CN114921384B - 一种枯草芽孢杆菌及其在降解中链和短链氯化石蜡中的应用 - Google Patents

一种枯草芽孢杆菌及其在降解中链和短链氯化石蜡中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种枯草芽孢杆菌及其在降解中链和短链氯化石蜡中的应用。本发明提供了一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)RX17，该菌株保藏编号为CGMCC NO.7.447。本发明提供的RX17菌株能够高效降解短链氯化石蜡(SCCPs)和中链氯化石蜡(MCCPs)，可在15天内将SCCPs和MCCPs降解到较低的程度。该菌株可用于制备氯化石蜡生物清除剂，一方面可应用于降解水体及土壤环境中的SCCPs和MCCPs污染，另一方面可应用于清除发酵饲料(青贮饲料)中的SCCPs和MCCPs残留，在促进环境治理及保障饲料安全等方面具有巨大的应用前景。

Description

一种枯草芽孢杆菌及其在降解中链和短链氯化石蜡中的应用
技术领域
本发明属于微生物石蜡降解技术领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)RX17，所述菌株的菌剂及其在降解中链和短链氯化石蜡中的应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
氯化石蜡(chlorinated paraffins，CPs)是烷烃经氯化形成的混合物，根据碳链长度主要分为短链氯化石蜡(C10-13，short-chain chlorinated paraffins，SCCPs)、中链氯化石蜡(C14-17，mediumchain chlorinated paraffins，MCCPs)与长链氯化石蜡(C≥18，long-chain chlorinated paraffins，LCCPs)。CPs一种价格低廉的氯代烷烃混合物，因具有阻燃性、低挥发性以及绝缘性等特点，被广泛用于阻燃剂、人造革、聚氨酯防水涂料等产品的生产。然而，CPs也是环境中普遍存在的难以降解的有毒污染物，广泛分布于大气、生物体、水体、土壤以及沉积物等各种环境介质中，甚至极地地区也有检出。短链氯化石蜡(SCCPs)和中链氯化石蜡(MCCPs)是氯化石蜡的两个主要类别，尤其是SCCPs，由于其具有高毒性、难降解，并能够在食物链中富集放大的特点，于2017年被列入《关于持久性有机污染物的斯德哥尔摩公约》，目的是限制氯化石蜡混合物中SCCPs的浓度。最近研究表明，MCCPs和SCCPs具有相似的性质，如生态毒性、远距离迁移性以及容易在生物体内蓄积而被限制使用。有研究发现，氯化度超过46％的MCCPs具有持久性和毒性，在环境样品中检出含量较高，因此MCCPs的生产应用可能给环境和生物圈带来新的负面影响与健康风险。
人体和畜禽动物的CPs暴露途径分为食品摄入、呼吸吸收、皮肤接触等，其中食品摄入是最大暴露源之一。人类暴露于CPs主要是通过饮食摄入，特别是动物源性食品。然而，关于乳制品中氯化石蜡浓度的信息仍然很少。最近关于畜产品以及饲料中短链和中链氯化石蜡污染特征的研究，揭示了氯化石蜡在“环境—青贮饲料—奶牛—生鲜乳”生产链条中的迁移转化规律，发现奶牛饲料(青贮饲料)可能是牛奶中短链和中链氯化石蜡的重要来源。因此，控制动物饲料中氯化石蜡的浓度，是减少动物源性食品中氯化石蜡、限制人类接触这些化合物的关键。生物去除法作为最经济的方法，对污染物进行生物吸附或生物降解，被认为是去除环境中有机污染物最可靠的方法之一，备受研究者青睐。在CPs的生物降解研究方面，已经鉴定出多株能够以SCCPs为碳源和能源的SCCPs降解菌，但缺点在于有效降解周期较长。而能够有效降解MCCPs的菌株还未见报道。因此，寻找能够高效降解SCCPs和MCCPs的菌株具有重要意义。
芽孢杆菌属革兰阳性菌，一般好氧生长，菌体呈杆状，在特定条件下可形成圆形、椭圆形或圆柱形芽孢。芽孢杆菌由于其芽孢的抗逆性及功能代谢产物分泌的多样性，目前已经被广泛应用于生物农药、生物肥料、生物保鲜、医药保健、生物饲料和污染防治等领域。
发明内容
鉴于此，本发明提供了一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)RX17及其在降解中链和短链氯化石蜡中的应用。
本发明可通过以下技术方案实现：
本发明提供了一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)RX17，该菌株已于2022年6月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址为：中国，武汉，武汉大学，其生物保藏号为：CCTCC NO：M 2022888。
上述菌株RX17分离自黄河三角洲石油开采区水底沉积物，菌株已完成全基因组测序，其菌株基因组为环状基因组，大小为4215640bp，GC含量43.51％，编码功能基因4440个。
菌株RX17具有枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的鉴定特征，认定为枯草芽孢杆菌。另外，菌株RX17内生孢子，具有较强的产孢能力，在产孢培养基中养3d后的芽孢产量为48.1×106CFU/mL，产率达82.5％。
除上述产孢特性外，本发明还发现，菌株RX17具有良好的抗逆性，具体表现在以下方面：
(1)具有较强的耐盐性，3％NaCl处理下RX17能够保持正常生长；
(2)具有良好的耐热性，菌落在50℃下还能够正常生长；在60℃下虽不能生长，但是在处理3天后，RX17仍能保持活力，在转移到30℃条件下可以正常生长；
(3)具有较强的耐酸和耐胆碱特性，在pH 3和3％胆碱浓度下仍能保持较高生长活力。
另外，菌株RX17还能够分泌淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶等多种降解酶类，促进饲料中淀粉、蛋白质等营养成分的高效分解，提高机体对营养物质的使用效率，从而提高菌株存活率。进一步的，本发明研究发现，菌株RX17能够以中链和短链氯化石蜡为唯一碳源和能源进行生长，并快速降解；在以中链和短链氯化石蜡作为简单碳源的培养基中，菌株RX17可在15天内将中链和短链氯化石蜡降解至降低水平，其中，中链氯化石蜡(MCCPs)去除率可达81.33％。
基于上述特性，本发明联想到将菌株RX17用于中链和短链氯化石蜡的微生物降解领域，本发明验证的一种实施方式中，将菌株RX17添加至被中链和短链氯化石蜡污染的饲料原料中，菌株可以有效降低饲料中的中链和短链氯化石蜡含量，保障畜禽养殖的生物安全。
另一种验证的实施方式中，本发明将菌株RX17与培养基载体混合制备了一种微生物菌剂，并将其施用于氯化石蜡污染的土壤中，微生物菌剂能够有效降解污染土壤中的中链和短链氯化石蜡，去除率可以达到70％以上。
以上一个或多个技术方案的有益效果是：
本发明提供的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)RX17分离于黄河三角洲石油开采区水底沉积物，具有高效降解短链氯化石蜡(SCCPs)和中链氯化石蜡(MCCPs)的能力，具有作为氯化石蜡生物清除剂的潜力，可作为饲料添加用于清除发酵饲料(青贮饲料)中的SCCPs和MCCPs残留，也通过制备菌剂用于降解水体及土壤环境中的SCCPs和MCCPs污染。同时，该菌株为野生型，遗传背景清晰，适合进行遗传改良，有望通过基因工程手段大幅提高其污染物处理能力，在促进环境治理及保障饲料安全等方面具有巨大的应用前景。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为实施例1中所述RX17的全基因组测序结果；
图2为实施例1中所述RX17的耐盐特性；
图3为实施例1中所述RX17的耐热特性；
图4为实施例1中所述RX17的产酶(蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶)特性。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
本发明第一方面，提供一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)RX17，该菌株已于2022年6月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址为：中国，武汉，武汉大学，其生物保藏号为：CCTCC NO：M 2022888。
优选的，所述枯草芽孢杆菌RX17的菌体特征如下：菌株杆状，圆形菌落，大小1-2mm，边缘整齐，呈浅黄色，不透明；表面粗糙灰暗，质地干燥，表面粗糙，边缘不规则，正面灰白色或浅色，形态扁平，易挑起，不产色素；内生孢子，芽孢(0.6～0.9)μm×(1.0～1.5)μm,椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。
优选的，所述枯草芽孢杆菌RX17采用营养肉汁培养基进行培养，所述营养肉汁培养基配置方式如下：每1L水中含有牛肉膏2～4g、蛋白胨8～12g、琼脂18～22g，pH6.8～7.2，灭菌。
优选的，所述枯草芽孢杆菌RX17的产孢培养基的配方如下：葡萄糖1～3％、豆粕0.5～1.5％、蛋白胨0.05～1.15％、硝酸钠0.1～0.3％、磷酸二氢钾0.05～0.15％、磷酸氢二钠0.03～0.08％，硫酸镁0.01～0.04％，硫酸锰0.01～0.04％，余量为水。
优选的，所述产孢培养方式如下：初始pH值7-7.2，温度28～32℃，转速150～220r/min，接种量为1～4％接种至产孢培养基中。
本发明第二方面，提供一种菌剂，所述菌剂包括第一方面所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)RX17或所述菌株的培养物、代谢物。
上述第二方面所述菌剂的一种实施方式中，包括第一方面所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)RX17的活化菌株或保藏菌株。
优选的，所述菌剂的剂型包括液体菌剂、粉剂或颗粒剂；
进一步的，所述液体菌剂的具体实例如水悬浮剂、可分散油悬浮剂；所述粉剂的具体实例如可湿性粉剂；所述颗粒剂的具体实例如水分散颗粒剂。
优选的，所述菌剂中，还包括培养基载体；所述培养基载体为包括但不限于硅藻土、草炭、麸皮中的一种或其组合；一种具体的实施方式中，本发明提供一种菌剂，包含2×(106-108)CFU·g-1的RX17芽孢，制备方法如下：将芽孢液和培养基载体搅拌混合，置于65℃下保温烘干后，粉碎，制得所述菌剂。
本发明第三方面，提供第一方面所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)RX17和/或第二方面所述菌剂在降解中链和短链氯化石蜡中的应用。
优选的，所述在氯化石蜡降解方面的应用包括大气、水体、土壤、生物体及食物中中链和短链氯化石蜡的降解。
进一步的，所述食物为动物饲料或饲料原料，所述饲料原料包括但不限于小麦、玉米、大豆及其副产品；具体的，如豆粕、小麦秸秆、麦麸或玉米秸秆等。
进一步的，所述土壤中中链和短链氯化石蜡的降解中，采用第二方面所述菌剂，具体实施方式为：向待处理的污染土壤中，施用第二方面所述菌剂，施用时间可根据污染土壤中氯化石蜡的积累量及土壤状况进行调整，例如20～35天。
本发明第四方面，提供一种氯化石蜡的生物清除剂，所述生物清除剂中包括第一方面所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)RX17，和/或第二方面所述菌剂。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例1
1、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)RX17的分离及鉴定
(1)菌种分离：
从黄河三角洲石油开采区水底沉积物，称取10g样品，干燥后碾碎呈细微粉末状，置于含有90mL 0.9％NaCl盐水的灭菌三角瓶中，28℃，160r/min，震荡1h充分混匀，制成悬浊液；取1mL置于50mL营养肉汁液体培养基内，30℃，150r/min富集培养24h。将获得的菌悬液在90℃水浴中孵育10min，取0.1mL以无菌水稀释成10-6、10-7和10-8三个浓度梯度，涂布营养肉汁琼脂平板，30℃培养24h。挑选具有芽孢的菌落，利用营养肉汁琼脂平板划线培养，获得单菌落，保存备用。营养肉汁液体培养基配方为：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，蒸馏水1.0L，pH 7.0，如营养肉汁琼脂培养基配置再加入琼脂20.0g。pH 7.0～7.2。121℃，15min灭菌。
(2)菌株鉴定：
本实施例对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)RX17开展了全基因组测序工作，基因组图谱示意图如图1所示，其菌株基因组为环状基因组，大小为4215640bp，GC含量43.51％，编码功能基因4440个。经比对RX17为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)RX17。
2、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)RX17发酵产孢实验
种子培养：挑取生长状态良好的平板培养基，挑取活化菌接种到营养肉汁液体培养基中，30℃，150r/min培养24h，收集菌液作为种子液。
产芽孢培养基配方为：葡萄糖2％，豆粕1％，蛋白胨0.1％，硝酸钠0.2％，磷酸二氢钾0.1％，磷酸氢二钠0.05％，硫酸镁0.02％，硫酸锰0.02％。
发酵条件为初始pH值7，温度30℃，转速200r/min，装液量125mL/250mL，接种量3％。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)RX17具有较强的产孢能力，在产孢培养基中养3d后的芽孢产量为48.1×106CFU/mL，产率达82.5％。
3、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)RX17抗逆性的鉴定
(1)耐盐实验
在营养肉汁平板上活化RX17菌株，30℃避光培养24-48h，挑取生长状态良好的平板培养基，用接种针挑取活化菌接种到含有不同浓度NaCl的营养肉汁平板上。将平板置于30℃倒置培养，观察菌落生长情况。
结果发现，枯草芽孢杆菌RX17有较强的耐盐性，在3％NaCl处理下，RX17能保持正常的生长(图2)。
(2)耐热实验
在营养肉汁平板上活化RX17菌株，30℃避光培养24-48h，挑取生长状态良好的平板培养基，用接种针挑取活化菌接种到营养肉汁平板上。将接有菌块的平板置于40℃-70℃培养，观察菌落生长情况。另外，将接有菌块的平板置于70℃培养3d后，将平板转入30℃培养，观察菌落生长情况。
结果发现：RX17菌体具有很强的耐热性，在50℃下还能够正常生长(图3A)。在60℃下虽不能生长，但是在处理3天后，RX17菌落仍能保持活力，在转移到30℃条件下可以正常生长(图3B)。
4、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)RX17在模拟胃酸条件下的耐酸和耐胆碱能力鉴定
在营养肉汁平板上活化RX17菌株，30℃避光培养24-48h，挑取生长状态良好的平板培养基，用接种针挑取活化菌接种到调节好pH(pH1、pH3、pH5)和加入了不同浓度牛胆碱盐(1％、3％、5％)的营养肉汁培养液中，温度30℃，转速200r/min，培养12h，采用分光光度计(λ＝600nm)测定菌液吸光度来检测菌株生长状况。
表1枯草芽孢杆菌RX17耐酸能力鉴定
Figure BDA0003698540770000071
表2枯草芽孢杆菌RX17耐牛胆碱盐能力鉴定
Figure BDA0003698540770000072
结果发现：RX17在pH 3和3％牛胆碱盐浓度下仍能保持较高的生长活力，其中在pH3条件下RX17能保持80.4％的生长速率(表1)，而在3％牛胆碱盐浓度下RX17能保持61.6％的生长速率(表2)。
5、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)RX17产降解酶特性
在营养肉汁平板上活化RX17菌株，30℃避光培养24-48h，挑取生长状态良好的平板培养基，用接种针挑取活化菌接种到含有不同底物的筛选培养基平板上。将平板置于30℃倒置培养48h，观察菌落生长和水解圈情况。蛋白酶筛选培养基配方为：酵母粉5.0g、葡萄糖10.0g、磷酸氢二钾4.0g、脱脂奶粉20.0g、琼脂20.0g、蒸馏水1 000mL、pH 7.0-7.2；纤维素酶筛选培养基配方为：蛋白胨5.0g、酵母粉5.0g、CMC-Na 20.0g、磷酸氢二钾4.0g、琼脂20.0g、蒸馏水1 000mL、pH 7.0-7.2；淀粉酶筛选培养基配方为：淀粉10.0g，蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，NaCl 10.0g，琼脂粉20.0g，蒸馏水1 000mL，pH 7.0-7.2。
结果显示：在培养48h后，RX17在蛋白酶筛选培养基、淀粉酶筛选培养基和纤维素酶筛选培养基上均能正常生长，有明显水解圈产生，说明RX17具有良好的产蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶的特性(图4)。
表3枯草芽孢杆菌RX17体外模拟消化试验
Figure BDA0003698540770000081
体外模拟消化试验，将豆粕、小麦麸、玉米面经80℃烘干处理24h后粉碎、过筛(80目)，配合成组合饲料(A：玉米面+豆粕；B：玉米面+小麦麸)。称取三种组合饲料10g于250mL三角瓶中，灭菌后加入50mL的无菌水，加入RX17菌液1mL，摇匀静置，调节至pH 6左右，加入10％猪胆酸盐溶液，37℃、50r/min培养72h后测定干物质消化率、粗纤维消化率、可溶性蛋白增加量。
结果显示：在处理72h后，RX17有效增强了饲料的干物质消化率、组纤维消化率，显著提高了可溶性蛋白增加率(表3)。
实施例2
1、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)RX17对中链和短链氯化石蜡的利用和降解情况
在营养肉汁平板上活化RX17菌株，30℃避光培养24-48h，挑取生长状态良好的平板培养基，用接种针挑取活化菌接种到营养肉汁培养液中，温度30℃，转速200r/min，培养24h。按3％加样量将RX17菌液加入到以中链和短链氯化石蜡为唯一碳源和能源的培养基(硝酸钠0.2％、磷酸氢二钾0.4％、NaCl 0.5％、七水硫酸镁0.5％、硫酸亚铁0.01％、中链或短链氯化石蜡50mg/L、pH 7.0-7.2)中培养。培养温度30℃，转速200r/min。
氯化石蜡的检测采用Agilent 7890A-7000A气相色谱三重四极杆质谱仪，SCCPs、MCCPs标准溶液购自于德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司。仪器条件：不分流模式下，采用DB-5MS(30m×0.25mm，0.25μm，Agilent，CA)模式进样1μL，进样口温度为275℃。以氦气为载气，流速1.2mL/min，甲烷为反应气，流速0.4mL/min。炉温升温程序如下：初始温度100℃，保持1min，以30℃/min升至160℃，保持5min，最后以30℃/min升至310℃，保持17min。传输线温度为280℃，离子源温度为200℃。
表4枯草芽孢杆菌RX17对中链和短链氯化石蜡的利用和降解
Figure BDA0003698540770000091
结果显示：RX17可在15天内将中链和短链氯化石蜡降解至降低水平，其中中链氯化石蜡(MCCPs)去除率可达81.33％，短链氯化石蜡(SCCPs)去除率可达87.91％(表4)。
2、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)RX17对发酵饲料中中链和短链氯化石蜡的消除效果
将被中链和短链氯化石蜡污染的小麦秸秆样品经研磨、灭菌，再经40℃烘干至恒重，测量其中链和短链氯化石蜡的含量。取RX17菌株发酵液，与上述小麦样品按照5:1(体积质量比)混合；以添加等体积液体培养基的小麦样品作为空白对照，30℃孵育72h，测量样品中中链和短链氯化石蜡的残留量。
表5枯草芽孢杆菌RX17对发酵饲料中中链和短链氯化石蜡的降解效果
Figure BDA0003698540770000092
Figure BDA0003698540770000101
结果显示：RX17可用于被中链和短链氯化石蜡污染饲料原料的添加和发酵，有效降解发酵饲料中的中链和短链氯化石蜡含量，处理72h后中链氯化石蜡(MCCPs)去除率可达51.73％，短链氯化石蜡(SCCPs)去除率可达57.01％(表5)。
3、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)RX17的菌剂制备及其对土壤中中链和短链氯化石蜡的降解效果
孢子液的制备：按照实施例2所述方法制备RX17孢子液，使用活菌计数法计算孢子产量，调整浓度为2×108CFU/mL。
菌剂载体的制备：分别称量硅藻土3000g、草炭1500g和麸皮750g，气流粉碎并过300目筛，收集得培养基载体。
复合菌剂的制备：取RX17孢子液(浓度2×108CFU/mL)，与200g菌剂载体搅拌混匀并置于65℃下保温烘干，随后粉碎过200目筛，收集得枯草芽孢杆菌RX17菌剂，此微生物菌剂种包含RX17芽孢的数量为2×(106-108)CFU·g-1。
取耕地用土(未经烘烤、灭菌)，用于室内模拟试验。按喷雾量0.075L/m2喷施36mg/L中链氯化石蜡或短链氯化石蜡溶液，混匀。48h后取样，测定土壤中中链氯化石蜡和短链氯化石蜡的含量。将制备菌剂按1％的施加量加入污染土壤中，混合均匀，处理30d后，取土壤样品再次测定中链氯化石蜡和短链氯化石蜡的残留含量，计算降解率。
表6枯草芽孢杆菌RX17对模拟污染土壤中中链和短链氯化石蜡的降解效果
Figure BDA0003698540770000102
结果显示：施加该菌剂可有效降解污染土壤中的中链和短链氯化石蜡，处理30d后中链氯化石蜡(MCCPs)去除率可达71.67％，短链氯化石蜡(SCCPs)去除率可达77.91％(表6)。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (15)

1. 一种枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）RX17，其特征在于，该菌株已于2022年6月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址为：中国，武汉，武汉大学，其生物保藏号为：CCTCC NO：M 2022888。
2. 如权利要求1所述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）RX17，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌RX17的菌体特征如下：菌株杆状，圆形菌落，边缘整齐，呈浅黄色，不透明；表面粗糙灰暗，质地干燥，表面粗糙，边缘不规则，正面灰白色或浅色，形态扁平，易挑起，不产色素；内生孢子，芽孢 (0.6～0.9)μm× ( 1.0～1.5)μm , 椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。
3. 如权利要求1所述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）RX17，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌RX17采用营养肉汁培养基进行培养，所述营养肉汁培养基配置方式如下：每1L水中含有牛肉膏2~4g、蛋白胨8~12g、琼脂18~22g，pH6.8~7.2，灭菌。
4. 如权利要求1所述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）RX17，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌RX17的产孢培养基的配方如下：葡萄糖1~3%、豆粕0.5~1.5%、蛋白胨0.05~1.15%、硝酸钠0.1~0.3 %、磷酸二氢钾0.05~0.15%、磷酸氢二钠0.03~0.08%，硫酸镁0.01~0.04%，硫酸锰0.01~0.04%，余量为水。
5. 如权利要求4所述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）RX17，其特征在于，所述产孢培养方式如下：初始pH值7-7.2，温度28~32℃，转速150~220 r/min，接种量为1~4%接种至产孢培养基中。
6. 一种菌剂，其特征在于，所述菌剂包括权利要求1-4任一项所述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）RX17或所述菌株的培养物。
7. 如权利要求6所述菌剂，其特征在于，所述菌剂中，包括所述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）RX17的活化菌株或保藏菌株；
或，所述菌剂的剂型包括液体菌剂、粉剂或颗粒剂。
8.如权利要求7所述菌剂，其特征在于，所述液体菌剂具体为水悬浮剂或可分散油悬浮剂；所述粉剂的具体为可湿性粉剂；所述颗粒剂的具体为水分散颗粒剂。
9.如权利要求6所述菌剂，其特征在于，所述菌剂中，还包括培养基载体；所述培养基载体为包括但不限于硅藻土、草炭、麸皮中的一种或其组合。
10.如权利要求9所述菌剂，其特征在于，所述菌剂中，所述菌剂中包含2×（106-108）CFU·g-1的RX17芽孢，制备方法如下：将芽孢液和培养基载体搅拌混合，置于65℃下保温烘干后，粉碎，制得所述菌剂。
11. 权利要求1-5任一项所述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）RX17和/或权利要求6-10任一项所述菌剂在降解中链和短链氯化石蜡中的应用。
12. 如权利要求11所述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）RX17和/或菌剂在降解中链和短链氯化石蜡中的应用，所述在氯化石蜡降解方面的应用包括水体、土壤、生物体及食物中中链和短链氯化石蜡的降解。
13. 如权利要求12所述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）RX17和/或菌剂在降解中链和短链氯化石蜡中的应用，其特征在于，所述食物为动物饲料或饲料原料，所述饲料原料为豆粕、小麦秸秆、麦麸或玉米秸秆。
14. 如权利要求12所述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）RX17和/或菌剂在降解中链和短链氯化石蜡中的应用，其特征在于，所述土壤中中链和短链氯化石蜡的降解，采用权利要求6-10任一项所述菌剂。
15. 一种氯化石蜡的生物清除剂，其特征在于，所述生物清除剂中包括权利要求1-5任一项所述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）RX17，和/或权利要求6-10任一项所述菌剂。
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