CN109280628A - 一种肠杆菌菌种及其在促进毛竹生长中的应用 - Google Patents

一种肠杆菌菌种及其在促进毛竹生长中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种肠杆菌菌种及其在促进毛竹生长中的应用。该菌株的分类命名为Enterobacter soli，菌株编号为RW37，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 2018355。本发明从毛竹根际土壤筛选的Enterobacter soli RW37具有高效的解磷、解钾和分泌IAA的能力；在不同初始pH下，对5种不同的矿质磷酸盐均具有较好的溶解能力；此外，本发明肠杆菌RW37制成的液体菌剂对毛竹地径和苗高具有显著的促生长作用。因此，本发明为开发环境友好型毛竹生物专用肥料提供了优良的菌株资源。

Description

一种肠杆菌菌种及其在促进毛竹生长中的应用
技术领域
本发明涉及微生物和生物肥料领域，具体涉及一种肠杆菌菌种及其在促进毛竹生长中的应用。
背景技术
毛竹(Phyllostachys edulis)是一种典型的单轴散生型克隆植物，且具有强烈的营养繁殖能力，在我国竹类植物中分布最广，蓄积量最多，用途最广泛，是经济与生态效益俱佳的竹种，也是继马尾松和杉木后最重要的木材生产物种。近些年来，随着对毛竹需求量的增加，毛竹人工林地养分耗竭的现象也与日剧增，已经威胁到竹林的可持续经营利用。当前，地力衰弱、养分供应不足是毛竹资源培育中面临主要问题之一。化学肥料带来污染竹林生态环境、土壤板结等一系列问题日益突出，应用微生物制剂来替代部分化肥逐渐成为研究热点。
根际微生物是根际过程的关键参与者和调控者。根际土壤微生物通过改变土壤养分的有效性以及与植物根系共生的方式直接或间接影响植物群落结构及生产力。植物根际存在有大量微生物，其中细菌在种类和数量都是最多的。目前土壤中有益的根际细菌统称为植物根际促生细菌(plant growth-promoting rhizobacteria,PGPR)(Kloepper,1980)。PGPR具有溶磷、溶钾、固氮、产生植物激素、分泌抗生素和产生促进植物生长生理活性物质等能力或至少具有其中之一能力(Dey,2004)，从而直接或者间接地促进或调节植物生长。除此之外，PGPR对土壤中病原微生物和非寄生性根际有害微生物还具有良好的生防作用，从而提高植物抗病性。研究表明，PGPR主要通过两个方面对植物起作用：一是分泌植物激素、有机酸等物质促进植物生长，或是改变土壤中营养元素的形态，使其更易于植物吸收，提高化肥的利用率；二是通过产生抗生素、铁载体或是营养竞争等方式抑制病原菌的生长，减缓植物病害。目前有关毛竹根际促生细菌的研究未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种肠杆菌菌种肠杆菌(Enterobacter soli)RW37及其在促进毛竹生长中的应用。所述的肠杆菌RW37对难溶性磷酸盐、难溶性钾盐具有较好的溶解能力，并具有较强的植物生长素IAA分泌能力，可明显促进植物，如毛竹实生苗的生长发育。
本发明采取的技术方案为如下：
从江西省宜春市宜丰县大港林场5年生毛竹根际土壤中，筛选获得了一株促进毛竹生长的肠杆菌(Enterobacter soli)RW37，菌株编号为RW37。已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国湖北省武汉市武汉大学，邮编：430072，保藏编号为：CCTCC NO：M2018355，保藏日期为2018年6月11日。
该肠杆菌(Enterobacter soli)RW37的主要生物学特征：无芽孢革兰氏阴性(G-)短杆菌，菌落圆形、边缘整齐，表面湿润粘稠。菌株乳白色，接触酶阳性，氧化酶阴性，3％氢氧化钾试验阳性，淀粉水解试验阳性，明胶水解阳性，硝酸还原试验阳性，甲基红阳性，VP阴性，吲哚阴性。肠杆菌(Enterobacter soli)RW37菌株的16S rDNA序列见SEQ ID NO:1所示。将所测的16S rDNA序列与GeneBank数据库中的序列进行比对分析。结果显示，菌株RW37与Enterobacter soli同源性很高，相似度达到98％。结合形态、生理生化特征(如表1所示)及16S rDNA序列分析，鉴定为Enterobacter soli。
表1菌株RW37的生理生化特征
备注：“-”表示反应阴性；“+”表示反应阳性。
本发明提供的肠杆菌RW37可进一步按照常规方法制成生物肥料，所述的生物肥料的剂型优选为粉剂、悬浮剂或颗粒剂。所述的肠杆菌RW37可促进肥料或土壤中难溶性磷酸盐和钾盐转化为易于被毛竹吸收的可溶性磷酸盐和钾盐。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明的肠杆菌RW37不仅具有高效解磷功能，还具较好的解钾和分泌植物生长素IAA能力。在初始pH 2.5～7.2条件下，对磷酸三钙、磷酸铁、磷酸氢钙、磷酸铝和植酸钙均具有较好溶解能力，与接种空白种子液的解磷培养基相比，差异显著；在液体振荡培养条件下，具有较强的植物生长素分泌能力和解钾能力。将肠杆菌RW37制成菌剂接种毛竹实生苗，结果表明，该菌剂明显促进毛竹实生苗的生长发育，因此，本发明为开发促进毛竹生长的细菌肥料提供了优良的菌株资源。
本发明的Enterobacter soli RW37于2018年6月11日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国湖北省武汉市武汉大学，邮编：430072，保藏编号为：CCTCC NO：M2018355。
附图说明
图1为肠杆菌RW37在NA培养基上的菌落形态和革兰氏染色下显微观察图，A图：在NA培养基上的菌落形态；B图：革兰氏染色下显微观察图。
图2为肠杆菌RW37的16S rDNA基因序列系统发育树，其中RW37代表本发明的肠杆菌RW37。
图3为肠杆菌RW37在NBRIP培养基上产生的溶磷圈。
图4为肠杆菌RW37在不同pH环境下对磷酸三钙(Ca3(PO4)2)，磷酸铁(FePO4)，磷酸氢钙(CaHPO4)，磷酸铝(AlPO4)和植酸钙(C6H6Ca6O24P6)的溶解能力；注：平均值±标准误，小写字母表示相同磷源在6种pH环境之间的差异(p<0.05)。
图5为肠杆菌RW37解钾能力。
图6为肠杆菌RW37分泌IAA能力。
图7为温室盆栽接种菌剂RW37 180d时对毛竹生长的影响。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1
从江西省宜春市宜丰县大港林场5年生毛竹根际土壤中，筛选获得了一株促进毛竹生长的肠杆菌(Enterobacter soli)RW37，菌株编号为RW37。该肠杆菌(Enterobactersoli)RW37的主要生物学特征：无芽孢革兰氏阴性(G-)短杆菌，菌落圆形、边缘整齐，表面湿润粘稠(图1)。菌株乳白色，接触酶阳性，氧化酶阴性，3％氢氧化钾试验阳性，淀粉水解试验阳性，明胶水解阳性，硝酸还原试验阳性，甲基红阳性，VP阴性，吲哚阴性。肠杆菌(Enterobacter soli)RW37菌株的16S rDNA序列见SEQ ID NO:1所示。将所测的16S rDNA序列与GeneBank数据库中的序列进行比对分析(图2)。结果显示，菌株RW37[肠杆菌(Enterobacter soli)RW37]与Enterobacter soli同源性很高，相似度达到98％。结合形态、生理生化特征(如表1所示)及16S rDNA序列分析，鉴定为Enterobacter soli，将其命名为：肠杆菌(Enterobacter soli)RW37。
表1菌株RW37的生理生化特征
备注：“-”表示反应阴性；“+”表示反应阳性。
肠杆菌(Enterobacter soli)RW37已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国湖北省武汉市武汉大学，邮编：430072，保藏编号为：CCTCC NO：M 2018355，保藏日期为2018年6月11日。
实施例2肠杆菌RW37在不同初始pH下解磷能力的测定
一、肠杆菌RW37对难溶性磷酸盐的溶磷能力检测
解磷培养基A：葡萄糖10g，Ca3(PO4)2 5g，MgCl2 5g，KCl 0.2g，MgSO4.7H2O 0.25g，(NH4)2SO4 0.1g，蒸馏水1000mL，混合均匀灭菌即得。
解磷培养基B：用磷酸铝(AlPO4)代替解磷培养基A中的Ca3(PO4)3(量也相同)，其它成分和含量相同，混合均匀灭菌即得。
解磷培养基C：用磷酸铁(FePO4)代替解磷培养基A 中的Ca3(PO4)3(量也相同)，其它成分和含量相同，混合均匀灭菌即得。
解磷培养基D：用磷酸氢钙(CaHPO4)代替解磷培养基A中的Ca3(PO4)3(量也相同)，其它成分和含量相同，混合均匀灭菌即得。
解磷培养基E：用植酸钙(C6H6Ca6O24P6)代替解磷培养基A中的Ca3(PO4)3(量也相同)，其它成分和含量相同，混合均匀灭菌即得。
采用LB固体培养基(胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g、琼脂16g，蒸馏水1000mL，pH 7.2，混合均匀灭菌即得)活化肠杆菌RW37，将活化的肠杆菌RW37接种于NA培养基(NA培养基的配方：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂16g，蒸馏水1000mL，pH 7.2，混合均匀灭菌即得)中，30℃，180r/min振荡培养24d作为种子液，将种子液按1％(v/v)接种量分别接种到装有50mL且pH分别调至2.5、3.5、4.5、5.5、6.5、7.2的解磷培养基A、B、C、D和E的100mL三角瓶中，以接种相同体积空白种子液的解磷培养基为对照(CK)，每个处理三个重复，25℃，121r/min培养8d后，发酵液4℃，10000r/min离心10min，钼锑抗比色法测定发酵液中可溶性磷含量，
结果见图4。由图4可知，分别以矿质磷酸盐磷酸三钙(Ca3(PO4)2)、磷酸铁(FePO4)、磷酸氢钙(CaHPO4)、磷酸铝(AlPO4)和植酸钙(C6H6Ca6O24P6)作为唯一磷源，在初始pH分别为2.5、3.5、4.5、5.5、6.5、7.2时，培养7d后，在不同初始pH条件下，肠杆菌RW37发酵液中均具有较高的可溶性磷含量。以上结果表明，肠杆菌RW37在初始pH 2.5～7.2范围内对5种矿质磷酸盐均具有较好的溶解能力。
二、肠杆菌RW37对NBRIP培养基的溶磷能力检测
NBRIP培养基：葡萄糖10g，Ca3(PO4)2 5g，MgCl2 5g，KCl 0.2g，MgSO4.7H2O 0.25g，(NH4)2SO4 0.1g，蒸馏水1000mL，琼脂15g，混合均匀灭菌即得。
将活化的肠杆菌RW37接种到NBRIP培养基中，30℃，培养5天。其结果如图3所示，从图3可以看出，肠杆菌RW37菌落周围具有溶磷圈，由此说明肠杆菌RW37具有溶磷能力。
实施例3肠杆菌RW37解钾能力的测定
按实施例2的方法活化肠杆菌RW37。将活化后的肠杆菌RW37接入装有50mL解钾培养基(解钾培养基的配方是：钾长石粉0.1g，Na2HPO4 2.0g，FeCl3 0.005g，MgSO4·7H2O0.5g，蔗糖5.0g，Ca2CO3 0.1g，蒸馏水1000mL，pH 7.0，混合均匀灭菌即得)的100mL三角瓶中，在28℃、180r/min条件下振荡培养7d得到发酵液，将发酵液先在500r/min，10min条件下除去发酵液中的不溶性物质，然后在10000r/min，10min条件下离心收集上清液，采用火焰分光光度计法测定上清液中有效钾的含量。并以接种相同体积空白种子液的解钾培养基作为对照(CK)。
结果如图5所示。由图5可知，肠杆菌RW37的解钾量为5.28mg/L，明显高于对照(CK)，具有较好的解钾能力。
实施例4肠杆菌RW37分泌植物生长素IAA能力试验
采用Salkowski比色法测定肠杆菌RW37分泌IAA的能力。取IAA标准品，配置成0、0.5、2.5、5.0、7.5、10、12.5、15.0、17.5、25.0、50.0mg/L的浓度梯度，取2mL各浓度IAA加入等量的氯化铁比色液(PC比色液)，30℃中暗保温30min，在波长530nm下利用分光光度计测定吸光度，绘制标准曲线，得方程y＝31.868x(R2＝0.9947)。将活化后的肠杆菌RW37接种至King培养基(King培养基配方为：蛋白胨2g、甘油1g、K2SO4 0.15g、MgSO4 4.7g、H2O 0.15g、琼脂1.5g、H2O 1000mL、pH 7.2，混合均匀后灭菌即得)摇床培养15d，按标准曲线制作方法测定发酵液中IAA含量。并以接种相同体积空白种子液的King培养基作为对照(CK)。
结果如图6所示。由图6可知，肠杆菌RW37具有较强的分泌IAA能力，其IAA分泌量为14.87mg/L，明显高于对照(CK)。
实施例5肠杆菌RW37温室盆栽试验
将活化2～3次后的肠杆菌RW37菌株接种至含有50mL NB培养基(NB培养基的配方：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，蒸馏水1000mL，pH 7.2，混合均匀后灭菌即得)的100mL三角瓶中，在30℃，180r/min振荡培养48h得到发酵液。取发酵液于4℃，6000r/min离心5min，收集菌体，将菌体沉淀用无菌生理盐水洗涤3次后得到菌悬液，用无菌生理盐水调节菌悬液至108cfu/mL制成菌剂。将上述菌剂接种至1年生毛竹实生苗根际，以等量无菌生理盐水为对照(CK)，接种量为5mL/株。每处理10个重复，置于温室统一管理，光照为12h/d，适时浇水。肠杆菌RW37接种60、120和180d对一年生毛竹实生苗生长的影响(见表2)。从表2可看出，接种肠杆菌RW37菌剂明显促进了毛竹实生苗的生长，该接种处理毛竹实生苗的苗高、地径与CK相比均有不同程度的增长。其中，在生长第60d后的苗高和地径比CK分别增长了27.84％和15.65％；在生长第120d后的苗高和地径比CK分别增长了53.12％和31.88％；在生长第180d后的苗高和地径比CK分别增长了56.49％和42.68％(见图7)。
表2接种肠杆菌RW37菌剂对毛竹实生苗在不同时间段生长的影响
注：同列不同小写字母代表在0.05水平差异显著。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 江西农业大学
<120> 一种肠杆菌菌种及其在促进毛竹生长中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1438
<212> DNA
<213> 肠杆菌 RW37(Enterobacter soli RW37)
<400> 1
gcatgcgcag ctaccatgca gtcgagcggt aacacaggga gcttgctcct gggtgacgag 60
cggcggacgg gtgagtaatg tctgggaaac tgcctgatgg agggggataa ctactggaaa 120
cggtagctaa taccgcataa tgtcgcaaga ccaaagaggg ggaccttcgg gcctcttgcc 180
atcagatgtg cccagatggg attagctagt aggtggggta atggctcacc taggcgacga 240
tccctagctg gtctgagagg atgaccagcc acactggaac tgagacacgg tccagactcc 300
tacgggaggc agcagtgggg aatattgcac aatgggcgca agcctgatgc agccatgccg 360
cgtgtatgaa gaaggccttc gggttgtaaa gtactttcag cgaggaggaa ggtgttgagg 420
ttaataacct cagcgattga cgttactcgc agaagaagca ccggctaact ccgtgccagc 480
agccgcggta atacggaggg tgcaagcgtt aatcggaatt actgggcgta aagcgcacgc 540
aggcggtctg tcaagtcgga tgtgaaatcc ccgggctcaa cctgggaact gcattcgaaa 600
ctggcaggct agagtcttgt agaggggggt agaattccag gtgtagcggt gaaatgcgta 660
gagatctgga ggaataccgg tggcgaaggc ggccccctgg acaaagactg acgctcaggt 720
gcgaaagcgt ggggagcaaa caggattaga taccctggta gtccacgccg taaacgatgt 780
cgatttggag gttgttccct tgaggagtgg cttccggagc taacgcgtta aatcgaccgc 840
ctggggagta cggccgcaag gttaaaactc aaatgaattg acgggggccc gcacaagcgg 900
tggagcatgt ggtttaattc gatgcaacgc gaagaacctt acctactctt gacatccaga 960
gaactttcca gagatggatt ggtgccttcg ggaactctga gacaggtgct gcatggctgt 1020
cgtcagctcg tgttgtgaaa tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccttatcctt 1080
tgttgccagc ggttcggccg ggaactcaaa ggagactgcc agtgataaac tggaggaagg 1140
tggggatgac gtcaagtcat catggccctt acgagtaggg ctacacacgt gctacaatgg 1200
catatacaaa gagaagcgac ctcgcgagag caagcggacc tcataaagta tgtcgtagtc 1260
cggattggag tctgcaactc gactccatga agtcggaatc gctagtaatc gtagatcaga 1320
atgctacggt gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc atgggagtgg 1380
gttgcaaaag aagtaggtag cttaaccttc gggagggcgc taccacttgg atcagcgg 1438

Claims (9)

1.肠杆菌(Enterobacter soli)RW37，保藏编号为：CCTCC NO：M 2018355。
2.权利要求1所述的肠杆菌RW37在促进植物生长中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的植物为毛竹。
4.权利要求1所述的肠杆菌RW37在溶解难溶性磷酸盐和/或难溶性钾盐中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的溶解难溶性磷酸盐是将难溶性磷酸盐转化为易于被植物吸收的可溶性磷酸盐。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的难溶性磷酸盐包括磷酸三钙、磷酸铁、磷酸氢钙、磷酸铝或植酸钙。
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的肠杆菌RW37可将难溶性钾盐转化为易于被植物吸收的可溶性钾盐。
8.权利要求1所述的肠杆菌RW37在制备植物生长素IAA中的应用。
9.一种生物肥料，其特征在于，含有权利要求1所述的肠杆菌RW37。
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