CN111733118B

CN111733118B - 一株芽孢杆菌pl-2及其在水产养殖中的应用

Info

Publication number: CN111733118B
Application number: CN202010824334.6A
Authority: CN
Inventors: 彭健; 方素云; 胡晓珂; 闵军
Original assignee: Zhongke Marine Microbial Industry Technology Research Institute Shandong Co ltd; Yantai Institute of Coastal Zone Research of CAS
Current assignee: Zhongke Marine Microbial Industry Technology Research Institute Shandong Co ltd; Yantai Institute of Coastal Zone Research of CAS
Priority date: 2020-08-17
Filing date: 2020-08-17
Publication date: 2020-12-04
Anticipated expiration: 2040-08-17
Also published as: CN111733118A

Abstract

本发明公开了一株芽孢杆菌PL‑2及其在水产养殖中的应用，其中，该芽孢杆菌PL‑2保藏编号为CCTCC NO：M 2020049，是从采自于威海市南海新区某养殖池的底泥样品中分离、纯化得到的，对氨氮、硫化氢、有机磷有良好的降解作用，发酵产物对溶藻弧菌和嗜水气单胞菌有良好的抑制作用，可以微生物菌剂的方式投施至养殖水域，是一种生物防治手段，具有与化学防治相比环保无污染、与物理防治相比防治成本更低、效益更高的特点。

Description

一株芽孢杆菌PL-2及其在水产养殖中的应用

技术领域

本发明涉及一株菌株及其应用，具体涉及一株芽孢杆菌PL-2及其在水产养殖中的应用，属于微生物技术领域。

背景技术

水体是水产动物生存生长所必须依赖的环境，水体水质的好坏是水产养殖特别是集约化养殖成败的关键。目前的水产养殖模式还大都是以多品种、高密度、大量施肥投饵从而获得高产量的传统养殖模式，人类的活动和养殖对象自身的分泌物和排泄物、饵料过剩、药物残留等因素极易导致养殖水体污染、水质因子平衡失调，使得水中氨氮、磷、亚硝酸盐、硫化氢等物质的含量迅速升高，进而引起水产养殖动物发病甚至大批量死亡。

当前以抗生素、激素、防腐剂为主的饲料药物添加剂给水产养殖业生产带来了很大的效益，含有这些饲料药物添加剂的饲料能够达到控制部分疾病发生、促进养殖动物生长的目的，但由此带来的药物残留、二次污染、水产品质量安全等问题愈发严重。

随着生物技术的迅速发展，生物防治措施日益受到人们的关注。生物防治是指：微生物通过调节水环境微生态平衡、拮抗致病微生物、降解养殖过程中的有机废物和无机废物等，来实现提高水生生物的免疫力和抗病力、促进水生生物生长以及净化水质的效果。

发明内容

本发明的目的在于：筛选一株有益微生物，并以微生物菌剂的方式投施至养殖水域，以实现改善水产养殖水体的水质、提升水产品的产量和品质，并确保环保无污染。

为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：

一株芽孢杆菌PL-2，其特征在于，该芽孢杆菌PL-2保藏编号为CCTCC NO：M2020049，保藏日期为2020 年03月02日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉。该芽孢杆菌PL-2是从采自于威海市南海新区某养殖池的底泥样品中分离、纯化得到的，对氨氮、硫化氢、有机磷有良好的降解作用，发酵产物对溶藻弧菌和嗜水气单胞菌有良好的抑制作用。

前述的芽孢杆菌PL-2在水产养殖方面的应用，其特征在于，制成微生物菌剂进行使用，该微生物菌剂的制备方法包括以下步骤：

步骤1：将芽孢杆菌PL-2划线接种在牛肉膏蛋白胨固体培养基上，培养获得单菌落；

步骤2：从牛肉膏蛋白胨固体培养基上挑取单菌落接种至LB液体培养基中，培养获得种子液；

步骤3：将所得种子液接种至发酵培养基中，培养获得发酵液，其中，发酵培养基的配方为：NH₄Cl 1g、CH₃COONa 3g、MgCl₂0.2g、CaCl₂0.2g、KH₂PO₄0.6g、NaCl 1g、酵母膏 2g、葡萄糖 2g、水1000 ml；

步骤4：将所得发酵液离心，弃上清得湿菌液；

步骤5：将沸石粉、牡蛎粉和硅藻土中的任意一种或任意几种按重量比1-4:2添加至所得湿菌液中，搅拌混匀，低温干燥，分装即得微生物菌剂。

前述的应用，其特征在于，在步骤1中，培养条件为：30℃恒温倒置培养24h。

前述的应用，其特征在于，在步骤2中，培养条件为：35℃、150rpm活化培养10h。

前述的应用，其特征在于，在步骤5中，沸石粉、牡蛎粉和硅藻土在使用前均先过250-300目筛。

前述的应用，其特征在于，在步骤5中，单独使用沸石粉，沸石粉按重量比1:1添加至所得湿菌液中；或者，同时使用沸石粉和牡蛎粉，二者按重量比1：1混合得混合粉体，混合粉体按重量比2:1添加至所得湿菌液中；再或者，同时使用沸石粉、牡蛎粉和硅藻土，三者按重量比2：2：1混合得混合粉体，混合粉体按重量比1:2添加至所得湿菌液中。

前述的应用，其特征在于，在步骤5中，低温干燥的温度设定为37℃。

本发明的有益之处在于：

1、本发明筛选得到的芽孢杆菌PL-2，以微生物菌剂的方式投施至养殖水域，是一种生物防治手段，具有（与化学防治相比）环保无污染、（与物理防治相比）防治成本更低、效益更高的特点；

2、本发明筛选得到的芽孢杆菌PL-2，分离自水产养殖池底泥，对氨氮、硫化氢、有机磷等污染物有良好的降解作用，由其制成的微生物菌剂对改善水体的水质有良好的作用；

3、本发明筛选得到的芽孢杆菌PL-2，能产生包括低分子量抗生素、抗菌多肽等在内的多种活性酶物质，这些活性酶物质能够抑制溶藻弧菌、嗜水气单胞菌等病原微生物，由其制成的微生物菌剂有利于改善水产动物的生长状况、提高水产动物的成活率，并且安全无公害，符合绿色健康可持续发展宗旨。

附图说明

图1是扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果图；

图2是芽孢杆菌PL-2对硫化氢的降解情况图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作具体的介绍。

一、芽孢杆菌PL-2的分离、纯化及鉴定

1、芽孢杆菌PL-2的分离、纯化

本发明筛选得到的芽孢杆菌PL-2是从采自于威海市南海新区某养殖池的底泥样品中分离、纯化得到的，分离、纯化的过程具体如下：

（1）取10g采自于威海市南海新区某养殖池的底泥样品，然后将该底泥样品加入到100ml 浓度为0.85%的NaCl无菌溶液中，制成浑浊液。

（2）将制备得到的浑浊液进行梯度稀释，然后取100μl稀释10000倍的浑浊液，以平板涂布的方式涂布至牛肉膏蛋白胨培养基上，这一步共涂3个平板，之后将3个涂布了浑浊液的平板置于37℃培养箱中倒置培养24h，此时每个平板上长出了大约60-90个单菌落。

（3）从每个平板上随机挑取3个单菌落至新的牛肉膏蛋白胨培养基上，采用平板划线的方式纯化单菌落，划线完毕后将该9个平板置于37℃培养箱中倒置培养24h，此时每个平板上长出了大约50个单菌落，最后随机保存一个菌落形态为圆形、表面不光滑、色泽微黄的单菌落，该单菌落即为本发明最终筛选所得单菌落，相应的，该单菌落中的菌株即为本发明最终筛选所得菌株。

2、芽孢杆菌PL-2的鉴定

（1）观察菌落形态

将本发明最终筛选所得菌株以平板涂布的方式涂布至牛肉膏蛋白胨培养基上，37℃培养箱中倒置培养24h，此时该平板上长出了大约100个单菌落，这些菌落呈圆形，微黄，表面褶皱，边缘不规则。

（2）凝胶电泳检测

将本发明最终筛选所得菌株接种至LB液体培养基中，37℃、 150rpm培养12h，得到菌液。

用细菌基因组DNA提取试剂盒提取上述菌液中的细菌的DNA，然后以所提DNA为模板、以27F（序列为AGA GTT TGA TCC TGG CTCAG）为上游引物、以ITS1（序列为TCCGTAGGTGAACCTGCGG）为下游引物进行序列扩增。PCR反应程序为：95℃预变性5 min；94℃变性1 min，56℃退火1 min，72℃延伸1 min，31个循环；72℃5 min。

扩增结束后，用1%（w/v）琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测，检测结果如图1所示：在1500bp处出现了清晰的条带。

检测结果表明：通用引物PCR扩增成功。

（3）16S rRNA鉴定

将本发明最终筛选所得菌株送至北京奥科鼎盛生物科技有限公司进行16S rRNA序列测定，并将测得的该菌株的16S rRNA序列在Gen Bank中进行同源序列比对检索，比对检索的结果显示：该菌株与芽孢杆菌（Bacillus sp.）相似度达到了100%。

最终，鉴定本发明最终筛选所得菌株为芽孢杆菌，记为芽孢杆菌PL-2。

二、检测芽孢杆菌PL-2的特性

1、降解特性

（1）对氨氮的降解情况

实验溶液：氨态氮浓度为100mg/L的池塘水。

将芽孢杆菌PL-2接种于LB液体培养基中，35℃、150rpm活化培养10h，然后以5%的转接比例转接于实验溶液中，混匀后30℃静置培养120h，对照组不接菌，每24h取样一次。

取样后，将水样用0.45μm膜滤掉杂质，然后采用纳氏试剂分光光度法在420nm处测水样的吸光值，之后对照标准曲线确定氨态氮的去除率，具体结果详见表1。

表1 芽孢杆菌PL-2对氨氮的降解情况

	初始氨氮浓度（mg/L）	最终氨氮浓度（mg/L）	去除率（%）
				实验组	100	11.6	88.4
对照组	100	95.8	4.2

由表1可知，芽孢杆菌PL-2对氨氮有良好的降解作用。

（2）对硫化氢的降解情况

培养基A：以硫化氢为唯一硫源的选择性培养基，配方具体如下：磷酸氢二钾1.2g/L、氯化铵1.0g/L、氯化镁0.4g/L、氯化钙0.05g/L、氯化钠0.1g/L、葡萄糖0.02g/L、400ppm标准硫化氢气体。

将芽孢杆菌PL-2接种于LB液体培养基中，35℃、150rpm活化培养10h，然后以5%的转接比例分别转接于LB液体培养基（对照组）和培养基A（实验组）中，混匀后30℃、160rpm培养72h，每12h取样一次，之后用气相色谱法分别测定芽孢杆菌PL-2在不同培养基中的生长情况，具体的，检测培养瓶上部空间硫化氢（H₂S）的浓度。检测的结果如图2所示。由图2可知，芽孢杆菌PL-2能在以硫化氢为唯一硫源的选择性培养基上良好生长，并且对硫化氢有良好的降解作用。

（3）对有机磷的降解情况

培养基B：有机磷平板培养基，配方具体如下：葡萄糖10.0g/L、硫酸铵0.21g/L、氯化钾0.1g/L、氯化镁5.0g/L、植酸钙2.0g/L、琼脂20.0g/L。

将芽孢杆菌PL-2接种于LB液体培养基中，35℃、150rpm活化培养10h，然后以5%的转接比例转接于培养基B中，30℃、恒温倒置培养72h，之后测量平板上透明圈的直径。测量结果见表2。

表2 芽孢杆菌PL-2对有机磷的降解情况

由表2可知，芽孢杆菌PL-2在含有植酸钙的有机磷平板上产生了明显的透明圈，表明芽孢杆菌PL-2对有机磷有良好的降解作用。

综上，芽孢杆菌PL-2对氨氮、硫化氢、有机磷等污染物都有良好的降解作用。

2、抑菌特性

病原菌：溶藻弧菌、嗜水气单胞菌。溶藻弧菌和嗜水气单胞菌是养殖池塘水体中常见的微生物，并且是会对养殖水产产生不良影响的病原微生物。

制作抑菌板：向熔融的LB固体培养基中分别添加活化的病原菌——溶藻弧菌和嗜水气单胞菌，溶藻弧菌和嗜水气单胞菌的添加浓度均为1%（v/v）。

将芽孢杆菌PL-2接种于LB液体培养基中，35℃、150rpm活化培养10h得种子液，然后将种子液以5%的接种比例接种至发酵培养基（配方：NH₄Cl 1g、CH₃COONa 3g、MgCl₂0.2g、CaCl₂0.2g、KH₂PO₄0.6g、NaCl 1g、酵母膏 2g、葡萄糖 2g、水1000 ml）中，30℃、200rpm放大培养20h得发酵液，之后将发酵液3000rpm离心5min，弃沉淀，得上清液。

在添加溶藻弧菌的抑菌板上打3个孔，并向每个孔内添加 100μl上述上清液，然后在37℃培养24h，之后观察并记录抑菌板上抑菌圈的直径。具体结果详见表3。

同样的，在添加嗜水气单胞菌的抑菌板上打3个孔，并向每个孔内添加 100μl上述上清液，然后在37℃培养24h，之后观察并记录抑菌板上抑菌圈的直径。具体结果详见表3。

表3 芽孢杆菌PL-2发酵产物的抑菌情况

由表3可知，芽孢杆菌PL-2的发酵产物能有效抑制溶藻弧菌和嗜水气单胞菌。

芽孢杆菌PL-2的发酵产物之所以能有效抑制溶藻弧菌和嗜水气单胞菌，是因为该发酵产物中含有包括低分子量抗生素、抗菌多肽等在内的多种活性酶物质，而低分子量抗生素、抗菌多肽正是抑制溶藻弧菌和嗜水气单胞菌的有效物质。

三、利用芽孢杆菌PL-2制备微生物菌剂

实施例1

利用芽孢杆菌PL-2制备微生物菌剂的方法具体包括以下步骤：

（1）将芽孢杆菌PL-2划线接种在牛肉膏蛋白胨固体培养基上，30℃恒温倒置培养24h，得单菌落，其中，牛肉膏蛋白胨固体培养基的配方为：牛肉膏3.0g、蛋白胨10.0g、NaCl5.0g、琼脂15g、水1000ml；

（2）从牛肉膏蛋白胨固体培养基上挑取单菌落接种至LB液体培养基中，35℃、150rpm活化培养10h，得种子液；

（3）将所得种子液以3%的接种比例接种至发酵培养基中，30℃、200rpm放大培养20h，得发酵液，其中，发酵培养基的配方为：NH₄Cl 1g、CH₃COONa 3g、MgCl₂0.2g、CaCl₂0.2g、KH₂PO₄0.6g、NaCl 1g、酵母膏 2g、葡萄糖 2g、水1000 ml；

（4）将所得发酵液3000rpm离心5min，弃上清，得湿菌液；

（5）将250目沸石粉按重量比1:1添加至所得湿菌液中，搅拌混匀，37℃低温干燥，分装即得微生物菌剂。

实施例2

利用芽孢杆菌PL-2制备微生物菌剂的方法具体包括以下步骤：

（4）将所得发酵液4000rpm离心6min，弃上清，得湿菌液；

（5）将300目沸石粉和300目牡蛎粉按重量比1：1混合，得混合粉体，然后将混合粉体按重量比2:1添加至所得湿菌液中，搅拌混匀，37℃低温干燥，分装即得微生物菌剂。

实施例3

利用芽孢杆菌PL-2制备微生物菌剂的方法具体包括以下步骤：

（3）将所得种子液以5%的接种比例接种至发酵培养基中，30℃、200rpm放大培养20h，得发酵液，其中，发酵培养基的配方为：NH₄Cl 1g、CH₃COONa 3g、MgCl₂0.2g、CaCl₂0.2g、KH₂PO₄0.6g、NaCl 1g、酵母膏 2g、葡萄糖 2g、水1000 ml；

（4）将所得发酵液5000rpm离心8min，弃上清，得湿菌液；

（5）将300目沸石粉、300目牡蛎粉和300目硅藻土按重量比2：2：1混合，得混合粉体，然后将混合粉体按重量比1:2添加至所得湿菌液中，搅拌混匀，37℃低温干燥，分装即得微生物菌剂。

实施例4

利用芽孢杆菌PL-2制备微生物菌剂的方法具体包括以下步骤：

（4）将所得发酵液5000rpm离心8min，弃上清，得湿菌液；

（5）将所得湿菌液37℃低温干燥，分装即得微生物菌剂。

实施例1、实施例2、实施例3和实施例4所制得的微生物菌剂均呈淡黄色粉末状，并均带有轻微发酵味道。

四、验证微生物菌剂的使用效果

选取同一区域内5个20亩刺参养殖池塘，分别记为池塘1、池塘2、池塘3、池塘4和池塘5，向池塘1、池塘2、池塘3和池塘4分别投施1000g实施例1、实施例2、实施例3和实施例4所制备的微生物菌剂，剩下的池塘5不投施任何微生物菌剂（对照组），之后每15天增投微生物菌剂一次，每次投施1000g，连续投施4个月，对照组始终不投施任何微生物菌剂。

每个月观察并记录每个养殖池塘的水质情况，具体结果详见表4。

表4 各养殖池塘的水质情况

	池塘1	池塘2	池塘3	池塘4	池塘5
						1个月后	一般	较好	较好	较好	一般
2个月后	较好	较好	良好	良好	较差
						3个月后	较好	良好	良好	良好	差
4个月后	较好	较好	良好	良好	很差

4个月后，测定每个养殖池塘内刺参的成活率和平均重量，具体结果详见表5。

表5 各养殖池塘内刺参的成活率和平均重量

	池塘1	池塘2	池塘3	池塘4	池塘5
						成活率（%）	71.5	73.3	75.2	75.4	48.5
刺参重量（g）	108.6	115.5	111.8	101.3	89.4

由表4和表5可知，该微生物菌剂不仅对改善水体的水质有良好的作用，而且有利于改善水产动物的生长状况（平均重量较对照组有明显提高）、提高水产动物的成活率。

五、保藏芽孢杆菌PL-2

由前面提供的利用芽孢杆菌PL-2制备得到的微生物菌剂的使用效果可知，本发明筛选得到的芽孢杆菌PL-2在水产养殖方面具有非常高的实际应用价值，所以我们对该芽孢杆菌PL-2进行了菌种保藏，保藏信息具体如下：

保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2020 年03月02日，保藏编号为CCTCC NO：M 2020049，保藏地址为中国武汉。

需要说明的是，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

Claims

1.一株芽孢杆菌PL-2，其特征在于，该芽孢杆菌PL-2保藏编号为CCTCC NO：M 2020049，保藏日期为2020 年03月02日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，该芽孢杆菌PL-2是从采自于威海市南海新区某养殖池的底泥样品中分离、纯化得到的，对氨氮、硫化氢、有机磷有的降解作用，发酵产物对溶藻弧菌和嗜水气单胞菌有的抑制作用。

2.权利要求1所述的芽孢杆菌PL-2在降解氨氮、硫化氢和有机磷以及抑制溶藻弧菌和嗜水气单胞菌方面的应用，其特征在于，制成微生物菌剂进行使用，该微生物菌剂的制备方法包括以下步骤：

步骤4：将所得发酵液离心，弃上清得湿菌液；

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，在步骤1中，培养条件为：30℃恒温倒置培养24h。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，在步骤2中，培养条件为：35℃、150rpm活化培养10h。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，在步骤5中，沸石粉、牡蛎粉和硅藻土在使用前均先过250-300目筛。

6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，在步骤5中，单独使用沸石粉，沸石粉按重量比1:1添加至所得湿菌液中。

7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，在步骤5中，同时使用沸石粉和牡蛎粉，二者按重量比1：1混合得混合粉体，混合粉体按重量比2:1添加至所得湿菌液中。

8.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，在步骤5中，同时使用沸石粉、牡蛎粉和硅藻土，三者按重量比2：2：1混合得混合粉体，混合粉体按重量比1:2添加至所得湿菌液中。

9.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，在步骤5中，低温干燥的温度设定为37℃。