CN108373982B - 一株indicus不动杆菌及其解磷方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株indicus不动杆菌及其解磷方法，该菌株的分类命名为Acinetobacter indicus JL‑1，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.60312。该菌株的解磷方法是：将保存的JL‑1转接至LB斜面培养基中，30℃活化培养24h；用接种环刮取斜面菌株接入种子培养基中，30℃、150r/min振荡培养24h得种子液；以1％(v/v)接种量将种子液接入无机磷液体培养基中，装液量为30～120mL/250mL，pH 6.5～7.5、25～40℃、120～150r/min振荡培养24～96h。本发明菌株适应能力较强，繁殖快，培养条件简单，对难溶性的无机磷酸盐Ca3(PO4)2具有较强的溶解能力，在最优解磷条件下，该菌株解磷量为61.02μg/mL，菌落数11.43log(CFU/mL)，具有广泛的应用前景。

Description

一株indicus不动杆菌及其解磷方法
技术领域
本发明属于农业微生物技术领域，涉及一株不动杆菌，具体涉及一株indicus 不动杆菌及其解磷方法。
背景技术
磷是植物成长进程中的一种重要元素，广泛地参加植物细胞内多种生理生化 进程，能够显著地促进植物生长发育和新陈代谢过程。我国大约有74％的耕地缺 磷，施入的磷肥当季作物利用率为5％～25％。大部分磷与土壤中的Ca2+、Fe3+、 Fe2+、Al3+结合，形成难溶性磷酸盐，因而大部分磷肥以难溶的无效态在土壤中 积累。土壤中存在大量的解磷菌，包括细菌、放线菌和酵母菌，它们能将难溶性 的磷转化为农作物可吸收使用的可溶性磷，促进农作物生长，改善土壤环境，显 著提高土壤中的有效磷含量，因此，解磷菌的研究与应用对于农业生产具有重要 的理论和实践意义，有助于缓解我国土壤磷素缺乏和环境污染问题。
解磷菌的解磷过程是个复杂的过程，解磷机理比较复杂，不同的解磷菌所具 有的解磷能力也有所不同，因此，有必要从自然条件下的植株根际筛选高效的解 磷菌，挖掘土壤磷库资源。
发明内容
本发明的目的之一是提供一株indicus不动杆菌，其具有较强的解磷能力。
本发明的目的之二是提供上述indicus不动杆菌在溶解难溶性无机磷酸盐中 的应用。
本发明的目的之三是提供上述indicus不动杆菌的解磷方法，能在复杂的环 境条件下发挥其解磷能力。
为实现上述目的，本发明提供一株indicus不动杆菌，其分类命名为Acinetobacter indicus JL-1，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址是广东省广 州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期为2018年1月8日，保藏编 号为GDMCC No.60312。
该菌株Acinetobacter indicus JL-1是从徐州丰县牛蒡根际土壤中纯化、筛选得到，经鉴定为革兰氏阴性菌，显微镜下可见菌株菌体为杆状，菌落呈淡黄色， 略微凸起，边缘不整齐，菌落表面较湿润，明胶液化、淀粉水解、葡萄糖产酸、 甲基红试验、过氧化氢酶试验呈阳性，吲哚、V.P.试验呈阴性。
菌株16S rDNA序列构建的系统发育树分析表明，菌株JL-1位于 Acinetobacterindicus分支上，结合生理生化试验将JL-1鉴定为不动杆菌属细菌。
所述的indicus不动杆菌在溶解难溶性无机磷酸盐中的应用。所述的难溶性 无机磷酸盐为磷酸钙。
所述的indicus不动杆菌的解磷方法，包括以下步骤：
(1)将-80℃保存的菌株Acinetobacter indicus JL-1转接于已灭菌的LB斜面 培养基中，置于30℃恒温培养箱中活化培养24h；所述的LB斜面培养基为：蛋 白胨5.0g、NaCl5.0g、牛肉浸膏2.50g、琼脂1.8g、蒸馏水500mL，pH7.0左右， 121℃灭菌20min；
用接种环刮取2环斜面菌株接入种子培养基中，种子培养基装液量为 100mL/250mL，在pH为6.5～7.5、温度为30℃的恒温振荡器中振荡培养24h至 对数期，振荡频率为150r/min，制得Acinetobacter indicus JL-1菌株种子液；所 述的种子培养基为：蛋白胨5.0g、NaCl 5.0g、牛肉浸膏2.50g、蒸馏水500mL， pH7.0左右，121℃灭菌20min；
(2)将步骤(1)培养好的Acinetobacter indicus JL-1菌株种子液接入无机 磷液体培养基中，种子液接种量为无机磷液体培养基体积的1％，无机磷液体培 养基装液量为30～120mL/250mL，在pH为6.5～7.5、温度为25～40℃的恒温振 荡器中培养24～120h，振荡频率为120～150r/min；所述的无机磷液体培养基为： 蔗糖5.0～25.0g、(NH4)2SO4 0.5～1.0g、酵母粉0.5～1.0g、Ca3(PO4)2 25.0g、NaCl 0.2g、KCl 0.2g、MgSO4·7H2O 0.1g、FeSO4·7H2O 0.03g、MnSO4·4H2O 0.03g、水 1000mL，pH 6.5～7.5；
(3)将步骤(2)培养好的发酵液于8000r/min离心15min取上清液，以不 接菌处理作空白对照，采用磷钼蓝比色法检测上清液中的可溶性磷含量。
优选的解磷条件如下：所述的无机磷液体培养基装液量为50mL/250mL，在 pH为7.5、温度为37℃的恒温振荡器中培养48h，振荡频率为150r/min；所述的 无机磷液体培养基为：蔗糖20.0g、(NH4)2SO4 1.0g、酵母粉1.0g，Ca3(PO4)2 25.0g、 NaCl 0.2g、KCl 0.2g、MgSO4·7H2O 0.1g、FeSO4·7H2O 0.03g、MnSO4·4H2O 0.03g、 水1000mL，pH 7.5。
本发明从徐州丰县牛蒡根际土壤土壤中筛选出一株解磷能力强的不动杆菌 属indicus菌株Acinetobacter indicus JL-1，该菌株适应能力较强，繁殖快，生活 周期短，培养条件简单，培养原料丰富多样，价廉环保，同时具备制成微生物菌 剂的潜在优势，以及为构建解磷基因工程菌提高新的菌种；对难溶性的无机磷酸 盐磷酸三钙(Ca3(PO4)2)具有较强的溶解能力，能够在较大变化幅度的温度、 溶氧条件下发挥其解磷能力，在最优解磷条件下，该菌株解磷量最高为 61.02μg/mL，菌落数11.43log(CFU/mL)，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1是本发明不动杆菌Acinetobacter indicus JL-1菌株的菌落形态图；
图2是本发明不动杆菌Acinetobacter indicu JL-1菌株的细胞形态图；
图3是本发明不动杆菌Acinetobacter indicus JL-1菌株的PCR扩增结果电泳图；
图4是本发明不动杆菌Acinetobacter indicus JL-1菌株的系统发育地位分析图。
具体实施方式
下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1本发明菌株的培养、纯化、筛选及鉴定
(1)培养基
①有机磷液体培养基：葡萄糖5.0g、MgSO4·7H2O 0.15g、(NH4)2SO4 0.25g、 MnSO40.015g、FeSO4·7H2O 0.015g、NaCl 0.15g、KCl 0.15g、CaCO3 2.50g、 (NH4)PO3 0.25g、卵磷脂0.2g、蒸馏水500mL，pH 6.8～7.2，121℃灭菌20min。
②有机磷固体培养基：葡萄糖5.0g、MgSO4·7H2O 0.15g、(NH4)2SO4 0.25g、 MnSO40.015g、FeSO4·7H2O 0.015g、NaCl 0.15g、KCl 0.15g、CaCO3 2.50g、 (NH4)PO3 0.25g、卵磷脂0.2g、琼脂粉9g、蒸馏水500mL，pH 6.8～7.2，121℃ 灭菌20min。
③LB固体培养基：蛋白胨5.0g、NaCl 5.0g、牛肉浸膏2.5g、琼脂粉7.5g、 蒸馏水500mL、pH 7.0左右，121℃灭菌20min。
④无机磷固体培养基：葡萄糖10.0g、Ca3(PO4)2 25.0g、(NH4)2SO4 0.5g、 NaCl0.2g、KCl 0.2g、MgSO4·7H2O 0.1g、FeSO4·7H2O 0.03g、MnSO4·4H2O 0.03g、 酵母粉0.5g、琼脂粉18g、水1000mL，pH6.8～7.2，121℃灭菌20min。
⑤无机磷液体培养基：葡萄糖10.0g、Ca3(PO4)2 25.0g、(NH4)2SO4 0.5g、NaCl0.2g、KCl 0.2g、MgSO4·7H2O 0.1g、FeSO4·7H2O 0.03g、MnSO4·4H2O 0.03g、酵 母粉0.5g，水1000mL，pH6.8～7.2，121℃灭菌20min。
(2)菌株的培养、纯化
①取徐州丰县牛蒡根际土壤，用研钵磨细，储存备用；
②称取过100目筛的泥土1.0g，加入盛有99mL灭菌的纯水瓶中，放入摇床 摇15分钟，制成10-2浓度的泥土稀释液；无菌操作条件下，吸100μL10-2稀释度 加到装有900μL灭菌的生理盐水的离心管中，颠倒混匀，制成10-3稀释度的菌 液；按梯度进行菌种稀释，分别用8％生理盐水稀释至10-3、10-4、10-5浓度；
③无菌操作条件下，将经过高压灭菌锅灭菌的有机磷及无机磷固体培养基分 别倒入培养皿内，用灭菌后达室温的涂布棒匀速涂布，将制作好的的平板倒置在 30℃培养箱中生长2～4d，并及时做好相应的标记；
④将倒好冷却至固态的培养皿倒置在28℃培养箱中培养24～48h，待形成菌 落后观察其形态，挑取周围有透明圈产生并且比较显著的菌落，在新鲜的LB固 体培养基上进行划线培养，然后将其倒置在35℃的恒温箱中培养24～48h，观察 是否出现预期的纯化单菌落。
(3)菌株的筛选
①平板法定性检测解磷能力：将种子液在无机磷固体培养基上划线，于恒温 箱培养7d，温度设定为30℃，查看菌落生长状况及透明圈大小。
②液体发酵定量检测解磷能力：以1％(v/v)接种量将种子液接入无机磷液 体培养基中，无机磷液体培养基装液量为100mL/250mL，于30℃、150r/min恒 温振荡器中培养5d。以不接菌的作对照，每24h取发酵液，8000r/min离心15min， 采用磷钼蓝比色法检测上清中的磷含量。
③根据透明圈与菌落直径比值的大小，筛选出JL-1，JL-5，JL-9，JL-11，JL-19，JL-26等48株解磷能力较强菌株，通过磷钼蓝比色法，最终筛选出解磷能力最强 菌株是JL-1。
(4)菌株的鉴定
①菌株JL-1的菌落形态特征：在基础平板上培养菌落呈淡黄色，略微凸起， 边缘不整齐，菌落表面较为湿润，如图1所示。
②菌株JL-1的菌体形态特征：显微镜下观察菌体为杆状，大小为 2.5μm×60μm，如图2所示。
③菌株JL-1的生理生化鉴定：革兰氏染色阴性，明胶液化、淀粉水解、葡 萄糖产酸、甲基红试验、过氧化氢酶试验呈阳性，吲哚、V.P.试验呈阴性；适合 此菌生长的pH范围是6.5～7.5，最适生长温度为30℃。
④菌株JL-1的16S rDNA基因片段的PCR扩增及种属分析：以细菌基因组 DNA为模板扩增16S rDNA，采用一对通用引物为扩增引物，用PCR仪(GeneAmp 9700AppliedBiosystems公司)进行扩增反应。
上游引物27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；(SEQ ID NO：2)
下游引物1492R：5'-GGCTACCTTGTTACGACT-3'。(SEQ ID NO：3)
PCR反应体系(25μL)：Template DNA 1μL，10×Easy Taq buffer 2.5μL， ForwardPrimer和Reverse Primer各0.5μL，Easy Taq DNA Polymerase 0.25μL，高 纯dNTP 2μL，双蒸水18.25μL。
PCR程序：94℃ 5min；94℃ 1min，58℃ 1min，72℃ 2min，循环30次；72℃ 10min。
1％琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物(如图3所示)，并委托生工(上海)生物 工程股份有限公司进行测序。
测序后得到菌株JL-1的16S rDNA长度为1335bp的序列，如SEQ ID NO：1所 示。将菌株序列提交到NCBI进行blast检索，通过比对发现菌株JL-1属于不动杆 菌属，与indicus不动杆菌相似性为100％。
采用MEGA4.1软件，邻位连接法显示菌株JL-1与相关种的16S rDNA序列系 统发育树见图4。
结合菌株的形态特征、生理生化鉴定并结合16S rDNA序列分析，将菌株JL-1 鉴定为不动杆菌属细菌，命名为Acinetobacter indicus JL-1。
实施例2菌株Acinetobacter indicus JL-1的解磷试验
利用菌株Acinetobacter indicus JL-1解磷的具体步骤为：
(1)将-80℃保存的菌株Acinetobacter indicus JL-1转接于已灭菌的LB斜面 培养基中，置于30℃恒温培养箱中活化培养24h；所述的LB斜面培养基为：蛋 白胨5.0g、NaCl5.0g、牛肉浸膏2.50g、琼脂1.8g、蒸馏水500mL，pH 7.0左右，121℃灭菌20min；
用接种环刮取2环斜面菌株接入种子培养基中，种子培养基装液量为 100mL/250mL，在pH为6.5～7.5、温度为30℃的恒温振荡器中振荡培养24h至 对数期，振荡频率为150r/min，制得Acinetobacter indicus JL-1菌株种子液；所 述的种子培养基为：蛋白胨5.0g、NaCl 5.0g、牛肉浸膏2.50g、蒸馏水500mL， pH7.0，121℃灭菌20min；
(2)将步骤(1)培养好的Acinetobacter indicus JL-1菌株种子液接入无机 磷液体培养基中，种子液接种量为无机磷液体培养基体积的1％，装液量为 50mL/250mL，在pH为7.5、温度为37℃的恒温振荡器中培养48h，振荡频率为 150r/min；所述的无机磷液体培养基为：蔗糖20.0g、(NH4)2SO4 1.0g、酵母粉1.0g， Ca3(PO4)2 25.0g、NaCl 0.2g、KCl 0.2g、MgSO4·7H2O 0.1g、FeSO4·7H2O 0.03g、 MnSO4·4H2O 0.03g、水1000mL，pH6.5-7.5；
(3)将步骤(2)培养好的发酵液于8000r/min离心15min取上清液，以不 接菌处理作空白对照，采用磷钼蓝比色法测得上清液中的可溶性磷含量为 61.02μg/mL，菌落数11.43log(CFU/mL)。
实施例3菌株Acinetobacter indicus JL-1的解磷试验
利用菌株Acinetobacter indicus JL-1解磷的具体步骤为：
(1)将-80℃保存的菌株Acinetobacter indicus JL-1转接于已灭菌的LB斜面 培养基中，置于30℃恒温培养箱中活化培养24h；所述的LB斜面培养基为：蛋 白胨5.0g、NaCl5.0g、牛肉浸膏2.50g、琼脂1.8g、蒸馏水500mL、pH 7.0左右， 121℃灭菌20min；
用接种环刮取2环斜面菌株接入种子培养基中，种子培养基装液量为 100mL/250mL，在pH为6.5～7.5、温度为30℃的恒温振荡器中振荡培养24h至 对数期，振荡频率为150r/min，制得Acinetobacter indicus JL-1菌株种子液；所 述的种子培养基为：蛋白胨5.0g、NaCl 5.0g、牛肉浸膏2.50g、蒸馏水500mL、 pH7.0，121℃灭菌20min；
(2)将步骤(1)培养好的Acinetobacter indicus JL-1菌株种子液接入无机 磷液体培养基中，种子液接种量为无机磷液体培养基体积的1％，装液量为 30mL/250mL，在pH为6.5、温度为25℃的恒温振荡器中培养96h，振荡频率为120r/min；所述的无机磷液体培养基为：蔗糖25.0g、(NH4)2SO4 0.5g、酵母粉0.5g， Ca3(PO4)2 25.0g、NaCl 0.2g、KCl 0.2g、MgSO4·7H2O 0.1g、FeSO4·7H2O 0.03g、 MnSO4·4H2O 0.03g、水1000mL，pH6.5；
(3)将步骤(2)培养好的发酵液于8000r/min离心15min取上清液，以不 接菌处理作空白对照，采用磷钼蓝比色法测得上清液中的可溶性磷含量为 45.21μg/mL，菌落数10.24log(CFU/mL)
实施例4菌株Acinetobacter indicus JL-1的解磷试验
利用菌株Acinetobacter indicus JL-1解磷的具体步骤为：
(1)将-80℃保存的菌株Acinetobacter indicus JL-1转接于已灭菌的LB斜面 培养基中，置于30℃恒温培养箱中活化培养24h；所述的LB斜面培养基为：蛋 白胨5.0g、NaCl5.0g、牛肉浸膏2.50g、琼脂1.8g、蒸馏水500mL、pH 7.0左右， 121℃灭菌20min；
用接种环刮取2环斜面菌株接入种子培养基中，种子培养基装液量为 100mL/250mL，在pH为6.5～7.5、温度为30℃的恒温振荡器中振荡培养24h至 对数期，振荡频率为150r/min，制得Acinetobacter indicus JL-1菌株种子液；所 述的种子培养基为：蛋白胨5.0g、NaCl 5.0g、牛肉浸膏2.50g、蒸馏水500mL， pH7.0，121℃灭菌20min；
(2)将步骤(1)培养好的Acinetobacter indicus JL-1菌株种子液接入无机 磷液体培养基中，种子液接种量为无机磷液体培养基体积的1％，装液量为 120mL/250mL，在pH为6.5、温度为40℃的恒温振荡器中培养24h，振荡频率 为140r/min；所述的无机磷液体培养基为：蔗糖5.0g、(NH4)2SO4 0.5g、酵母粉 0.5g，Ca3(PO4)2 25.0g、NaCl 0.2g、KCl 0.2g、MgSO4·7H2O 0.1g、FeSO4·7H2O 0.03g、MnSO4·4H2O 0.03g、水1000mL，pH6.5；
(3)将步骤(2)培养好的发酵液于8000r/min离心15min取上清液，以不 接菌处理作空白对照，采用磷钼蓝比色法测得上清液中的可溶性磷含量为 47.62μg/mL，菌落数10.88log(CFU/mL)。
实施例5菌株Acinetobacter indicus JL-1的解磷试验
利用菌株Acinetobacter indicus JL-1解磷的具体步骤为：
(1)将-80℃保存的菌株Acinetobacter indicus JL-1转接于已灭菌的LB斜面 培养基中，置于30℃恒温培养箱中活化培养24h；所述的LB斜面培养基为：蛋 白胨5.0g、NaCl5.0g、牛肉浸膏2.50g、琼脂1.8g、蒸馏水500mL，pH 7.0左右， 121℃灭菌20min；
用接种环刮取2环斜面菌株接入种子培养基中，种子培养基装液量为 100mL/250mL，在pH为6.5～7.5、温度为30℃的恒温振荡器中振荡培养24h至 对数期，振荡频率为150r/min，制得Acinetobacter indicus JL-1菌株种子液；所 述的种子培养基为：蛋白胨5.0g、NaCl 5.0g、牛肉浸膏2.50g、蒸馏水500mL， pH7.0，121℃灭菌20min；
(2)将步骤(1)培养好的Acinetobacter indicus JL-1菌株种子液接入无机 磷液体培养基中，种子液接种量为无机磷液体培养基体积的1％，装液量为 50mL/250mL，在pH为7.5、温度为37℃的恒温振荡器中培养48h，振荡频率为 150r/min；所述的无机磷液体培养基为：葡萄糖15.0g、(NH4)2SO4 0.5g、Ca3(PO4)2 25.0g、NaCl 0.2g、KCl 0.2g、MgSO4·7H2O0.1g、FeSO4·7H2O 0.03g、MnSO4·4H2O 0.03g、水1000mL，pH7.5；
(3)将步骤(2)培养好的发酵液于8000r/min离心15min取上清液，以不 接菌处理作空白对照，采用磷钼蓝比色法测得上清液中的可溶性磷含量为 39.56μg/mL，菌落数9.56log(CFU/mL)。
序列表
<110> 徐州工程学院
<120> 一株indicus不动杆菌及其解磷方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1335
<212> DNA
<213> 不动杆菌(Acinetobacter indicus)
<400> 1
cttagcttag cggcggacgg gtgagtaatg cttaggaatc tgcctattag tgggggacaa 60
cattccgaaa gggatgctaa taccgcatac gccctacggg ggaaagcagg ggatcttcgg 120
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aaggcgacga tctgtagcgg gtctgagagg atgatccgcc acactgggac tgagacacgg 240
cccagactcc tacgggaggc agcagtgggg aatattggac aatgggggga accctgatcc 300
agccatgccg cgtgtgtgaa gaaggccttt tggttgtaaa gcactttaag cgaggaggag 360
gcgctctagg ataataccct agatgcgtgg acgttactcg cagaataagc accggctaac 420
tctgtgccag cagccgcggt aatacagagg gtgcgagcgt taatcggatt tactgggcgt 480
aaagcgcgcg taggtggcta attaagtcaa atgtgaaatc cccgagctta acttgggaat 540
tgcattcgat actggttagc tagagtatgg gagaggatgg tagaattcca ggtgtagcgg 600
tgaaatgcgt agagatctgg aggaataccg atggcgaagg cagccatctg gcctaatact 660
gacactgagg tgcgaaagca tggggagcaa acaggattag ataccctggt agtccatgcc 720
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aagtagaccg cctggggagt acggtcgcaa gactaaaact caaatgaatt gacgggggcc 840
cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt cgatgcaacg cgaagaacct tacctggcct 900
tgacatacag agaactttcc agagatggat tggtgccttc gggaactctg atacaggtgc 960
tgcatggctg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa 1020
cccttttcct tacttgccag catttcggat gggaacttta aggatactgc cagtgacaaa 1080
ctggaggaag gcggggacga cgtcaagtca tcatggccct tacggccagg gctacacacg 1140
tgctacaatg gtcggtacaa agggttgcta cacagcgatg tgatgctaat ctcaaaaagc 1200
cgatcgtagt ccggattgga gtctgcaact cgactccatg aagtcggaat cgctagtaat 1260
cgcggatcag aatgccgcgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac 1320
catgggagtt tgttg 1335
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggctaccttg ttacgact 18

Claims (5)

1.一株indicus不动杆菌，其特征在于，其分类命名为Acinetobacter indicus JL-1，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址是广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期为2018年1月8日，保藏编号为GDMCC No.60312。
2.权利要求1所述的indicus不动杆菌在溶解难溶性无机磷酸盐中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的无机磷酸盐为磷酸钙。
4.权利要求1所述的indicus不动杆菌的解磷方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将-80℃保存的权利要求1所述的indicus不动杆菌转接于已灭菌的LB斜面培养基中，置于30℃恒温培养箱中活化培养24h；所述的LB斜面培养基为：蛋白胨5.0g、NaCl 5.0g、牛肉浸膏2.50g、琼脂1.8g、蒸馏水500mL，pH 7.0，121℃灭菌20min；
用接种环刮取2环斜面菌株接入种子培养基中，种子培养基装液量为100mL/250mL，在pH为6.5～7.5、温度为30℃的恒温振荡器中振荡培养24h至对数期，振荡频率为150r/min，制得种子液；所述的种子培养基为：蛋白胨5.0g、NaCl 5.0g、牛肉浸膏2.5g、蒸馏水500mL，pH 7.0，121℃灭菌20min；
(2)将步骤(1)培养好的种子液接入无机磷液体培养基中，种子液接种量为无机磷液体培养基体积的1％，无机磷液体培养基装液量为30～120mL/250mL，在pH为6.5～7.5、温度为25～40℃的恒温振荡器中培养24～96h，振荡频率为120～150r/min；所述的无机磷液体培养基为：蔗糖5.0～25.0g、(NH4)2SO4 0.5～1.0g、酵母粉0.5～1.0g、Ca3(PO4)2 25.0g、NaCl0.2g、KCl 0.2g、MgSO4·7H2O 0.1g、FeSO4·7H2O 0.03g、MnSO4·4H2O 0.03g、水1000mL，pH6.5～7.5；
(3)将步骤(2)培养好的发酵液于8000r/min离心15min取上清液，以不接菌处理作空白对照，采用磷钼蓝比色法检测上清液中的可溶性磷含量。
5.根据权利要求4所述的indicus不动杆菌的解磷方法，其特征在于，步骤(2)中的解磷条件如下：所述的无机磷液体培养基装液量为50mL/250mL，在pH为7.5、温度为37℃的恒温振荡器中培养48h，振荡频率为150r/min；所述的无机磷液体培养基为：蔗糖20.0g、(NH4)2SO4 1.0g、酵母粉1.0g，Ca3(PO4)2 25.0g、NaCl 0.2g、KCl 0.2g、MgSO4·7H2O 0.1g、FeSO4·7H2O 0.03g、MnSO4·4H2O 0.03g、水1000mL，pH 7.5。
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Denomination of invention: A strain of Acinetobacter indicus and its phosphorus solubilization method

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