulfúrico concentrado e aquecidas para converter o PHB em ácido crotônico. As amostras foram resfriadas, diluídas, filtradas e analisadas por HPLC com um detector de UV-Vis para quantificar o ácido crotônico. Os resultados de produção inicial de PHB estão resumidos na Figura 3, que mostra a produção bem-sucedida de aproximadamente 1,15% em peso de PHB em um micro-organismo de Wood-Ljungdahl.

[0098] No entanto, dados os baixos rendimentos comparados aos produtores nativos, tais como Cupriavidus e Pseudomonas, que são capazes de sintetizar polímeros como o PHB, de modo a representarem mais de 90% de seu peso, parece que a síntese de PHB a partir de gás nos micro- organismos de Wood-Ljungdahl não é tão simples quanto em produtores nativos que crescem em substratos não gasosos. Sem desejar estar vinculado a

36 / 43 qualquer teoria específica, os inventores pressupõem que a produção de PHB em micro-organismos de Wood-Ljungdahl pode exigir a adaptação ao códon para superar as diferenças quanto a preferências de pH, requisitos de oxigênio, utilizações de substrato, etc., entre os micro-organismos de Wood- Ljungdahl e produtores nativos de PHB.

[0099] Após alcançar a “síntese” de PHB em C. autoethanogenum a partir de substratos gasosos, o trabalho descrito acima foi repetido com condições de crescimento alteradas, em um esforço para explorar condições que podem “favorecer”/aprimorar o rendimento de PHB. Em particular, os experimentos foram realizados para repetir as condições descritas acima (condição 1, Figura 4A), para alterar a composição de gás para 50/30/10/10 de CO/CO2/H2/N2 (condição 2, Figura 4B), para estender a incubação da cultura em fase estacionária (condição 3, Figura 4C), e atualizar periodicamente o gás nos frascos (condição 4, Figura 4D). Conforme mostrado nas Figuras 4A a 4D, o crescimento foi similar para a cepa projetada e a cepa de controle sob todas as condições testadas.

[00100] As células foram colhidas e analisadas quanto à produção de PHB, conforme descrito acima. Os resultados são representados na Figura 5, que mostra a produção de aproximadamente 1,65% em peso de PHB sob a condição 1, aproximadamente 1,50% em peso de PHB sob a condição 2, aproximadamente 1,50% em peso de PHB sob a condição 3 e aproximadamente 0,85% em peso de PHB sob a condição 4. EXEMPLO 3

[00101] Esse exemplo demonstra a produção de PHB a partir de substratos gasosos em uma fermentação contínua.

[00102] A cepa construída no Exemplo 1 foi testada sob fermentação contínua com o uso de gás como a principal fonte de carbono, sob condições similares às descritas em Valgepea, Cell Syst, 4: 505 a 515, 2017. Similar aos experimentos realizados em frascos Schott, as culturas contínuas foram

37 / 43 cultivadas e manipuladas anaerobicamente. Ao contrário de frascos Schott, as culturas foram cultivadas de maneira contínua por aproximadamente 20 dias com alimentação constante de meios. Duas composições de gases diferentes foram usadas para crescimento e produção de PHB: 50/20/20/10 de CO/CO2/H2/Ar e 50/20/2/28 de CO/CO2/H2/N2. A captação de gás foi monitorada com o uso de espectrometria em massa (MS) e as amostras foram coletadas periodicamente para quantificar os metabólitos líquidos por HPLC.

[00103] O PHB não foi quantificado até a conclusão da fermentação contínua. Semelhante aos experimentos com frascos Schott, as células foram coletadas por centrifugação, congeladas e secas por liofilização. As células secas foram subsequentemente analisadas quanto ao PHB por tratamento com ácido sulfúrico e calor para converter o PHB em ácido crotônico. A quantificação de PHB foi, então, executada por HPLC. Os resultados de produção de PHB na fermentação contínua são mostrados na Figura 6. Em particular, os micro-organismos cultivados em gás de hidrogênio a 20% produziram aproximadamente 0,45% em peso de PHB e micro-organismos cultivados em gás de hidrogênio a 2%, produziram aproximadamente 0,25% em peso de PHB. EXEMPLO 4

[00104] Esse exemplo demonstra a otimização de fermentador para aumentar a produção de PHB.

[00105] Várias condições foram testadas em fermentações contínuas para aumentar o teor de PHB em células. Conjuntos de acetil-CoA e NADPH aumentam a concentrações de biomassa mais baixas (Valgepea, Cell Syst., 4: 505 a 515, 2017). Portanto, testou-se se um nível mais baixo de biomassa no estado estacionário resultaria em um aumento de teor de PHB por meio de níveis aumentados dos conjuntos de acetil-CoA e NADPH. A redução da taxa de absorção de CO e, por extensão, da concentração de biomassa no fermentador, demonstrou aumentar o fluxo de recursos celulares com relação

38 / 43 ao PHB (Figura 7).

[00106] Outro fator encontrado para aumentar o PHB foi o pH. A um pH mais elevado, menos ácido acético difundiria e desacoplaria a força motriz de prótons (PMF) (Valgepea, Cell Syst., 4: 505 a 515, 2017) . Portanto, testou-se se o aumento do pH de 5 para 5,5 ou 6 consumiria menos energia para manter a PMF. A energia extra disponível fornece ATP adicional para apoiar a produção de PHB, reduzindo a produção de acetato necessária para a produção de ATP. Alterar o pH de 5,0 para 5,5 ou 6,0 resultou em aumento da produção de PHB (aproximadamente 12,5 vezes em pH 5,5). Entretanto, é difícil manter um valor de pH 6,0, uma vez que C. autoethanogenum cresce de modo ideal em um pH mais ácido. EXEMPLO 5

[00107] Esse exemplo demonstra alterações no nível de transcrição e metaboloma ao produzir PHB, em comparação com a cepa de controle (plasmídeo vazio).

[00108] A análise de dados de transcriptoma de sequenciamento de RNA foi baseada em um script R publicado anteriormente (Valgepea, Cell Syst., 4: 505 a 515, 2017) com as seguintes modificações: uso da sequência de referência de NCBI de C. autoethanogenum CP006763.1 e seu genoma anotado descrito em Brown, Biotechnol. Biofuels, 7: 40, 2014; adição da sequência de nucleotídeos para os três genes de PHB (SEQ ID Nos: 3, 6, 9.)

[00109] Um pacote de metabolômica disponível em R (Livera and Bowne, R package, 2014) foi usado para realizar a análise estatística dos dados de metabolômica intracelulares. Esse script normaliza e integra os dados metabolômicos em um ajuste de modelo linear (De Livera, Anal. Chem., 84: 10.768 a 10.776, 2012). As concentrações intracelulares de metabólitos foram normalizadas por biomassa (µmol/gDCW) antes da importação dos dados para o script. Um ajuste de modelo linear que usa estatísticas comuns (isto é, não Bayesianas) foi usado para a análise estatística

39 / 43 dos dados de metaboloma (De Livera, Anal. Chem., 84: 10.768 a 10.776, 2012; De Livera, Metabolomics Tools for Natual Product Discovery, 2013).

[00110] Embora a arginina não tenha sido fornecida, foi observada uma regulação positiva para a via de arginina desiminase, uma via alternativa encontrada para fornecer ATP em (Valgepea, Metab. Eng. 41: 202 a 211, 2017) (valor q <0,01): arginina desiminase (CAETHG_3021, aproximadamente 7 vezes); ornitina carbamoiltransferase (CAETHG_3022, aproximadamente 6 vezes); carbamato cinase (CAETHG_3025, aproximadamente 3,3 vezes). Adicionalmente, três genes que codificam o complexo de Rnf, que fazem parte do complexo de conservação de energia em acetógenos (Schuchmann and Müller, Nat. Rev. Microbiol. 12: 809 a 821, 2014), mostraram um aumento de aproximadamente 2 vezes na cepa de PHB: (CAETHG_3231, valor q = 0,02; CAETHG_3228, valor q = 0,04 e CAETHG_3230, valor q = 0,03). Essas observações destacam mudanças no metabolismo energético devido à produção heteróloga. Além disso, a expressão de dois genes da codificação da via de Wood-Ljungdahl (WLP) para a CO desidrogenase/acetil-CoA sintase (CAETHG_1610, aproximadamente 1,4 vez; CAETHG_1611, aproximadamente 1,2 vez) e um gene que codifica uma (FeFe)-hidrogenase (CAETHG_1691, aproximadamente 2,5 vezes) foram suprarregulados na cepa de PHB. Essas alterações podem refletir o aumento necessário para a produção de acetil-CoA e NADPH para a produção de PHB (Figura 1).

[00111] No nível de metaboloma, a cepa de PHB apresentou uma razão de NADH/NAD+ intracelular mais alta em comparação com EP. Isso sugere possíveis alterações no estado redox após a expressão de PHB. Produção de acetato, o subproduto nativo principal de metabolismo de C. autoethanogenum (Abrini, Arch. Microbiol., 161: 345 a 351, 1994; Marcellin, Green Chem., 18: 3.020 a 3.028, 2016), diminuiu em comparação com a cepa de EP em gás de síntese (valor p < 0,01; o teste t de variância igual bicaudal).

40 / 43 Nenhuma mudança foi observada no gás de usina siderúrgica. EXEMPLO 6

[00112] Esse exemplo mostra resultados de reconstruções de modelo metabólico em escala de genoma (GEM). O modelo metabólico em escala de genoma GEM iCLAU786 (Valgepea, Cell Syst., 4: 505 a 515, 2017) foi usado com a adição da via de PHB. Foram realizadas simulações para a cepa de PHB cultivada em gás de síntese em todas as condições listadas acima.

[00113] Simulações de fluxo confirmaram que menos CO2 foi dissipado sob as condições de maior PHB (isto é, “baixo teor de biomassa” e “pH 5,5”). Adicionalmente, conforme observado anteriormente (Valgepea, Cell Syst., 4: 505 a 515, 2017), essas simulações também mostraram que CO2 foi diretamente reduzido para formato por H2 através da atividade de formato- H2 liase do complexo de enzima de hidrogenase-formato desidrogenase bifurcada por elétrons (HytA-E/FdhA) (Wang, J. Bacteriol., 195: 4.373 a

4.386, 2013). Isso oferece uma vantagem sobre a redução de CO2 pela formato desidrogenase que consome redox, pois nenhum redox é consumido durante a redução de CO2 no WLP utilizando o primeiro complexo enzimático. Também observou-se que nos experimentos com “baixo teor de biomassa” e “pH 5,5”, o equilíbrio da quantidade total de ferredoxina reduzida foi alcançado aumentando ou diminuindo o fluxo para algumas reações-chave, como a AOR (Aldeído ferredoxina oxidorredutase), complexo de Nfn ou reação bifurcante de metileno THF redutase, comparada ao controle (PHB20).

[00114] De modo surpreendente, a condição de “controle” (PHB20) teve, in silico, menor custo de manutenção de ATP (mmol/gDCW/h) e custos de manutenção de ATP de produção total de ATP (% de mATP) em comparação com a condição "PHBpH5.5".

[00115] Simulações para determinar se ATP, NADH, NADPH ou ferredoxina reduzida (Fdvermelha) estavam limitando a produção de PHB

41 / 43 também foram executadas. As simulações mostraram que, quando o ATP foi fornecido, a produção de PHB (mmol/gDCW/h) atingiu seu valor máximo entre os candidatos “limitantes” em todas as condições testadas (isto é, “PHB20,” “PHBBaixoTeordeBiomassa” e “PHBpH5.5.”). Essa observação é consistente com o entendimento de metabolismo de acetógeno que se limita ao ATP (Schuchmann and Müller, Nat. Rev. Microbiol. 12: 809 a 821, 2014). O modelo também demonstrou que seguido pela limitação de ATP, produção de PHB é limitada por Fdvermelha, NADPH e, então, disponibilidade de NADH (Figura 8).

[00116] Esse resultado confirma a importância de ATP e Fdvermelha como carreadores de alta energia em acetógenos. Como ATP suporta principalmente o anabolismo e manutenção celular, Fdvermelha é essencial para o complexo de conservação de energia de Rnf (Biegel, Cell. Mol. Life Sci. 68: 613 a 634, 2011) e somente Fdvermelha é conhecida por fornecer elétrons para a redução de CO2 para CO na ramificação de carbonila dp WLP (Schuchmann and Müller, Nat. Rev. Microbiol. 12: 809 a 821, 2014).

[00117] Todas as referências, incluindo publicações, pedidos de patentes e patentes, citadas no presente documento, são aqui incorporadas a título de referência, na mesma medida em que se cada referência fosse individual e especificamente indicada para ser incorporada a título de referência e fosse apresentada no presente documento em sua totalidade. A referência a qualquer técnica anterior neste relatório descritivo não é, e não deve ser tomada como, um reconhecimento de que essa técnica anterior faz parte do conhecimento geral comum no campo de atuação em qualquer país.

[00118] O uso dos termos “um” e “uma” e “o/a” e referentes similares no contexto de descrição da invenção (especialmente no contexto das reivindicações a seguir) devem ser interpretados de modo a cobrir o singular e o plural, a menos que seja indicado de outra forma no presente documento ou o contexto dite claramente o contrário. Os termos “que compreende (ou que

42 / 43 compreendem)”, “que tem (ou que têm)”, “que inclui (ou que incluem)” e “que contém (ou que contêm)” devem ser interpretados como termos em aberto (isto é, que significa "incluindo, mas sem limitação"), a menos que indicado de outra forma. O termo “que consiste (ou consistem) essencialmente em” limita o escopo de uma composição, processo ou método aos materiais ou etapas especificados, ou àqueles que não afetam de modo relevante as características básicas e inovadoras da composição, processo ou método. O uso da alternativa (por exemplo, “ou”) deve ser entendido como uma, ambas ou qualquer combinação das alternativas. Conforme usado no presente documento, o termo “cerca de” significa ± 20% da faixa, valor ou estrutura indicados, a menos que indicado de outra forma.

[00119] A recitação de valores no presente documento é meramente destinada a servir como um método abreviado de referência individual a cada valor separado dentro da faixa, a menos que indicado de outra forma no presente documento, e cada valor separado é incorporado ao relatório descritivo como se fosse recitado no presente documento individualmente. Por exemplo, qualquer faixa de concentração, faixa percentual, faixa de proporção, faixa de números inteiros, faixa de tamanho ou faixa de espessura deve ser entendida como incluindo o valor de qualquer número inteiro dentro da faixa recitada e, quando apropriado, suas frações (como um décimo e centésimo de um número inteiro), salvo indicação em contrário.

[00120] Todos os métodos descritos no presente documento podem ser realizados em qualquer ordem adequada, a menos que indicado de outra forma no presente documento ou o contexto dite claramente o contrário. O uso de todos e quaisquer exemplos ou linguagem exemplificativa (por exemplo, “tal como”) fornecidos no presente documento, visa apenas esclarecer melhor a invenção e não representa uma limitação ao escopo da invenção, a menos que seja reivindicado de outra forma. Nenhuma linguagem no relatório descritivo deve ser interpretada como indicando qualquer

43 / 43 elemento não reivindicado como essencial para a prática da invenção.

[00121] As modalidades preferenciais dessa invenção são descritas no presente documento. Variações dessas modalidades preferenciais podem se tornar evidentes para os versados na técnica após a leitura da descrição anterior. Os inventores esperam que técnicos versados na técnica empreguem tais variações, conforme apropriado, e os inventores pretendem que a invenção seja praticada de outra forma que não a especificamente descrita no presente documento. Consequentemente, esta invenção inclui todas as modificações e equivalentes do objeto recitado nas reivindicações anexas, conforme permitido pela lei aplicável. Além disso, qualquer combinação dos elementos acima descritos em todas as suas variações possíveis é abrangida pela invenção, a menos que indicado de outra forma no presente documento ou claramente contradito pelo contexto.

Claims (20)

REIVINDICAÇÕES

1. Micro-organismo de Wood-Ljungdahl de ocorrência não natural caracterizado pelo fato de que compreende: a. uma enzima que converte acetil-CoA em acetoacetil-CoA, b. uma enzima que converte acetoacetil-CoA em 3- hidroxibutiril-CoA, e c. uma enzima que converte 3-hidroxibutiril-CoA em poli- hidroxibutirato.

2. Micro-organismo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a enzima que converte acetil-CoA em acetoacetil-CoA é uma acetil-CoA C-acetiltransferase (EC 2.3.1.9).

3. Micro-organismo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a acetil-CoA C-acetiltransferase é derivada de Acinetobacter baumannii, Aeromonas hydrophilia, Alcaligenes latus, Arthrospira platensis, Bacillus subtilis, Burkholderia cepacia, Clostridium acetobutylicum, Cupriavidus necator, Escherichia coli, Haloferax mediterranei, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas mandelii, Pseudomonas oleovorans, Pseudomonas putida ou Streptomyces coelicolor.

4. Micro-organismo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a enzima que converte acetoacetil-CoA em 3- hidroxibutiril-CoA é uma acetoacetil-CoA redutase (EC 1.1.1.36) ou uma 3- hidroxibutiril-CoA desidrogenase (EC 1.1.1.157).

5. Micro-organismo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a acetoacetil-CoA redutase é derivada de Acinetobacter baumannii, Aeromonas hydrophilia, Alcaligenes latus, Arthrospira platensis, Bacillus subtilis, Burkholderia cepacia, Cupriavidus necator, Haloferax mediterranei, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas mandelii, Pseudomonas oleovorans, Pseudomonas putida ou Streptomyces coelicolor.

6. Micro-organismo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a 3-hidroxibutiril-CoA desidrogenase é derivada de Clostridium beijerinckii, Clostridium acetobutylicum ou Clostridium kluyveri.

7. Micro-organismo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a enzima que converte 3-hidroxibutiril-CoA em poli-hidroxibutirato é uma poli-hidroxialcanoato sintase (EC 2.3.1.-).

8. Micro-organismo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a poli-hidroxialcanoato sintase é derivada de Acinetobacter baumannii, Aeromonas caviae, Aeromonas hydrophilia, Alcaligenes latus, Arthrospira platensis, Bacillus subtilis, Burkholderia cepacia, Cupriavidus necator, Haloferax mediterranei, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas mandelii, Pseudomonas oleovorans, Pseudomonas putida, Pseudomonas sp. 61-3, Rhodospirillum rubrum ou Streptomyces coelicolor.

9. Micro-organismo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo é um membro de um gênero selecionado a partir do grupo que consiste em Acetobacterium, Alkalibaculum, Blautia, Butyribacterium, Clostridium, Eubacterium, Moorella, Oxobacter, Sporomusa e Thermoanaerobacter.

10. Micro-organismo de acordo com a reivindicação 1, em que o micro-organismo é caracterizado pelo fato de que é derivado de um micro- organismo parental selecionado a partir do grupo que consiste em Acetobacterium woodii, Alkalibaculum bacchii, Blautia producta, Butyribacterium methylotrophicum, Clostridium aceticum, Clostridium autoethanogenum, Clostridium carboxidivorans, Clostridium coskatii, Clostridium drakei, Clostridium formicoaceticum, Clostridium ljungdahlii, Clostridium magnum, Clostridium ragsdalei, Clostridium scatologenes,

Eubacterium limosum, Moorella thermautotrophica, Moorella thermoacetica, Oxobacter pfennigii, Sporomusa ovata, Sporomusa silvacetica, Sporomusa sphaeroides e Thermoanaerobacter kiuvi.

11. Micro-organismo de acordo com a reivindicação 10, em que o micro-organismo é caracterizado pelo fato de que é derivado de uma bactéria parental selecionada a partir do grupo que consiste em Clostridium autoethanogenum, Clostridium coskatii, Clostridium ljungdahlii e Clostridium ragsdalei.

12. Micro-organismo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo consome substratos gasosos que compreendem um ou mais dentre CO, CO2 e H2.

13. Micro-organismo de acordo com a reivindicação 1, em que o micro-organismo é caracterizado pelo fato de que é anaeróbio.

14. Micro-organismo de acordo com a reivindicação 1, em que o micro-organismo é caracterizado pelo fato de que não é capaz de degradar poli-hidroxibutirato.

15. Micro-organismo de acordo com a reivindicação 1, em que o micro-organismo é caracterizado pelo fato de que não é fototrófico, fotossintético ou metanotrófico.

16. Método para produzir poli-hidroxibutirato caracterizado pelo fato de que compreende a cultura do micro-organismo de acordo com a reivindicação 1, na presença de um substrato gasoso, em que o micro- organismo produz poli-hidroxibutirato.

17. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o substrato gasoso compreende um ou mais dentre CO, CO2 e H2.

18. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a cultura é realizada sob condições anaeróbicas.

19. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a cultura é realizada na ausência de substratos de carboidratos.

20. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a cultura é efetuada na ausência de luz.