TWI409242B

TWI409242B - 耐高溫多功能溶磷微生物及其生物肥料製作

Info

Publication number: TWI409242B
Application number: TW097130603A
Authority: TW
Inventors: Shang Shyng Yang; Cheng Hsiung Chang
Original assignee: Shang Shyng Yang
Priority date: 2008-08-12
Filing date: 2008-08-12
Publication date: 2013-09-21
Also published as: TW201006786A

Description

耐高溫多功能溶磷微生物及其生物肥料製作

本發明係關於耐高溫溶磷微生物Bacillus coagulans C45 BCRC 910392和Bacillus smithii F18 BCRC 910393，可以在25和50℃下生長，並溶解三磷化鈣、磷酸鐵、磷酸鋁、羥磷灰石(hydroxyapatite)及礦物磷的能力外，同時具有澱粉質分解酵素活性、纖維素分解酵素活性、幾丁質分解酵素活性、果膠質分解酵素活性、蛋白質分解酵素活性、脂質分解酵素活性與固氮酵素活性。當其接種至農業廢棄物及禽畜糞廢棄物等原料基質，製備多功能性生物肥料時，可以加速有機物分解、促進腐熟、增加可溶性磷含量及提高品質，增進中溫和耐高溫溶磷、纖維素分解、蛋白質分解及脂質分解微生物生長。此種製備多功能性生物肥料，深具有機農業、資源回收、環境保護等永續經營應用。

磷是植物生長的主要營養元素之一，可提供植物生長時的生化代謝能量來源和組合細胞內遺傳物質、各種胞器、巨分子及化學物質之成份以及儲存細胞內能量、反應外來環境的刺激和進行訊息的傳遞。磷對於植物生長及繁衍，具有重要功能。但是在自然界中，可以供給植物利用的可利用型態的磷非常少。土壤中磷的平均含量為0.05%(w/w)，其中只有0.1%可為植物利用型態，其餘的磷源則被土壤固定，形成植物不易吸收利用之固定態磷。農民為了增加收獲，使用大量化學磷肥，提高土壤中可利用磷含量，提供農作物吸收利用。但是使用大量的磷肥會造成土壤的酸化、地下水源污染和河川優養化等環境污染問題，而且磷肥一旦施用於農地時，會和土壤中之元素形成不可利用型態之複合物而降低磷肥有效性，造成環境污染和提高農業生產成本。

土壤中存在著一群具有溶解固定態磷能力的微生物，被稱為溶磷菌。其溶磷機制可能因其產生溶磷酵素(phosphatase)、有機酸及產生鉗合劑(chelating agent)形成溶解固態磷的現象。1971年Bajpei和Sundara將溶磷微生物接種於生長小麥和牛豆(cowpea)的土壤中，配合有機肥料的施用，可以增加作物對磷之吸收。1982年Banik和Dey於土壤中添加廄肥、磷礦石及Bacillus、Streptomyces和Aspergillus等溶磷微生物後，可以增加土壤中游離磷之濃度。1988年Asea等人將溶磷真菌Penicillium bilaji及Penicillium fusum接種於施用磷礦石粉之低磷土壤中後，發現小麥生長較良好，磷之吸收增加14%，乾重增加16%。2008年El-Tarabily等接種Micromonospora endolithica於添加過磷酸鹽(super-phosphate，SP)或磷礦石中可以促進豆科植物根部和幼芽生長，提升土壤中可溶性磷含量。

在目前研究，所應用的溶磷微生物大多是中溫微生物，只能應用於中溫的生長條件，並不適合於堆肥和生物肥料的製作，因為在堆肥和生物肥料製作過程中，會產生45-95℃的高溫而抑制中溫溶磷微生物的生長。因此本發明擬製作含高肥力和高濃度可溶性磷之生物磷肥，接種於中溫和高溫均能生長且同時具有多種溶磷和酵素活性之耐高溫溶磷微生物。表現耐高溫溶磷及酵素活性，縮短生物肥料腐熟時間和提高磷有效性，且其亦可在中溫生長，當其施用於田間，表現中溫溶磷及酵素活性幫助植物生長。

本發明利用PVK(Pikovskaya)培養基每升含glucose 10 g、Ca₃(PO₄)₂ 5 g、(NH₄)₂SO₄ 0.5 g、yeast extract 0.5 g、NaCl 0.2 g、MgSO₄‧7H₂O 0.1 g、KCl 0.2 g、MnSO₄‧4H₂O 0.002 g、FeSO₄‧7H₂O 0.002 g和agar 15 g。NBRIP(National Botanical Research Institute’s growth medium)培養基每升含glucose 10 g、Ca₃(PO₄)₂ 5 g、(NH₄)₂SO₄ 0.1 g、MgCl₂‧6H₂O 5 g、MgSO₄‧7H₂O 0.25 g、KCl 0.2 g和agar 15g及SCP(Sucrose calcium phosphate medium)培養基每升含sucrose 10 g、Ca₃(PO₄)₂ 5 g、NH₄NO₃ 0.27 g、yeast extract 0.1 g、MgSO₄‧7H₂O 0.1 g、KCl 0.2 g、MnSO₄‧4H₂O 0.001 g、FeSO₄‧7H₂O 0.001 g和agar 15 g。三種培養基於25和50℃培養2-5天，比較不同堆積時間農業及禽畜糞堆肥和生物肥料樣品中溫和耐高溫溶磷菌相。觀察菌落生長並且利用游標尺測量菌落直徑(CS)和溶磷圈直徑(CZ)，計算溶三磷化鈣活性參數(TCPSAI)。

軌道式豬糞堆肥樣品A，每克乾重基質含中溫和耐高溫總菌數分別為(2.8±0.6)×10⁷-(1.6±0.0)×10⁸和(1.6±0.3)×10⁷-(8.5±1.8)×10⁷ CFU，含中溫和耐高溫溶磷菌數分別為(9.5±0.2)×10⁵-(1.4±0.1)×10⁷和(1.7±0.5)×10⁵-(1.8±0.2)×10⁶ CFU。軌道式豬糞堆肥樣品B，每克乾重基質含中溫和耐高溫總菌數分別為(4.0±0.2)×10⁷-(2.6±0.3)×10⁹和(3.4±1.0)×10⁶-(3.4±0.4)×10⁷ CFU，中溫和耐高溫溶磷菌數分別為(1.1±0.2)×10⁶-(1.4±0.3)×10⁷和(1.9±0.2)×10⁵-(1.8±0.2)×10⁶ CFU。軌道式豬糞堆肥樣品E，每克乾重基質含中溫和耐高溫總菌數分別為(4.4±0.5)×10⁷-(1.2±0.2)×10⁸和(1.4±0.2)×10⁷-(4.8±0.1)×10⁷ CFU，中溫和耐高溫溶磷菌數分別為(1.1±0.2)×10⁷-(1.3±0.2)×10⁷和(8.8±1.6)×10⁶-(9.6±0.7)×10⁶ CFU。

生物肥料樣品C，每克乾重基質含中溫菌(4.4±0.9)×10⁸-(6.3±0.5)×10⁹ CFU，耐高溫總菌數(2.3±0.7)×10⁸-(5.3±0.4)×10⁹ CFU，中溫溶磷菌(2.3±0.6)×10⁷-(1.4±0.2)×10⁸ CFU和耐高溫溶磷菌(1.0±0.2)×10⁶-(3.3±0.7)×10⁶ CFU。生物肥料樣品D，每克乾重基質含中溫和耐高溫總菌數分別為(6.1±1.0)×10⁶和(2.6±0.6)×10⁶ CFU，中溫和耐高溫溶磷菌數分別為(3.1±0.9)×10⁵-(3.7±0.4)×10⁵和(1.6±0.3)×10⁵-(2.0±0.3)×10⁵ CFU。

一共進行22次禽畜糞堆肥場堆肥樣品和4次生物肥料樣品採集，豬糞堆肥溫度介於19.0-74.0℃，隨堆積時間逐漸下降。堆積初期0-2週之堆肥溫度最高，平均為63.5±6.1℃，依次為堆積2-4週51.8±8.1℃，堆積4-8週為42.6±7.6℃，混合原料為36.8±4.2℃，而成品為32.7±5.8℃最低。中溫總菌數介於(7.2±2.1)×10⁵-(1.4±0.2)×10¹⁰ CFU g^-1、耐高溫總菌數介於(1.9±0.1)×10⁵-(1.1±0.3)×10¹⁰ CFU g^-1、中溫溶磷菌數介於(4.5±0.7)×10⁴-(2.4±0.1)×10⁹ CFU g^-1及耐高溫溶磷菌數介於(5.0±1.4)×10³-(1.6±0.2)×10⁷ CFU g^-1。中溫溶磷菌數佔總中溫菌數比例介於0.1-76.0%，耐高溫溶磷菌數佔總耐高溫菌數比例介於0.1-72.8%。

雞糞堆肥溫度介於19.0-84.0℃，隨堆積時間逐漸下降。堆積初期0-2週之堆肥溫度最高，平均為72.8±6.1℃，依次為堆積2-4週65.2±6.1℃，堆積4-8週43.5±4.6℃，混合原料為42.6±4.2℃，成品為37.5±4.8℃最低。中溫總菌數介於(1.1±0.1)×10⁶-(3.6±0.3)×10⁹ CFU g^-1、耐高溫總菌數介於(8.0±1.4)×10⁴-(1.6±0.4)×10⁸ CFU g^-1、中溫溶磷菌數介於(2.0±0.0)×10⁴-(1.1±0.1)×10⁹ CFU g^-1及耐高溫溶磷菌數介於(1.5±0.3)×10³-(4.0±0.6)×10⁷ CFU g^-1。中溫溶磷菌數佔總中溫菌數比例介於 0.1-80.1%，耐高溫溶磷菌數佔總耐高溫菌數比例介於0.1-69.6%。

自製生物肥料Y和Z於堆積時期之堆肥溫度介於26.1-62.0℃，隨堆積時間逐漸下降。堆積0-2週之堆肥溫度最高，平均為49.5±2.1℃，堆積2-4週為35.2±4.1℃，成品為27.2±3.7℃。中溫總菌數介於(6.1±1.0)×10⁶-(9.0±1.5)×10⁸ CFU g^-1、耐高溫總菌數介於(4.5±0.7)×10⁵-(4.7±0.5)×10⁸ CFU g^-1、中溫溶磷菌數介於(3.1±0.9)×10⁵-(2.9±0.7)×10⁸ CFU g^-1及耐高溫溶磷菌數介於(3.5±0.5)×10⁴-(3.3±0.7)×10⁷ CFU g^-1。中溫溶磷菌數佔總中溫菌數比例介於2.8-44.4%，耐高溫溶磷菌數佔總耐高溫菌數比例介於0.5-6.9%。

從堆肥和生物肥料分別以傾倒培養基法分離溶磷微生物(phosphate-solubilizing microbes，PSMs)，一共分離出977株PSMs，其中694株為耐高溫PSMs和283株為中溫PSMs(表1)。在這些分離株中，621株為耐高溫溶磷細菌(thermo-tolerant phosphate-solubilizing bacteria)、202株為中溫溶磷細菌、49株為耐高溫溶磷放線菌(thermo-tolerant phosphate-solubilizing actinomycetes)、40株為中溫溶磷放線菌、23株為耐高溫溶磷真菌(thermo-tolerant phosphate-solubilizing fungi)以及42株為中溫溶磷真菌(表2)。

由上述結果可知，耐高溫溶磷微生物分離機率最高，中溫溶磷微生物次之。堆肥溫度決定溶磷微生物分佈。耐高溫溶磷微生物主要分離於堆積初期堆肥溫度最高之第0-2週樣品。中溫溶磷細菌、中溫和耐高溫溶磷放線菌、中溫及耐高溫溶磷黴菌主要分離於堆肥溫度較低之堆積後期第4-8週堆肥樣品、原料基質以及成品。

621株耐高溫溶磷細菌以PVK、SCP以及NBRIP培養基平板檢測法於50℃培養5天後，分別有272、141和57株的菌落直徑介於5-11 mm之間；分別有415、238和137株的菌落直徑介於4-11 mm之間；分別有31、36和65株不生長以及分別有4、79以及3株產生游走現象。於25℃培養5天後，分別有72、61和11株細菌分離株的菌落直徑介於5-12 mm之間，較50℃培養時小；分別有171、126和48株細菌分離株的菌落直徑介於4-12 mm之間，也較50℃培養時小；分別有436、344和255株細菌分離株的菌落直徑介於3-12 mm之間；分別有41、57和91株細菌分離株不生長，以及分別有5、43和0株細菌分離株產生游走現象。由上述結果可知，耐高溫溶磷細菌在50℃生長時較25℃為佳，而且在PVK培養基上生長最佳，其次為SCP培養基。

下列提供之實例為進一步了解本發明，但是對於所附帶請求專利部分並無侷限用意。

實施例一、耐高溫溶磷微生物分離株磷酸鈣、磷酸鐵、磷酸鋁、羥磷灰石(hydroxyapatite，HA)與礦物磷的溶解能力

由上述堆肥和生物肥料製備過程中所分離具高溶磷活性之耐高溫溶磷微生物分離株Bacillus coagulans C45 BCRC 910392和Bacillus smithii F18 BCRC 910393，分別於25和50℃培養在PVK(Pikovskaya)培養基、磷酸鐵培養基(每升含glucose 10 g、FePO₄‧7H₂O 5 g、(NH₄)₂SO₄ 0.5 g、yeast extract 0.5 g、NaCl 0.2 g、MgSO₄‧7H₂O 0.1 g、KCl 0.2 g、MnSO₄‧4H₂O 0.002 g、FeSO₄‧7H₂O 0.002 g和agar 15 g)、磷酸鋁培養基(每升含glucose 10 g、AlPO₄ 5 g、(NH₄)₂SO₄ 0.5 g、yeast extract 0.5 g、NaCl 0.2 g、MgSO₄‧7H₂O 0.1 g、KCl 0.2 g、MnSO₄‧4H₂O 0.002 g、FeSO₄‧7H₂O 0.002 g和agar 15 g)、羥磷灰石(hydoxyapatite)培養基(每升含glucose 10 g、hydroxyapatite 5 g、(NH₄)₂SO₄ 0.5 g、yeast extract 0.5 g、NaCl 0.2 g、MgSO₄‧7H₂O 0.1 g、KCl 0.2 g、MnSO₄‧4H₂O 0.002 g、FeSO₄‧7H₂O 0.002 g和agar 15 g)和磷礦石培養基(每升含glucose 10 g、磷礦石(rock phosphate)(台糖公司提供)5 g、(NH₄)₂SO₄ 0.5 g、yeast extract 0.5 g、NaCl 0.2 g、MgSO₄‧7H₂O 0.1 g、KCl 0.2 g、MnSO₄‧4H₂O 0.002 g、FeSO₄‧7H₂O 0.002 g和agar 15 g)。測其對磷酸鈣、磷酸鐵、磷酸鋁、羥磷灰石與礦物磷的溶解能力。結果如表3所示。於50℃培養時，分離株Bacillus smithii F18 BCRC 910393具有溶解5種磷酸鹽的能力，分離株Bacillus coagulans C45 BCRC 910392只具有溶解4種磷酸鹽的能力，對磷酸鐵溶解不明顯。於25℃培養時，分離株Bacillus coagulans C45 BCRC 910392具有溶解5種磷酸鹽的能力，但分離株Bacillus smithii F18 BCRC 910393只具有溶解磷酸鋁的能力。

實施例二、耐高溫溶磷細菌液態培養時溶磷活性

耐高溫溶磷微生物分離株Bacillus coagulans C45 BCRC 910392和Bacillus smithii F18 BCRC 910393在PVK於50℃培養時，具有最高溶三磷化鈣能力。培養10天後溶三磷化鈣能力，分別為466.8和532.5 μg ml^-1(表4)。

Nautiyal(1997、1999)報告指出NBRIP培養基，可在鹼性土壤中分離溶磷菌。利用平板檢測法探討PVK和NBRIP培養基對分離株Pseudomonas spp.和Bacillus spp.菌落型態之影響，當分離株培養於PVK和NBRIP時，所測得之溶磷圈和菌落大小並沒有明顯差異。但本發明發現耐高溫溶磷細菌分離株Bacillus smithii F18 BCRC 910393和 Bacillus coagulans C45 BCRC 910392在PVK培養基於50℃培養2天，其溶三磷化鈣能力分別為344.4和81.8 μg ml^-1，而在NBRIP培養基中溶三磷化鈣能力分別為10.1和12.4 μg ml^-1，兩者相差2.47~63.51倍。在PVK培養基於50℃培養10天，其溶三磷化鈣能力比NBRIP培養基於50℃培養10天，溶三磷化鈣能力約高3.26~69.10倍。耐高溫溶磷細菌在50℃培養時，PVK為其表現溶三磷化鈣能力最佳的培養基。

耐高溫溶磷細菌分離株Bacillus coagulans C45 BCRC 910392及Bacillus smithii F18 BCRC 910393是利用PVK培養基從堆肥或生物肥料中所分離出，可能其本身溶解磷酸鈣能力就較其所具有溶解磷酸鐵和磷酸鋁能力高有關。在磷酸鐵液態檢測法於25和50℃培養時，分離株Bacillus smithii F18 BCRC 910393溶解磷酸鐵能力分別為3.6和10.2 μg ml^-1，而分離株Bacillus coagulans C45 BCRC 910392分別為6.4和8.3 μg ml^-1。

在磷酸鋁液態檢測法於25和50℃培養時，分離株Bacillus smithii F18 BCRC 910393溶解磷酸鋁能力較高，分別為6.6和119.9 μg ml^-1，而分離株Bacillus coagulans C45 BCRC 910392分別為9.5和77.5 μg ml^-1。由上可知，耐高溫溶磷細菌在50℃培養時所得溶磷酸鐵與磷酸鋁能力高於在25℃培養時之結果。耐高溫溶磷細菌在50和25℃培養時所得溶磷酸鈣能力最高，溶磷酸鋁能力次之，而溶磷酸鐵能力較低。

培養液pH值隨培養過程而降低，溶磷活性愈高則培養液pH值愈低，溶磷機制可能與產酸有關。

實施例三、耐高溫溶磷微生物澱粉質、纖維素、幾丁質、果膠質、蛋白質、脂質分解酵素活性和固氮活性

耐高溫溶磷微生物分離株Bacillus coagulans C45 BCRC 910392和Bacillus smithii F18 BCRC 910393分別培養於可溶性澱粉-酵母抽取物培養基(每升含yeast extract 10 g、soluble starch 10 g和agar 15 g)、Mendles-Reese培養基(每升含carboxymethylcellulose(CMC)10 g、peptone 1 g、urea 0.3 g、(NH₄)₂SO₄ 1.4 g、KH₂PO₄ 2 g、CaCl₂‧6H₂O 0.4 g、MgSO₄‧7H₂O 0.3 g、FeSO₄‧7H₂O 0.005 g、ZnSO₄‧7H₂O 0.014 g、MnSO₄‧4H₂O 0.016 g、CoCl₂‧6H₂O 0.002 g和agar 15 g)、幾丁質分解酵素分析培養基(每升含chitin 10 g、urea 0.3 g、(NH₄)₂SO₄ 1.4 g、KH₂PO₄ 2 g、CaCl₂‧6H₂O 0.4 g、MgSO₄‧7H₂O 0.3 g、FeSO₄‧7H₂O 0.005 g、ZnSO₄‧7H₂O 0.014 g、MnSO₄‧4H₂O 0.016 g、CoCl₂‧6H₂O 0.002 g和agar 15 g)、果膠質分解酵素分析培養基(每升含pectin 10 g、urea 0.3 g、(NH₄)₂SO₄ 1.4 g、KH₂PO₄ 2 g、CaCl₂‧6H₂O 0.4 g、MgSO₄‧7H₂O 0.3 g、FeSO₄‧7H₂O 0.005 g、ZnSO₄‧7H₂O 0.014 g、MnSO₄‧4H₂O 0.016 g、CoCl₂‧6H₂O 0.002 g和agar 15 g)、蛋白質分解酵素分析培養基(每升含skim milk 5 g、glucose 0.005 g、nutrient broth 1 g、KH₂PO₄ 0.5 g和agar 15 g)、脂質分解酵素分析培養基(每升含peptone from meat 2.5 g、peptone from casein 2.5 g、yeast extract 3 g、tributyrin 10 ml和agar 15 g)、Winogradsky’s無氮礦物培養基(每升含glucose 10 g、CaCO₃ 0.1g、KH₂PO₄ 0.25 g、MgSO₄‧7H₂O 0.125 g、NaCl 0.125 g、FeSO₄‧7H₂O 0.005 g、Na₂MoO₄‧2H₂O 0.005 g、MnSO₄‧4H₂O 0.005 g和agar 15 g)和無氮甘露糖醇培養基(每升含mannitol 10 g、KH₂PO₄ 0.5 g、MgSO₄‧7H₂O 0.2 g、NaCl 0.2 g、MnSO₄‧4H₂O 0.005 g、FeSO₄‧7H₂O 0.005 g和agar 15 g)。於50和25℃培養5天後，分別測量其菌落直徑(C.S.)、透明圈直徑(C.Z.)以及計算透明圈直徑與菌落直徑比值(halo ratio，H.R)，以偵測其澱粉質、纖維素、幾丁質、果膠質、蛋白質、脂質分解酵素活性以及固氮活性。

分離株Bacillus coagulans C45 BCRC 910392和Bacillus smithii F18 BCRC 910393在25℃和50℃培養時之澱粉質分解酵素活性、纖維素分解酵素活性、幾丁質分解酵素活性、果膠質分解酵素活性、蛋白質分解酵素活性、脂質分解酵素活性與固氮酵素活性如表5-7所示。

耐高溫溶磷微生物在可溶性澱粉-酵母抽取物培養基、Mendles-Reese培養基、幾丁質分解酵素分析培養基以及果膠質分解酵素分析培養於50℃培養時，分離株Bacillus coagulans C45 BCRC 910392和Bacillus smithii F18 BCRC 910393具有分解可溶性澱粉、纖維素和幾丁質能力。於25℃培養時，分離株Bacillus coagulans C45 BCRC 910392具有分解可溶性澱粉酵素活性。耐高溫溶磷微生物在50℃培養時酵素活性高於25℃培養。分離株Bacillus coagulans C45 BCRC 910392和Bacillus smithii F18 BCRC 910393同時具有澱粉質分解酵素活性、纖維素分解酵素活性和幾丁質分解酵素活性。

耐高溫溶磷微生物分離株Bacillus coagulans C45 BCRC 910392和Bacillus smithii F18 BCRC 910393於50和25℃培養5天之蛋白質分解酵素活性和脂質分解酵素活性如表6所示。兩個分離株於50℃培養5天皆具蛋白質分解酵素和脂質分解酵素活性，而分離株Bacillus smithii F18 BCRC 910393則在25℃培養時蛋白質分解酵素活性和脂質分解酵素活性不明顯。

耐高溫溶磷微生物分離株Bacillus coagulans C45 BCRC 910392和Bacillus smithii F18 BCRC 910393在Winogradsky’s無氮礦物培養基和無氮甘露糖醇培養基於50和25℃培養，其固氮酵素活性如表7所示。兩個分離株於50℃培養5天皆具固氮酵素活性，而分離株Bacillus smithii F18 BCRC 910393則在25℃培養時固氮酵素活性不明顯。

實施例四、耐高溫溶磷微生物多功能生物肥料製備

以糖蜜為唯一碳源之改良式Mandels-Reese培養基，每公升糖蜜含量5Kg、(NH₄)₂SO₄含量0.7 Kg和KH₂PO₄含量1 Kg，進行種菌量產。接種耐高溫溶磷菌分離株Bacillus co _a gulans C45 BCRC 910392於1,800 公升發酵槽，使其每ml含有1-2×10⁵ CFU。培養條件溫度為50℃，pH 7，通氣震盪連續培養3天。培養2天菌數達10⁹ CFU ml^-1(表8)。接種耐高溫溶磷微生物分離株Bacillus smithii F18 BCRC 910393於糖蜜為唯一碳源之改良式Mandels-Reese培養基進行1.8噸量產時，培養至第2天每ml菌數密度亦達10⁹ CFU。

Means±S.D.(n=3)

當每克乾重堆肥基質(雞糞15%、中藥渣15%、木屑35%、茶渣10%、紙漿10%和其他15%)接種約1×10⁶ CFU分離株Bacillus coagulans C45 BCRC 910392或Bacillus smithii F18 BCRC 910393，以噴灑器均勻噴灑於堆肥表面，之後再進行翻堆均勻混合。製備多功能生物肥料時，堆積7天接種分離株Bacillus smithii F18 BCRC 910393生物肥料溫度顯著(P<0.001)最高，其次為接種分離株Bacillus coagulans C45 BCRC 910392生物肥料，而未接種微生物對照組最低(圖1)。生物肥料製備過程溫度變化與先前於台灣地區各禽畜糞堆肥場堆積過程研究(Pai等，2003)及廚餘堆肥製備研究(Tsai等，2007)所得結果相似。接種分離株Bacillus coagulans C45 BCRC 910392及分離株Bacillus smithii F18 BCRC 910393生物肥料溫度較未接種微生物對照組高。

Means±S.D.(n=3)

生物肥料水份含量隨堆積時間緩慢遞減，堆積第56天所得結果最低，接種分離株Bacillus smithii F18 BCRC 910393和分離株Bacillus coagulans C45 BCRC 910392生物肥料較低，而未接種空白對照組最高，與其較高堆肥溫度有關。因堆積過程產熱蒸發水份隨堆積時間遞減(Pai等，2003；Yang和Chen，2003；Chang和Yang，2006)(圖2a)。

生物肥料pH值隨堆積時間緩慢遞升，堆積第56天最高，因含氮有機物分解形成銨和氫氧離子釋放所致(Yang和Chen，2003；Chang和Yang，2006)。接種分離株Bacillus smithii F18 BCRC 910393生物肥料pH值顯著(P<0.05)較高、依次分別為接種分離株Bacillus coagulans C45 BCRC 910392，而未接種空白對照組最低(圖2b)。所製備生物肥料成品為微鹼性，對農業生產具正面意義。當生物肥料施用於農地後，可中和因過度種植、雨淋或施用過量化學肥料之酸性土壤，恢復其有機質和磷含量(Huang，1991；Fageria和Baligar，2001；Franzluebbers等，2002)。

生物肥料灰份隨堆積時間緩慢遞升，堆積第56天最高，因灰份為生物肥料不可分解無機物(Yang，2000、2003)。禽畜糞生物肥料以接種分離株Bacillus smithii F18 BCRC 910393所得灰份含量較高，依次為接種分離株Bacillus coagulans C45 BCRC 910392，而未接種微生物之空白對照組呈顯著(P<0.001)較低(圖2c)。

生物肥料總有機碳含量隨堆積時間緩慢遞減，堆積第56天最低，因有機物於堆積過程中被物理化學或微生物作用分解產生CO₂等氣體釋放於空氣中(Yang，2000、2003)。接種分離株Bacillus smithii F18 BCRC 910393生物肥料總有機碳含量較低，依次為接種分離株Bacillus coagulans C45 BCRC 910392，而未接種微生物空白對照組顯著(P<0.001)較低(圖2d)。

生物肥料總氮含量隨堆積時間緩慢遞增，堆積第56天最高，與Pai等(2003)、Yang和Chen(2003)及Chang和Yang(2006)報告結果相似。接種分離株Bacillus smithii F18 BCRC 910393生物肥料所得總氮含量較高，依次為接種分離株Bacillus coagulans C45 BCRC 910392，而未接種微生物空白對照組呈顯著(P<0.001)較低(圖2e)。

生物肥料碳氮比隨堆積時間緩慢下降，與Pai等(2003)、Yang和Chen(2003)及Chang和Yang(2006)報告結果相似。堆積第56天，禽畜糞生物肥料以接種分離株Bacillus smithii F18 BCRC 910393之C/N比較低，依序為接種分離株Bacillus coagulans C45 BCRC 910392，而未接種微生物之空白對照組呈顯著(P<0.001)較低(圖2f)。

發芽率為堆肥腐熟最重要指標，可為廚餘、農業廢棄物和禽畜糞堆肥腐熟之依據(Yang，2000、2003；Chang和Yang，2006；Chikae等，2006)。禽畜糞生物肥料苜蓿種子發芽率均隨堆積時間呈顯著(P<0.05)遞升，與Pai等(2003)、Yang和Chen(2003)及Chang和Yang(2006)結果相似。禽畜糞生物肥料堆積14天，接種分離株Bacillus smithii F18 BCRC 910393和分離株Bacillus coagulans C45 BCRC 910392生物肥料苜蓿種子發芽率均超過90%，但未接種微生物之空白對照組，則延遲至堆積第21天後方超越90%(圖2g)。

接種耐高溫溶磷微生物可提升生物肥料苜蓿種子發芽率，因其於堆積過程中，有機物被分解和去除有害植物生長之植物毒性化合物如氨、環氧乙烷、醋酸、丙酸和正丁酸(Yang和Chen，2003)。接種分離株Bacillus smithii F18 BCRC 910393效果較佳，接種分離株Bacillus coagulans C45 BCRC 910392次之。

生物肥料乾重消失比均隨堆積時間緩慢遞升，堆積56天最高，因生物肥料所含有機物被分解產生CO₂和N₂O等氣體釋放於大氣，與Pai等(2003)、Yang和Chen(2003)及Chang和Yang(2006)結果相似。堆積第56天，禽畜糞生物肥料接種分離株Bacillus smithii F18 BCRC 910393所測得結果較高，依序為接種分離株Bacillus coagulans C45 BCRC 910392，而未接種微生物之空白對照組呈顯著(P<0.001)較低(圖2h)。

禽畜糞生物肥料開始堆積時顆粒直徑介於0.1-78 mm，為不均勻原料基質，因翻堆時以鐵鏟磨碎直徑較大顆粒，均質堆肥。隨堆積時間，顆粒直徑漸小。至第56天堆積時，顆粒直徑降為0.1-36 mm。

禽畜糞生物肥料於堆積初期，均為灰棕色(grayish brown，GB)和可嗅混合氨氣和雞糞尿之惡臭味，判定為4級惡臭(4-)(表9)。由於生物肥料堆積過程中腐植質逐漸上升，以致生物肥料顏色轉變為暗棕色(dark brown，DB)，因此生物肥料顏色變化可做為生物肥料腐熟指標之一(Hayes等，1989；Chiu，1995；Frimmel和Christman，1988)。生物肥料顏色隨堆積時間加深。堆積0-14天，顏色為灰棕色(GB)；堆積21天，接種微生物生物肥料顏色轉換為暗棕色(DB)，未接種微生物空白對照組依然為灰棕色；堆積35天，接種微生物之生物肥料顏色轉變為黑棕色(black brown，BB)，但未接種微生物空白對照組依然為深棕色；堆積42天，全部生物肥料均轉變為黑棕色，且穩定至堆積第56天。

禽畜糞生物肥料堆積第7天，接種分離株Bacillus coagulans C45 BCRC 910392及分離株Bacillus smithii F18 BCRC 910393氣味轉變為3級惡臭(3-)，而未接種微生物空白對照組依然為4級惡臭(4-)；接種分離株Bacillus coagulans C45 BCRC 910392及分離株Bacillus smithii F18 BCRC 910393生物肥料於堆積第21天出現芳香土壤味(1+1-)；堆積第42天，接種分離株Bacillus coagulans C45 BCRC 910392及分離株Bacillus smithii F18 BCRC 910393生物肥料氣味為芳香土壤味，讓人聞之歡愉，判定為4級香氣(4+)，且穩定至堆積第56天。但未接種微生物空白對照組直到堆積第56天方轉變為4級香氣(4+)。

先前研究指出，接種嗜熱性Streptomyces sp.No.101, Thermoactinomyces sp.No.64和Micromonospora sp.No.604於分解cereal shochu-distillery waste可降低具刺激和惡臭脂肪酸產生，減少不悅惡臭(Tanaka等，1995)。因此接種耐高溫溶磷微生物的確可降低生物肥料惡臭及促進其腐熟和加深顏色。

禽畜糞生物肥料於開始堆積時並未發現蛆和飛蟲(類似蒼蠅)。堆積第7天，未接種微生物之空白對照組翻堆時即可發現少量蛆和飛蟲，同時其生物肥料溫度也顯著(P<0.001)較低，但接種耐高溫溶磷細菌生物肥料並未發現，且溫度顯著較高。堆積11天，未接種微生物之空白對照組於翻堆時可發現大量蛆和少量飛蟲且生物肥料溫度較低；接種分離株Bacillus smithii F18 BCRC 910393生物肥料於翻堆時可發現少量蛆和飛蟲；接種分離株Bacillus coagulans C45 BCRC 910392生物肥料並未發現蛆和飛蟲且溫度較高。未接種微生物之空白對照組生物肥料於堆積第14天翻堆時出現大量蛆和飛蟲，且溫度較低。堆積第28天，接種分離株Bacillus coagulans C45 BCRC 910392及分離株Bacillus smithii F18 BCRC 910393生物肥料已經沒有蛆和飛蟲出現，但未接種微生物之空白對照組依然發現少量蛆和飛蟲，直到堆積第42天後才消失。生物肥料發酵所產生高溫可有效殺死病原微生物、寄生蟲卵、蒼蠅卵及草籽(陳，1998a；Yang，2000、2003；Vinnerås等，2003)。因此接種耐高溫溶磷微生物可產生較高生物肥料溫度，殺死蟲卵及抑制蛆和飛蟲生長，深具防疫和環境保護應用價值。

實施例五、接種耐高溫溶磷微生物對可溶性磷含量影響

禽畜糞生物肥料總磷含量隨堆積時間緩慢上升至堆積第56天最高，因為磷於堆積過程中為不可消滅元素。接種分離株Bacillus smithii F18 BCRC 910393生物肥料總磷含量較高，其次為接種分離株Bacillus coagulans C45 BCRC 910392，而未接種微生物之空白對照組較低(圖3a)。

禽畜糞生物肥料於堆積過程中，接種分離株Bacillus smithii F18 BCRC 910393生物肥料之可溶性磷含量呈顯著(P<0.05)最高，依次為接種分離株Bacillus coagulans C45 BCRC 910392，而未接種微生物對照組顯著最低。開始堆積時，生物肥料可溶性磷含量介於3.7±0.6-3.9±0.2 g kg^-1，堆積第7天顯著(P<0.01)快速下降，其後緩慢下降至第56天。接種分離株Bacillus smithii F18 BCRC 910393生物肥料可溶性磷含量顯著(P<0.05)最高(3.0±0.2 g kg^-1)，依次為接種分離株Bacillus coagulans C45 BCRC 910392(2.7±0.2 g kg^-1)，而未接種微生物空白對照組(1.4±0.2 g kg^-1)顯著最低(圖3b)。

溶磷效率為可溶性磷對總磷之比值，代表生物肥料因微生物活性和物理化學作用將不可溶性磷溶解成可溶性磷之效率(Chang和Yang，2006)。禽畜糞生物肥料溶磷效率均隨堆積時間而逐漸下降，接種分離株Bacillus smithii F18 BCRC 910393溶磷效率顯著(P<0.05)最高，依序為接種分離株Bacillus coagulans C45 BCRC 910392，而未接種微生物對照組顯著最低。堆積初期，溶磷效率由10.6±2.3-11.5±1.0%顯著(P<0.001)快速下降至堆積第7天之7.1±0.9-9.2±1.2%，而後緩慢下降至堆積第56天最低，且以接種分離株Bacillus smithii F18 BCRC 910393溶磷效率最高(5.3±0.6%)，依次為接種分離株Bacillus coagulans C45 BCRC 910392(4.9±0.7%)，而未接種微生物空白對照組(2.9±0.2%)顯著(P<0.001)最低。由上述結果可知，接種耐高溫溶磷微生物於農業廢棄物和禽畜糞廢棄物生物肥料中可顯著提升其總磷含量，可溶性磷含量及溶磷效率。

實施例六、接種耐高溫溶磷微生物對微生物相之影響

禽畜糞生物肥料堆積過程中，中溫和耐高溫菌數、溶磷菌數及蛋白質分解菌數迅速增加至堆積第14天最高，而後隨堆積時間增長而降低。接種分離株Bacillus smithii F18 BCRC 910393生物肥料含最高中溫和耐高溫菌數、溶磷菌數及蛋白質分解菌數，其後依次為接種分離株Bacillus coagulans C45 BCRC 910392，而未接種微生物之空白對照組最低。可知，中溫和耐高溫微生物、溶磷菌及蛋白質分解菌族群於堆積發酵初期均大量生長，之後逐漸降低，其於堆積過程中均扮演重要角色，生物肥料所含之中溫和耐高溫菌數、溶磷菌數及蛋白質分解菌數和其腐熟速度為正相關性(圖2和5)。接種分離株Bacillus smithii F18 BCRC 910393於堆積過程中可溶性磷含量、總磷含量、溶磷效率、中溫和耐高溫微生物、溶磷菌及蛋白質分解菌族群顯著(P<0.05)最高，依次為接種分離株Bacillus coagulans C45 BCRC 910392，而未接種微生物之空白對照組最低。

接種分離株Bacillus smithii F18 BCRC 910393及分離株Bacillus coagulans C45 BCRC 910392於堆積第0-7天可提升中溫溶磷和蛋白質分解菌數於中溫菌數比例及耐高溫溶磷菌數於耐高溫菌數比例。接種分離株Bacillus smithii F18 BCRC 910393於堆積過程中此3種比例顯著(P<0.05)最高，依序為接種分離株Bacillus coagulans C45 BCRC 910392生物肥料。接種分離株Bacillus smithii F18 BCRC 910393於堆積第0-7天可提升耐高溫蛋白質分解微生物菌數於耐高溫菌數比例。

接種耐高溫溶磷微生物之生物肥料可提升中溫放線菌、黴菌、溶磷黴菌及溶磷放線菌於中溫菌數比例與耐高溫放線菌、黴菌、溶磷黴菌及溶磷放線菌於耐高溫菌數比例，堆積第56天顯著(P<0.05)最高，但中溫和耐高溫菌數於堆積第56天較低。接種耐高溫分離株Bacillus smithii F18 BCRC 910393及分離株Bacillus coagulans C45 BCRC 910392在堆積過程中有顯著(P<0.05)較高之中溫溶磷放線菌數於中溫菌數比例和耐高溫溶磷放線菌數於耐高菌數比例，而未接種微生物空白對照組最低。接種耐高溫黴菌在堆積過程中可得顯著(P<0.05)較高中溫溶磷黴菌數於中溫菌數比例和耐高溫溶磷黴菌數於耐高菌數比例，其比例依序為接種分離株Bacillus smithii F18 BCRC 910393、分離株Bacillus coagulans C45 BCRC 910392，而未接種微生物空白對照組最低。

生物肥料之中溫和耐高溫溶磷和蛋白質分解微生物分別相對於中溫和耐高溫菌數比例於堆積28-56天期間呈逐漸上升趨勢。接種分離株Bacillus smithii F18 BCRC 910393生物肥料有最高中溫和耐高溫溶磷和蛋白質分解菌數與中溫和耐高溫菌數比例，其次為接種分離株Bacillus coagulans C45 BCRC 910392，而未接種微生物空白對照組最低。因此接種分離株Bacillus smithii F18 BCRC 910393及分離株Bacillus coagulans C45 BCRC 910392可增加禽畜糞生物肥料微生物菌數、溶磷微生物菌數及蛋白質分解微生物菌數與溶磷微生物菌數及蛋白質分解微生物菌數佔全部微生物菌數之比例。

實施例七、耐高溫溶磷細菌分離株之特性及鑑定

耐高溫溶磷細菌分離株Bacillus smithii F18 BCRC 910393和分離株Bacillus coagulans C45 BCRC 910392分別在50℃培養於營養洋菜培養基上，耐高溫溶磷分離株Bacillus smithii F18 BCRC 910393為革蘭氏陽性桿菌，菌體長1.4-3.4 μm，寬0.5-0.8 μm；產內生孢子，位於細胞中央(圖6)。生長溫度5-75℃，最適生長溫度50-55℃。以營養洋菜培養基於25℃培養2、5及10天菌落直徑分別為0、1.8±0.4及2.9±0.5 mm，菌落呈圓形白色；於50℃培養2、5及10天菌落直徑分別為2.6±0.2、4.3±0.7及6.0±0.7 mm，菌落呈圓形白色；於55℃培養2、5及10天菌落直徑分別為3.5±0.5、5.9±0.8及8.2±1.2 mm，菌落呈圓形白色。以PVK培養基於25和50℃培養5天之菌落直徑分別為2.3±0.6和7.8±0.4 mm，菌落呈圓形白色；溶磷圈直徑分別為2.5±0.6和10.6±0.9 mm；溶磷圈直徑與菌落直徑比值分別為1.1±0.0和1.4±0.1，菌落呈圓形白色。

耐高溫溶磷分離株Bacillus coagulans C45 BCRC 910392為革蘭氏陽性桿菌，菌體長2.2-5.8 μm，寬0.5-0.7μm；產內生孢子，位於細胞中央(圖7)。生長溫度5-75℃，最適生長溫度50-55℃。以營養洋菜培養基於25℃培養2、5及10天，菌落直徑分別為0、2.7±0.1及3.2±0.2 mm，菌落呈圓形白色；於50℃培養2、5及10天菌落直徑分別為2.2±0.2、4.0±0.2及4.5±0.8 mm，菌落呈圓形白色。以PVK培養基於25和50℃培養5天之菌落直徑分別為2.1±0.1和3.0±0.4 mm，菌落呈圓形白色；溶磷圈直徑分別為2.4±0.1和7.4±1.7 mm；溶磷圈直徑與菌落直徑比值分別為1.1±0.0和2.5±0.3，菌落呈圓形白色。

以顯微鏡觀察和16S核糖體基因(16S rDNA)序列比對進行鑑定。在顯微鏡觀察，挑選生長於NA平板在50℃培養之單獨2-3菌落，進行革蘭氏和孢子染色，以顯微鏡(Olympus BH-2)於1,000倍下觀察菌落型態和內生孢子位置。在分子生物學鑑定，使用16S核糖體基因定序和其基因庫比對，進行分離株體基因DNA(genomic DNA)萃取與16S核糖體基因聚合酵素鏈鎖反應(PCR)放大(amplification)、定序(sequencing)及比對(alignment)。

由耐高溫溶磷分離株Bacillus smithii F18 BCRC 910393和分離株Bacillus coagulans C45 BCRC 910392菌體分別抽取分離株基因體DNA、16S核糖體基因以聚合酵素鏈鎖反應進行放大反應，聚合酵素鏈鎖反應引子對為：前引子(forward primer)8F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和後引子(reverse primer)1491R (5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)。純化之16S核糖體基因以自動核酸定序分析儀ABI 3730 automated DNA sequencer(Tri-I Bioteck,Inc.)進行定序。基因序列以FASTA程序於基因庫(FASTA program)進行比對(Pearson和Lipman，1988)，並以Clustal W軟體進行排整(alignment)(Thompson等，1997)。

分離株Bacillus smithii F18 BCRC 910393與Bacillus smithii最相似，在1,407個核苷酸中只有1個不同，相似度達99.9%。分離株Bacillus coagulans C45 BCRC 910392與Bacillus coagulans strain T5最相似，在1,396個核苷酸中只有1個不同，相似度達99.9%(表10)。因而本發明之分離株Bacillus smithii F18 BCRC 910393經16S rDNA鑑定為Bacillus smithii F18，而分離株Bacillus coagulans C45 BCRC 910392經16S rDNA鑑定為Bacillus coagulans C45。

接種耐高溫溶磷微生物Bacillus smithii F18 BCRC 910393和/或Bacillus coagulans C45 BCRC 910392，因其具有溶解磷酸鈣、磷酸鐵、磷酸鋁、羥磷灰石(hydroxyapatide)與礦物磷的能力。同時亦具有澱粉質分解酵素、纖維素分解酵素、幾丁質分解酵素、果膠質分解酵素、蛋白質分解酵素、脂質分解酵素以及固氮酵素的活性。當耐高溫溶磷微生物Bacillus smithii F18 BCRC 910393和/或Bacillus coagulans C45 BCRC 910392接種至於農業廢棄物和禽畜糞廢棄物生物肥料中，可以加速廢棄物分解、縮短腐熟時間、增加可溶性磷含量及提高生物肥料品質，增進中溫和耐高溫溶磷、纖維素分解、蛋白質分解及脂質分解微生物生長。此種耐高溫多功能溶磷微生物及其所製備多功能性生物肥料，深具資源回收、環境保護和農業永續經營等應用，具產業永續經營應用價值。

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根據本發明，耐高溫多功能溶磷微生物Bacillus smithii F18 BCRC 910393和Bacillus coagulans C45 BCRC 910392可以單獨或一起接種至農業廢棄物和禽畜糞廢棄物生物肥料基質中，調節初水份含量約為65%、基質碳氮比20-25，每克乾重基質接種約1-2×10⁶ CFU耐高溫溶磷微生物，生物肥料基質高度約為40-100公分，於室外進行堆積，堆積過程中每3-4天翻堆1次，將大顆粒堆肥基質粉碎，充分透氣供氧和散失臭味，同時觀察其顏色、顆粒大小、黏性、氣味，測定多功能性生物肥料之物理、化學和生物性質、可溶性磷含量。測定中溫及耐高溫總菌數、溶磷菌數、纖維素分解菌數、蛋白質分解菌數及脂質分解菌數。堆積42-56天後可得腐熟多功能性生物肥料，可供花卉、蔬菜、水果及農業生產使用。提高農業生產、改善產品品質。深具資源回收、環境保護和農業永續經營等應用，具產業永續經營應用價值。

圖1.接種耐高溫溶磷微生物製備多功能生物肥料之溫度剖面。未接種微生物對照組(●)，接種分離株Bacillus coagulans C45 BCRC 910392(□)，接種分離株Bacillus smithii F18 BCRC 910393(◆)和大氣溫度(▽)。數據資料以平均值表示，其上下標代表標準偏差(n3)。

圖2.接種耐高溫溶磷微生物製備多功能生物肥料之性質變化。(a).水分含量(%)，(b)pH，(c)灰分含量(%)，(d)總有機態碳含量(%)，(e)總氮含量(%)，(f)C/N比，(g)苜蓿發芽率(%)，(h)乾重量消失比(%)。未接種微生物對照組(●)，接種分離株Bacillus coagulans C45 BCRC 910392(□)，接種分離株Bacillus smithii F18 BCRC 910393(◆)。數據資料以平均值表示，其上下標代表標準偏差(n3)。

圖3.接種耐高溫溶磷微生物製備多功能生物肥料之磷含量變化。(a).總磷含量(g kg^-1)，(b)可溶性磷含量(g kg^-1)。未接種微生物對照組(●)，接種分離株Bacillus coagulans C45 BCRC 910392(□)，接種分離株Bacillus smithii F18 BCRC 910393(◆)。數據資料以平均值表示，其上下標代表標準偏差(n3)。

圖4.接種耐高溫溶磷微生物製備多功能生物肥料之細菌微生物相變化。(a)中溫菌數(CFU g^-1)，(b)耐高溫菌數(CFU g^-1)，(c)中溫溶磷菌數(CFU g^-1)，(d)耐高溫溶磷菌數(CFU g^-1)，(e)中溫蛋白質分解菌數(CFU g^-1)，(f)耐高溫蛋白質分解菌數(CFU g^-1)。未接種微生物對照組(●)，接種分離株Bacillus coagulans C45 BCRC 910392(□)，接種分離株Bacillus smithii F18 BCRC 910393(◆)。數據資料以平均值表示，其上下標代表標準偏差(n3)。

圖5.接種耐高溫溶磷微生物製備多功能生物肥料之放線菌和黴菌微生物相變化。(a)中溫放線菌數(CFU g^-1)，(b)耐高溫放線菌數(CFU g^-1)，(c)中溫溶磷放線菌數(CFU g^-1)，(d)耐高溫溶磷放線菌數(CFU g^-1)，(e)中溫黴菌數(CFU g^-1)，(f)耐高溫黴菌數(CFU g^-1)，(g)中溫溶磷黴菌數(CFU g^-1)，(h)耐高溫溶磷黴菌數(CFU g^-1)。未接種對照組(●)，接種分離株Bacillus coagulans C45 BCRC 910392(□)，分離株Bacillus smithii F18 BCRC 910393(◆)。數據資料以平均值表示，其上下標代表標準偏差(n3)。

圖6.分離株Bacillus smithii F18 BCRC 910393在顯微鏡下之形態(1,000倍)。

圖7.分離株Bacillus coagulans C45 BCRC 910392在顯微鏡下之形態(1,000倍)。

圖2.接種耐高溫溶磷微生物製備多功能生物肥料之性質變化。(a).水分含量(%)，(b)pH，(c)灰分含量(%)，(d)總有機態碳含量(%)，(e)總氮含量(%)，(t)C/N比，(g)苜蓿發芽率(%)，(h)乾重消失比(%)。未接種對照組(●)，接種分離株Bacillus coagulans C45 BCRC 910392(□)，接種分離株Bacillus smithii F18 BCRC 910393(◆)。數據資料以平均值表示，其上下標代表標準偏差(n3)。

圖3.接種耐高溫溶磷微生物製備多功能生物肥料之磷含量變化。(a).總磷含量(g kg^-1)，(b)可溶性磷含量(g kg^-1)。未接種對照組(●)，接種分離株Bacillus coagulans C45 BCRC 910392(□)，接種分離株Bacillus smithii F18 BCRC 910393(◆)。數據資料以平均值表示，其上下標代表標準偏差(n3)。

Claims

一種製作多功能性生物肥料之方法，係接種耐高溫溶磷菌Bacillus smithii F18 BCRC 910393或Bacillus coagulans C45 BCRC 910392，可將農業廢棄物及禽畜糞廢棄物等原料基質轉變成生物肥料為特徵。
如申請專利範圍第1項所述之方法，耐高溫溶磷菌具有溶解三磷化鈣、磷酸鐵、磷酸鋁、羥磷灰石(hydroxyapatite)及礦物磷的能力，且可在15-75℃生長。
如申請專利範圍第1項所述之方法，耐高溫溶磷菌具有澱粉質分解酵素活性、纖維素分解酵素活性、幾丁質分解酵素活性、果膠質分解酵素活性、蛋白質分解酵素活性、脂質分解酵素活性與固氮酵素活性，且可在15-75℃生長。
如申請專利範圍第1項所述之方法，接種耐高溫溶磷菌可以提高所生產生物肥料之總氮含量、灰份含量、可溶性磷含量和種子發芽率，降低總有機碳含量、碳氮比和初脂肪含量，縮短生物肥料腐熟時間和提高生物肥料品質。