CN103045511B - 一株具有解磷解钾功能的产纤维素酶地衣芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

一株具有解磷解钾功能的产纤维素酶地衣芽孢杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株具有解磷解钾功能的产纤维素酶地衣芽孢杆菌及其应用。本发明公开了一株保藏号为CCTCC No.M 2012457的地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis）BL-1，该菌株可产纤维素酶且兼具良好的解磷解钾能力，将该菌株与酵母菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、圆褐固氮菌进行科学复配后可制成复合微生态制剂，将按比例添加该复合微生态制剂的微生物活性污泥有机肥料直接或经堆肥发酵后施用于作物生长区域，具有明显的肥田增产效应。本发明实现了燃料乙醇生产企业废弃活性污泥的高效资源化综合利用，同时杜绝了环境污染，处理工艺简单，应用成本低，有利于生态保护和农业的可持续发展。

Description

一株具有解磷解钾功能的产纤维素酶地衣芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术及微生物肥料领域，具体涉及一株具有解磷解钾功能的产纤维素酶地衣芽孢杆菌，一种包含该地衣芽孢杆菌的高效微生态制剂，以及该微生态制剂在提高燃料乙醇生产工业废弃活性污泥肥料效应上的应用。
背景技术
化学肥料是农业生产中必不可少的肥料，在肥料领域占据主导性地位已近百年，对农业生产贡献巨大。但是，化肥的长期使用不仅会降低农作物品质，引起土壤板结等现象，还会导致环境污染，十分不利于农业的可持续发展。近年来，世界各国都在研究用无毒无害的微生物发酵肥料来取代或部分取代化肥，主要集中在自然菌种的有效利用、化学模拟以及基因工程菌等几个方面，在此基础上开发的各种微生态制剂在国内被越来越多的用于提高有机肥料的功效和利用率。
作为新一代的清洁环保型可再生燃料，乙醇燃料在我国拥有巨大的产能。我国主要以粮食发酵来生产燃料乙醇，然而微生物发酵过程中会产生大量的污水，通过城市污水处理后剩余的活性污泥量也不断增加。活性污泥是微生物残体与多种营养成分的混合物，富含淀粉、脂肪、纤维素和蛋白质等有机物质。鉴于直接进行自然堆放或填埋处理造成的人力耗费以及资源浪费，寻求活性污泥的资源化利用途径成为当前的研究热点。
目前，许多专利和文献都对工业废弃活性污泥的资源化综合利用进行了报道。申请号为CN00114561.4专利在啤酒酿造厂产生的活性污泥中直接添加市售氮磷钾等元素制备成有机复合肥；申请号为CN201110207584.6利用生物菌液和酶制剂综合处理活性污泥后，通过固态发酵处理得到有机肥料；2010年，陈毅明等将具有固氮、解磷解钾功能的菌种复配到味精厂废弃活性污泥中，通过发酵得到微生物复合肥料（北京化工大学学报，2010年第37卷第6期第107页）。但目前还没专门针对燃料乙醇生产厂废弃活性污泥的高效资源化利用方法。
发明内容
针对现有技术存在的上述缺陷，本发明提供了一株具有解磷解钾功能的产纤维素酶地衣芽孢杆菌及其应用。本发明菌株可产纤维素酶且兼具良好的解磷解钾能力，由该菌株和其他微生物菌株（酵母菌等）按一定比例复配制成的复合微生态制剂可提高燃料乙醇生产工业废弃活性污泥的肥料效应，实现了活性污泥的高效资源化利用。
本发明的技术方案如下：
本发明提供了一株具有解磷解钾功能的产纤维素酶地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）BL-1，保藏编号为CCTCC No.M 2012457。
本发明提供了一种复合微生态制剂，由酵母菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌BL-1、巨大芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、圆褐固氮菌的活菌干粉制剂按照活菌数量比10∶1∶2∶1∶1∶10的比例经混合而成。
其进一步的技术方案为：
所述复合微生态制剂的活菌总数为1.0×109～1.0×1010cfu/g。
本发明提供了一种上述复合微生态制剂在提高燃料乙醇生产工业废弃活性污泥肥料效应上的应用，是将所述复合微生态制剂按照重量百分比0.1～1.0％的比例与所述活性污泥均匀混合制得微生物有机肥料，将其直接或进行发酵后施用于作物生长区域。
其进一步的技术方案为：
所述发酵为堆肥发酵，其条件控制为：发酵初始水分30～50％，发酵温度5～45℃，发酵时间3～15天；优选地，所述发酵温度为20～38℃。
其进一步的技术方案为：
所述作物生长区域包括农田、林地或景观苗圃。
本发明的有益技术效果是：
本发明公开了一株具有解磷解钾功能的产纤维素酶地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）BL-1（保藏编号：CCTCC No.M 2012457）。该菌株可产纤维素酶且兼具良好的解磷解钾能力，将该菌株与酵母菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、圆褐固氮菌经科学复配后可制成复合微生态制剂，该微生态制剂一方面可有效分解利用燃料乙醇生产企业废弃活性污泥中的营养成分，大大提高活性污泥有效组分（如N、P、K、有机质、SO4 2-、Cl）的含量，使其更好地被作物吸收，同时由于微生物自身增殖产生种类丰富的维生素、氨基酸等物质，能促进作物更好地生长；将按比例添加本发明复合微生态制剂的微生物活性污泥有机肥料直接或经堆肥发酵后施用于作物生长区域，具有明显的肥田增产效应，且土壤不板结；本发明实现了燃料乙醇生产企业废弃活性污泥的高效资源化综合利用，变废为宝，同时杜绝了环境污染，处理工艺简单，应用成本低，有利于生态保护和农业的可持续发展。
本发明所提供的具有解磷解钾功能的产纤维素酶地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis）BL-1，已于2012年11月14日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号：CCTCC M 2012457，保藏地址：中国，武汉，武汉大学。该菌株以下简称：地衣芽孢杆菌BL-1CCTCC M 2012457。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步的描述，以下实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
实施例1
实施例1地衣芽孢杆菌BL-1CCTCC M 2012457的筛选和分离
于2011年5月从河南、安徽、江苏三地的林地中采集土壤样品7份，用以羧甲基纤维素作为唯一碳源的平板培养基（培养基成分按重量百分数计如下：羧甲基纤维素钠1.0％、KH2PO4 0.1％、胰蛋白胨0.3％、酵母膏0.1％、质量浓度2％的刚果红水溶液0.2％、琼脂2.0％，其余成分为水）进行分离，分离方法为微生物典型的稀释涂布法，并于37℃在恒温箱中过夜培养；根据培养基上生长菌落所产生透明圈的大小来确定菌株产纤维酶能力的强弱，最终筛选得到一株产纤维素酶能力最强的菌株（透明圈最大）。
实施例2地衣芽孢杆菌BL-1CCTCC M 2012457的鉴定
1．菌落菌体形态特征
在LB固体培养基上于37℃培养过夜后，形成边缘不整齐、毛发状的圆形菌落，菌苔呈灰白色，干燥，不透明，蔓延状；用光学显微镜观察呈革兰氏染色阳性，菌体形状为帮杆状，形成芽孢为椭圆形，略偏长。
2．生理生化特征
对实施例1分离所得产纤维素酶菌株进行生理生化鉴定，其主要生理生化特征参见表1。
表1
试验项目 结果
芽孢形状 椭圆形，略偏长
菌体形态 棒杆状
水解酪蛋白 +
水解淀粉 +
VP反应 +
水解明胶 +
D-葡萄糖产酸 +
L-阿拉伯糖产酸 +
柠檬酸盐 +
D-木糖产酸 +
丙酸盐 +
甘露醇产酸 +
苯丙氨酸脱脂酶 +
葡萄糖产气 -
酪氨酸水解 -
吲哚 +
触酶 +
硝酸盐还原 +
苯丙氨酸脱脂酶 +
葡萄糖产气 -
酪氨酸水解 -
吲哚 +
触酶 +
注：“-”表示阴性；“+”表示阳性。
3．遗传学特征
采用16S rDNA测序进行分类学分子鉴定。利用PCR技术扩增上述产纤维素酶菌株的16S rDNA，其中，上游引物：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，下游引物：5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGC-3’。PCR扩增产物经测序分析可知，该16S rDNA碱基序列与地衣芽孢杆菌标准株Bacillus licheniformis DSM 13之间具有99％的同源性。
结合上述形态特征、生理生化特征以及遗传性特征，可鉴定该产纤维素酶菌株为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis），并将其命名为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）BL-1。
实施例3地衣芽孢杆菌BL-1CCTCC M 2012457解磷解钾能力的测定
1．解磷能力的测定
采用培养基（培养基成分按克/升计为：葡萄糖10、硫酸铵1.0、氯化钠0.1、硫酸镁0.5、碳酸钙0.5、酵母粉0.5、磷矿粉1，加水至1L，调节pH至7.2～7.5）；按照重量百分比1％的接种量将本发明地衣芽孢杆菌BL-1CCTCC M2012457接种至上述培养基，于37℃培养14天；采用钼锑抗比色法测定培养菌液中的磷元素总量，同时设空白对照（不接种本发明菌株），平行测定两次。检测结果显示，上述培养菌液中磷元素含量两次平行测定结果分别为12.0387mg/L和11.8643mg/L，空白对照分别为2.0829mg/L和2.3476mg/L。
2．解钾能力的测定
采用培养基（培养基成分按克/升计为：葡萄糖10、硫酸铵1.0、磷酸氢二钠2.0、氯化钠0.1、硫酸镁0.5、碳酸钙0.5、酵母粉0.5、钾长石粉1，加水至1L，调节pH至7.2～7.5）；按照重量百分比1％的接种量将本发明地衣芽孢杆菌BL-1CCTCC M 2012457接种至上述培养基，于37℃培养60天；采用原子吸收法测定培养菌液中的钾元素含量，同时设空白对照（不接种本发明菌株），平行测定两次。检测结果显示，上述培养菌液中钾元素含量两次平行测定结果分别为5.7231mg/L和5.8159mg/L，空白对照分别为2.6449mg/L和2.7936mg/L。
上述测定结果表明，本发明产纤维素酶地衣芽孢杆菌BL-1CCTCC M2012457具备良好的解磷解钾能力，可应用于提高肥料功效。
实施例4～实施例5所使用菌种来源如下：干酵母菌购自安琪酵母股份有限公司，枯草芽孢杆菌活菌粉剂购自武汉科诺生物科技股份有限公司，巨大芽孢杆菌活菌粉剂购自江苏绿科生物科技有限公司，胶质芽孢杆菌活菌粉剂购自中国普通微生物菌种保藏管理中心（保藏编号：CGMCC No.1.910，可采用本领域技术人员公知的任何方法制成活菌粉剂），圆褐固氮菌购自美国模式菌种收集中心（保藏编号：ATCC No.49674，可采用本领域技术人员公知的任何方法制成活菌粉剂），地衣芽孢杆菌BL-1CCTCC M 2012457可采用本领域技术人员公知的任何方法制成活菌粉剂。
实施例4
将酵母菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌BL-1CCTCC M 2012457、巨大芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、圆褐固氮菌的活菌干粉制剂按照活菌数量比10∶1∶2∶1∶1∶10的比例混合均匀，配制成活菌总数为5×109cfu/g的复合微生态制剂，上述每个菌种的具体添加量参见表2。
实施例5
将酵母菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌BL-1CCTCC M 2012457、巨大芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、圆褐固氮菌的活菌干粉制剂按照活菌数量10∶1∶2∶1∶1∶3的比例混合均匀，配制成活菌总数为5×109cfu/g的复合微生态制剂，上述每个菌种的具体添加量参见表2。
表2
注：活菌数单位为cfu/g。
肥效试验
应用实施例1
将实施例4所制复合微生态制剂按照重量百分比0.1％的比例添加到取自某木薯燃料乙醇生产企业的废弃活性污泥中，充分搅拌并混合均匀，制得微生物有机肥料；将该微生物有机肥料（活性污泥＋复合微生态制剂）和上述活性污泥按照正常施肥作业程序，分批次等量分别施用于江苏宜兴某玉米苗地中，共两批次，每批次各100株玉米苗，施肥量为3吨有机肥/亩；各株玉米苗长势相同，无明显高度及粗壮差异；两周后测量玉米苗平均株高；试验结果参见表3。
表3
由表3可知，施用微生物有机肥料（活性污泥＋复合微生态制剂）的玉米苗批次生长速度优于直接施用活性污泥的玉米苗批次，两批次玉米苗的平均株高相差3.4cm。
将实施例4所制复合微生态制剂按照重量百分比1.0％的比例添加到取自某木薯燃料乙醇生产企业（同上）的废弃活性污泥中，充分搅拌并混合均匀，制得微生物有机肥料；将该微生物有机肥料（活性污泥＋复合微生态制剂）和上述活性污泥按照正常施肥作业程序，分批次等量施用于河南周口某杨树苗生长地中，共两批次，每批次各100株杨树苗，施肥量为5吨有机肥料/亩；各株树苗长势相同，无明显高度及粗壮差异；三周后测量杨树苗平均株高，试验结果表明，施用微生物有机肥料（活性污泥＋复合微生态制剂）的杨树苗批次生长速度明显优于直接施用活性污泥的杨树苗批次，两批次杨树苗的平均株高相差6.2cm，施肥期间未出现土壤板结现象。
应用实施例2
将实施例5所制复合微生态制剂按照重量百分比0.5％的比例添加到取自某木薯燃料乙醇生产企业（同上）的废弃活性污泥中，充分搅拌并混合均匀，制得微生物有机肥料；将该微生物有机肥料进行堆肥发酵，发酵条件控制：发酵初始水分40％，发酵温度30℃，发酵时间10天，得到发酵活性污泥有机肥料；按照生物有机肥领域常规测定方法对发酵前后活性污泥中的有效组分（均以干基计）进行检测，结果参见表4；试验结果表明，添加了本发明复合微生态制剂的活性污泥经过发酵后，其有效组分（N、P、K、有机质、SO4 2-、C1）含量得到了较大提高。
将上述发酵活性污泥有机肥料和未经发酵的活性污泥按照正常施肥作业程序，分别施用于玉米苗长势一致的两块平行玉米地中；两周后测定玉米苗平均株高，试验结果表明，施用发酵活性污泥有机肥料的玉米苗生长速度优于施用未发酵活性污泥的玉米苗，二者平均株高相差5cm，施肥期间未出现土壤板结现象。
表4
有效组分类别 发酵前活性污泥 发酵后活性污泥有机肥料
N 3.13％ 3.65％
P 3.12％ 3.66％
K 5.14％ 6.24％
有机质 46.5％ 55.7％
SO4 2- 1.77％ 1.81％
C1- 0.11％ 0.12％
上述肥效试验证明，包含本发明地衣芽孢杆菌BL-1CCTCC M 2012457的复合微生态制剂可明显提高燃料乙醇企业废弃活性污泥的肥料效应，施肥后可明显促进农作物或植物的生长。
如无特殊说明，以上实施例所涉及各试剂和原料均为市售商品。

Claims (7)

1.一株具有解磷解钾功能的产纤维素酶地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）BL-1，保藏编号为CCTCC No.M 2012457。
2.一种复合微生态制剂，其特征在于由酵母菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌BL-1 CCTCC No.M 2012457、巨大芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、圆褐固氮菌的活菌干粉制剂按照活菌数量比10:1:2:1:1:10的比例经混合而成。
3.根据权利要求2所述复合微生态制剂，其特征在于该制剂的活菌总数为1.0×109~1.0×1010-cfu/g。
4.权利要求2~3任一项所述复合微生态制剂在提高木薯燃料乙醇生产工业废弃活性污泥肥料效应上的应用，其特征在于：将所述复合微生态制剂按照重量百分比0.1~1.0%的比例与所述活性污泥均匀混合制得微生物有机肥料，将其直接或进行发酵后施用于作物生长区域。
5.根据权利要求4所述复合微生态制剂在提高木薯燃料乙醇生产工业废弃活性污泥肥料效应上的应用，其特征在于所述发酵为堆肥发酵，其条件控制为：发酵初始水分30~50%，发酵温度5~45℃，发酵时间3~15天。
6.根据权利要求4所述复合微生态制剂在提高木薯燃料乙醇生产工业废弃活性污泥肥料效应上的应用，其特征在于所述作物生长区域包括农田、林地或景观苗圃。
7.根据权利要求5所述复合微生态制剂在提高木薯燃料乙醇生产工业废弃活性污泥肥料效应上的应用，其特征在于所述发酵温度控制为20~38℃。
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