CN110317755B - 一株耐低温解纤维素孟氏假单胞菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一株耐低温解纤维素孟氏假单胞菌及其应用，本发明的孟氏假单胞菌(Pseudomonas mandelii)命名为NWX‑1，保藏编号为CCTCC M 2019150。本发明提供的孟氏假单胞菌菌株NWX‑1在15℃下具有较强的产纤维素酶能力，所述的纤维素酶分别为内切β‑葡聚糖酶、外切β‑葡聚糖酶和β‑葡萄糖苷酶，具有调节土壤功能酶的活力，因而具有良好的工业化应用前景。

Description

一株耐低温解纤维素孟氏假单胞菌及其应用

技术领域

本发明涉及菌株分离及应用技术领域，具体涉及一种耐低温解纤维素孟氏假单胞菌及其应用。

背景技术

纤维素是由葡萄糖以β-1,4-糖苷键连接而组成的大分子多糖，为植物细胞壁的重要组成成分，约占植物干重的35％-50％，是自然界中含量最为丰富的碳水化合物。同时，纤维素也是一类十分重要的可再生资源，可作为能源、食品和化工产业的原料，如生产乙醇、乳酸和单细胞蛋白等。然而，由于纤维素含有大量的高能氢键，不易被降解，利用率低，绝大多数的纤维素资源被废弃或直接焚烧，造成了极严重的资源浪费和环境污染问题。因此，纤维素资源的有效开发与利用已经成为当前能源与环境研究的热点之一。

利用自然界中的微生物对纤维素进行生物转化，具有降解效率高、能耗低、安全、无污染等特点，可有效克服物理和化学处理法的弊端，越来越受到人们的重视。然而，由于低温微生物菌株资源的限制，纤维素的微生物转化研究主要集中在常温或高温条件下，对于低温菌株及其产酶能力的研究则相对较少。高效降解纤维素低温菌株的开发与利用，可进一步地节省产业能耗，从而提高纤维素资源的利用效率。

随着全球温室气体浓度升高而引起的全球变化，地球化学循环的研究日益得到重视，尤其是C、N、P这3种最为重要的生命构成元素。而土壤微生物是陆地生态系统的重要组分，在陆地生态系统C、N、P循环中的扮演了核心角色。因此，耐低温解纤维素菌株在高山、深海、极地等低温自然环境的生物地球化学循环中发挥着极为关键的作用，其群落结构和功能特征的变化影响着生物地球化学循环过程。因此，低温解纤维素菌株的研究具有重要的理论意义和应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种耐低温解纤维素孟氏假单胞菌及其应用。

本发明从西藏那曲地区海拔4500m金露梅根际土样中分离得到一株孟氏假单胞菌，命名为NWX-1。

具体分离方法为：采集西藏那曲地区海拔4500m金露梅根际土样；将采集的土样放入装有无菌水的离心管中充分震荡，制成土壤悬浮液；将所述土壤悬浮液梯度稀释，制成10^-2至10^-7浓度的土壤悬浮液；将所述稀释土壤悬浮液加入至NA培养基平板上进行涂布处理，并放到4℃培养箱中培养，得到菌落；挑选形态各异的单菌落进行划线纯化，培养24h，低温保藏菌种；将所述菌种点接至刚果红羧甲基纤维素钠平板上，15℃培养，选择水解圈最大的菌株，经鉴定为孟氏假单胞菌，并命名NWX-1。

NWX-1的菌落呈浅黄色、圆形、边缘不整齐、表面湿润光滑。

本发明的孟氏假单胞菌菌株NWX-1已于2019年3月15日保藏于中国典型培养物保藏中心(保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学；邮政编码： 430072)，分类命名为：Pseudomonas mandelii，保藏编号为CCTCC NO: M 2019150。

本发明的孟氏假单胞菌NWX-1，其能够产纤维素酶，所述纤维素酶包括内切β-葡聚糖酶、外切β-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶。

本发明的孟氏假单胞菌NWX-1其能够在低温下生长，所述低温为 4-15℃。在该温度条件下，产纤维素酶的能力最强，内切β-葡聚糖酶、外切β-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶具有较高的酶活力，分别达到19.88U/mL、 24.69U/mL和17.61U/mL。

含有本发明孟氏假单胞菌NWX-1或其发酵液的菌剂属于本发明的保护范围。

含有本发明孟氏假单胞菌NWX-1或其发酵液的土壤功能酶活力调节剂属于本发明的保护范围。

本发明提供了孟氏假单胞菌NWX-1或其发酵液或含有其的菌剂在低温环境下产纤维素酶、解纤维素中的应用。

所述纤维素酶包括内切β-葡聚糖酶、外切β-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶。

本发明提供了孟氏假单胞菌NWX-1或其发酵液或含有其的菌剂在低温环境下调节土壤功能酶活力中的应用。

进一步地，所述土壤功能酶包括β-1,4-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、蔗糖酶、脱氢酶、脲酶、N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶、磷酸酶。

优选地，本发明所述的应用均优选在低温条件下进行，所述低温为 4-15℃。

本发明还提供了上述耐低温解纤维素孟氏假单胞菌NWX-1的菌液制备方法，包括：将孟氏假单胞菌NWX-1接种在液体培养基中，在15℃下摇床震荡3天，得到孟氏假单胞菌NWX-1的发酵液。

优选地，所述摇床震荡的转速为160r/min。

优选地，所述液体培养基为LB液体培养基，按照浓度包含以下组分：10g/L的胰蛋白胨，5g/L的酵母提取物，10g/L的氯化钠。

优选地，所述液体培养基的pH为7.2-7.4，且在121℃高压蒸汽灭菌20min。

本发明提供的耐低温解纤维素孟氏假单胞菌(Pseudomonas mandelii) NWX-1是在高海拔地区分离得到的，在15℃下具有较强的产纤维素酶能力，所产的内切β-葡聚糖酶、外切β-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶活性高，为处理纤维素提供了一种高效降解的手段，具有良好的工业化应用前景。同时，该菌株来源于西藏那曲地区海拔4500m左右的金露梅根际土壤，在低温环境下能够有效地调节土壤功能酶活力，具有较好的环境效益和经济效益。

附图说明

图1是本发明实施例提供的孟氏假单胞菌NWX-1的制备流程图。

图2是本发明实施例提供的孟氏假单胞菌NWX-1在15℃下培养3天的菌落图。

图3为本发明实施例提供的孟氏假单胞菌NWX-1在4℃下培养5天的菌落图。

图4是本发明实施例提供的孟氏假单胞菌NWX-1的革兰氏染色图。

图5是本发明实施例提供的孟氏假单胞菌NWX-1的16S序列构建的系统发育树图。

图6是本发明实施例提供的孟氏假单胞菌NWX-1的刚果红羧甲基纤维素钠平板水解效果示意图(15℃下培养)。

图7是本发明实施例提供的孟氏假单胞菌NWX-1的产纤维素酶测定结果图。

图8是本发明实施例提供的孟氏假单胞菌NWX-1的调节土壤功能酶的测定结果图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例中所用的培养基：LB培养基为营养琼脂培养基，其组成按照浓度包括10g/L的胰蛋白胨，5g/L的酵母提取物，10g/L的氯化钠，pH 值为7.2-7.4。

刚果红羧甲基纤维素钠培养基组成按照浓度包括15g/L的羧甲基纤维素钠，5g/L的氯化钠，1g/L的KH₂PO₄，0.2g/L的MgSO₄，10g/L 的蛋白胨，5g/L的酵母粉，pH值为7.2-7.4。培养基在121℃高压蒸汽灭菌20min。

实施例1孟氏假单胞菌NWX-1的分离与鉴定

请参考图1，图1示出了本发明实施例提供的耐低温解纤维素孟氏假单胞菌NWX-1的制备流程图。本发明实施例提供的耐低温解纤维素孟氏假单胞菌NWX-1的制备步骤为：

采集西藏那曲地区海拔4500m金露梅根际土样；将采集的土样放入装有无菌水的离心管中充分震荡，制成土壤悬浮液；将所述土壤悬浮液梯度稀释，制成10^-2至10^-7浓度的土壤悬浮液；将所述稀释土壤悬浮液加入至LB培养基平板上进行涂布处理，并放到4℃培养箱中培养，得到菌落；挑选形态各异的单菌落进行划线纯化，培养24h，低温保藏菌种；将所述菌种点接至刚果红羧甲基纤维素钠平板上，15℃培养，选择水解圈最大的菌株命名为NWX-1。

1、形态学鉴定

将本发明实施例提供的菌株NWX-1划线到NA固体培养基上，然后将平板倒转，在温度为15℃的条件下培养24h，观察并记录平板上菌落的生长情况。本发明实施例提供的菌株NWX-1的菌落形态图请参考图2。从图2能够看出菌株的菌落呈浅黄色、圆形、边缘不整齐、表面湿润光滑。4℃下培养5天的菌落图见图3。本实施例还发现在温度为4-15℃的低温条件下，菌株NWX-1生长情况良好。说明本发明的菌株NWX-1 具有耐低温的能力。

用试剂盒对发明实施例提供的菌株进行革兰氏染色，并在油镜下观察菌株，该菌株的革兰氏染色图见图4。从图4能够看出菌株呈红色，为革兰氏阴性菌。

2、生理生化鉴定

参照《常见细菌系统鉴定手册》中的生理生化鉴定指标，对本发明实施例提供的菌株NWX-1进行生理生化鉴定。

本发明实施例提供的菌株的生理生化鉴定指标包括过氧化氢酶能力、 VP实验、甲基红MR实验、氧化酶能力、淀粉水解能力、明胶液化能力、产硫化氢能力、解磷能力、硝酸盐还原、丙二酸盐利用能力、产氨能力。生理生化鉴定结果如表1。

表1本菌株的生理生化鉴定结果

表性特征	反应特征	表性特征	反应特征
				过氧化氢酶	+	产硫化氢	–
VP实验	–	解磷	+
				MR实验	–	硝酸盐还原	+
氧化酶	+	丙二酸盐利用	+
				淀粉水解	–	产氨测定	+
明胶液化	–

表中，+表示本菌株有反应或可以利用，–表示本菌株没有反应或不可以利用。

3、16S rDNA序列分析

本发明实施例采用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取本菌株中的DNA。25μL的PCR反应体系包括2.5μL的10×PCR buffer，0.5μL 的DNA模板，1μL的dNTPs，0.5μL的，0.5μL的下游引物，0.2μL 的Taq DNA聚合酶，19.8μL的ddH₂O。

反应条件为：在温度为94℃预变性4min；94℃变性45s；55℃退火45s；72℃延伸1min，30个循环，4℃保存。

PCR产物由上海生工生物工程股份有限公司测序，测序结果如SEQ ID NO.1所示。将所得序列在GenBank中进行BLAST相似性比对，得到相似性较高的序列。运用MEGA 7.0软件构建菌株的系统发育树，本菌株的16S rDNA序列与孟氏假单胞菌(Pseudomonasmandelii)的同源性达到99％，本菌株的发育树图请见图5。

综合上述形态学观察、生理生化鉴定及16S rDNA序列分析结果，能够确定本菌株NWX-1为假单胞菌属孟氏假单胞菌(Pseudomonas mandelii)，其被命名为孟氏假单胞菌NWX-1。该菌株已于2019年3月 15日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学；邮政编码：430072)，分类命名：Pseudomonas mandelii，保藏编号为CCTCC NO:M 2019150。

实施例2孟氏假单胞菌菌株NWX-1的低温下降解纤维素能力测定

本发明实施例提供了耐低温解纤维素孟氏假单胞菌菌株NWX-1在刚果红羧甲基纤维素钠平板上水解的效果示意图，见图6。从图6中能够看出15℃下，接种有孟氏假单胞菌菌株NWX-1的刚果红羧甲基纤维素钠平板3天后出现了明显的水解圈，且水解圈的直径在3.7cm以上，由水解圈的出现能够说明本发明实施例提供的孟氏假单胞菌菌株 NWX-1在低温条件下具有较强的降解纤维素的潜力。

实施例3孟氏假单胞菌菌株NWX-1的低温下产纤维素酶能力测定

本发明实施例对孟氏假单胞菌菌株NWX-1进行了产纤维素酶能力测定，该测定包括以下内容：

1、粗酶液的制备

将本发明实施例1提供的菌株NWX-1接种至NA液体培养基中，于15℃，160r/min下培养24h，然后以1％的接种量接种于产酶培养基中，15℃，160r/min下培养7d。期间，每隔24h测定酶活力，取发酵液在6000r/min，4℃，离心10min，每个时间3次重复，上清液即为粗酶液。

所述产酶培养基的组成为:CMC-Na 15.0g/L，酵母粉5.0g/L， KH₂PO₄ 2.0g/L，pH7.0，121℃灭菌20min。

2、葡萄糖标准曲线的制作

取0-1.2mL(每管差0.2mL)的1mg/mL的葡萄糖标准液于7支刻度试管中，加蒸馏水补足至2mL，再加入DNS 1.5mL，混匀，沸水浴5 min，取出后待冷却至室温，用蒸馏水定容至20mL，颠倒混匀，用分光光度计测量OD540nm。以光密度值为纵坐标，葡萄糖含量(mg)为横坐标，作葡萄糖标准曲线。测样品的OD值，通过标准曲线计算葡萄糖的生成量。

3、酶活的测定

(1)内切型-β-葡聚糖酶活力的测定

以1％羧甲基纤维素钠溶液作为底物，测试组取1％羧甲基纤维素钠溶液1mL，加入pH 4.5的柠檬酸缓冲液0.5mL，上述制得的粗酶液0.5 mL，于50℃水浴锅中反应30min，中止反应后，加入1.5mL DNS试剂，将各管摇匀，沸水浴5min，取出，待冷却至室温后，定容至20mL，加塞，颠倒混匀，在540nm下测定其OD值。空白组不进行50℃水浴，先加DNS以钝化酶活，其它都与测试组相同。以每分钟生成相当于1μg 的葡萄糖为一个酶活单位。

(2)外切型-β-葡聚糖酶活力的测定

在试管中加入1％的微晶纤维素底物溶液和0.5mL缓冲液，再加入 0.5Ml粗酶液，于50℃浴锅中反应30min，中止反应后与内切型-β-葡聚糖酶的处理方式相同，在540nm下测定其OD值。空白组不进行50℃水浴，先加DNS以钝化酶活，其它都与对照组相同。以每分钟生成相当于1μg的葡萄糖为一个酶活力单位。

(3)β-葡萄糖苷酶活力的测定

底物是1％水杨素溶液，取1.0mL底物，加入0.5mL缓冲液和0.5Ml 粗酶液，于50℃水浴锅中反应30min，中止反应后与CMC酶的处理方式相同，在540nm下测定其OD值。空白组不进行50℃水浴，先加 DNS以钝化酶活，其它都与对照组相同。以每分钟生成相当于1μg的葡萄糖为一个酶活力单位。

本发明提供了耐低温解纤维素孟氏假单胞菌菌株NWX-1产纤维素酶包括内切型-β-葡聚糖酶、外切型-β-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶的测定结果图，结果图请参考图7。从图7中能够看出在15℃下，菌株具有较强的产酶能力，且在发酵培养3天时，内切型-β-葡聚糖酶、外切型-β-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶均具有最高的酶活力，分别达到19.88U/mL、24.69 U/mL和17.61U/mL，具有良好的工业化应用前景。

实施例4孟氏假单胞菌菌株NWX-1的调节土壤功能酶活力测定

本发明实施例以西藏海拔4500m土壤为例进行了耐低温解纤维素孟氏假单胞菌NWX-1发酵液调节土壤功能酶活力的研究，如下：

1、供试土壤的准备

(1)土壤的选用本实施例使用的实验土壤采自西藏那曲地区海拔4500 m的草甸土壤。

(2)土壤的预处理将采集的土壤风干7天，去除石块和植物根系后将其研磨捣碎，然后过2mm的筛网，得到供试土样。

(3)土壤的培育将300g的供试土壤放入长宽高为11.5cm×11.5 cm×9.5cm的盆钵中，添加无菌水将土壤含水率调至15％，然后置于15℃下。

2、发酵液的制备

本实施例使用的发酵液制备方法如下：将孟氏假单胞菌菌株NWX-1 接种于液体培养基，在15℃下，摇床培养3天，转速为160r/min。所述液体培养基为LB液体培养基，按照浓度包含以下组分：10g/L的胰蛋白胨，5g/L的酵母提取物，10g/L的氯化钠。

3、具体的实验设计

实验共分为2组：空白组(CK)：无菌水；实验组(NWX-1)：菌株 NWX-1发酵液。孟氏假单胞菌NWX-1的发酵液用无菌水将菌液稀释加入供试土壤中搅拌均匀，使浓度达到10⁸CFU/g(干土)，空白组添加等量的无菌水。每个处理3个重复，将装有土样的盆钵置于15℃气候箱培养60天。

4、土壤功能酶活力的测定

本实施例测定的土壤功能酶包括β-1,4-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、蔗糖酶、脱氢酶、脲酶、N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶、磷酸酶。

本实施例使用的是北京索莱宝科技有限公司的土壤酶活性检测试剂盒，按照其说明书指示要求进行土壤功能酶活力的分析，采用了96孔板和酶标仪进行定量测定。

5、测定结果

本发明提供了耐低温解纤维素孟氏假单胞菌菌株NWX-1的调节土壤功能酶的测定结果图，结果图请参考图8。从图8中能够看出在15℃下，菌株可以显著地调节土壤的β-葡萄糖苷酶、蔗糖酶、脱氢酶、N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶和磷酸酶的活力。

与对照组相比，15℃下菌株NWX-1发酵液能够显著地增强土壤β- 葡萄糖苷酶、蔗糖酶、脱氢酶和磷酸酶的活力。对照组酶活分别为37.30 U/g、90.63U/g、1.67U/g、13576.40U/g，实验组酶活分别为44.47U/g、 115.25U/g、2.57U/g、26812.28U/g。

与对照组相比，15℃下菌株NWX-1发酵液能够显著地降低土壤 N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶活力，空白组酶活为25.24U/g，实验组酶活为 17.40U/g。

综上，本发明提供的耐低温解纤维素孟氏假单胞菌菌株NWX-1可在低温条件下，有效地调节土壤C、N、P循环相关的功能酶。因此，具有良好的改善土壤生态环境的应用前景。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 北京大学

<120> 一株耐低温解纤维素孟氏假单胞菌及其应用

<130> KHP191111776.4

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1385

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtcgagcggc agcacgggta cttgtacctg gtggcgagcg gcggacgggt gagtaatgcc 60

taggaatctg cctggtagtg ggggataacg ctcggaaacg gacgctaata ccgcatacgt 120

cctacgggag aaagcagggg accttcgggc cttgcgctat cagatgagcc taggtcggat 180

tagctagttg gtgaggtaat ggctcaccaa ggcgacgatc cgtaactggt ctgagaggat 240

gatcagtcac actggaactg agacacggtc cagactccta cgggaggcag cagtggggaa 300

tattggacaa tgggcgaaag cctgatccag ccatgccgcg tgtgtgaaga aggtcttcgg 360

attgtaaagc actttaagtt gggaggaagg gcagttacct aatacgtatc tgttttgacg 420

ttaccgacag aataagcacc ggctaactct gtgccagcag ccgcggtaat acagagggtg 480

caagcgttaa tcggaattac tgggcgtaaa gcgcgcgtag gtggtttgtt aagttggatg 540

tgaaatcccc gggctcaacc tgggaactgc attcaaaact gacaagctag agtatggtag 600

agggtgggtg gaatttcctg tgtagcggtg aaatgcgtag atataggaag gaacaccagt 660

ggcgaaggcg accacctgga ctgatactga cactgaggtg cgaaagcgtg gggagcaaac 720

aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacgatgtc aactagccgt tgggagcctt 780

gagctcttag tggcgcagct aacgcattaa gttgaccgcc tggggagtac ggccgcaagg 840

ttaaaactca aatgaattga cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg 900

aagcaacgcg aagaacctta ccaggccttg acatccaatg aactttccag agatggattg 960

gtgccttcgg gaacattgag acaggtgctg catggctgtc gtcagctcgt gtcgtgagat 1020

gttgggttaa gtcccgtaac gagcgcaacc cttgtcctta gttaccagca cgtaatggtg 1080

ggcactctaa ggagactgcc ggtgacaaac cggaggaagg tggggatgac gtcaagtcat 1140

catggccctt acggcctggg ctacacacgt gctacaatgg tcggtacaga gggttgccaa 1200

gccgcgaggt ggagctaatc ccagaaaacc gatcgtagtc cggatcgcag tctgcaactc 1260

gactgcgtga agtcggaatc gctagtaatc gcgaatcaga atgtcgcggt gaatacgttc 1320

ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc atgggagtgg gttgcaccag aagtagctag 1380

tctaa 1385

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agtttgatcm tggctcag 18

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggttaccttg ttacgactt 19

Claims (7)

1.一株孟氏假单胞菌（Pseudomonas mandelii）NWX-1，其保藏编号为CCTCC M2019150。

2.含有权利要求1所述孟氏假单胞菌NWX-1或其发酵液的菌剂。

3.含有权利要求1所述孟氏假单胞菌NWX-1或其发酵液的土壤功能酶活力调节剂。

4.权利要求1所述孟氏假单胞菌NWX-1或其发酵液或权利要求2所述的菌剂在低温环境下产纤维素酶、水解纤维素中的应用；所述低温为4-15℃。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述纤维素酶包括内切β-葡聚糖酶、外切β-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶。

6.权利要求1所述孟氏假单胞菌NWX-1或其发酵液或权利要求2所述的菌剂在低温环境下调节土壤功能酶活力中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述土壤功能酶包括β-1,4-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、蔗糖酶、脱氢酶、脲酶、N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶、磷酸酶。

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