CN116606760B - 一株竹林耐盐促生假单胞菌属k22-d及其应用 - Google Patents

一株竹林耐盐促生假单胞菌属k22-d及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株竹林耐盐促生假单胞菌K22‑D及其应用，假单胞菌K22‑D，已于2023年3月3日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCCNO.26735。本发明耐盐促生假单胞菌K22‑D，具有高效溶磷、固氮等能力，可用于土壤修复，并且能够产生淀粉酶、铁载体和IAA，耐盐(NaCl)浓度达到20％，将其制备为土壤修复的微生物制剂，可实现废弃物资源化利用；还具备高效去除竹笋加工废水中COD和NH4‑N的特性，可广泛应用于食品工厂所产生的高盐废水的处理。

Description

一株竹林耐盐促生假单胞菌属K22-D及其应用
技术领域
本发明涉及一株耐盐促生假单胞菌属K22-D及其应用，属于微生物技术和生态修复技术领域。
背景技术
磷是植物的必要元素，特别是对植物生长以及植物的抗性(抗病、抗旱、抗寒)具有较大影响。土壤中的磷是不可再生矿质资源，且大部分的磷不能被植物吸收。
铁是植物所需的微量元素，植物对病害的抗性与铁元素的分配有关。利用非病原微生物产生铁载体，通过螯合作用将不溶解的三价稳态Fe3+转化为可溶性铁，以干扰病原菌对铁元素的正常摄取，可以抑制植物病害的爆发。
化学需氧量(COD)和氨氮(NH4-N)，是快速监测河流污染和工业废水性质的有机物污染参数。工业废水等高盐度的大规模废水，直接排放会给土壤、水体、大气环境带来不可逆的破坏，甚至影响周边植物生长。目前，利用生物修复技术处理高盐工业废水，有目标地筛选耐盐菌株对该类废液进行降解，利用微生物的生长代谢，将废水中的有机物开环、分解，从而使之符合排放标准，同时又能改善土壤自身环境，促进植物生长。因此，筛选高效耐盐、促生的微生物，利用高盐有机废水作为微生物的营养成分、制备土壤改良的微生物制剂，是生态修复的突破点。
发明内容
本发明提供一种耐盐促生假单胞菌属K22-D及其应用，具有高效溶磷、固氮等能力，并且能够产生淀粉酶、铁载体和吲哚-3乙酸，还具备高效去除废水中COD和NH4-N等。
为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
一株竹林耐盐促生假单胞菌属K22-D，已于2023年3月3日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC NO.26735。
本申请竹林耐盐促生假单胞菌属K22-D是发明人自行筛选得到的，其保藏命名为Pseudomonas K22-D。
上述竹林耐盐促生菌Pseudomonas K22-D为圆平台形，菌落表面光滑有光泽，不透明，乳白色，直径1.5～3.5mm，菌株数量级达到1012cfu/mL以上。
上述菌株的16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。测定结果与Blast和GenBank中所登录的16S rRNA序列(登录号：NR 169411.1和CP 087178.1)进行比对，发现K22-D菌株与假单胞菌的同源性大于99％。
SEQ ID No.1：
TAGTTTGATTCAGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGATGAGAAGAGCTTGCTCTTCGATTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAATACCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGACAACGTTTCGAAAGGAACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCTACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCAGTAAGCGAATACCTTGCTGTTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTCGTTAAGTTGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTGGCGAGCTAGAGTAGGGCAGAGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGGCTCATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCAACTAGCCGTTGGAATCCTTGAGATTTTAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGCCTTGACATCCAATGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACATTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACGTTATGGTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAGAGGGTCGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCTCACAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGAATCAGAATGTCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCACCAGAAGTAGCTAGTCTAACCTTCGGGAGGACGGTTACCACGGTGTGATTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAA
本发明提供的竹林耐盐促生菌Pseudomonas K22-D，盐胁迫(NaCl浓度为0％～20％)条件下，菌株能够正常生长，该菌株属于中度耐盐菌。
上述竹林耐盐促生假单胞菌属K22-D在10％NaCl浓度下，仍具有高效溶解有机磷的能力。即该菌能够把难溶性的磷分解为活性磷。
上述竹林耐盐促生假单胞菌属K22-D可用于产生吲哚-3-乙酸、铁载体和淀粉酶。
上述竹林耐盐促生假单胞菌属K22-D还具有固氮作用，可用作土壤修复的微生物制剂。
上述竹林耐盐促生假单胞菌属K22-D可去除废水中的COD和NH4-N等，可用于废水处理，优选，用于处理竹笋加工废水，能够高效去除竹笋加工废水COD和NH4-H等含量。
将竹笋加工废水结合耐盐促生菌株K22-D，可制备为土壤修复的微生物制剂。K22-D可去除废水中的有害物质，废水中残留的有机物质等可对土壤起到施肥效果，同时K22-D繁殖快，且有固氮等促生作用，并源于土壤，适应土壤环境，可对土壤起到持久有效的修复作用。
本发明未提及的技术均参照现有技术。
本发明耐盐促生假单胞菌属K22-D，具有盐胁迫下高效溶磷、固氮等能力，可用于土壤修复，并且能够产生淀粉酶、铁载体和吲哚-3-乙酸，在盐胁迫(NaCl)浓度大于20％条件下正常生长。还具备高效去除竹笋加工废水中COD和NH4-N的特性，可广泛应用于食品工厂所产生的高盐废水的处理。将竹笋加工废水结合耐盐促生菌株，制备为土壤修复的微生物制剂，可实现废弃物资源化利用。
附图说明
图1为菌株K22-D在不同NaCl浓度下的生长曲线；
图2为菌株K22-D的解有机磷图片(左图中NaCl浓度为0％，右图中NaCl浓度为10％)；
图3为菌株K22-D的固氮图片；
图4为菌株K22-D产淀粉酶图片；
图5为菌株K22-D产铁载体图片；
图6为菌株K22-D产生吲哚-3-乙酸图片(左图为避光静置0min，右图为避光静置30min)；
图7为菌株K22-D对竹笋加工废水中COD含量的影响曲线；
图8菌株K22-D对竹笋加工废水NH4-N含量的影响曲线；
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
无特别说明时，各例中稀释均采用质量浓度为0.90％的无菌生理盐水；％无特别说明的均为质量百分比。
实施例一、菌种分离和筛选
称取浙江省湖州市安吉县竹林土壤2g于50ml LB液体培养基(蛋白胨10g/L，NaCl10g/L，酵母浸出物5g/L，其余为水，pH 7.0，121℃灭菌20min，各例提到相同的培养基组成相同)中，30℃，170r/min摇床震荡48h，即得到悬浊液。吸取100μL悬浊液，采用质量浓度为0.90％无菌生理盐水梯度稀释菌液，分别将稀释了10-3、10-4和10-5三个浓度梯度涂布于LB固体培养基中，最后倒置于30℃的恒温培养箱内，观察菌落生长情况。
上述固体培养基生长3d，即获得单个菌落。使用接种针挑取形态、颜色不一的单个菌落，分别在LB固体培养基表面连续划线培养，重复4次，得到多个单一菌落的纯化菌株。
将上述多个纯化菌株分别在额外添加NaCl(15％，20％)固体培养基(蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，酵母浸出物5g/L，琼脂10g/L，pH 7.0，121℃灭菌20min)中划线，挑取生长良好的单个耐盐菌落，即获得耐盐菌株3株。将上述3株耐盐菌以2％的接种量分别转接于含0％，1％，5％，10％，15％，20％NaCl的LB液体培养基(蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，酵母浸出物5g/L，其余为水，pH 7.0，121℃灭菌20min)中，以170r/min转速30℃培养24h，命名为K，K22-X，K22-D。利用全自动细菌生长曲线仪器，设置参数30℃，振荡150rpm，间隔1h，时长2d，测定吸光度OD600，绘制生长曲线。如图1，由图1可看出菌株K22-D的NaCl培养基中有较广的耐盐范围(0～20％)，最佳生长浓度为1％，半抑制浓度为10％。
最后，将3株耐盐菌活化至对数生长期时，与甘油比例为7:3充分混合后，置于-80℃冰箱保存。
实施例二、菌种的鉴定
(1)形态特征
将1mL-80℃冰箱保藏的K22-D菌株用5ml LB液体培养基活化，呈均匀混浊并伴有微量沉淀，轻轻摇动沉淀即散开。采用质量浓度为0.90％无菌生理盐水梯度稀释菌液，分别选择10-9，10-10，10-11梯度吸取100μL菌液涂布在LB固体培养基上，倒置于30℃培养箱48h后，观察到K22-D菌落直径为1.5～3.5mm，表面光滑，圆平台形，边缘锯齿状，不透明，乳白色，质地较软，产生发臭气味，菌株数量级达到1012cfu/mL以上。
(2)16S rRNA序列分析
对菌株K22-D进行进一步的16S rRNA序列分析与比对。根据细菌16S rDNA的保守序列设计一对引物，上游引物(7F)：5’－CAGAGTTTGATCCTGGCT－3’，下游引物(1540R)：5’－AGGAGGTGATCCAGCCGCA－3’，由上海生工合成。PCR扩增分别以筛选得到的菌株为模板，反应条件：94℃预变性4min，94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸1min，反应30个循环。目的片段按照常规方法进行克隆和序列测定，测定结果与GenBank中所登录的16S rRNA序列登录号：NR 169411.1和CP 087178.1)进行比对分析，基因同源性达到99％以上。根据《Bergey'sMannual of Determinative Bacteriology》(Holt,J.G.,Gibbons,N.E.,1994)和《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠和蔡妙英等，2001)，通过形态特征和16S rRNA序列分析，确定菌株K22-D为假单胞菌(Pseudomonas)，命名为Pseudomonas K22-D，保藏于中国普通微生物菌株保藏管理中心(CGMCC)，保藏编号CGMCC NO.26735，保藏时间2023年3月3日。
实施例三、菌株K22-D的解磷功能
在固体培养基中挑取绿豆大小的单菌落K22-D于5ml LB液体培养基中活化后，分别吸取5μL菌液滴于有机磷培养基(葡萄糖10.0g/L,硫酸铵0.5g/L,氯化钠0.3g/L,硫酸镁0.3g/L,硫酸锰0.03g/L,硫酸钾0.3g/L,硫酸亚铁0.03g/L,卵磷脂5.0g/L,琼脂15.0g/L,pH值7.0-7.5,115℃高压灭菌30min)及额外添加5％和10％ NaCl的有机磷培养基，每皿2个点植点，重复三次。在30℃恒温培养箱培养5d，如图2所示，观察到菌株周围有透明圈，说明该菌株具有解有机磷的能力，直径越大说明该菌株具有解有机磷的能力越强。
实施例四、菌株K22-D的固氮功能鉴定
在固体培养基中挑取绿豆大小的单菌落K22-D于5ml LB液体培养基中活化后，用无菌接种环蘸取种子液在阿须贝固氮培养基平板划线(磷酸二氢钾0.2g/L,氯化钠0.2g/L,硫酸镁0.2g/L,碳酸钙5.0g/L,硫酸钙0.1g/L,甘露醇10g/L,琼脂15.0g/L,pH值7.0-7.5,121℃高压灭菌15min)，重复三次。30℃恒温培养5d，如图3所示，观察到菌株能够良好生长，说明该菌株具固氮的能力。
实施例五、菌株K22-D的产淀粉酶功能鉴定
在固体培养基中挑取绿豆大小的单菌落K22-D于5ml LB液体培养基中活化后，作为种子液，吸取5μL种子液点接于可溶性淀粉培养基平板上(可溶性淀粉10.0g/L、磷酸氢二钾1.0g/L、硫酸镁1.0g/L、氯化钠1.0g/L、硫酸铵2.0g/L、硫酸亚铁0.001g/L、氯化锰0.001g/L、硫酸锌0.001g/L，琼脂10.0g/L，pH值7.0～7.4、121℃灭菌15min)，每个培养皿接种两个点，重复三次。倒置于30℃恒温箱，培养3d，如图4所示，菌落周围出现明显的透明水圈，即该菌株具有产淀粉酶的功能。
实施例六、菌株K22-D分泌铁载体
在固体培养基中挑取绿豆大小的单菌落K22-D于5ml LB液体培养基中活化后，作为种子液，吸取5μL接种于CAS固体培养基(葡萄糖4.0g，蛋白胨5.0g/L，KCl 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，pH为6.8，水800mL；另加100mL磷酸缓冲液和100mL 0.06g/LCAS检测液混匀，115℃灭菌20min)，每个培养皿中点2个植点，重复3次。在30℃恒温培养箱培养3d，如图5所示，蓝色CAS培养基中出现黄色晕圈，变色程度很深，表明产铁载体能力很强。
实施例七、菌株K22-D产生吲哚-3-乙酸(IAA)
在固体培养基中挑取绿豆大小的单菌落K22-D于5ml LB液体培养基中活化后，作为种子液，吸取5μL接种于质量浓度为100mg/L L-色氨酸的LB液体培养基，30℃，170r/min摇床震荡24h，取2ml菌液与Salkowski显色剂(FeCl3 4.5g溶于1L 10.8mol/L浓硫酸)等体积混合进行显色反应，避光静置30min后，观察颜色变化。如图6所示，出现粉红色，表明能够产生IAA。
实施例八、菌株处理竹笋加工废水
竹笋加工废水分为水煮笋废水、腌制笋废水和罐头笋废水，其中，水煮笋废水的产量最大，其含盐量为0.3wt％(NaCl)，COD和NH4-N含量最高。因此，将大量水煮笋废水收集起来进行微生物(K22-D菌株)处理以达到降解废水的目的，具体方法如下：
1.以2％接种量将K22-D菌株分别接入未厌氧发酵水煮笋废水(CK，含盐量为0.3wt％)和已经厌氧发酵水煮笋废水的250mL玻璃三角瓶中，30℃170r/min恒温震荡箱中培养144h，每24h采集水样利用重铬酸钾盐(HJ828-2017)测定COD含量。实验结果如图7所示，假单胞菌K22-D处理水煮笋废水未发酵和发酵废水144h，随着时间增加，菌株对两种废水的COD均具有非常强的去除作用，但是发酵水煮笋废水的降解效果更好。在0-120h内，菌株对COD的去除效果呈现明显下降趋势，在144h时，发酵废水COD的去除率达到67.11％。
2.以2％接种量将K22-D菌株分别接入未发酵水煮笋废水(CK，含盐量为0.3wt％)和已经厌氧发酵水煮笋废水的250mL玻璃三角瓶中，30℃170r/min恒温震荡箱中培养144h，每24h采集水样利用纳氏试剂分光光度法(HJ 535-2009)测定NH4-N含量。实验结果如图8所示，经过厌氧发酵后的水煮笋氨氮含量比未发酵水煮笋废水高，加入假单胞菌K22-D 144h后，随着时间增加，发酵水煮笋废水中NH4-N含量去除率达到49.05％，而未发酵废水中NH4-N含量去除率仅为25.40％。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一株竹林耐盐促生假单胞菌属（Pseudomonas sp.）K22-D，其特征在于：已于2023年3月3日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO.26735。
2.权利要求1所述的竹林耐盐促生假单胞菌属K22-D的应用，其特征在于：用于产生吲哚-3-乙酸。
3.权利要求1所述的竹林耐盐促生假单胞菌属K22-D的应用，其特征在于：用于产生铁载体。
4.权利要求1所述的竹林耐盐促生假单胞菌属K22-D的应用，其特征在于：用于产生淀粉酶。
5.权利要求1所述的竹林耐盐促生假单胞菌属K22-D的应用，其特征在于：1%~10% NaCl条件下，用于解有机磷。
6.权利要求1所述的竹林耐盐促生假单胞菌属K22-D的应用，其特征在于：用于固氮。
7.权利要求1所述的竹林耐盐促生假单胞菌属K22-D的应用，其特征在于：用于去除竹笋加工废水中的COD和NH4-N。
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