CN110699300B

CN110699300B - 一种具有水产病原菌拮抗特性的复合微生物底质改良剂的制备方法及其应用

Info

Publication number: CN110699300B
Application number: CN201911117444.2A
Authority: CN
Inventors: 施大林; 张维娜; 高亮; 于丹; 孙梅; 匡群
Original assignee: JIANGSU SUWEI MICROBIOLOGY RESEARCH CO LTD
Current assignee: JIANGSU SUWEI MICROBIOLOGY RESEARCH CO LTD
Priority date: 2019-11-15
Filing date: 2019-11-15
Publication date: 2023-03-07
Anticipated expiration: 2039-11-15
Also published as: CN110699300A

Abstract

一种具有水产病原菌拮抗特性的复合微生物底质改良剂的制备方法及其应用，属于微生物技术领域。本发明提供两株菌株：枯草芽孢杆菌AB‑90008‑15、格式乳杆菌88，通过菌种活化、发酵培养、离心收集菌体及真空干燥粉碎得到复合微生物底质改良剂。本发明提供的复合微生物底质改良剂能够拮抗嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、维氏气单胞菌、豚鼠气单胞菌、爱德华氏菌、鳗利斯顿氏菌、副溶血弧菌及溶藻弧菌等水产病原菌，能够降解池塘底泥中含碳有机物、含氮有机物，促进底泥矿化，降低养殖水体COD、氨氮、亚硝酸盐、总磷、总氮的含量，促进水体营养物质的良性循环，防止有毒有害物质的蓄积，改善养殖底质生态环境。

Description

一种具有水产病原菌拮抗特性的复合微生物底质改良剂的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种具有水产病原菌拮抗特性的复合微生物底质改良剂的制备方法及其应用，属于微生物技术领域。

背景技术

养鱼先养水，养水先养底。池塘养殖以水为基础，水质的好坏是影响水产养殖生物存活率和产量的主要原因。底泥环境的状况对水体水质影响很大，因此，其健康程度直接影响到养殖的经济及生态效益的优劣。如果底泥过厚，常常会给水体带来很多潜在的危害性。在淤泥较多的池塘中，有机质的氧化分解会消耗掉底层本来并不多的氧气，造成底部处于缺氧状态，厌氧细菌大量繁殖，分解池塘底部的有机物质而产生大量有毒的中间产物，这些物质大都对养殖鱼类有着很大的毒害作用，并且会在水中不断积累，影响鱼类的生长，使饵料系数增大，养殖成本升高。

目前国内针对养殖池塘底泥的改良处理方法一般分为原位和异位修复处理方法。异位修复处理方法需要清淤并异地处理，存在着工程实施困难、成本高昂、易引起二次污染等问题，因此原位修复技术成为人们治理水体底泥污染的首选方法。水产养殖中底泥的原位改良和修复技术主要有：传统的产前干塘爆嗮改良、原位化学处理技术和原位生物修复技术。近年来，在集约化养殖污染排放问题及优质水资源匮乏问题的双重夹击下，干塘爆嗮改良方法面临节水减排的环保压力，已难以大面积持续使用。原位化学处理技术需要引入絮凝、氧化类化学物质，如铁铝絮凝氧化物等，仅对有害物质进行吸附，治标不治本，没有从根本上消除底泥中有害物质，持续时间短，一旦吸附作用消失极容易反弹，引入的化学物质也容易引起重金属污染，对生态系统存在潜在的威胁，难以满足水产养殖在产前产中对底泥原位生态处理的高度需求。因此，原位生物修复技术模拟自然物质循环，采用动植物尤其是微生物对污染底泥进行物质转化降解，以其绿色、无污染、成本低、易操作等优点成为近年来研究的热点。

微生物是自然界中的分解者，主要通过氧化、还原、水解等作用对有机物进行分解。在好氧条件下，能将有机污染物彻底氧化，分解成 CO₂、H₂O等无机物。在厌氧条件下，将有机物降解转化成小分子有机酸，CO₂、H₂、CH₄等。在养殖池塘中，底泥的矿化减量主要由微生物完成，即在微生物的作用下，水体底泥沉积物中的有机质通过不断的腐殖化及矿化过程，从而实现底泥的减量，促进水体物质与能量循环，发挥调节养殖水体生态环境的重要作用。

目前国内在利用微生物对养殖池塘底泥进行修复改良方面的研究工作已起步，涂玮灵等﹙环境工程2015.10﹚采用反硝化菌制剂修复黑臭水体和底泥。结果表明，当反硝化细菌投加量为0.5g/m³时，6周后，底泥厚度削减3.43cm，形成0.7cm 的表层氧化层，底泥有机质降解率 13.6%，且生物降解能力显著提高。马加军等﹙CN105505810A﹚公开了一种复合微生物底改颗粒，达到提高池塘底质有益微生物优势群落，同时分解底质中的有机物，降解氨氮、亚硝酸盐、硫化氢等各种有害物质。邹国忠等﹙CN109430579A﹚公开了一种EM菌钙镁复合微生态制剂，该微生态制剂可高效分解池塘有机污染物，提高虾蟹等水生甲壳动物对钙、镁、磷的吸收，快速促使虾蟹甲壳硬化；能明显改善虾蟹品质，促进虾蟹增重，有效提高养殖成活率。上述研究结果表明：微生物在有效降解养殖水体底泥中有机物含量，促进水产动物生长等方面具有积极的作用。

此外，由于养殖池塘底泥是一个污染汇集地，高污染负荷必然滋生各种病原菌和寄生虫，底泥中病原菌的数量远高于水体。因此，抑制底泥中病原菌的生长也是养殖池塘底泥微生物修复需要关注的重要方面。对病原菌具有拮抗作用的有益微生物，能够抑制水产病原菌的生长，减少养殖中化学药物的用量，克服了应用抗生素造成的菌群失调，二重感染和耐药性菌株增加等缺点。目前国内在微生物对水产养殖病原菌的抑制作用方面的研究处于刚起步阶段，张德锋等﹙CN108676756A﹚提供一种贝莱斯芽孢杆菌及其作为水产病原菌抑制剂的应用，该菌具有广谱拮抗水产常见病原菌功能，能有效抑制无乳链球菌、海豚链球菌、鰤鱼诺卡氏菌、嗜水气单胞菌、舒氏气单胞菌和迟缓爱德华氏菌等病原菌的生长。王世锋等﹙CN106906169A﹚公开了一种枯草芽孢杆菌HAINUP40及其应用，该菌对罗非鱼源致病性无乳链球菌、海豚链球菌、鳗弧菌、创伤弧菌、珊瑚肠弧菌、溶藻弧菌，黑海弧菌等病原菌具有明显的拮抗作用，同时能促进罗非鱼的生长，对养殖水体的净化也具有明显效果。

目前，常见的底泥改良用微生物以好氧的芽孢杆菌为主，以粉剂或颗粒的形式泼洒应用，应用时需要晴好天气配合，以防止芽孢杆菌好氧而造成池塘缺氧状况。异养的乳酸菌、光合细菌也可见在水产养殖中应用，但这两种微生物对环境敏感，容易失活，常见是以水剂形式应用，主要对水体水质进行调控，菌剂不容易保存，有效期短，使用成本较高，养殖应用效果不稳定。此外，单一菌群微生态制剂来改善底质存在一定局限性，相比之下，采用复合菌群能通过互利共生关系组成复杂而又相对稳定的微生态系统，发挥各种菌群的不同功能，通过协同作用有效地降低养殖底泥中的有害物质，从而改善池塘的生态环境。

因此，针对池塘底质的低氧环境条件，养殖池塘底质改良用微生物制剂创制的一个重要方向就是开发不消耗水产养殖溶氧，对水产病原菌有拮抗作用的多功能兼性厌氧的新型有益菌株，通过几种不同功能菌种的混合，复配出多功能全天候使用的微生物制剂，克服当前微生物底质改良剂投入品以好氧菌剂为主，菌种结构单一，使用条件局限，菌剂自身好氧导致养殖水体存在缺氧风险，实际应用效果不明显或不稳定等问题。

发明内容

本发明的目的是克服上述不足之处，提供一种具有水产病原菌拮抗特性的复合微生物底质改良剂的制备方法及其应用，其具有拮抗作用，能够修复池塘底质，改善养殖生态环境。

本发明的技术方案涉及两株菌株：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）AB90008-15、格氏乳杆菌（Lactobacillus gasseri）88。枯草芽孢杆菌已被列入农业部饲料添加剂品种目录（2013），格氏乳杆菌被卫生部批准作为益生菌在食品中应用，同时也被美国食品药品监督管理局（FDA）表列安全菌种之一。因此，本发明提供的两株菌株是能够应用于养殖动物的安全菌株。格氏乳杆菌88蛋白酶活力高，对含氮有机质的降解能力强，生长代谢不需要氧气，非严格厌氧菌，能够耐受水体微氧环境，沉入池底后不耗氧、不与水产动物争溶氧，可全天候使用，安全高效，目前格氏乳杆菌多应用于食品及医药卫生领域，尚无用于修复养殖池塘底质的专利报道；

枯草芽孢杆菌AB90008-15属于兼性好氧菌，在有氧及无氧环境下均能生长，克服了现有在池塘中应用的枯草芽孢杆菌单一好氧，容易出现快速消耗所在环境中的氧气，造成环境缺氧情况的发生，降低养殖风险。此外，本株枯草芽孢杆菌AB90008-15具有较强的分解纤维素的特性，能够有效降解底泥中的纤维素类含碳有机物，促进含碳有机质的矿化与腐殖化，实现养殖水体底质改良。这两株有益菌均可以在池塘水体底部和淤泥的低溶氧条件下生长，分解养殖水体底部的残饵、粪便、动植物尸体等含碳、含氮有机质，转化为浮游植物生长所需的营养盐类，促进水体营养物质的良性循环，防止有毒有害物质的蓄积，改善底质生态环境。此外，这两株菌在生长过程中均可产生抑菌物质，抑制池塘底部和水体病原微生物的增殖，具有一定预防疾病的作用。目前尚无此种类复合菌株协同修复养殖池塘底质、抑制病原菌方面的专利报道。

其生物材料样品保藏情况如下：

（1）枯草芽孢杆菌AB90008-15，分类命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期2019年10月15日，保藏号CGMCC NO.18684。

（2）格氏乳杆菌88，公开于申请号2019100266597，发明名称为一种具有水产病原菌拮抗特性的格氏乳杆菌制剂的制备及应用；其分类命名为格式乳杆菌（Lactobacillusgasseri），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期2018年12月19日，保藏编号：CGMCC No.17004。

本发明涉及的格氏乳杆菌菌株88，革兰氏阳性菌，镜检呈杆状，不产生孢子，该菌株属于非严格厌氧菌，生长温度范围广，20℃-45℃均能生长。在LB平板上菌落直径为0.5-1.0mm，形态规则，表面光滑、不透明、无色素。在MRS培养基上可得大量圆形、表面光滑、不透明、白色的菌落。菌株88，能够产生H₂S，色氨酸脱氨酶、乙酰甲基甲醇，能发酵葡萄糖、甘露醇、蔗糖、苦杏仁甙、半乳糖、果糖、N-乙酰-葡糖胺、熊果甙、苦杏仁甙、七叶灵、柳醇、纤维二糖、麦芽糖、乳糖、蜜二糖、海藻糖、拢牛儿糖、D-塔格糖。格氏乳杆菌88菌株的16S rRNA 基因序列，长度为1459bp，具体如SEQ ID NO.1所示。

本发明涉及的枯草芽孢杆菌AB90008-15，革兰氏阳性菌，镜检呈杆状，内生孢子0.8×1.5-1.8µm，该菌株兼性好氧菌，生长温度范围广，20℃-45℃均能生长良好。洋菜培养基上菌落圆或不规则形，表面色暗，不透明，奶油色或褐色。其生化特性为：能水解七叶灵、明胶，产生β-半乳糖甙酶，硝酸盐还原为阳性，能同化苹果酸、柠檬酸、丙乙酸，能利用L-阿拉伯糖、核糖、D-木糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、甘露醇、肌醇、山梨醇、α-甲基-D-葡萄糖甙、苦杏仁甙、七叶灵、麦芽糖、蜜二糖、蔗糖、海藻糖、菊糖、棉子糖、淀粉、糖原。不能利用赤癣醇、D-阿拉伯糖、L-木糖、阿东醇、β-甲基-D-木糖甙、半乳糖、山梨糖、鼠李糖、卫茅醇、α-甲基-D-甘露糖甙、N-乙酰-葡糖胺、熊果甙、柳醇、纤维二糖、乳糖、松叁糖、木糖醇、拢牛儿糖、D-松二塘、D-来苏糖、D-塔格糖、D-岩糖、D-阿拉伯糖醇、L-阿拉伯糖醇、葡萄糖酸盐、2-酮基-葡萄糖酸盐、5-酮基-葡萄糖酸盐。枯草芽孢杆菌AB90008-15的16S rRNA基因序列，16SrRNA 基因长度为1473bp，具体如SEQ ID NO.2所示。

本发明涉及的格氏乳杆菌菌株88、枯草芽孢杆菌AB90008-15均属于兼性厌氧菌，沉入池底后不耗氧、不与水产动物争溶氧，可全天候使用，安全高效。同时，在淡水养殖中枯草芽孢杆菌对嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、维氏气单胞菌、豚鼠气单胞菌、爱德华氏菌有广谱拮抗作用，格氏乳杆菌对鳗利斯顿氏菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌、豚鼠气单胞菌的抑制效果显著。两菌株在水体中拮抗致病菌的种类不同，将两菌株配合使用，能在一定程度上拓宽单一菌株拮抗致病菌的种类，起到广谱拮抗的效果。同时，枯草芽孢杆菌AB90008-15具有较强的分解纤维素的特性，能够有效降解底泥中的纤维素，促进含碳有机质矿化与腐殖化，实现养殖水体底质改良。因此，将这两株菌株复配得到的复合微生物底质改良剂是一种新型的多功能微生物制剂。

所述菌株制备具有水产病原菌拮抗特性的底质改良剂的方法，步骤如下：

（1）菌种活化：

无菌开启格氏乳杆菌88、枯草芽孢杆菌AB90008-15的冻干保藏菌种，分别接种于装有MRS肉汤的试管、麸皮营养琼脂试管斜面，于34-38℃静置培养24-48h，然后分别转接于MRS肉汤三角瓶、麸皮营养琼脂茄子瓶斜面，34-38℃培养24-48h。反复活化2-3次，镜检，计数，当格氏乳杆菌88菌体浓度﹥10⁸CFU/mL，枯草芽孢杆菌AB90008-15 90%以上菌体形成芽孢时，即为成熟。作为种子液；

MRS肉汤培养基组成以g/L计：酪蛋白酶消化物 10，牛肉膏粉 10，酵母膏粉 4，柠檬酸三铵 2，乙酸钠 5，硫酸镁 0.2，硫酸锰 0.05，磷酸氢二钾 2，葡萄糖 20，吐温-801.08，以蒸馏水定容配制，pH 5.7±0.2。

麸皮营养琼脂斜面培养基组成以g/L计：蛋白胨 10，牛肉膏3，NaCl 5,麸皮10，琼脂 15-20，以蒸馏水水定容配制，pH 7.0-7.2。

（2）发酵培养：

1、格氏乳杆菌88发酵培养：

一级培养：将步骤（1）所得种子液以体积比1%-10%接种量接入装有一级发酵培养基的100L发酵罐中，发酵罐装液量为体积比70%-80%，厌氧静置培养，34-38℃恒温培养24-48h，得到一级培养发酵液；

一级发酵培养基组成以g/L计：蛋白胨15，酵母膏4，葡萄糖30，吐温-80 1，柠檬酸三铵2，碳酸钙10，磷酸氢二钾2，乙酸钠5，七水硫酸镁0.2。以自来水定容配制，pH6.0±0.2。

二级培养：将一级培养发酵液作为种子液以体积比1%-5%接种量接入装有二级发酵培养基的2000L发酵罐中，发酵罐装液量为体积比70%-80%，厌氧静置培养，34-38℃恒温培养24-48h，当发酵液pH降至4.0-5.0,培养结束，得到发酵液；

二级发酵培养基组成以g/L计：红糖15-25，酵母膏0.5-1.0，KH₂PO₄0.5-1.0，以自来水定容配制，pH 6.5-7.0。

2、枯草芽孢杆菌AB90008-15发酵培养：

将步骤（1）所得种子菌悬液以体积比1%-10%接种量接入装有发酵培养基的2000L发酵罐中，发酵罐装液量为体积比50%-60%，转速为80-120rpm，通气量40-60m³/h, 30-37℃发酵培养20-24h，得到发酵液；

发酵培养基组成以g/L计：麸皮 10-50，以自来水定容配制，pH 7.0。

（3）具有水产病原菌拮抗特性的复合微生物底质改良剂的制备及应用：

将步骤（2）所得发酵液经6000-10000rpm高速离心收集湿菌体，枯草芽孢杆菌AB90008-15湿菌体:格氏乳杆菌湿菌体88:海藻酸钠:淀粉:沸石粉以质量比1:1:2-5:1-2:1-3进行混合，通过在45-60℃真空干燥18-20h，粉碎机粉碎，过0.9mm筛，获得复合微生物底质改良剂；获得的底质改良剂的菌浓度不低于5.0×10⁸ CFU/g。

用所述方法制备的复合微生物底质改良剂：用作水产养殖底质改良剂，按50-100g/亩•米的用量全池泼洒。

（4）抑菌性测定：

将无菌滤纸片在浓度约为10⁶CFU/mL枯草芽孢杆菌AB90008-15新鲜培养液中浸泡1.0 h。取浓度约10⁸CFU/mL的水产养殖中常见致病菌嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、维氏气单胞菌、豚鼠气单胞菌、鳗利斯顿氏菌、爱德华氏菌、副溶血性弧菌、大肠杆菌、溶藻弧菌的液体培养液0.1 mL，分别涂布于LB琼脂培养基平皿上，然后将浸泡过菌液的滤纸片贴于培养皿上，每个平皿贴3片，每个平皿做3个重复。平皿置于25-30℃培养箱中24、48 h，测量抑菌圈大小。

（5）将致病菌与格氏乳杆菌88菌液共同接入MRS肉汤培养基中，使培养基中格氏乳杆菌88和致病菌的起始菌浓度均为10⁶CFU/mL，35℃静置培养48h，于0h、24h、48h取样计数，观察格氏乳杆菌88对致病菌的拮抗作用，致病菌计数使用LB（添加5µg/mL阿莫西林）培养基，格氏乳杆菌88计数使用MRS（pH调至5.5）培养基。

（6）枯草芽孢杆菌AB90008-15降解纤维素的测定：

将枯草芽孢杆菌AB90008-15点种于纤维素培养基，在平板上出现透明圈即表明该菌株具有产纤维素酶的能力。用公式Up=(D/d)²来表示水解能力的大小，D为透明圈直径（mm），d为菌落直径（mm）；

纤维素培养基（g/L）：K₂HPO₄0.50，MgSO₄·7H₂O 0.25，CMC-Na 1.88 ，刚果红0.20，琼脂16.00 ，明胶2.00，pH7.0。

本发明的有益效果：本发明制备的复合微生物底质改良剂由能够厌氧生长的枯草芽孢杆菌AB90008-15和兼性厌氧的格氏乳杆菌88经包埋制备的复合活性制剂，能够全天候使用的，不存在降低养殖水体溶氧水平问题。该菌剂克服了当前微生物底质改良剂投入品以好氧菌剂为主，耗氧生长而极易产生养殖水体缺氧风险，使用条件局限，常需要晴好天气条件配合，实际应用效果不明显或不稳定等问题。

复合微生物底质改良剂对水产常见病原菌具有广谱拮抗特性，其中枯草芽孢杆菌对嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、维氏气单胞菌、豚鼠气单胞菌、爱德华氏菌有广谱拮抗作用，格氏乳杆菌88对爱德华氏菌、副溶血性弧菌、大肠杆菌、溶藻弧菌、嗜水气单胞菌的抑制效果显著。格氏乳杆菌88与枯草芽孢杆菌AB90008-15的组合，拓宽并增强了复合制剂对水产常见病原菌的抗菌能力，从而确保复合微生物底质改良剂能够有效防控由病原菌引发的水产养殖动物病害，保护水生动物健康生长。

枯草芽孢杆菌AB90008-15和格氏乳杆菌88营养要求均非常简单，格氏乳杆菌88经过驯化筛选，其规模化培养基仅需红糖、酵母膏等简单组分，耐氧，非严格厌氧培养，与其它乳酸杆菌培养条件相比简单易操作，发酵成本低。枯草芽孢杆菌的发酵原料仅为麸皮，十分廉价且发酵技术十分成熟，规模化扩培成本低。菌剂采样包埋技术，不仅提高了格氏乳杆菌及枯草芽孢杆菌在干燥过程中的存活率，提高了复合菌剂的活性和有效期，而且使菌剂能够常温运输及保存，降低使用成本，便于推广应用。

复合微生物底质改良剂能够降解底泥中含碳有机物、含氮有机物，促进底泥矿化，降低养殖水体COD、氨氮、亚硝酸盐、总磷、总氮的含量，促进水体营养物质的良性循环，防止有毒有害物质的蓄积，改善养殖底质生态环境。

生物材料样品保藏：一株枯草芽孢杆菌AB90008-15，分类命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期2019年10月15日，保藏编号CGMCC NO.18684。

附图说明

图1是菌株格氏乳杆菌88采用邻接法构建的菌株分子发育树示意图。

图2是菌株枯草芽孢杆菌AB90008-15采用邻接法构建的菌株分子发育树示意图。

具体实施方式

实施例1：菌种的筛选

（1）格氏乳杆菌的筛选：在无锡鹅湖养殖池塘采集异育银鲫样品，将鱼体解剖取肠道，加入生理盐水，研磨制成匀浆液，取移液枪吸取0.1mL于MRS固体培养基上，涂布，再覆盖一层MRS培养基，37℃培养。根据菌落大小选取生长良好的菌落反复接种筛选，直至得到均匀的单个菌落，命名为88。

（2）枯草芽孢杆菌的筛选：样品采集于无锡鹅湖青鱼池塘，称取池塘底泥10 g于装有90 ml无菌水及少量玻璃珠的250 ml三角瓶中，振荡30 min，静置。取上清，接种于分离培养基中，37℃培养7天。每个样品吸取1.0 mL，80℃加热10 min，取移液枪吸取0.1 mL于基础培养基上，涂布，37 ℃培养。挑取单菌反复划线纯化3次，待长出菌落后，随机挑选菌落并纯化，编号为AB90008-15。

分离培养基组成为（g/L）：麸皮10g、玉米浆干粉10g、NaCl 5g，pH 7.0。基础培养基为BPY培养基，组成为（g/L）：葡萄糖5g，蛋白胨1g，牛肉膏5g，NaCl 5g，pH 7.0。

实施例2：菌种鉴定

（1）形态特征：

菌株88，革兰氏阳性菌，镜检呈球状，不产生孢子，该菌株属于非严格厌氧菌，生长温度范围广，20℃-45℃均能生长。在LB平板上菌落直径为0.5-1.0mm，形态规则，表面光滑、不透明、无色素。在MRS培养基上可得大量圆形、表面光滑、不透明、白色的菌落。

菌株AB90008-15，革兰氏阳性菌，镜检呈杆状，内生孢子0.8×1.5-1.8µm，洋菜培养基上菌落圆或不规则形，表面色暗，不透明，奶油色或褐色。

（2）生化特性：

菌株88，能够产生H₂S，色氨酸脱氨酶、乙酰甲基甲醇，能发酵葡萄糖、甘露醇、蔗糖、苦杏仁甙、半乳糖、果糖、N-乙酰-葡糖胺、熊果甙、苦杏仁甙、七叶灵、柳醇、纤维二糖、麦芽糖、乳糖、蜜二糖、海藻糖、拢牛儿糖、D-塔格糖。

菌株AB90008-15，能水解七叶灵、明胶，产生β-半乳糖甙酶，硝酸盐还原为阳性，能同化苹果酸、柠檬酸、丙乙酸，能利用L-阿拉伯糖、核糖、D-木糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、甘露醇、肌醇、山梨醇、α-甲基-D-葡萄糖甙、苦杏仁甙、七叶灵、麦芽糖、蜜二糖、蔗糖、海藻糖、菊糖、棉子糖、淀粉、糖原。不能利用赤癣醇、D-阿拉伯糖、L-木糖、阿东醇、β-甲基-D-木糖甙、半乳糖、山梨糖、鼠李糖、卫茅醇、α-甲基-D-甘露糖甙、N-乙酰-葡糖胺、熊果甙、柳醇、纤维二糖、乳糖、松叁糖、木糖醇、拢牛儿糖、D-松二塘、D-来苏糖、D-塔格糖、D-岩糖、D-阿拉伯糖醇、L-阿拉伯糖醇、葡萄糖酸盐、2-酮基-葡萄糖酸盐、

5-酮基-葡萄糖酸盐。

（3）16S rRNA序列分析和系统发育树的构建：

菌株88的16S rRNA基因序列，16S rRNA 基因长度为1459bp，如SEQ ID NO.1所示；菌株AB90008-15的16S rRNA基因序列，16S rRNA 基因长度为1473bp，如SEQ ID NO.2所示；与从GenBank中已知的核酸序列进行Blast分析，挑选同源性较高的序列在Cluster X软件完成序列比对，比对结束后使用MEGA 4.1软件构建系统发育树。

菌株88基因序列测序结果：将菌株所扩增的16S rRNA基因序列在NCBI通过Blast进行同源性检索，结果检索出为乳杆菌属的16S rRNA基因序列，采用邻接法构建菌株分子发育树，分离菌株在系统发育树上与格氏乳杆菌（Lactobacillus gasseri ATCC 33323）(登录号：CP000413)属同一支（见图1）。结合形态学和生理生化特征将所分离菌株鉴定为格氏乳杆菌。

菌株AB90008-15基因序列测序结果：将菌株所扩增的16S rRNA基因序列在NCBI通过Blast进行同源性检索，采用邻接法构建菌株分子发育树，分离菌株在系统发育树上与枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis subsp.stercoris D7XPN1）(登录号：JHCA01000027)属同一支（见图2）。结合形态学和生理生化特征将所分离菌株鉴定为枯草芽孢杆菌。

实施例3：枯草芽孢杆菌AB90008-15抑菌性测定

将无菌滤纸片在浓度约为10⁶CFU/mL枯草芽孢杆菌新鲜培养液中浸泡1.0 h。取浓度约10⁸CFU/mL的水产养殖中常见致病菌嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、维氏气单胞菌、豚鼠气单胞菌、爱德华氏菌、副溶血性弧菌、大肠杆菌、溶藻弧菌的液体培养液0.1 mL，分别涂布于LB琼脂培养基平皿上，然后将浸泡过菌液的滤纸片贴于培养皿上，每个平皿贴3片，每个平皿做3个重复。平皿置于25-30℃培养箱中24、48 h，测量抑菌圈大小。测定结果如表1所示：

表1枯草芽孢杆菌AB90008-15抑菌性测定结果(抑菌圈直径：mm)

注：“-”表示无抑菌圈，纸片直径为7.00 mm。

枯草芽孢杆菌AB90008-15对嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、维氏气单胞菌、豚鼠气单胞菌、爱德华氏菌均具有一定的抑制作用，其中对温和气单胞菌和豚鼠气单胞菌的抑制效果较显著。对溶藻弧菌、大肠杆菌、副溶血性弧菌无明显抑制作用。

实施例4：格氏乳杆菌88抑菌性测定

将致病菌与格氏乳杆菌88菌液共同接入MRS肉汤培养基中，使培养基中格氏乳杆菌和致病菌的起始菌浓度均为10⁶CFU/mL，35℃静置培养48h，于0h、24h、48h取样计数，观察格氏乳杆菌对致病菌的拮抗作用，致病菌计数使用LB（添加5µg/mL阿莫西林）培养基，格氏乳杆菌计数使用MRS（pH调至5.5）培养基。测定结果如表2所示：

表2 格氏乳杆菌与致病菌的共培养测定结果(CFU/mL)

由表2可知，低浓度（9.5E+05）的格氏乳杆菌88对高浓度的不同种类的致病菌生长均能起到一定的抑制作用。共培养至24h，格氏乳杆菌88对鳗利斯顿氏菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌、豚鼠气单胞菌的抑制效果显著。共培养至48h，格氏乳杆菌88菌浓虽然较24h有所下降，但仍能够显著抑制致病菌的生长，至培养后期，致病菌菌浓均大幅降低。

实施例5：枯草芽孢杆菌AB90008-15降解纤维素的测定：

表3 枯草芽孢杆菌产纤维素酶特性测定结果

注：纸片直径为0.6cm。

从表3结果可看出，枯草芽孢杆菌AB90008-15具有较强的纤维素酶活性，能够有效降解底泥中的纤维素。

实施例6：复合微生物底质改良剂的制备

（1）菌种活化：无菌开启格氏乳杆菌88、枯草芽孢杆菌AB90008-15的冻干保藏菌种，分别接种于装有MRS肉汤的试管、麸皮营养琼脂斜面试管，于34-38℃静置培养24-48h，然后分别转接于MRS肉汤三角瓶、麸皮营养琼脂斜面茄子瓶，34-38℃培养24-48h。反复活化2-3次，镜检，计数，当格氏乳杆菌菌体浓度﹥10⁸CFU/mL,枯草芽孢杆菌AB90008-15 90%以上菌体形成芽孢时，即为成熟。作为种子液；

麸皮营养琼脂斜面培养基组成以g/L计：蛋白胨 10，牛肉膏3，NaCl 5,麸皮10，琼脂 15-20，以蒸馏水定容配制，pH 7.0-7.2。

（2）发酵培养：

ⅰ、格氏乳杆菌88发酵培养：

ⅱ、枯草芽孢杆菌AB90008-15发酵培养：将步骤（1）所得种子菌悬液以体积比1%-10%接种量接入装有装有发酵培养基的2000L发酵罐中，发酵罐装液量为体积比50%-60%，通气量50m³/h 转速为100 rpm，30-37℃恒温振荡培养24h，得到发酵液；

（3）具有水产病原菌拮抗特性的复合微生物底质改良剂的制备：将步骤（2）所得发酵液经6000rpm高速离心收集湿菌体，枯草芽孢杆菌湿菌体:格氏乳杆菌湿菌体:海藻酸钠:淀粉:沸石粉以质量比1:1:4:1:1进行混合，通过在45-60℃真空干燥18-20h,粉碎机粉碎，过0.9mm筛，获得复合微生物底质改良剂；获得的底质改良剂的菌浓度不低于5.0×10⁸个（CFU）/克。

实施例7：复合微生物底质改良剂净化底质方面的应用

随机选取养殖青鱼池塘6个，3个为试验组，3个为对照组。池塘水面积均为20亩，平均水深1米，试验池晴天巡塘时泼洒复合微生物底质改良剂，50-100g/亩·米，每隔5天使用1次，对照池不添加菌剂，试验周期为30天。试验结束后检测水体和底泥的各项理化指标。

表4 复合微生物底质改良剂对养殖青鱼池塘底质和水体的影响

注：同一行数据中有不同字母表示差异显著 ( P<0.05)。

从表4中可以看出，试验组各项底质指标较试验前均显著降低（P<0.05），且明显低于对照组(P<0.05)。同时，试验组水体中COD、氨氮、亚硝酸盐含量较试验前均显著降低（P<0.05），并且显著低于对照组(P<0.05)；总磷、总氮含量较试验前无显著差异（P>0.05），但显著低于对照组(P<0.05)。因此，通过结果可以说明复合微生物底质改良剂能够有效降低底质中的污染物含量，改善养殖底泥环境和上覆水水质，能够作为底质和水体净化剂应用于水产养殖。

序列表

<110> 江苏省苏微微生物研究有限公司

<120> 一种具有水产病原菌拮抗特性的复合微生物底质改良剂的制备方法及其应用

<141> 2019-11-15

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1459

<212> DNA

<213> 格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)

<400> 1

gtgctataca tgcagtcgag cgagcttgcc tagatgaatt tggtgcttgc accaaatgaa 60

actagataca agcgagcggc ggacgggtga gtaacacgtg ggtaacctgc ccaagagact 120

gggataacac ctggaaacag atgctaatac cggataacaa cactagacgc atgtctagag 180

tttaaaagat ggttctgcta tcactcttgg atggacctgc ggtgcattaa ctagttggta 240

aggtaacggc ttaccaaggc aatgatgcat agccgaattg aaagactgat cggccacatt 300

gggactgaaa cacggcccaa actcctacgg gaggcagcag tagggaatct tccacaatgg 360

acgcaagtct gatggagcaa cgccgcgtga gtgaagaagg gtttcggctc gtaaagctct 420

gttggtagtg aagaaagata gaggtagtaa ctggccttta tttgacggta attacttaaa 480

aagtcacggc taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg taagtggcaa gcgttgtccg 540

gatttattgg gcgtaaagcg agtgcaggcg gttcaataag tctgatgtga aagccttcgg 600

ctcaaccgga gaattgcatc agaaactgtt gaacttgagt gcagaagaag agagtggaac 660

tccatgtgta gcggtggaat gcgtagatat atggaagaac accagtggcg aaggcggctc 720

tctggtctgc aactgacgct gaggctcgaa agcatgggta gcgaacagga ttagataccc 780

tggtagtcca tgccgtaaac gatgagtgct aagtgttggg aggtttccgc ctctcagtgc 840

tgcagctaac gcattaagca ctccgcctgg ggagtacgac cgcaaggttg aaactcaaag 900

gaattgacgg gggcccgcac aagcggtgga gcatgtggtt taattcgaag caacgcgaag 960

aaccttacca ggtcttgaca tccagtgcaa acctaagaga ttaggagttc ccttcgggga 1020

cgctgagaca ggtggtgcat ggctgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc 1080

ccgcaacgag cgcaaccctt gtcattagtt gccatcatta agttgggcac tctaatgaga 1140

ctgccggtga caaaccggag gaaggtgggg atgacgtcaa gtcatcatgc cccttatgac 1200

ctgggctaca cacgtgctac aatggacggt acaacgagaa gcgaacctgc gaaggcaagc 1260

ggatctctga aagccgttct cagttcggac tgtaggctgc aactcgccta cacgaagctg 1320

gaatcgctag taatcgcgga tcagcacgcc gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac 1380

accgcccgtc acaccatgag agtctgtaac acccaaagcc ggtgggataa cctttatagg 1440

agtcagccgt ctaagtaga 1459

<210> 2

<211> 1473

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400> 2

tgcgcgtcta tacatgcagt cgagcggaca gatgggagct tgctccctga tgttagcggc 60

ggacgggtga gtaacacgtg ggtaacctgc ctgtaagact gggataactc cgggaaaccg 120

gggctaatac cggatggttg tttgaaccgc atggttcaaa cataaaaggt ggcttcggct 180

accacttaca gatggacccg cggcgcatta gctagttggt gaggtaacgg ctcaccaagg 240

cgacgatgcg tagccgacct gagagggtga tcggccacac tgggactgag acacggccca 300

gactcctacg ggaggcagca gtagggaatc ttccgcaatg gacgaaagtc tgacggagca 360

acgccgcgtg agtgatgaag gttttcggat cgtaaagctc tgttgttagg gaagaacaag 420

taccgttcga atagggcggt accttgacgg tacctaacca gaaagccacg gctaactacg 480

tgccagcagc cgcggtaata cgtaggtggc aagcgttgtc cggaattatt gggcgtaaag 540

ggctcgcagg cggtttctta agtctgatgt gaaagccccc ggctcaaccg gggagggtca 600

ttggaaactg gggaacttga gtgcagaaga ggagagtgga attccacgtg tagcggtgaa 660

atgcgtagag atgtggagga acaccagtgg cgaaggcgac tctctggtct gtaactgacg 720

ctgaggagcg aaagcgtggg gagcgaacag gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa 780

acgatgagtg ctaagtgtta gggggtttcc gccccttagt gctgcagcta acgcattaag 840

cactccgcct ggggagtacg gtcgcaagac tgaaactcaa aggaattgac gggggcccgc 900

acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga agcaacgcga agaaccttac caggtcttga 960

catcctctga caatcctaga gataggacgt ccccttcggg ggcagagtga caggtggtgc 1020

atggttgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc 1080

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agagtttgta acacccgaag tcggtgaggt aaccttttag gagccagccg ccgaaggtgg 1440

gacagatgat tggggtgaag tcgtaacaag agc 1473

Claims

1.一株枯草芽孢杆菌AB90008-15，分类命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期2019年10月15日，保藏编号CGMCC NO.18684。

2.根据权利要求1所述枯草芽孢杆菌，其特征是：所述菌株的16S rRNA基因序列，长度为1473bp，具体如SEQ ID NO.2所示。

3.一种具有水产病原菌拮抗特性的复合微生物底质改良剂的制备方法，其特征是步骤如下：

（1）菌种活化：无菌开启格氏乳杆菌88、保藏编号CGMCC NO.18684的枯草芽孢杆菌AB90008-15的冻干保藏菌种，分别接种于装有MRS肉汤的试管、麸皮营养琼脂斜面试管，于34-38℃静置培养24-48h，然后分别转接于MRS肉汤三角瓶、麸皮营养琼脂斜面茄子瓶，34-38℃培养24-48h；反复活化2-3次，镜检，计数，当格氏乳杆菌88菌体浓度﹥10⁸CFU/mL,枯草芽孢杆菌AB90008-15 90%以上菌体形成芽孢时，即为成熟，作为种子液；

所述MRS肉汤培养基组成以g/L计：酪蛋白酶消化物 10，牛肉膏粉 10，酵母膏粉 4，柠檬酸三铵 2，乙酸钠 5，硫酸镁 0.2，硫酸锰 0.05，磷酸氢二钾 2，葡萄糖 20，吐温-801.08，以蒸馏水定容配制，pH 5.7±0.2；

麸皮营养琼脂斜面培养基组成以g/L计：蛋白胨 10，牛肉膏3，NaCl 5，麸皮10，琼脂15-20，以蒸馏水定容配制，pH 7.0-7.2；

（2）发酵培养：

ⅰ、格氏乳杆菌88发酵培养：

a、一级培养：将步骤（1）所得种子液以体积比1%-10%接种量接入装有一级发酵培养基的100L发酵罐中，发酵罐装液量为体积比70%-80%，厌氧静置培养，34-38℃恒温培养24-48h，得到一级培养发酵液；

b、二级培养：将一级培养发酵液作为种子液以体积比1%-5%接种量接入装有二级发酵培养基的2000L发酵罐中，发酵罐装液量为体积比70%-80%，厌氧静置培养，34-38℃恒温培养24-48h，当发酵液pH降至4.0-5.0培养结束，得到发酵液；

ⅱ、枯草芽孢杆菌AB90008-15发酵培养：将步骤（1）所得种子菌悬液以体积比1%-10%接种量接入装有发酵培养基的2000L发酵罐中，发酵罐装液量为体积比50%-60%，转速为80-120 rpm，通气量40-60m³/h，30-37℃发酵培养20-24h，得到发酵液；

格氏乳杆菌88发酵培养的一级发酵培养基组成以g/L计：蛋白胨15，酵母膏4，葡萄糖30，吐温-80 1，柠檬酸三铵2，碳酸钙10，磷酸氢二钾2，乙酸钠5，七水硫酸镁0.2；

以水定容配制，pH6.0±0.2；

二级发酵培养基组成以g/L计：红糖15-25，酵母膏0.5-1.0，KH₂PO₄0.5-1.0，以水定容配制，pH 6.5-7.0；

枯草芽孢杆菌AB90008-15发酵培养基组成以g/L计：麸皮 50，以水定容配制，pH 7.0；

（3）具有水产病原菌拮抗特性的复合微生物底质改良剂的制备：将步骤（2）所得发酵液经6000rpm-10000rpm离心收集湿菌体，枯草芽孢杆菌AB90008-15湿菌体:格氏乳杆菌88湿菌体:海藻酸钠:淀粉:沸石粉以质量比1:1:2-5:1-2:1-3进行混合，通过在45-60℃真空干燥、粉碎获得复合微生物底质改良剂；获得的底质改良剂的菌浓度不低于5.0×10⁸ CFU/g。

4.权利要求3制备所得具有水产病原菌拮抗特性的复合微生物底改良剂的应用，其特征是：将其用作水产养殖底质改良剂，按50-100g/亩•米的用量全池泼洒。