CN115992063B - 一种抗盐碱复合微生物菌剂、制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗盐碱复合微生物菌剂、制备方法及应用，属于土壤修复领域。本发明公开了一种楚氏喜盐芽孢杆菌(Halobacillus Trueperi)，保藏编号为CGMCC No.25218。还公开了一种抗盐碱复合微生物菌剂，包括楚氏喜盐芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、金黄节杆菌(Arthrobacter aurescens)、费氏中华根瘤菌(Sinorhizobiumfredii)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)和不动杆菌(Acinetobacter sp.)。该菌剂能够促进盐碱土壤植被恢复以及盐碱制种农作物生长和产量提高。

Description

一种抗盐碱复合微生物菌剂、制备方法及应用

技术领域

本发明涉及土壤修复领域，特别是涉及一种抗盐碱复合微生物菌剂、制备方法及应用。

背景技术

土壤盐碱化的扩增严重限制了我国土壤资源的有效利用和可持续性，其不仅会造成土壤板结、孔隙度低、土壤肥力差，还会对很多植物直接造成毒害作用。甘肃省的土壤盐碱化区域主要分布在河西走廊灌溉农业地区，全省所有盐碱化土地面积约为6559km²。甘肃省盐碱地的形成除了人为对化肥农药等化学物质的滥用、农田的不适当耕作和过度开发种植等原因，其主要原因是地表水的引灌造成区域地下水水位上升，容易发生土壤次生盐碱化，使得农田土壤盐碱化愈加严重。该现状已严重威胁到甘肃省的生态环境与粮食安全，找到一种合适且具有生态效益的改良方法将具有十分重要的现实意义。

盐碱地的微生物数量一般要少于普通农用土壤，原因认为是由于盐度导致的微生物生存适宜环境改变的结果。盐碱地中土壤微生物、碳、氮、基础呼吸都比普通农用土壤有较大幅度下降，土壤盐碱度的降低会增加微生物对有机质的分解作用，说明盐碱土壤的养分含量比普通农田的低。微生物菌剂可通过微生物的生命活动增加植物营养元素的供应量，同时抑制有害微生物的活动，改善土壤物理性状，如降低土壤体积质量、增加土壤孔隙度等，增进了肥力并改善了微生态环境，提高作物产量。因此，筛选出对高浓度盐碱具有耐受性的促生微生物菌株，对盐碱地的改良恢复以及盐碱地植被或作物的种植，都具有深远的影响。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗盐碱复合微生物菌剂、制备方法及应用，以解决上述现有技术存在的问题，该抗盐碱复合微生物菌剂能够促进盐碱土壤植被恢复以及促进盐碱制种农作物生长和产量提高。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种楚氏喜盐芽孢杆菌(Halobacillus Trueperi)，该菌株的保藏编号为CGMCC No.25218，已于2022年7月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

本发明还提供一种抗盐碱复合微生物菌剂，所述抗盐碱复合微生物菌剂包括权利要求1所述的楚氏喜盐芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、金黄节杆菌(Arthrobacter aurescens)、费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)和不动杆菌(Acinetobacter sp.)。

优选的是，所述巨大芽孢杆菌保藏编号为GSICC 30209；所述地衣芽孢杆菌保藏编号为GSICC 30203；所述金黄节杆菌保藏编号为GSICC 30144；所述费氏中华根瘤菌保藏编号为GSICC 31803；所述不动杆菌保藏编号为GSICC 30314。

优选的是，所述抗盐碱复合微生物菌剂中，所述楚氏喜盐芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、金黄节杆菌、费氏中华根瘤菌和不动杆菌的含菌量比例为(50-150):10:10:1:1:1。

本发明还提供所述的抗盐碱复合微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤：

(1)将楚氏喜盐芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、金黄节杆菌、费氏中华根瘤菌和不动杆菌6种微生物斜面种子分别依次经过液体种子培养、扩大培养，获取对应的6种发酵液；

(2)将楚氏喜盐芽孢杆菌发酵液、巨大芽孢杆菌发酵液、金黄节杆菌发酵液、费氏中华根瘤菌发酵液、地衣芽孢杆菌发酵液和不动杆菌发酵液按照体积比(1-3):1:1:1:1:1混合，制备抗盐碱复合微生物菌剂。

优选的是，步骤(1)中，所述液体种子培养和扩大培养均采用细菌液体培养基，所述细菌液体培养基包括以下重量份的组分：胰蛋白胨10份，酵母提取物5份，氯化钠10份以及蒸馏水1000份；

所述液体种子培养条件为：温度33℃，转速200r/min震荡培养30h；

所述扩大培养条件为：温度33℃，转速200r/min培养34h，直至楚氏喜盐芽孢杆菌发酵液中有效活菌数为5×10⁹CFU/mL；巨大芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌发酵液中有效活菌数分别为1×10⁹CFU/mL；金黄节杆菌、费氏中华根瘤菌和不动杆菌中有效活菌数分别为1×10⁸CFU/mL。

优选的是，6种微生物斜面种子的制备方法为：将楚氏喜盐芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、金黄节杆菌、费氏中华根瘤菌和不动杆菌分别接种于细菌固体斜面培养基，于30℃恒温培养48h后，分别得到对应的微生物斜面种子；所述细菌固体斜面培养基包括以下重量份的组分：胰蛋白胨10份，酵母提取物5份，氯化钠10份，琼脂20份以及蒸馏水1000份。

本发明还提供所述的楚氏喜盐芽孢杆菌，或者所述的抗盐碱复合微生物菌剂在促进盐碱土壤植被恢复中的应用。

本发明还提供所述的楚氏喜盐芽孢杆菌，或者所述的抗盐碱复合微生物菌剂在促进盐碱地制种农作物生长和产量提高方面的应用。

优选的是，所述农作物包括玉米。

本发明公开了以下技术效果：

1、本发明的微生物菌株分离自河西地区，应用于河西地区植被恢复和作物种植具有较好的促生性，说明微生物菌株适应河西地区土壤生态环境，可在该环境中定殖生长。

2、本发明还提供一种抗盐碱微生物土壤修复剂，其微生物菌株不仅可以分泌植物促生激素，同时具有溶磷、解钾和固氮，促进植物生长，提高土壤肥效，改善土壤微生物菌群结构的作用，同时对高浓度盐碱具有较强的耐受性，易在盐碱土壤环境存活繁殖，改良土壤的同时提高植物盐碱抗逆性，逐步缓解改良盐碱土壤。

3、本发明土壤修复制剂菌株之间无抑制作用，微生物菌种协同作用，共同发挥促生的作用。

4、本发明一种抗盐碱微生物土壤修复菌剂生产工艺简单，便于实现工业化生产。

5、本发明土壤修复菌剂通过田间试验验证，对盐碱土壤植被恢复具有积极的影响，对盐碱土壤制种玉米的生长、农艺性状及产量均有显著提高。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为不同菌株溶解无机磷的能力；

图2为不同菌株溶解有机磷的能力；

图3为楚氏喜盐芽孢杆菌(A)、金黄节杆菌(B)和地衣芽孢杆菌(C)的解钾能力；

图4为金黄节杆菌(A)、费氏中华根瘤菌(B)、不动杆菌(C)的生物固氮的能力；

图5为不同菌株分泌IAA的能力；

图6为不同菌株的ACC脱氨酶活性；

图7为不同恢复方式对植被平均高度的影响；

图8为不同恢复方式对植被盖度的影响。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

以下实施例所用菌株的来源：

(1)楚氏喜盐芽孢杆菌

采集甘肃河西盐碱地区植物根际土壤，具体为：取10g土样，加入到装有100mL无菌水的三角瓶中，在200rpm在摇床上震荡30min后，取1mL混匀后的液体土样，加入到新的装有9mL无菌水的试管中，在震荡器中震荡5min后，再取1mL液体土样加到新的装有9mL无菌水的试管中，直至将土样稀释到10^-8。依次选取10^-4、10^-5、10^-6和10^-7浓度的土样，分别吸取100μL涂布于细菌固体培养基，在30℃恒温培养，直至平板上长出菌落呈黄色，菌落较大，表面凸起，光滑湿润，边缘平整的菌株，通过平板划线法分离纯化，将菌株制成斜面，4℃保存备用。

细菌固体斜面培养基为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH至7.0。在121℃高压蒸汽灭菌20min。

采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株的总DNA后，利用通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)对其进行扩增。PCR反应体系：DNA模板3μL，10×PCR Buffer(含Mg²⁺)5.0μL，dNTP(2.5mmol/L)4.0μL，Taq酶(2.5U/μL)1.0μL，上、下游引物(10mol/L)各1μL，加ddH₂O至50μL。PCR反应条件：95℃10min；94℃30s，54℃40s，72℃90s，共30个循环；72℃12min。PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，利用PCR产物纯化试剂盒进行纯化，纯化后的产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。测结果在NCBI数据库中进行BLAST同源性分析，该菌株16s rDNA序列(SEQ IDNO：1)为：

GACGACGCTGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGCGGGAAGCGAGCGGATCCCTTCGGGGTGAAGCTCGTGGAACGAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGCAACCTGCCTGTAAGATCGGAATAACCCCGGGAAACCGGGGCTAATGCCGGGTAATACTTTCTTTCGCATGAAGGAAAGTTGAAAGATGGCTTCTTGCTATCACTTACAGATGGGCCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAACGATGAAGGTCTTCGGATCGTAAAGTTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTGCGAATAGAGCGGTACCTTGACGGTACCTAACGAGGAAGCCCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGTTCCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGGACAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTTTCTGACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGTTAGGGGGCTTCCACCCCTTAGTGCTGAAGTTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTTGGACAACCCTAGAGATAGGGCTTTCCCTTCGGGGACCAAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTAATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGCGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAAAGGGCAGCGAAGCCGCGAGGTGTAGCAAATCCCATAAAACCATTCTCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGCCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTGGCAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTTGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGGGCCAATGATTGGGGTGAA。

经上述鉴定获得的楚氏喜盐芽孢杆菌(Halobacillus trueperi)，已于2022年7月1日保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.25218。

(2)其他菌株

巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)菌购买于中国工业菌种保藏管理中心甘肃分中心，保藏编号为GSICC 30209；金黄节杆菌(Arthrobacter aurescens)购买于中国工业菌种保藏管理中心甘肃分中心，保藏编号为GSICC 30144；费氏中华根瘤菌(Sinorhizobiumfredii)购买于中国工业菌种保藏管理中心甘肃分中心，保藏编号为GSICC 31803；地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)购买于中国工业菌种保藏管理中心甘肃分中心，保藏编号为GSICC 30203；不动杆菌(Acinetobacter sp.)购买于中国工业菌种保藏管理中心甘肃分中心，保藏编号为GSICC 30314。

所述抗盐碱复合微生物菌剂，除楚氏喜盐芽孢杆菌外，其余菌株均从中国工业微生物菌种保藏管理中心甘肃分中心(http://jzk.gsmsc.cn)购买，这些菌株还可以通过还可从中国普通微生物菌种保藏管理中心(https://cgmcc.net/)、中国工业微生物菌种保藏管理中心(http://sales.china-cicc.org/)、广东微生物菌种保藏管理中心(https://www.gdmcc.net/main.do？method＝contactUs&css＝9&englist＝1)等获取，不作为本专利约束性保藏菌株。

实施例1菌株促生性能的测定

1、溶磷能力的测定

将楚氏喜盐芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、金黄节杆菌、费氏中华根瘤菌、地衣芽孢杆菌和不动杆菌分别接种至PKO无机磷培养基和蒙金娜有机磷培养基中，28℃、180r/min培养48h，采用钼锑抗显色法测定其解磷能力。

取菌株培养液于10000r/min离心15min，吸取上清液5mL于50mL容量瓶中，用水稀释至20mL，加2,6-二硝基酚指示剂2滴，用10％氢氧化钠或稀硫酸溶液调节pH至溶液刚呈微黄色(小心缓加，边加边摇，防止产生的二氧化碳把溶液喷出瓶口)，然后加入钼锑抗显色剂5mL，摇匀，定容至刻度。在室温(20℃～25℃)下放置30min，测定OD₆₉₀值。

上述PKO无机磷培养基为：(NH₄)₂SO₄ 0.1g，蔗糖10.0g，NaCl 0.5g，KCl 0.2g，MgSO₄ 0.1g，FeSO₄ 0.03g，MnSO₄ 0.03g，Ca₃(PO₄)₂ 3.0g，酵母浸粉0.5g，蒸馏水1000mL。

上述蒙金娜有机磷培养基为：葡萄糖10g，(NH₄)₂SO₄ 0.5g，NaCl 3g，KCl 0.3g，FeSO₄·7H₂O 0.03g，MnSO₄·H₂O 0.03g，MgSO₄·7H₂O 0.3g，CaCO₃ 5g，酵母膏0.4g，蒸馏水1000mL，pH7.0-7.5。100mL的蒙金娜培养基加入2g琼脂粉，包装，灭菌。用酒精擦净新鲜鸡蛋外壳，用解剖刀切破鸡蛋两端，溜去蛋清后将蛋黄流入已灭菌的锥形瓶中，约加入等量的无菌水，摇匀。待灭菌后的蒙金娜培养基冷却至50℃后，立即加入卵黄液，每100mL的蒙金娜培养基加卵黄稀释液1mL作为有机磷源，混匀后分装于培养皿内凝成平板。

2、解钾能力的测定

将楚氏喜盐芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、金黄节杆菌、费氏中华根瘤菌、地衣芽孢杆菌和不动杆菌分别划线接种于硅酸盐细菌培养基，30℃恒温培养3d，经3次重复实验，如果平板上能生长菌落并且呈光滑透明油滴状，则证明菌株具有解钾的能力。

上述硝酸盐细菌培养基为：蔗糖5g，MgSO₄ 0.5g，CaCO₃ 0.1g，NaHPO₄ 2g，FeCl₃0.005g，玻璃粉1g，蒸馏水1000mL，pH 7.0。

3、固氮能力的测定

采用划线接种的方法，将楚氏喜盐芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、金黄节杆菌、费氏中华根瘤菌、地衣芽孢杆菌和不动杆菌分别划线接种于Ashby固体培养基上，在30℃培养10d，连续转接3次，第3次依然能在Ashby培养基上生长的细菌则被视为具有固氮能力。

上述Ashby培养基为：KH₂PO₄ 0.2g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，NaCl 0.2g，CaCO₃ 5.0g，甘露醇10.0g，CaSO₄·2H₂O 0.1g,蒸馏水1000mL，pH6.8～7.0。

4、分泌IAA的定量测定

(1)IAA标准曲线的绘制

配制100μg/mL的IAA母液，用蒸馏水进行梯度稀释配制5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL和25μg/mL，每组设3组重复实验。采用Salkowski法进行测定，吸取待测液1mL，滴加1mL Salkowski比色液，在避光条件下显色30min后，迅速用分光光度计进行比色(530nm)，统计数据绘制标准曲线。

(2)菌株分泌IAA的定量测定

将楚氏喜盐芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、金黄节杆菌、费氏中华根瘤菌、地衣芽孢杆菌和不动杆菌6株耐盐碱菌株分别接种于含有L-色氨酸的LB培养液中，28℃、180r/min培养48h，于10000r/min离心10min，吸取离心上清液1mL，加4mL Salkowski比色液，在避光条件下显色30min后，迅速用分光光度计进行比色(530nm)。测量三组数据，结果取平均值，在标准曲线上找到相对应的产IAA的量。

上述Salkowski比色液：50mL 35％HClO₄+1mL 0.5mol/L FeCl₃。

5、ACC脱氨酶活性的测定

(1)标准曲线的绘制

用0.1mol/L Tris-HCl(pH 8.5)缓冲液配制100mmol/L的α-丁酮酸保存液，经梯度稀释配制终浓度0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0μmol/mL的α-丁酮酸溶液，各取200μLα-丁酮酸溶液加入300μL 0.2％的2,4-二硝基苯肼，30℃孵育30min，加2mL的2mol/L NaOH溶液显色苯腙，540nm测定吸光度。以α-丁酮酸的浓度(mmol/L)为横坐标，吸光率(A₅₄₀)为纵坐标绘制标准曲线。

(2)酶活力测定

①将楚氏喜盐芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、金黄节杆菌、费氏中华根瘤菌、地衣芽孢杆菌和不动杆菌分别接种至30mL DF液体培养基，在30℃、200r/min条件下避光振荡培养12h，得到菌悬液；

②菌悬液在4℃、8000rpm条件下低温离心10min，收集菌体沉淀；

③将菌体沉淀重悬在30mL ADF液体培养基中，然后在30℃、200rpm条件下振荡培养24h以诱导细菌的ACC脱氨酶活性；

④将上述步骤③诱导培养的菌悬液在4℃、8000rpm条件下低温离心10min，收集菌体沉淀，重悬于5mL 0.1mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.6)，在4℃、8000rpm条件下低温离心10min后收集沉淀。

⑤向步骤④最终收集的沉淀中加入1mL，0.1mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.6)悬浮菌体，然后转移至1.5mL离心管中，11000rpm条件下离心10min；重悬菌体于600μL，0.1mol/LTris-HCl缓冲液(pH 8.5)，加入30μL甲苯同时漩涡振荡30s来破碎菌体细胞；

⑥吸取200μL破碎细胞菌悬液，加入20μL 0.5mol/L ACC溶液，混匀后于30℃条件下水浴15min；然后向其中加入1mL，0.56mol/L HCl溶液混匀，在11000rpm转速下离心10min；

⑦取上述步骤⑥离心后上清液1mL，加入800μL 0.56mol/L HCl溶液混匀后，再加入300μL 2g/L 2,4-二硝基苯肼溶液，30℃下水浴30min。

⑧加入2mL 2mol/L NaOH溶液显色，检测OD₅₄₀，以无菌水代替菌悬液的处理作为空白对照。

将样品的OD₅₄₀值代入标准曲线计算其对应α-丁酮酸含量，将每分钟形成1μmoLα-丁酮酸的量定义为1个酶活力单位。

上述DF培养基的制备方法：DF培养基包括组分一和组分二，其中组分一(100mL)：MoO₃ 10mg，H₃BO₃ 10mg，MnSO₄·H₂O 11.19mg，CuSO₄·5H₂O 78.22mg，ZnSO₄·7H₂O 124.6mg；组分二(10mL)：FeSO₄·7H₂O 100mg；组分一溶于100mL无菌蒸馏水中，组分二溶解于10mL无菌蒸馏水中，低温冷藏备用。分别取组分一0.5mL，组分二0.2mL，MgSO₄·7H₂O 0.2g，柠檬酸2.0g，(NH₄)₂SO₄ 2.0g，葡糖酸2.0g，葡萄糖2.0g，KH₂PO₄ 4.0g，Na₂HPO₄ 6.0g，定容到1000mL，pH 7.0。

ADF培养基：将DF培养基中的(NH₄)₂SO₄替换成ACC。ACC母液浓度为0.5M，在ADF培养基中的添加量为6mL/L。

6、结果与分析

(1)溶磷能力的测定结果

当以磷酸三钙为唯一磷源时，结果如图1所示，检测48h内各培养基内产生的可溶性磷含量发现，最大值由高到低依次为地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、不动杆菌属、金黄节杆菌和费氏中华根瘤菌，最大值分别为448.25、430.17、375.06、282.58和279.32μg/mL；楚氏喜盐芽孢杆菌不能溶解无机磷。

当以卵磷脂为唯一磷源时，结果如图2所示，检测48h内各培养基内产生的可溶性磷含量，发现最大值由高到低依次为地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、不动杆菌属、费氏中华根瘤菌和金黄节杆菌，最大值分别为57.22、53.64、33.07、32.51和13.5μg/mL；楚氏喜盐芽孢杆菌不能溶解有机磷。

(2)解钾能力的测定结果

6株菌株分别接种到硅酸盐细菌培养基中，经过3次重复试验获得生长良好并且呈光滑透明油滴状的菌株，如图3所示，楚氏喜盐芽孢杆菌、金黄节杆菌和地衣芽孢杆菌具有解钾能力；而其他3株菌解钾能力均较差。

(3)固氮能力的测定结果

6株菌分别接种于Ashby固体培养基上，观察它们能否生长，推断它们是否拥有生物固氮的能力。结果如图4所示，在30℃下培养10d，经过连续转接3次后，金黄节杆菌、费氏中华根瘤菌和不动杆菌属Ashby固体培养基上长势良好，说明该3株菌具有固氮能力，而楚氏喜盐芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌未生长。

(4)分泌IAA的定量测定结果

在微生物接种后的48h内，对培养基中的IAA含量每隔12h进行检测。如图5所示，楚氏喜盐芽孢杆菌和费氏中华根瘤菌分泌吲哚乙酸(IAA)能力最强，其次分别为巨大芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和金黄节杆菌，不动杆菌属分泌能力最弱。

(5)ACC脱氨酶活性的测定

6株菌的菌悬液中均能够检测到ACC脱氨酶活性，但其活性表现出显著的差异。楚氏喜盐芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、费氏中华根瘤菌和巨大芽孢杆菌的ACC脱氨酶活性显著高于另外2株，金黄节杆菌和不动杆菌属几乎无ACC酶活性，如图6所示。

实施例2菌株耐盐碱性能的测定

将Gibbons改良培养基的盐度和碱度进行调整，以达到筛选耐盐碱菌株的目的。具体操作如下：

分别设置三组试验，第一组试验在保证培养基pH 9.0的条件下，通过外源向培养基中加入NaCl，以达到调节培养基盐度的作用，使各培养基中NaCl浓度分别为100、120、140、160、180、200g/L；第二组试验保证培养基NaCl浓度为100g/L的条件下，通过外源向培养基中加入1mol/L NaOH溶液以调节培养基的碱度，调节培养基的pH值分别为9.0、10.0、11.0、12.0；第三组试验分别调节培养基的pH值和NaCl浓度为：9.0和100g/L、11.0和140g/L、12.0和200g/L。最后将分离纯化的菌株接种于不同盐碱度的培养基上，37℃静置培养4d后观察菌落生长状况，筛选出耐盐碱能力较强的菌株。

上述Gibbson改良培养基为：干酪素5.0g，柠檬酸钠3.0g，酵母浸粉10.0g，KCl2.0g，蛋白胨5.0g，MgSO₄·7H₂O 2.0g，NaCl 100g，，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH值9.0。

结果如表1所示，在Gibbson改良培养基pH为9.0的前提下，菌株楚氏喜盐芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、金黄节杆菌、费氏中华根瘤菌、地衣芽孢杆菌和不动杆菌的耐盐能力相同，可耐受含盐量为200g/L以上的培养基。

当Gibbson改良培养基NaCl浓度保持在100g/L时，菌株楚氏喜盐芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、金黄节杆菌、费氏中华根瘤菌、地衣芽孢杆菌和不动杆菌的耐碱能力相同，最高能够生长在pH 12.0以上的碱性环境中。

在NaCl浓度为200g/L和pH 12.0时，菌株楚氏喜盐芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、金黄节杆菌、费氏中华根瘤菌、地衣芽孢杆菌和不动杆菌均可以生长，由此可以看出，6株菌株对高浓度盐、碱均有较强的耐受能力。

表1菌株的耐盐和耐碱能力

实施例3一种抗盐碱微生物土壤修复菌剂的制备方法

(1)微生物斜面种子的制备

将楚氏喜盐芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、金黄节杆菌、费氏中华根瘤菌、地衣芽孢杆菌和不动杆菌属分别接种于细菌固体斜面培养基，30℃恒温培养48h后，即为种子斜面。

上述细菌固体斜面培养基为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH至7.0。在121℃高压蒸汽灭菌20min。

(2)微生物液体种子的培养

将步骤(1)制备的楚氏喜盐芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、金黄节杆菌、费氏中华根瘤菌、地衣芽孢杆菌和不动杆菌属分别接种于细菌液体培养基，在温度为33℃，转速为200r/min震荡培养30h后，即为液体种子。

上述细菌液体培养基与上述细菌固体斜面培养基相同，区别为不添加琼脂。

(3)菌株液体扩大培养

将步骤(2)培养的楚氏喜盐芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、金黄节杆菌、费氏中华根瘤菌、地衣芽孢杆菌和不动杆菌属分别接种于50L发酵罐中，培养基为细菌液体培养基，接种量为10％，在温度为33℃，转速为200r/min培养34h，直至楚氏喜盐芽孢杆菌5×10⁹CFU/mL；巨大芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌发酵液中有效活菌数分别为1×10⁹CFU/mL；金黄节杆菌、费氏中华根瘤菌和不动杆菌中有效活菌数分别为1×10⁸CFU/mL。

所述细菌液体培养基与步骤(2)相同。

(4)微生物制剂的制备

将步骤(3)中分别扩大培养的微生物菌液，按体积比1:1:1:1:1:1混合均匀，即得到抗盐碱微生物土壤修复菌剂。

实施例4一种抗盐碱微生物土壤修复菌剂的制备方法

(1)-(3)同实施例3的(1)-(3)。

(4)微生物制剂的制备

将步骤(3)中分别扩大培养的微生物菌液，按体积比3:1:1:1:1:1混合均匀，即得到抗盐碱微生物土壤修复菌剂。

应用例1

黑河流域位于河西走廊中部，是我国西北干旱区的第二大内陆河流域，流域面积11.6×10⁴km²，总长821km。本研究区位于黑河中游流域(98°57'-100°52'E，38°39'-39°59'N)，从莺落峡至正义峡之间的河段，流域面积为2.56×10⁴km²。

在张掖黑河中游湿地选择：恢复方式1：自然恢复方式，即湿地恢复过程中无人为参与恢复与管理，仅依靠自然过程恢复的湿地恢复方式；恢复方式2：添加实施例3制备的抗盐碱微生物土壤修复菌剂；恢复方式3：添加实施例4制备的抗盐碱微生物土壤修复菌剂，分别将抗盐碱微生物土壤修复菌剂均匀的施加在各自样地；CK组：自然湿地，选择邻地未退化的自然湿地作为对照。待抗盐碱微生物土壤修复菌剂作用12个月，每6个月补施一次修复菌剂，统一采集土壤，统计植被。

试验结果：

植物可以适应自然条件变化并对自然条件改变做出反应，由此湿地植被可以用于评价湿地生态状况。由图7可知，施用修复菌剂的植被平均高度均明显高于恢复方式1和CK组，说明抗盐碱微生物土壤修复菌剂具有促进植被平均高度的效果；其中实施例4制备的土壤修复菌剂促进植被平均高度效果略好于实施例3。由图8可知，施用修复菌剂组和CK组植物盖度均明显高于恢复方式1，说明抗盐碱微生物土壤修复菌剂具有提高植物盖度的效果，其中实施例4制备的土壤修复菌剂提高植物盖度的效果稍好于实施例3。由图7和图8可知，抗盐碱微生物土壤修复菌剂中楚氏喜盐芽孢杆菌的含量增加对植被生长具有促进作用，但考虑到施用效果和成本投入，选择实施例3制备的抗盐碱微生物土壤修复菌剂作为促进黑河中游湿地恢复微生物菌剂。

上述结果说明，由于本发明制备的抗盐碱微生物土壤修复菌剂的使用，张掖黑河国家自然保护区植被恢复。

应用例2

甘肃省河西地区是我国最重要的制种基地之一，同时也成为全国最大的杂交玉米种子生产基地。甘肃省杂交玉米种子生产面积达150万亩，产种量5.5亿公斤，占全国杂交玉米种子用量的六成左右，面积和产量均居全国首位，并且种子合格率达100％。

选择河西地区玉米制种基地土壤盐碱含量较高的试验田，设置4个处理组，处理1：施用实施例3制备的抗盐碱微生物土壤修复菌剂；处理2：施用实施例4制备的抗盐碱微生物土壤修复菌剂；处理3：商品对照(北海业盛旺生物科技有限公司)；处理4：CK组，不添加微生物菌剂，每个处理3个重复，试验采用完全随机区组设计。在玉米三叶期和大喇叭口期分别补施微生物菌剂1次，玉米成熟期统计制种玉米农艺性状和产量。

施用抗盐碱微生物土壤修复菌剂对河西制种玉米的农艺性状及产量的影响如下表2所示。施用本发明土壤修复菌剂组玉米农艺性状及产量明显好于商品组和对照，说明本发明的一种抗盐碱微生物土壤修复菌剂有效促进制种玉米植株生长，提升制种玉米穗粒重量，提高制种玉米产量的效果；土壤修复菌剂组中，施用实施例4制备的土壤修复菌剂后玉米农艺性状好于实施例3，表明抗盐碱微生物土壤修复菌剂中楚氏喜盐芽孢杆菌的含量增加可促进制种玉米生长，综合考虑施用效果和成本投入，选择实施例3制备的抗盐碱微生物土壤修复菌剂作为制种玉米促生长微生物菌剂。

表2微生物菌剂对制种玉米农艺性状和产量的影响

土壤微生物在土壤有机物的降解、矿化释放无机元素供其他生物吸收，营养物质转化，系统稳定性及抗干扰能力中居于支配地位，控制着土壤生态系统功能的关键过程；土壤的综合肥力特征及土壤养分转化进程，可以作为衡量生态系统土壤质量变化的指标，主要来源于微生物。研究表明，随着土壤盐碱化程度的加重土壤微生物总数呈现显著降低的趋势，土壤酶活性呈现显著下降趋势，土壤养分含量呈现明显的降低趋势，说明微生物对盐碱地的修复起到了至关重要的作用。

通过上述实施例和应用例可以看出，本发明利用对高浓度的盐碱具有较强耐受性，且具有植物促生性能的微生物菌株发酵制备土壤修复剂。该土壤修复剂的微生物菌株对高浓度盐碱具有较好的耐受性，可以在盐碱地定殖生长，促进土壤酶活性提升、土壤养分提升；另外，本发明土壤修复剂中的微生物菌株均有植物促生性能，其溶磷解钾、固氮的作用促进了磷钾肥吸收，分泌产生的吲哚乙酸(IAA)、ACC脱氨酶等植物激素，对植物的生长促进作用具有广谱性。因此，本发明提供的一种抗盐碱微生物土壤修复菌剂，不仅具有修复盐碱土壤、平衡微生物菌群结构、提高土壤酶活性、提升土壤养分的功效，而且具有明显的植物促生性能，进一步提高了植物在盐碱土壤环境中的抗逆性，促进植物生长，逐步缓解土壤盐碱化。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (9)

1.一种楚氏喜盐芽孢杆菌（Halobacillus Trueperi），其特征在于，该菌株的保藏编号为CGMCC No.25218。

2.一种抗盐碱复合微生物菌剂，其特征在于，所述抗盐碱复合微生物菌剂包括权利要求1所述的楚氏喜盐芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、金黄节杆菌（Arthrobacter aurescens）、费氏中华根瘤菌（Sinorhizobium fredii）和不动杆菌（Acinetobacter sp.）；

所述巨大芽孢杆菌保藏编号为GSICC 30209 ；所述地衣芽孢杆菌保藏编号为GSICC30203；所述金黄节杆菌保藏编号为GSICC 30144；所述费氏中华根瘤菌保藏编号为GSICC31803；所述不动杆菌保藏编号为GSICC 30314。

3.如权利要求2所述的抗盐碱复合微生物菌剂，其特征在于，所述抗盐碱复合微生物菌剂中，所述楚氏喜盐芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、金黄节杆菌、费氏中华根瘤菌和不动杆菌的有效活菌数的比例为(50-150):10:10:1:1:1。

4.如权利要求2-3任一项所述的抗盐碱复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）将楚氏喜盐芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、金黄节杆菌、费氏中华根瘤菌和不动杆菌6种微生物斜面种子分别依次经过液体种子培养、扩大培养，获取对应的6种发酵液；

（2）将楚氏喜盐芽孢杆菌发酵液、巨大芽孢杆菌发酵液、金黄节杆菌发酵液、费氏中华根瘤菌发酵液、地衣芽孢杆菌发酵液和不动杆菌发酵液按照体积比（1-3）:1:1:1:1:1混合，制备抗盐碱复合微生物菌剂。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述液体种子培养和扩大培养均采用细菌液体培养基，所述细菌液体培养基包括以下重量份的组分：胰蛋白胨10份，酵母提取物5份，氯化钠10份以及蒸馏水1000份；

所述液体种子培养条件为：温度33℃，转速200r/min震荡培养30h；

所述扩大培养条件为：温度33℃，转速200r/min培养34h，直至楚氏喜盐芽孢杆菌发酵液中有效活菌数为5×10⁹ CFU/mL；巨大芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌发酵液中有效活菌数分别为1×10⁹ CFU/mL；金黄节杆菌、费氏中华根瘤菌和不动杆菌中有效活菌数分别为1×10⁸CFU/mL。

6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，6种微生物斜面种子的制备方法为：将楚氏喜盐芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、金黄节杆菌、费氏中华根瘤菌和不动杆菌分别接种于细菌固体斜面培养基，于30℃恒温培养48h后，分别得到对应的微生物斜面种子；所述细菌固体斜面培养基包括以下重量份的组分：胰蛋白胨10份，酵母提取物5份，氯化钠10份，琼脂20份以及蒸馏水1000份。

7.如权利要求1所述的楚氏喜盐芽孢杆菌，或者权利要求2-3任一项所述的抗盐碱复合微生物菌剂在促进盐碱土壤植被恢复中的应用。

8.如权利要求1所述的楚氏喜盐芽孢杆菌，或者权利要求2-3任一项所述的抗盐碱复合微生物菌剂在促进盐碱地制种农作物生长和产量提高方面的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述农作物包括玉米。