CN109251914B - 一种蜡样芽胞杆菌及其在生产纤维素酶中的应用 - Google Patents

一种蜡样芽胞杆菌及其在生产纤维素酶中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN109251914B
CN109251914B CN201811417709.6A CN201811417709A CN109251914B CN 109251914 B CN109251914 B CN 109251914B CN 201811417709 A CN201811417709 A CN 201811417709A CN 109251914 B CN109251914 B CN 109251914B
Authority
CN
China
Prior art keywords
cellulase
bacillus cereus
cctcc
culture
parts
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201811417709.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109251914A (zh
Inventor
黄捷
王磊
苑广伟
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenzhen Zhonglv Environment Group Co., Ltd
Original Assignee
Guangdong Zhonglv Garden Group Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangdong Zhonglv Garden Group Co ltd filed Critical Guangdong Zhonglv Garden Group Co ltd
Priority to CN201811417709.6A priority Critical patent/CN109251914B/zh
Publication of CN109251914A publication Critical patent/CN109251914A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109251914B publication Critical patent/CN109251914B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2437—Cellulases (3.2.1.4; 3.2.1.74; 3.2.1.91; 3.2.1.150)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor

Abstract

本发明涉及蜡样芽胞杆菌CCTCC NO:M 2018679在生产纤维素酶中的应用，以及蜡样芽胞杆菌CCTCC NO:M 2018679生产纤维素酶的方法，包括以下步骤：S1接种：将蜡样芽胞杆菌株CCTCC NO:M 2018679菌株种子液以1.0×105～3.0×106接种浓度、0.5％～2％体积比接种量接种于培养基中；S2培养：将接种有所述蜡样芽胞杆菌株的培养基，于37℃，恒温培养12～48小时；S3离心：培养结束后，离心去除沉淀，留取上清液；所述上清液为含有蜡样芽胞杆菌CCTCC NO:M 2018679所产纤维素酶的液体。蜡样芽胞杆菌株CCTCC NO:M 2018679产纤维素酶所需培养时间短，且在高盐浓度下也仍能够生产纤维素酶。另外其所产的纤维素酶，不仅酶活力高，且具有较宽的温度适宜范围。可见，蜡样芽胞杆菌株CCTCC NO:M 2018679有利于被大规模应用于纤维素酶生产。

Description

一种蜡样芽胞杆菌及其在生产纤维素酶中的应用
技术领域
本发明涉及微生物领域，尤其是涉及一种蜡样芽胞杆菌及其在生产纤维素酶中的应用。
背景技术
纤维素(cellulose)是由葡萄糖组成的大分子多糖，其不溶于水及一般有机溶剂，是植物细胞壁的主要成分，纤维素中的碳元素含量很高，而碳元素是粮食和燃料中的主要物质。鉴于全球纤维素含量惊人，若人们能够有效利用纤维素则可以对粮食和能源危机有所缓解。但是，纤维素不能直接作为粮食和燃料使用，其需要被纤维素酶水解生成葡萄糖，以葡萄糖的形式或葡萄糖经过进一步反应生成的含碳物质的形式加以利用。因此，若想利用纤维素，首先需要生产大量纤维素酶。而纤维素酶是复合酶，其主要成分包括葡聚糖内切酶(EG)、葡聚糖外切酶(CBH)和β-葡萄糖苷酶(BG)。
当下，利用微生物生产纤维素酶是研究热点。因为，利用微生物生产纤维素酶具有如下优点：a.微生物菌种具有生物多样性，通过不同的微生物菌种发酵可以得到同一反应的酶，选择范围大，便于选择最佳的微生物菌种；b.微生物生长繁殖快、易于培养、微生物发酵周期短、培养基经济实惠，可降低生产成本并易于人为管理控制，可以不受季节和土地等客观因素的限制；c.微生物所生产的生物酶大多为胞外酶，便于分离、纯化和提取，较适用于大规模工业化生产；d.筛选微生物菌种过程简单，在短时间内可分离筛选大量的微生物，易于操作，且菌株容易诱变，易于优化产酶性能；e.可以通过利用基因突变或者基因工程等技术手段对菌种进行改造，从而大大增加酶的产量。
芽孢杆菌(Bacillus sp.)，一般为革兰氏阳性菌，好氧或兼型厌氧。在一定条件下会产生抗逆性内生孢子；芽孢杆菌生理特性非常丰富，其主要分布在土壌、植物体表面及水体中，多是益生菌，可以在其快速生长繁殖过程中产生多种维生素、有机酸、氨基酸，分泌纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶等功能酶类；芽孢杆菌具有生长迅速的特点，产生营养体的同时并抑制有害菌生长。故通过本发明菌株蜡样芽胞杆菌进行纤维素酶的生产，并对其产纤维素酶条件进行优化，便于大量纤维素酶制剂的生产。
发明内容
基于此，本发明的目的在于，提供一种蜡样芽胞杆菌CCTCC NO:M 2018679及其在生产纤维素酶中的应用，并对该蜡样芽胞杆菌代谢生产纤维素酶的条件进行优化，以便于使其可以应用于大规模纤维素酶制剂的生产。
本发明采用的技术方案如下：
蜡样芽胞杆菌CCTCC NO:M 2018679在生产纤维素酶中的应用。
本发明所述的蜡样芽胞杆菌株CCTCC NO:M 2018679产纤维素酶所需培养时间短，且在高盐浓度下也仍能够生产纤维素酶。另外其所产的纤维素酶，不仅酶活力高，而且具有较宽的温度适宜范围，即使在低温下也能够高效快速分解纤维素。可见，蜡样芽胞杆菌株CCTCC NO:M 2018679有利于被大规模应用于纤维素酶生产。
本发明还提供蜡样芽胞杆菌CCTCC NO:M 2018679生产纤维素酶的方法，该方法包括以下步骤：
S1接种：将蜡样芽胞杆菌株CCTCC NO:M 2018679菌株种子液以1.0×105～3.0×106接种浓度、0.5％～2％体积比接种量接种于培养基中；
S2培养：将接种有所述蜡样芽胞杆菌株的培养基，于37℃，恒温培养12～48小时；
S3离心：培养结束后，离心去除沉淀，留取上清液；
所述上清液为含有本发明所述的蜡样芽胞杆菌所产纤维素酶的液体。
进一步地，所述培养基为LB培养基，所述LB培养基包括以下重量份的原料：胰蛋白胨10份、酵母浸粉5份、氯化钠10份、无菌水1000份。
优选地，步骤S1中的接种量为1％。
优选地，步骤S2中的培养时长为24小时。
优选地，所述LB培养基包括以下重量份的原料：胰蛋白胨10份、酵母浸粉5份、氯化钠30份、无菌水1000份。
进一步地，步骤S1中的接种浓度为1.0×106个/ml。
进一步地，步骤S2中，于37℃培养时，以150-200rpm速度摇动。
优选地，步骤S2中，于37℃培养时，以180rpm速度摇动。
进一步地，步骤S3中，离心的条件为12000rpm，离心时间为1～2min。
为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本发明。
附图说明
图1为基于本发明的蜡样芽胞杆菌株在2216E琼脂固体培养基上培养48h后的菌落形态图；
图2为基于本发明的蜡样芽胞杆菌株在LB固体培养基上培养48h后的菌落形态图；所述LB固体培养基的配方按照以下重量份组成：胰蛋白胨10份、酵母浸粉5份、氯化钠10份、琼脂粉15份、无菌水1000份；。配制方法为：称取和量取上述各组分后，将各组分搅拌溶解在无菌水中后分装至锥形瓶中，将锥形瓶用灭菌纸封口后，置于灭菌锅内121℃、101KPa高压蒸汽灭菌20min，待灭菌锅温度降至70℃以下，压力恢复至0KPa时取出，于超净台上倒入培养皿中，每个培养皿约倒入10ml培养基，冷却凝固后，将固体培养板于4℃保存；
图3为本发明的蜡样芽胞杆菌16SrRNA序列的PCR扩增核酸电泳图；
图4为基于本发明的蜡样芽胞杆菌株与相似菌种的16S rRNA序列条形码构建的进化树；
图5为为本发明的蜡样芽胞杆菌株培养24小时后的纤维素酶定性试验结果图；
图6为本发明的蜡样芽胞杆菌株培养24小时后的纤维素酶定性试验数据分析图；
图7为不同时长培养本发明的蜡样芽胞杆菌株与所得纤维素酶的酶活关系图；
图8为不同无机盐浓度培养本发明的蜡样芽胞杆菌株与所得纤维素酶的酶活关系图；
图9为本发明的蜡样芽胞杆菌株生产纤维素酶的最适温度图。
具体实施方式
本发明所述的蜡样芽胞杆菌株，命名为Bacillus cereus.MS2，于2018年10月15日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国湖北省武汉市武汉大学校内中国典型培养物保藏中心)，保藏编号为CCTCC NO:M2018679。
实施例一：分离纯化方法
本发明所述的蜡样芽胞杆菌株的分离纯化方法，步骤如下：
S1：称取10g的土壤样品，所述土壤样品来自广东省海陵岛红树林国家湿地公园的红树林土壤；然后，于超净工作台中，向土壤样品中添加90ml无菌水，置于振荡器上振荡60min，使土样均匀地分散在稀释液中成为土壤悬液；待土壤分散后，吸取100ul土壤悬液到900ul无菌水中得到10倍稀释液，然后依次稀释10倍，得到102倍稀释液、103倍稀释液、104倍稀释液、105倍稀释液和106倍稀释液，整个过程在超净工作台中进行。
S2：取100ul的10倍稀释液、102倍稀释液、103倍稀释液、104倍稀释液、105倍稀释液和106倍稀释液分别涂布于2216E琼脂固体培养板上，然后将培养板置于培养箱28℃恒温培养2～3天，培养板上长出菌斑。
S3：培养结束后，根据菌落生长情况从适当稀释梯度平板一一挑取形状、颜色、大小等不同的单菌斑进行平板划线，分离出本发明所述的蜡样芽胞杆菌株。本发明所述的蜡样芽胞杆菌株在2216E琼脂固体培养板上培养48h的形态，如图1所示，本发明蜡样芽胞杆菌菌落呈灰白色不规则状，质地较软，表面粗糙，菌落向周围扩散。
S4：从2216E挑取已纯化培养的菌株，接种于内含200ml 2216E液体培养基的500ml锥形瓶中，在28℃、180rpm恒温摇床培养条件下培养28h，制得种子液。所述种子液与甘油按照1:4的体积比装管并混匀得到浓度为1.0×105～5.0×106个/ml的甘油种子液(即后文中的菌株种子液)，在管壁上做好标记后，于-20℃保存，或于-80℃长期保存。
所述2216E琼脂固体培养基的配方按照以下重量份组成：蛋白胨5份、酵母浸粉1份、柠檬酸铁0.1份、氯化钠19.45份、氯化镁5.98份、硫酸钠3.24份、氯化钙1.8份、氯化钾0.55份、碳酸钠0.16份、溴化钾0.08份、氯化锶0.034份、硼酸0.022份、硅酸钠0.004份、氟化钠0.0024份、硝酸钠0.0016份、磷酸氢二钠0.008份、琼脂15份、无菌水1000份。配制方法为：称取和量取上述各组分后，将各组分搅拌溶解在无菌水中后分装至锥形瓶中，将锥形瓶用灭菌纸封口后，置于灭菌锅内121℃、101KPa高压蒸汽灭菌20min，待灭菌锅温度降至70℃以下，压力恢复至0KPa时取出，于超净台上倒入培养皿中，每个培养皿约倒入20ml培养基，冷却凝固后，将固体培养板于4℃保存。
所述2216E液体培养基的配方按照以下重量份组成：蛋白胨5份、酵母浸粉1份、柠檬酸铁0.1份、氯化钠19.45份、氯化镁5.98份、硫酸钠3.24份、氯化钙1.8份、氯化钾0.55份、碳酸钠0.16份、溴化钾0.08份、氯化锶0.034份、硼酸0.022份、硅酸钠0.004份、氟化钠0.0024份、硝酸钠0.0016份、磷酸氢二钠0.008份、无菌水1000份。称取和量取上述各组分后，将各组分搅拌溶解在无菌水中后分装至锥形瓶中，然后将锥形瓶用灭菌纸封口后，置于灭菌锅内121℃、101KPa高压蒸汽灭菌20min，待灭菌锅温度降至70℃以下，压力恢复至0KPa时取出，保存备用。
实施例二：培养方法
第一种培养方法，使用2216E液体培养基，过程如下所示：
培养前活化：取实施例一中-20℃保存的甘油种子液以1：100体积比接种量接种到2216E液体培养基中，置于恒温摇床中28℃恒温振荡培养28h，获得已活化的菌液。
S1接种：取已活化的菌液按照1：100体积比接种于500ml 2216E液体培养基中；
S2培养：将接种有所述蜡样芽胞杆菌的培养瓶，置于恒温摇床中28℃、以180～220rpm速度恒温振荡培养24～48h，可获得高密度的菌悬液。
从时间上较为优化地考虑，当培养基为2216E液体培养基，在步骤S2中，转速为180rpm，恒温培养时间为28h，为最佳培养方式。
所述2216E液体培养基配方与实施例一相同。
第二种培养方法，使用LB液体培养基，过程如下所示：
培养前活化：取实施例一中-20℃保存的甘油种子液以1：100体积比接种量接种到LB液体培养基中，置于恒温摇床中28℃恒温振荡培养28h，获得已活化的菌液。
S1接种：取已活化的菌液按照1：100体积比接种于500ml LB液体培养基中；
S2培养：将接种有所述蜡样芽胞杆菌的培养瓶，置于恒温摇床中28℃、以180～220rpm速度恒温振荡培养24～48h，可获得高密度的菌悬液。
从时间上较为优化地考虑，当培养基为LB液体培养基，在步骤S2中，转速为180rpm，恒温培养时间为24h，为最佳培养方式。
所述LB液体培养基的配方按照以下重量份组成：胰蛋白胨10份、酵母浸粉5份、氯化钠10份、无菌水1000份。制作方法为：准确添加各组分，最后定容，分装至锥形瓶，置于灭菌锅内121℃、101KPa高压蒸汽灭菌20min，待灭菌锅温度降至70℃以下，压力恢复至0KPa时取出，保存备用。
鉴于，该新的菌种在LB培养基上的生长速度远远快于在2216E培养基中的生长速度，为了节约时间，加快该菌种的繁殖速度，后续实验，我们优选LB培养基。
实施例三：PCR扩增16S rRNA序列并测序
S1：取基因组DNA
采用Omega Bacterial DNA Kit(D3350-01)试剂盒提取基因组DNA。首先，取实施例一中所述的甘油种子液2ml于无菌的2ml离心管中，12000rpm离心2min，弃上清保留沉淀；然后，向沉淀中加入100ul 1×TE Buffer，涡旋混匀，加入10ul溶菌酶混匀，37℃温浴10min；加入100ul BTL Buffer和20ul蛋白酶K，混匀，55℃温浴1h，中间振荡混匀三次；加入5ul RNaseA酶，混匀，室温静置5min后，10000rpm离心2min，取200ul上清液转移至新的无菌的1.5ml离心管中；加入200ul BTL Buffer，混匀，置于65℃温浴10min；加入200ul无水乙醇，涡旋混匀，将样品全部转移至吸附柱中，10000rpm离心2min，弃上清和吸附柱，将吸附柱放入新的收集管中；向吸附柱中加入500ul HBC Buffer，10000rpm离心2min，弃上清；向吸附柱上加入700ul DNA Wash Buffer，10000rpm离心2min，弃上清，重复两次；将空的吸附柱重新放入收集管中，10000rpm离心2min；向吸附柱中加入用30ul～50ul Elution Buffer(已于65℃预热)溶解DNA沉淀，即得到基因组DNA，-20℃保存备用。
S2：PCR扩增16SrRNA序列
以步骤S1所得基因组DNA为模板，Eubac27F和Eubac1492R为引物进行PCR扩增，PCR反应体系(50μl)如下：
Figure BDA0001879879150000051
Figure BDA0001879879150000061
PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s、55℃复性30s、72℃延伸1min，变性、复性和延伸的过程反复循环30次；72℃再延伸10min，4℃保存PCR扩增产物。
所述上游引物Eubac27F的序列为：agagtttgat cctggctcag
所述下游引物Eubac1492R的序列为：ggttaccttg ttacgactt
S3：PCR产物进行核酸电泳
取5ul步骤S2所得的PCR产物点样后于120V电压下进行核酸电泳25min。电泳结果如附图3所示，以本发明所述的假单胞菌株的基因组DNA为模板扩增出的16S rRNA片段条带单一且亮度高，且16S rRNA序列长度约为1500bp。
S4：16S rRNA序列进行测序
步骤S2所得的PCR产物经纯化回收后，取30ul纯化产物送广州擎科生物技术有限公司进行序列双向测通测定，测序结果显示本发明所述蜡样芽胞杆菌菌株的16S rRNA序列长度为1460bp，具体序列如下所示：
Figure BDA0001879879150000062
实施例四：构建系统进化树
将本发明所述的蜡样芽胞杆菌株的16S rRNA序列输入NCBI中，进行BLAST比对，并基于条形码16S rRNA区段序列构建NJ系统进化树，如附图4所示，根据系统进化树本发明所得的菌株，其16S rRNA序列与蜡样芽胞杆菌Bacillus sp.Z7(EU236738.1)的序列相似度达到99％，并且其与蜡样芽胞杆菌属的16S rRNA条形码数据库中大部分序列高度相似但不存在完全重合，也没有唯一邻近的物种序列，因此可知，本发明所得的菌株在分类上属于蜡样芽胞杆菌属Bacillus cereus，且为一个新种，暂时命名为Bacillus cereus.MS2。
实施例五：纤维素酶定性试验
蜡样芽胞杆菌属于芽孢杆菌(Bacillus sp.)，具有芽孢杆菌生长迅速，产生营养体的同时能够抑制有害菌生长，且在快速生长繁殖过程中能够分泌纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶等功能酶类的特点。本实验室猜想新分离筛选到的蜡样芽胞杆菌CCTCC NO:M 2018679应该也具有分泌纤维素酶的能力，为了印证这个猜想，做了以下实验：
S1：取实施例一所得的甘油种子液以1％菌液与培养基体积比接种量接种于内含300ml 300ml LB液体培养基的1000ml锥形瓶中，在37℃、180rpm恒温摇床条件下培养24h，制得本发明所述的蜡样芽胞杆菌CCTCC NO:M 2018679菌液。
S2：分别取菌液的上清液，12000rpm离心2min获得粗酶液，将粗酶液经0.22um滤膜过滤获得无菌酶液。
S3：取无菌培养皿数个，每个培养皿倒入30ml纤维素酶定性培养基，待其自然冷却，进行打孔，每个培养皿中打四个孔。
S4：取步骤S2获得的无菌酶液和1mg/ml的标准纤维素酶液进行点样，每个孔的上样量均为20ul，其中，三个孔点入无菌酶液，一个孔点入标准纤维素酶液。
S5：点样后将定性培养皿置于恒温培养箱中37℃恒温培养48h。
S6：恒温培养结束后，先向定性培养皿中加入3ml 0.2％刚果红溶液，静置30min后倒出，再加入3ml 1M NaCl溶液，洗脱15min后倒出，最后再加入3ml 5％乙酸钠溶液固定10min。观察此时定性培养皿上的透明圈大小并计算出酶活力大小。
其中，所述纤维素酶定性培养基组分及制作方法如下：蛋白胨5g、酵母粉0.5g、KH2PO4 1.5g、MgSO4 0.2g、NaCl 5g、CMC-Na 10g、琼脂12g，加水定容至1000ml。分装后121℃高温灭菌20min，取出备用。
如图5所示，点入无菌酶液的三个孔与点入标准纤维素酶液的一个孔均对侵蚀了孔周围的培养基，说明所述无菌酶液即本发明的蜡样芽胞杆菌CCTCC NO:M 2018679菌液与标准纤维素酶液一样含有可以水解羧甲基纤维素钠(CMC-Na)的成分——纤维素酶，可见，本发明的蜡样芽胞杆菌CCTCC NO:M 2018679菌株具有纤维素酶活性，能够分泌纤维素酶。
如图6所示，计算点入无菌酶液孔的透明圈直径与点入标准纤维素酶液孔的透明圈直径的比值，参照纤维素酶标准品的纤维素酶活，可得出本发明的蜡样芽胞杆菌CCTCCNO:M 2018679菌株的纤维素酶活约为48.39U/ml。而现有已知的产纤维素酶的丝状真菌，如里氏木霉菌野生菌株(TreeseiQM6a)的纤维素酶活约为16.20U/ml，棘孢木霉(T.asperellum T-1)的纤维素酶活约为15.10U/ml。可见，本发明的蜡样芽胞杆菌CCTCCNO:M 2018679菌株的纤维素酶活相较于现有已知的丝状真菌的纤维素酶活有明显提升，说明本发明的蜡样芽胞杆菌CCTCC NO:M 2018679菌株相较于现有已知的丝状真菌能够生产更多的纤维素酶，具备更加高效地分解纤维素的能力。
实施例六：蜡样芽胞杆菌CCTCC NO:M 2018679生产纤维素酶的方法
S1接种：将蜡样芽胞杆菌CCTCC NO:M 2018679菌液以1.0×105～3.0×106个/ml接种浓度、0.5％～2％体积比接种量接种于LB液体培养基中；
S2培养：将接种有蜡样芽胞杆菌株CCTCC NO:M 2018679菌株的培养基，于37℃，以180～220rpm转速恒温培养12～48小时，制得蜡样芽胞杆菌CCTCC NO:M 2018679菌液；
S3离心：培养结束后，将蜡样芽胞杆菌CCTCC NO:M 2018679菌液，于12000rpm离心1～2min去除沉淀，留取上清液。
由于蜡样芽胞杆菌CCTCC NO:M 2018679在生长过程中，能够分泌纤维素酶到细胞外部，即分泌纤维素酶到培养液中。因此，步骤S3中，离心所得的沉淀即为蜡样芽胞杆菌CCTCC NO:M 2018679菌体，所留取的上清液即为含有纤维素酶的液体，简称粗酶液。
其中，所述LB液体培养基的配方按照以下重量份组成：胰蛋白胨10份、酵母浸粉5份、氯化钠10份、无菌水1000份。制作方法为：准确添加各组分，最后定容，分装至锥形瓶，置于灭菌锅内121℃、101KPa高压蒸汽灭菌20min，待灭菌锅温度降至70℃以下，压力恢复至0KPa时取出，保存备用。
实施例七：筛选产最佳酶活状态纤维素酶的菌株培养条件
(1)筛选最优培养时长
S1：取蜡样芽胞杆菌CCTCC NO:M 2018679菌株种子液以1×106接种浓度、1％菌株种子液和LB液体培养基的体积比接种量接种于内含300ml LB液体培养基的1000ml锥形瓶中，在37℃，180rpm摇床条件下恒温振荡培养，分别于12h、24h、36h、48h、60h、72h吸取10ml菌液，置于4℃冰箱保存；
S2：从4℃冰箱中取出各时间段的菌液，12000rpm离心2min获得粗酶液；
S3：采用DNS法以羧甲基纤维素钠(CMC-Na)为底物，检测不同接种量所得粗酶液的纤维素酶酶活。
其中，所述DNS法的具体步骤如下：
a.羧甲基纤维素钠溶液制备：准确称取2.00g羧甲基纤维素钠于烧杯中(精确至1mg)，缓慢加入200mL磷酸缓冲液(pH＝6.7)，边加热边搅拌至80～90℃，直至溶液澄清透明，加入磷酸缓冲液至接近300mL，缓慢滴加2mol/L的盐酸或氢氧化钠溶液调节pH值至7.0±0.05，容量瓶定容至300mL，4℃保存备用。
b.DNS试剂制备：600mL的蒸馏水溶解10.00±0.10g 3,5-二硝基水杨酸，边搅拌边加入10g的NaCl，边搅拌边加热至50℃，缓慢加入酒石酸钾钠200g，重蒸苯酚2g和无水亚硫酸钠5g，搅拌直到溶解完全(溶液澄清)，冷却至室温，蒸馏水定容至1000mL，棕色瓶室温条件下暗处保存7d后使用。
c.纤维素酶标准品(1mg/mL)使用液配制：取1g纤维素酶(江苏锐阳生物科技有限公司)，加入10mL无菌水中，混匀获得浓度为100mg/mL的纤维素酶液体，然后取1mL100mg/mL的纤维素酶液体加入到99mL无菌水中，混匀，然后通过CAS9012-54-8)0.22μm滤膜过滤除菌即获得纤维素酶标准品(1mg/mL)使用液。
d.于5mL离心管中加入2mL羧甲基纤维素钠溶液作为底物，然后加入0.5mL制备的粗酶液，每个样做三个实验平行组，同时另取一组不加粗酶液作为空白对照，振荡均匀；
e.将步骤d获得的混合样品放入30℃的水浴锅内恒温反应30min；准确反应30min后，立即取0.5mL粗酶液加入恒温反应30min的空白对照组，混匀；
f.分别取纤维素酶标准品(1mg/mL)使用液、实验组反应液及空白组反应液0.5mL加入1.5mL DNS试剂，振荡均匀，沸水显色10min，取出放入冰水中迅速冷却，紫外可见分光光度计570nm处测定吸光度值。得到吸光度值根据葡萄糖标准曲线得到对应的还原糖浓度，从而计算出纤维素酶的酶活力(Lynd LR et al，2016)。
酶活力测定时，酶活力等于实验组减去空白组。
阳性对照：是指用纤维素酶标准品作为实验组，同时以不加纤维素酶标准品为空白组，其酶活力也等于实验组减去空白组。
酶活计算公式如下所示：
Figure BDA0001879879150000101
U：纤维素酶酶活力，即在特定温度、特定pH条件下，每分钟内催化底物羧甲基纤维素钠产生1μg还原糖所需要的酶量定义为1个酶活力单位(1U)；
W：对照葡萄糖标准曲线得到的葡萄糖浓度；
N：酶液稀释总倍数(8)；
T：反应时间(min)；
1000：mg-μg。
检测结果如附图7所示，蜡样芽胞杆菌CCTCC NO:M 2018679具有明显的产纤维素酶能力。当培养时间为24h时，蜡样芽胞杆菌CCTCC NO:M 2018679所产的纤维素酶的酶活达到峰值，为28.346U/mL，相比纤维素酶标准品(阳性对照，1mg/mL)，酶活还要高出13.248U/mL。而当培养时间低于24h或高于24h时蜡样芽胞杆菌CCTCC NO:M 2018679所产的纤维素酶的酶活均较培养时间为24h低。故培养时间为24h是蜡样芽胞杆菌CCTCC NO:M 2018679酶解纤维素能力最佳的培养时间。另外，当培养时间仅为12h时，蜡样芽胞杆菌CCTCC NO:M2018679生产的纤维素酶的酶活也已经高于阳性对照组，可见，其生产纤维素酶所需的时间短且所产的纤维素酶酶活高，有利于应用于工业生产纤维素酶。
(2)筛选最优培养无机盐浓度(c(NaCl))
S1：取蜡样芽胞杆菌CCTCC NO:M 2018679菌株种子液以1×106接种浓度、1％菌株种子液和LB液体培养基的体积比接种量分别接种于内含300ml不同盐浓度(c(NaCl))的LB液体培养基的1000ml锥形瓶中，在37℃，180rpm摇床条件下恒温振荡培养24h，吸取10ml菌液，置于4℃冰箱保存；
S2：从4℃冰箱中取出不同盐浓度(c(NaCl))培养24h的菌液，12000rpm离心2min获得粗酶液，采用如前所述的DNS法以羧甲基纤维素钠(CMC-Na)为底物，检测不同盐浓度(c(NaCl))所得粗酶液的纤维素酶酶活。
其中，所述不同盐浓度(c(NaCl))的LB液体培养基：即在其他培养基成分不变的条件下，调整NaCl含量，分别加入0份、10份、20份、30份、40份的氯化钠，形成0％、1％、2％、3％、4％五个不同盐浓度的LB液体培养基。
检测结果如附图8所示，当培养基中添加不同浓度的氯化钠时，蜡样芽胞杆菌CCTCC NO:M 2018679所产的纤维素酶的酶活力差别很大。当培养基盐浓度为3％时，蜡样芽胞杆菌CCTCC NO:M 2018679所产的纤维素酶具有最高的酶活力，为39.840U/mL。可见，3％的盐浓度是蜡样芽胞杆菌CCTCC NO:M 2018679酶解纤维素能力最佳的无机盐浓度(c(NaCl))。另外，当盐浓度高达4％时，蜡样芽胞杆菌CCTCC NO:M 2018679也仍然能够生产纤维素酶，可见，其耐盐性良好，有利于应用于工业生产纤维素酶。
实施例八：筛选蜡样芽胞杆菌CCTCC NO:M 2018679生产纤维素酶的最适温度
S1：取蜡样芽胞杆菌CCTCC NO:M 2018679菌株种子液以1×106接种浓度、1％菌株种子液和LB液体培养基的体积比接种量接种于300ml盐浓度为3％的LB液体培养基中，于37℃，180rpm转速，置于摇床上恒温振荡培养24h后，吸取10ml菌液，12000rpm离心2min获得粗酶液；
S2：将S1所得的粗酶液分别置于10℃、20℃、30℃、40℃、50℃和60℃下，如前所述的DNS法以羧甲基纤维素钠(CMC-Na)为底物，检测本发明所述的蜡样芽胞杆菌所产的纤维素酶在不同温度条件下的酶活。
检测结果如附图9所示，蜡样芽胞杆菌CCTCC NO:M 2018679所产的纤维素酶在30℃条件下具有最高酶活，达到39.840U/mL。可见，蜡样芽胞杆菌CCTCC NO:M 2018679所产的纤维素酶的最适温度为30℃。另外，当温度高于30℃后，酶活逐渐下降；温度低于30℃之前，酶活呈逐步上升的趋势。但是当反应温度为20℃/40℃时，酶活虽下降，但仍保持较高活性。可见，本发明所述的蜡样芽胞杆菌所产的纤维素酶具有较宽的温度适宜范围，其具有一定的耐冷性(20℃)，适用于大规模生产。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Figure BDA0001879879150000121
Figure BDA0001879879150000131
序 列 表
<110> 广东中绿园林集团有限公司
<120> 一种蜡样芽胞杆菌及其在生产纤维素酶中的应用
<160> 13
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 1460
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 本发明所述的蜡样芽胞杆菌株的16S rRNA序列
<400> 1
tgccatctct gtccacctta ggcggctggc tccaaaaggt taccccaccg acttcgggtg 60
ttacaaactc tcgtggtgtg acgggcggtg tgtacaaggc ccgggaacgt attcaccgcg 120
gcatgctgat ccgcgattac tagcgattcc agcttcatgt aggcgagttg cagcctacaa 180
tccgaactga gaacggtttt atgagattag ctccacctcg cggtcttgca gctctttgta 240
ccgtccattg tagcacgtgt gtagcccagg tcataagggg catgatgatt tgacgtcatc 300
cccaccttcc tccggtttgt caccggcagt caccttagag tgcccaactt aatgatggca 360
actaagatca agggttgcgc tcgttgcggg acttaaccca acatctcacg acacgagctg 420
acgacaacca tgcaccacct gtcactctgc tcccgaagga gaagccctat ctctagggtt 480
gtcagaggat gtcaagacct ggtaaggttc ttcgcgttgc ttcgaattaa accacatgct 540
ccaccgcttg tgcgggcccc cgtcaattcc tttgagtttc agccttgcgg ccgtactccc 600
caggcggagt gcttaatgcg ttaacttcag cactaaaggg cggaaaccct ctaacactta 660
gcactcatcg tttacggcgt ggactaccag ggtatctaat cctgtttgct ccccacgctt 720
tcgcgcctca gtgtcagtta cagaccagaa agtcgccttc gccactggtg ttcctccata 780
tctctacgca tttcaccgct acacatggaa ttccactttc ctcttctgca ctcaagtctc 840
ccagtttcca atgaccctcc acggttgagc cgtgggcttt cacatcagac ttaagaaacc 900
acctgcgcgc gctttacgcc caataattcc ggataacgct tgccacctac gtattaccgc 960
ggctgctggc acgtagttag ccgtggcttt ctggttaggt accgtcaagg tgccagctta 1020
ttcaactagc acttgttctt ccctaacaac agagttttac gacccgaaag ccttcatcac 1080
tcacgcggcg ttgctccgtc agactttcgt ccattgcgga agattcccta ctgctgcctc 1140
ccgtaggagt ctgggccgtg tctcagtccc agtgtggccg atcaccctct caggtcggct 1200
acgcatcgtt gccttggtga gccgttacct caccaactag ctaatgcgac gcgggtccat 1260
ccataagtga cagccgaagc cgcctttcaa tttcgaacca tgcggttcaa aatgttatcc 1320
ggtattagcc ccggtttccc ggagttatcc cagtcttatg ggcaggttac ccacgtgtta 1380
ctcacccgtc cgccgctaac ttcataagag caagctctta atccattcgc tcgacttgca 1440
tgtatagcac ccgccagccc 1460
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 上游引物Eubac27F
<400> 2
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 下游引物Eubac1492R
<400> 3
ggttaccttg ttacgactt 19

Claims (10)

1.蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus.MS2)CCTCC NO:M 2018679在生产纤维素酶中的应用。
2.如权利要求1所述的蜡样芽胞杆菌CCTCC NO:M 2018679在生产纤维素酶中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
S1接种：将蜡样芽胞杆菌株CCTCC NO:M 2018679菌株种子液以1.0×105～3.0×106接种浓度、0.5％～2％体积比接种量接种于培养基中；
S2培养：将接种有所述蜡样芽胞杆菌株的培养基，于37℃，恒温培养12～48小时；
S3离心：培养结束后，离心去除沉淀，留取上清液；
所述上清液为含有所述的蜡样芽胞杆菌所产纤维素酶的液体。
3.如权利要求2所述的蜡样芽胞杆菌CCTCC NO:M 2018679在生产纤维素酶中的应用，其特征在于，所述培养基为LB培养基，所述LB培养基包括以下重量份的原料：胰蛋白胨10份、酵母浸粉5份、氯化钠10份、无菌水1000份。
4.如权利要求2所述的蜡样芽胞杆菌CCTCC NO:M 2018679在生产纤维素酶中的应用，其特征在于：步骤S1中的接种量为1％。
5.如权利要求2所述的蜡样芽胞杆菌CCTCC NO:M 2018679在生产纤维素酶中的应用，其特征在于：步骤S2中的培养时长为24小时。
6.如权利要求2所述的蜡样芽胞杆菌CCTCC NO:M 2018679在生产纤维素酶中的应用，其特征在于，所述培养基为LB培养基，所述LB培养基包括以下重量份的原料：胰蛋白胨10份、酵母浸粉5份、氯化钠30份、无菌水1000份。
7.如权利要求2所述的蜡样芽胞杆菌CCTCC NO:M 2018679在生产纤维素酶中的应用，其特征在于：步骤S1中的接种浓度为1.0×106个/ml。
8.如权利要求2所述的蜡样芽胞杆菌CCTCC NO:M 2018679在生产纤维素酶中的应用，其特征在于：步骤S2中，于37℃培养时，以150-200rpm速度摇动。
9.如权利要求8所述的蜡样芽胞杆菌CCTCC NO:M 2018679在生产纤维素酶中的应用，其特征在于：步骤S2中，于37℃培养时，以180rpm速度摇动。
10.如权利要求2所述的蜡样芽胞杆菌CCTCC NO:M 2018679在生产纤维素酶中的应用，其特征在于：步骤S3中，离心的条件为12000rpm，离心时间为1～2min。
CN201811417709.6A 2018-11-26 2018-11-26 一种蜡样芽胞杆菌及其在生产纤维素酶中的应用 Active CN109251914B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811417709.6A CN109251914B (zh) 2018-11-26 2018-11-26 一种蜡样芽胞杆菌及其在生产纤维素酶中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811417709.6A CN109251914B (zh) 2018-11-26 2018-11-26 一种蜡样芽胞杆菌及其在生产纤维素酶中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109251914A CN109251914A (zh) 2019-01-22
CN109251914B true CN109251914B (zh) 2020-02-18

Family

ID=65042143

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811417709.6A Active CN109251914B (zh) 2018-11-26 2018-11-26 一种蜡样芽胞杆菌及其在生产纤维素酶中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109251914B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113652363B (zh) * 2021-05-26 2022-07-22 黄山学院 一种产耐热耐酸纤维素酶菌株hsu-12及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2000253870A (ja) * 1999-03-09 2000-09-19 Baiteku:Kk バチルス属微生物とその用途
CN101381714A (zh) * 2008-10-30 2009-03-11 哈尔滨工业大学 一种葡聚糖酶及其分离纯化的方法
KR101589028B1 (ko) * 2014-09-26 2016-01-28 재단법인 발효미생물산업진흥원 바이오제닉 아민은 생산하지 않고, 유해 미생물에 대한 항균 활성이 있는 바실러스 서틸리스 scj4 균주 및 이의 용도

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2000253870A (ja) * 1999-03-09 2000-09-19 Baiteku:Kk バチルス属微生物とその用途
CN101381714A (zh) * 2008-10-30 2009-03-11 哈尔滨工业大学 一种葡聚糖酶及其分离纯化的方法
KR101589028B1 (ko) * 2014-09-26 2016-01-28 재단법인 발효미생물산업진흥원 바이오제닉 아민은 생산하지 않고, 유해 미생물에 대한 항균 활성이 있는 바실러스 서틸리스 scj4 균주 및 이의 용도

Also Published As

Publication number Publication date
CN109251914A (zh) 2019-01-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109294933B (zh) 一株酿酒酵母及其与产酯酵母共培养提高传统发酵食品品质的方法
CN111100827B (zh) 一株可产高活力褐藻胶裂解酶的芽孢杆菌及其应用
CN108707556A (zh) 一种横梗霉菌菌株及其在生产纤维素酶中的应用
CN111808775B (zh) 一株耐高温热噬淀粉芽孢杆菌及其应用
CN109251880B (zh) 一种蜡样芽胞杆菌及其在改善水体磷污染中的应用
CN115873754A (zh) 一株肠源凝结魏茨曼氏菌rs804及其应用
CN113930368B (zh) 一种死谷芽孢杆菌及其在食醋酿造中的应用
CN111100825A (zh) 一株芽孢杆菌及其在工业中的应用
CN109251914B (zh) 一种蜡样芽胞杆菌及其在生产纤维素酶中的应用
CN111893065B (zh) 一株低温纤维素降解细菌
CN113151091B (zh) 一种罗氏假单胞菌pr415及其应用
CN113214999B (zh) 一株地霉tn42及其在污水处理中的应用
CN113897319B (zh) 一株解淀粉芽孢杆菌及其应用
CN114933974A (zh) 一种拟康氏木霉c5-9及其在拮抗灰葡萄孢菌中的应用
CN107164280A (zh) 一株呕吐毒素降解菌及其应用
CN111019995B (zh) 一种以丁香酚为底物发酵生成香兰素的方法
CN111117923B (zh) 一株具有降解果胶功能的水生拉恩氏菌新菌株Gj-4
CN112175876A (zh) 一种脱色芽孢杆菌及其在拮抗果蔬真菌病害中的应用
CN110317755B (zh) 一株耐低温解纤维素孟氏假单胞菌及其应用
CN114836355B (zh) 一种假单胞菌dt04及其在污水脱氮的应用
CN102994487B (zh) 酸性脲酶的生产方法
CN116731934B (zh) 一株大肠埃希氏菌及其在生产氨基葡萄糖中的应用
CN114591856B (zh) 一株产碱性磷酸酶的解淀粉芽孢杆菌及其应用
CN107699516A (zh) 嗜盐球菌及其制剂与应用
CN111733118B (zh) 一株芽孢杆菌pl-2及其在水产养殖中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CP01 Change in the name or title of a patent holder
CP01 Change in the name or title of a patent holder

Address after: 518116 Third Floor 301, Building F, No. 2, Shenzhen Puling Road, Nanlian Community, Longgang Street, Longgang District, Shenzhen City, Guangdong Province

Patentee after: Shenzhen Zhonglv Environment Group Co., Ltd

Address before: 518116 Third Floor 301, Building F, No. 2, Shenzhen Puling Road, Nanlian Community, Longgang Street, Longgang District, Shenzhen City, Guangdong Province

Patentee before: Guangdong Zhonglu Garden Group Co., Ltd.