CN105331552B - 一株高效脱氮不动杆菌新种及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株高效脱氮不动杆菌新种及其应用。不动杆菌Acinetobacterguangzhouens is YZS‑X1‑1于2014年8月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO. M 2014369。该菌具有较好的脱氮能力，能够有效去除氨氮及亚硝酸盐氮，从而保护环境。进一步可以用于制作生物脱氮菌剂。

Description

一株高效脱氮不动杆菌新种及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种具有脱氮能力的不动杆菌（Acinetobacter）属细菌新种。

背景技术

氮素是水体污染中的一项重要污染物。其主要以有机氮和无机氮两种形式存在，有机氮包括如蛋白质、氨基酸、尿素等；无机氮主要有氨氮、硝酸盐氮和亚硝酸盐氮。近年来，随着氮肥的使用及高密度水产养殖的发展，虽然带来巨大经济效益，同时也造成了严重的环境问题。

池塘养殖在我国水产养殖体系中占有重要位置，其中2009年我国淡水池塘养殖面积达到了淡水养殖总面积的42.99%。与此同时，养殖池塘系统也是水体系统中比较特殊的类型，因为它必须有人为地大量外源性氮、磷等营养物质的投入，这样就改变了自然状态下系统中氮、磷等元素的输入输出组成，使得其表现一些特有的规律性特征。特别是近年来，随着鱼类配合饲料的广泛应用，养殖密度越来越大，养殖产量不断提高，大量残余饵料和鱼类粪便变成悬浮有机物质或沉降于池塘底部中，从而带来了一系列的问题：悬浮或沉积有机物中释放的N、P元素带来的池塘水体富营养化，有机物分解加剧水体溶解氧的消耗，有机物中N、S 等元素在特定的环境下变为对养殖对象有毒有害的亚硝酸盐氨氮和硫化氢等化合物。所有这些或者直接造成了鱼类的死亡或者降低了鱼类的免疫力造成鱼病的发生。尤其是大雨过后，亚硝酸盐含量极其容易超标，由此造成的水产养殖动物病害甚至死亡现象已多见报道。如在对虾养殖中，亚硝酸盐含量超过0.1ppm 达到0.3ppm 以上时，很容易造成对虾中毒，且不易抢救。目前对这种污染问题的处理主要包括：物理、化学和生物（植物及硝化菌、光合菌等微生物）等治理技术。其中生物脱氮工艺简单，对环境负荷小，脱氮更彻底。目前自然界生物脱氮技术有自养硝化和异养硝化两种。传统的自养硝化作用速率低、硝化过程和反硝化因子的复杂，运作非常困难。近年来，具有异养硝化作用和需氧反硝化作用的功能细菌被作为生物脱氮系统中潜在的微生物群而成为现代生物脱氮技术研究热点。Hu和Kuang 报 道 从ABS 废水处理系统中分离得到一株不动杆菌，这是第一株在异养硝化领域中的不动 杆 菌 属 微 生 物，但 未 对 该 菌 株 作 进 一 步 鉴定；孔庆鑫通过极限稀释的方法获得一株去除氨氮效果较好的不动杆菌Acinetobacter.sp.YY-5 ，该菌株鉴定为鲍 曼 不 动 杆 菌(Acinetobacter baumannii)。研究者们在近二十年的时间，分离出多株具 有 异 养 硝 化 的 细 菌，其 中 不动杆菌的数量较少，尚在研究的初级阶段。

发明内容

本发明的目的在于提供一株具有脱氮功能的不动杆菌属细菌新种，该菌具有被开发为脱氮微生物菌剂的潜能，对于解决水产养殖水体亚硝酸盐氨氮超标等富营养化问题，具有良好的应用前景。

不动杆菌YZS-X1-1（Acinetobacterguangzhouensis YZS-X1-1）是从广东省广州市南沙区淡水池塘底泥中中分离获得的一株革兰氏阴性细菌，已于2014年8月6日在中 国典 型 培 养 物 保 藏 中 心保藏，保藏地址：中国，武汉，武汉大学，邮编：430072。保藏编号为CCTCC NO. M 2014369。

该菌株的形态特征、培养特性、16S rRNA 基因序列和菌种分类结果如下：

1、形态特征：菌株YZS-X1-1在30℃下，LB培养基上培养16h 后，生长为黄色的圆形菌落，菌落边缘整齐，表面湿润光滑；通过革兰氏染色后在显微镜下，菌体呈短杆状。

2、菌株YZS-X1-1的生物学特性：菌株在Nacl盐浓度为0到3%都能生长；菌株YZS-X1-1 在LB固体培养基上，10 ℃～37 ℃的温度条件下均可生长，其中30℃为其最适生长温度。该菌株的主要生理生化特性如碳源利用、产酶能力结果如表1，表2所示。

3、菌株的基因序列特征：测序所得菌株YZS-X1-1的16S rRNA 基因、gyrB 基因、rpoB部分序列如序列表所示，利用EzBioCloud Identify进行比对分析发现，菌株YZS-X1-1的16S rRNA 基因与 EzTaxon public database中模式菌株对应序列相似度最高的为Acinetobacter indicus CIP 110367T， 在序列覆盖率100% 的条件下，序列相似度为96.75%。新菌YZS-X1-1的gyrB 基因序列与GenBank 数据库中已确定种名的模式菌株对应序列相似度最高为Acinetobacter lwoffii(85%)，其次是Acinetobacter schindleri(84%)；其rpoB基因的部分DNA 序列与GenBank 中Acinetobacter属已确定种名的模式菌株Acinetobacter schindleri对应序列的相似度最高（90%），与Acinetobacter属其他菌株相似度为86-88%不等。

本发明的高效脱氮不动杆菌YZS-X1-1具有较好的脱氮能力，能够有效去除氨氮及亚硝酸盐氮，从而保护环境。进一步可以用于制作生物脱氮菌剂。

附图说明

图1显示本发明不动杆菌新种菌株YZS-X1-1在光学显微镜下观察的细胞形态；

图2 显示本发明不动杆菌新种菌株YZS-X1-1的16S rRNA 基因构建的系统发育进化树；

图3显示本发明不动杆菌新种菌株YZS-X1-1的gyrB基因构建的系统发育树；

图4显示本发明不动杆菌新种菌株YZS-X1-1的rpoB基因构建的系统发育树；

图5、图6显示本发明不动杆菌新种菌株YZS-X1-1对氨氮、亚硝态氮去除效果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

实施例1不动杆菌新菌的获得

1.1配制如下培养基：

氨氧化培养基：NH₄Cl 0.382g、乙酸钠2g、MgSO₄•7H₂O 0.05g、K₂HPO₄ 0.2g、NaCl0.12g、MnSO₄•4H₂O 0.01g、FeSO₄ 0.01g、水定容至1000mL、pH7.2 ；

亚硝酸盐还原培养基： NaNO₂ 0.04928 g、葡萄糖 10 g、乙酸钠 1 g、 Na₂HPO₄ 3g、KH₂PO₄ 2 g、NaCl 3g、水1 L，pH7.2；固体培养基添加1.5%的琼脂。

筛选异养硝化细菌

1. 采集样品：实验中的样品采集于广东省广州市南沙区池塘底泥中。

微生物富集培养：

（1）取20mL 所采集的新鲜样品并加入至180 mL 的氨氧化培养基中，于30℃、180r/min 下富集培养3d 后，重复富集1 次得富集液，备用。

（2）分别取1ml 步骤（1）所得的富集液并分别进行梯度稀释，选用稀释度为10^-3，10^-4、10^-5；分别取0.1ml 所得的稀释液并分别均匀涂布于异养氨化培养基平板上，之后置于30℃生化培养箱内培养3d左右。

（3）挑取步骤（2）所得的单菌落转入新的亚硝酸盐还原培养基中在30 ℃、180r/min 的条件下恒温震荡培育，1 ～2d 后，取上清液5ml加至100ml 新鲜的亚硝酸盐还原培养基中相同条件下培养，如此反复5 次；每次逐渐提高培养液中NaNO₂ 的浓度，其中NaNO₂初始浓度为0.01g/L，然后提高至0.1g/L，0.5g/L、1g/L、1.5g/L，最终浓度为2g/L。

（4）将富集培养物通过多次平板划线分离纯化，获得具有高效降解氨氮和亚硝酸盐氮菌株，接种LB 斜面上，4℃冰箱中保存。

实施例2: 本发明新微生物的特征

2.1菌株形态学特征鉴定

取菌株YZS-X1-1 的单菌落，转接到LB 固体培养基（琼脂）上，于30℃恒温培养箱中培养24h、36h 和48h，分别观察其菌落的大小、颜色、边缘、凸起、光滑度、粘性、透明度等特点。结果显示，菌株YZS-X1-1在LB 固体培养基上形成边缘整齐，光滑，粘稠，表面光泽，不透明的菌落。在显微镜下制片观察，为短杆状，结果如图1 所示。

菌株的生理生化特征

挑取在LB固体培养基（琼脂）上培养24h 的新鲜培养物，进行生理 生化测试。结果显示，YZS-X1-1 为革兰氏阴性杆菌。

1、API 20NE 鉴定特征

利用法国梅里埃API20NE 标准鉴定系统测定菌株YZS-X1-1 利用碳源及产酸情况，API 20 NE试验条是由20个含干燥底物或培养基的小管所组成。

1）API 20NE AUX 培养基成分：（NH₄）₂SO₄ 2 g，琼脂 1.5 g，无机盐基础82.8 mg，氨基酸250 mg，维生素和营养物底物35.9 mg，磷酸缓冲液 0.04 M，加至1000 ml，最终pH：7.0-7.2。

NaCl 0.85% 培养基：NaCl 8.5 g，H₂O1000 ml。

2）在平板上培养菌株，以接种针从分离物的平板上挑取1-4分纯单个菌落至2mlNaCl 0.85% 培养基中，仔细研匀以达到均一的细菌悬液，所需浓度为0.5麦氏单位标准浊度。打开AUX培养基的安瓿管加入200ul(6到8滴)剩下的生理盐水菌悬液至安瓿，仔细混匀，但要避免有气泡产生。

3）盐水菌悬液和接种的AUX培养基分别加入相应的试验条小管，GLU， ADH和CIRE则用矿物油覆盖。

4）盖上培养盒，于30℃培养24小时后观察现象。

菌株YZS-X1-1与其相近不动杆菌利用碳水化合物的结果如表1 所示：

2、API ZYM鉴定特征

利用法国梅里埃API ZYM系统，可系统和快速地研究菌株YZS-X1-1产酶能力，APIZYM 试验条是由20个小管所组成，它的底部是一个专门设计含有酶底物和缓冲液的支持物。步骤如下：

1）用2 ml无菌蒸馏水挑新鲜细菌培养物制备一个菌悬液，其混浊度在McFarlandNo 5和No 6之间。

2）用吸管接种，于试验条的每个杯中接入2滴标本(65微升)。

3）接种后，于37℃培养箱培养4小时。

4）培养后，加1滴ZYM A 试剂和1滴ZYM B 试剂。观察颜色并记录结果

菌株YZS-X1-1与其相近不动杆菌产酶情况结果如表2 所示。

表1. 菌株YZS-X1-1与其相近不动杆菌的API20NE鉴定结果

注：菌株1为新菌AcinetobacterguangzhouensisYZS-X1-1，菌株2为Acinetobacter towneri DSM 14962^T，菌株3为Acinetobacter indicus DSM 25388^T，菌株4为Acinetobacter soli JCM 15062^T ，菌株5为Acinetobacter radioresistens JCM9326^T；“+”表示阳性，“-”表示阴性。

表2. 菌株YZS-X1-1与其相近不动杆菌的API ZYM鉴定结果

注：菌株1为新菌Acinetobacter sp. YZS-X1-1，菌株2为 Acinetobacter towneri DSM 14962^T，菌株3为Acinetobacter indicus DSM 25388^T，菌株4为Acinetobacter soli JCM 15062^T，菌株5为Acinetobacter radioresistens JCM 9326^T；“+”表示阳性“-”表示阴性，W 是指“weak”，弱阳性。

菌株的分子生物学鉴定

1）利用天跟细菌基因组提取试剂盒（TIANAMP Bacteria DNA Kit）提取菌株YZS-X1-1 的基因组DNA，步骤按厂家说明书要求所述。利用细菌通用引物27F，1492R扩增菌株YZS-X1-1 的16S rDNA 片段，利用引物UP1E，AprU扩增菌株YZS-X1-1的gyrB基因序列。利用引物Ac696F， Ac1093R扩增菌株YZS-X1-1的rpoB基因序列。PCR 产物分别经1.5% 琼脂糖凝胶电泳，利用凝胶回收试剂盒回收目的条带后送交公司测序。将所测得序列整理后提交到到NCBI 及EzTaxon 数据库中，比对得到与最相近的菌株（Acinetobacter indicus CIP110367^T）相似性为96.75%。

2）如上所述的引物对序列为：

1492R ：TACCTTGTTACGACTT（SEQ ID NO.4），

27F ：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG（SEQ ID NO.5），

UP1E：CAGGAAACAGCTATGACCAYGSNGGNGGNAARTTYRA（SEQ ID NO.6），

AprU：TGTAAAACGACGGCCAGTGCNGGRTCYTTYTCYTGRCA（SEQ ID NO.7）， Ac696F：TAYCGYAAAGAYTTGAAAGAAG（SEQ ID NO.8）， Ac1093R：CMACACCYTTGTTMCCRTGA（SEQ IDNO.9）。

3）菌株YZS-X1-1 的16S rRNA，gyrB，rpoB 基因测序的结果如SEQ ID NO.1、SEQID NO.2 、SEQ ID NO.3所示。 如上所述的16S rRNA 序列采用软件CLUSTAL_X program(version1.83) 进行比对，使用软件MEGA version 5.05.software 绘制进化关系树。采用neighbor-joining 计算，并以maximum-parsimony 和maximum-likelihood 进行验证计算，bootstrap 设置为1000 个循环，以三个基因序列构建的系统发育树分别如图2（16SrRNA），图3（gyrB），图4（rpoB） 所示。从图2、图3、图4都可看出，通过对16S rRNA，gyrB，rpoB基因的系统发育树分析，菌株YZS-X1-1 可以归入到Acinetobacterindicus簇。但是，菌株YZS-X1-1 与Acinetobacterindicus模式菌株相似性为96.75%，而97% 则是同一属内不同种类菌株相似性的16S rRNA的阈值，而且很多文献中证明了有些菌16S rRNA 基因序列的相似性超过了99%，但是他们仍然属于不同的菌种。故综合菌株YZS-X1-1有关生理生化指标结果和分子生物学鉴定结果，结合其形态学特征，我们将其归入不动杆菌属(Acinetobacter)，是一株不动杆菌属的新种，命名为：不动杆菌(Acinetobactersp.) YZS-X1-1。

本发明新微生物的脂肪酸含量特征

菌株YZS-X1-1 的总脂肪酸含量的测定：

分别送样用气相色谱—质谱法检测新菌YZS-X1-1细胞脂肪酸和相似菌株细胞脂肪酸含量，所有菌株的数据都是在30℃培养箱中，LB琼脂培养基上生长48小时后测得，结果表明菌株YZS-X1-1的主要细胞脂肪酸组成为C_16:1 w7c或C_16:1 w6c (35.92 %)，C_18:1 w9c(24.86 %)，C_{16 : 0} (18.59 %) and C_{12 : 0} (5.48 %)。而且与相似菌株脂肪酸种类、含量上均有差异，如表3所示，以此判断同相似菌株属于不同种类。

表3. YZS -X1- 1和相近不动杆菌属标准菌株的细胞脂肪酸图谱

注：1，Strain YZS-X1-1T；2，A. towneri DSM 14962T；3，A. indicus DSM25388T；4，A. soli JCM 15062T；5，A. radioresistens JCM 9326T. 表格中的数值是总脂肪酸的百分比；ND，未检测到； tr，微量(<1 %). *Summed features代表了两个或三个脂肪酸基团，不能用GLC与MIDI系统分离. Summed feature 2 由C_14:0 3OH/C_16:1 iso I组成；summed feature 3由C_16:1 w7c/ C_16:1 w6c组成；summed feature 8由 C_18:1 w6c /w7c组成。

不动杆菌新菌与常规脱氮菌株对氨氮、亚硝态氨的降解能力对比

菌株采用市面上常规用于脱氮的菌株，其中包括枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）CST-1、屎肠球菌（Enterococcus faecium）CSZ-2、约氏不动杆菌（Acinetobacter johnsonii）CSIO-3、威尼斯不动杆菌（Acinetobacter venetianus）CSM。在如下相同条件下与本发明YZS-X1-1菌株进行了脱氮对比。

使用氨氧化培养基（初始氮浓度100 mg/L）和亚硝酸盐还原培养基（初始氮浓度10mg/L），将活化后的菌液离心，收集菌体，用PBS缓冲液重悬，按2.5%的接种量接入培养基中，空白不加菌， 30℃，120 rpm，振荡培养。利用纳氏试剂分光光度法（HJ 535-2009 GB 7479-87）和盐酸萘乙二胺分光光度法(GB/T 5009.33-2008)，每隔24h取样检测其对氨氮、亚硝酸盐氮的降解能力，结果见图5和图6。

由图中数据可知不动杆菌新菌YZS-X1-1 在两种培养基中培养都可以有效脱氮，在氨氧化培养基中培养24h，氨氮降解率达76.1%，亚硝酸盐培养基中培养24h 亚硝氮降解率为34.3%，其它菌株仅表现出轻微的脱氮效果，且无法做到对氨氮、亚硝态氮的同时去除。本专利菌株此条件下对氨氮、亚硝态氮都表现出了较好的去除效果，同对照菌株相比优势明显。

<110> 广州中国科学院先进技术研究所

<120> 一株高效脱氮不动杆菌新种及其应用

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<170> PatentIn version 3.5

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<212> DNA

<213> 不动杆菌（Acinetobacter sp.）

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gattgaacgc tggcggcagg cttaacacat gcaagtcgag cggggatagg gtgcttgcac 60

ctgattccta gcggcggacg ggtgagtaat gcttaggaat ctgcctatta gtgggggaca 120

acgttccgaa agggacgcta ataccgcata cgtcctacgg gagaaagcag gggatcttcg 180

gaccttgcgc taatagatga gcctaagtcg gattagctag ttggtggggt aaaggcctac 240

caaggcgacg atctgtagcg ggtctgagag gatgatccgc cacactggga ctgagacacg 300

gcccagactc ctacgggagg cagcagtggg gaatattgga caatgggggg aaccctgatc 360

cagccatgcc gcgtgtgtga agaaggcctt ttggttgtaa agcactttaa gcgaggagga 420

ggcttacctg gttaatacct gggataagtg gacgttactc gcagaataag caccggctaa 480

ctctgtgcca gcagccgcgg taatacagag ggtgcaagcg ttaatcggat ttactgggcg 540

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<221> misc_feature

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<223> n is a, c, g, or t

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<221> misc_feature

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<212> DNA

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<221> misc_feature

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Claims (3)

1.一株高效脱氮不动杆菌新种菌株(Acinetobacter sp.)YZS-X1-1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO.M 2014369。

2.权利要求1所述的高效脱氮不动杆菌在去除水体氨氮及亚硝酸盐氮中的应用。

3.一种生物脱氮菌剂，其含有权利要求1所述的高效脱氮不动杆菌。