CN110484470A - 一株多效植物促生菌及分离筛选方法 - Google Patents

Abstract

一株多效植物促生菌及分离筛选方法。本发明属于农业微生物领域，具体地说是一株具有解磷、产NH3、产植物生长激素和产嗜铁素的多效根际促生菌，包括所述的多效植物促生菌保藏编号为CGMCCNo.14664，所述的多效植物促生菌在肥料中和微生物接种剂的应用，本发明所述的分离筛选方法包括采样、培养菌株、菌株鉴定及选择、菌株初选、菌株复选、菌株性能签定和多效菌株确定。

Description

一株多效植物促生菌及分离筛选方法

技术领域

本发明涉及农业微生物领域，尤其涉及一株具有解磷、产NH3、 产植物生长激素和产嗜铁素的根际促生菌及其分离筛选方法。

背景技术

据统计，当前我国单位面积化肥使用量为世界平均水平的三倍， 居世界第一位。由于大量施用化肥，造成耕地土壤中化学养分大量累 积，土壤酸化、次生盐渍化等问题越来越突出，土壤微生态平衡严重 破坏，病原菌大量积累，植物生长弱势，病害高发，对农田生态环境 安全和食品安全造成了严重威胁。改进当前农业生产中化肥农药过量 施用的生产技术模式，改善土壤结构，增加土壤中有益微生物的数量 和活性，促进植物生长，提高土壤中肥料的利用率，提高土壤的供肥 能力，成为当前及以后我国农业发展的重要方向，对于恢复良好的农 田生态环境，实现农业生产与自然和谐相处、共同发展，促进农业生 态、经济、社会的可持续发展是十分必要的。

近年来，随着生物技术的不断进步，微生物肥料的研究与应用有 了很大的发展，在我国也有微生物肥料应用方面的很多报道，是新型 肥料的研究热点。研究表明，许多功能微生物可以固定空气中的氮气， 溶解土壤中不能被植物直接吸收的磷素，分泌植物生长调节物质，促 进植物根系生长，增强植物抗病能力，拮抗土壤中的致病微生物，减 少土壤病害的发生。通过接种这些功能微生物制备的生物肥料，与化 肥相比具有成本低，使用安全，持续效果好，增产稳定，非再生能源 消耗少，对环境、食品安全，经济效益高等特点，同时可以改善土壤 结构，提高土壤有机质含量，改良盐碱地，保持农牧业生态系统的平 衡，实现农牧业生产的可持续发展。

但目前我国由于在微生物肥料方面研究起步较迟，使得我国的生 物肥料产业存在整体水平不高、技术创新不足、产品质量与应用效果 表现欠稳定，在微生物肥料研制中往往采用单一功能的微生物菌株， 由于这些微生物功能单一，在土壤中定殖困难，导致对土壤中养分的 转化和对植物的促生功效不明显，这些都制约了我国微生物肥料的进 一步推广和普及。因此开展具有养分转化、植物促生多效功能的优良 菌株，并研发养分高效利用、抗病促生的环保型生物肥料，成为我国 当前的迫切需求。

发明内容

本发明目的是提供一种多效植物促生菌及分离筛选方法。

本发明的目的是要解决现有微生物肥料研制中往往采用单一功 能的微生物菌株，其功能单一，在土壤中定殖困难，导致对土壤中养 分的转化和对植物的促生功效不明显的问题。

本发明通过以下技术方案来实现：。

本发明所述的一种多效植物促生菌已于2017年9月25日保藏 于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编 号为CGMCCNo.14664。

所述的多效植物促生菌在肥料中的应用。所述的肥料为微生物菌 肥料。

所述的多效植物促生菌在促进农作物生长的微生物接种剂的应 用。

所述的多效植物促生菌为阿耶波多氏芽孢杆菌Bacillus aryabhattai。

所述的一种多效植物促生菌保藏菌株的形态、培养、生理、生化 特征为：细胞杆状、在LB培养基中生长良好，在牛肉膏蛋白胨琼脂 平板上培养时菌落为白色，不透明，呈圆形，表面干燥，边缘不整齐。

所述的多效植物促生菌生长性能中不同接种量对所述菌株的生长 的影响：测定发现菌株的生长速率较快，接种后4h就进入对数生长 期，10h时已经进入稳定期；不同接种量对菌株2-2生长的影响较小， 菌株进入对数生长期和稳定期的时间无显著差异；在培养28h后，2％ 高接种量的处理出现菌体密度下降；培养结果说明，菌株2-2的代谢 能力较强、生长速率较快，在定殖中快速的占领生态位；

所述的多效植物促生菌生长性能中不同pH对菌株生长的影响： pH对菌株的生长影响较大，pH为4.0时，菌株生长速率较低，在培 养结束时都没有生长；菌株在初始pH6.0时的生长速率最高，后期未 出现菌体浓度下降，初始pH为8.0时初始生长速率较快与pH6.0时接近，但是26h后出现菌体浓度下降的情况。

所述的一种多效植物促生菌的分离筛选方法，其特征在于所述的 分离筛选方法至少包括如下步骤：

A、采样：从浙江金华辣椒连作基地采集植株长势较好的根际土 样6袋，所述的采样时间为2016年；

B:菌株分离：采用LB固体培养基分离法进行分离，所述的LB 固体培养基分离法为：从每袋土样中称取5克的样品，分别置于45ml 无菌水中，在摇床上振荡30min，然后吸取振荡均匀的土壤溶液0.5ml 至9.5ml的无菌水中，如此稀释直至10^-6，吸取稀释倍数为10^-4、10^-5、 10^-6的溶液各0.1ml，涂布于LB固体培养基平板；涂布后的该平板在 30度培养箱中培养24h,根据菌落形态差异，最后挑取46株菌株，用 进一步的筛选；

C：菌株鉴定及选择：用提取菌株的基因组DNA，扩增16S rDNA 序列，在NCBI数据库进行比对，对得到的菌株进行初步鉴定，选择 不同种属、生长速率较快的8株菌株；

D、菌株初筛：采用平板法初筛，对上述分离选出的8株菌株通 过其溶磷能力的比较进行初筛选；初筛选择采用改良的PVK固体培 养基进行；平板法进行初筛过程是：用灭菌的牙签将8株菌株分别点 接在改良的PVK培养基上，30℃温度下培养3d，测量溶磷圈的直径(D)和菌落的直径(d)，计算溶磷圈与菌落直径比(D/d)；平板初筛发 现其中的四株菌株溶磷圈大于其它菌株，溶磷效果好；

E、菌株复筛：采用摇瓶法对菌株的溶磷能力进行复筛，所述的复 筛采用NBRIP培养基；

所述的摇瓶法对菌株的溶磷能力进行复筛步骤为：于250mL三 角瓶中装入NBRIP培养基50mL，115℃、30min高压灭菌备用； 将在LB液体培养基中过夜培养的8株细菌离心收集菌体，用无菌水 悬浮制成菌悬液1×10⁶CFU·mL^-1，取0.5mL菌悬液接种于上述灭 菌的NBRIP培养基中，以接入等体积无菌水为对照CK；通过摇瓶 法定量筛选发现欺其中的二株菌株有好的溶磷作用；

F、菌株产NH₃能力测定

将选择的8株菌株在LB液体培养基活化后，将菌株转接到含10 mL蛋白胨水(10g/L)试管中，28℃±2℃培养48-72h，每管加入 0.5mLNessler’s试剂，颜色由褐色转为黄色的表明有NH₃产生。

G、菌株产植物激素吲哚乙酸IAA能力测定

采用Salkow ski比色法测定植物促生菌分泌IAA的能力：，颜色 越深表示分泌数量多；2个重复均不变色为阴性，表示不分泌IAA； 比色液根据IAA产生的浓度选择PC比色液或者S2比色液其中一种 加入；

H、多效菌株的确定：综合比较8个菌株在溶磷、产氨和产植物 激素吲哚乙酸的能力，其中的一个菌株的多效效果明显，得到的该菌 株即为多效植物促生菌所述的一种多效植物促生菌的形态、培养、生 理、生化特征为：细胞杆状、在LB培养基中生长良好、在牛肉膏蛋 白胨琼脂平板上培养时菌落白色，不透明，呈圆形，表面干燥，边缘 不整齐。

本发明的有益效果：本发明的微生物对植物具有明显多效的促生 功效。用其制作的肥料和接种剂在土壤中容易定殖，对土壤中养分转 化效果明显，对植物的生长有良好的促进作用。相比单一功能的微生 物菌株制成的肥料，本发明能更好地能让土壤养分转化和吸收，从而 保证植物生长所需要的充足养分。

附图说明

图1为菌株菌落形态照片和电镜照片。

图2为八株菌株溶磷能力对比表。

图3为八株菌株产NH₃能力对比表。

图4为不同接种量下菌株的生长速率曲线。

图5为不同pH对菌株的生长速率曲线。

具体实施方式：

下面结合附图及具体实旆例对本发明作进一步的说明。

本发明所述的一种多效植物促生菌已于2017年9月25日保藏 于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编 号为CGMCCNo.14664。保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3 号。

所述的多效植物促生菌在肥料中的应用。所述的肥料为微生物菌 肥料。

所述的多效植物促生菌在促进农作物生长的微生物接种剂的应 用。

所述的多效植物促生菌为阿耶波多氏芽孢杆菌Bacillus aryabhattai，根据菌株的菌落形态特征、培养特征和生理生化特征， 通过其16S rDNA序列在NCBI数据库上进行核酸序列比对，并参照伯 杰氏细菌鉴定手册，该菌株为阿耶波多氏芽孢杆菌Bacillusaryabhattai。

所述的一种多效植物促生菌的形态、培养、生理、生化特征为： 细胞杆状、在LB培养基中生长良好、在牛肉膏蛋白胨琼脂平板上培 养时菌落白色，不透明，呈圆形，表面干燥，边缘不整齐。

本发明所述的一种多效植物促生菌已于2017年9月25日 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保 藏编号为CGMCCNo.14664。

所述的多效植物促生菌在肥料中的应用。所述的肥料为微生物菌 肥料。

所述的多效植物促生菌在促进农作物生长的微生物接种剂的应 用。

所述的多效植物促生菌为阿耶波多氏芽孢杆菌Bacillus aryabhattai，根据菌株的菌落形态特征、培养特征和生理生化特征， 通过其16S rDNA序列在NCBI数据库上进行核酸序列比对，并参照伯 杰氏细菌鉴定手册，该菌株为阿耶波多氏芽孢杆菌Bacillusaryabhattai。

所述的一种多效植物促生菌保藏菌株的形态、培养、生理、生化 特征为：细胞杆状、在LB培养基中生长良好，在牛肉膏蛋白胨琼脂 平板上培养时菌落为白色，不透明，呈圆形，表面干燥，边缘不整齐。

所述的多效植物促生菌生长性能中不同接种量对所述菌株的生长 的影响：在相同体积的液体LB液体培养基中，分别接种0.1％、0.5％、 1.0％和2.0％的活化种子液，置于30℃摇床上，每隔1h，利用分光光 度计测定OD600值，连续测定44h，设置1个空白对照；测定发现菌 株的生长速率较快，接种后4h就进入对数生长期，10h时已经进入 稳定期；不同接种量对菌株2-2生长的影响较小，菌株进入对数生长 期和稳定期的时间无显著差异；在培养28h后，2％高接种量的处理出 现菌体密度下降；培养结果说明，菌株2-2的代谢能力较强、生长速 率较快，在定殖中快速的占领生态位；

所述的LB液体培养基：蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化钠5g，pH 7.0,121℃灭菌20min，冷却后用于接种菌种。

所述的多效植物促生菌生长性能中不同pH对菌株生长的影响：调 整初始LB液体培养基的pH为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，121℃灭 菌20min后，并接种0.5％菌株种子液，置于30℃摇床上，每隔1h， 利用分光光度法测定OD600值，连续测定44h，设置1个空白对照； pH对菌株的生长影响较大，pH为4.0时，菌株生长速率较低，在培 养结束时都没有生长；菌株在初始pH6.0时的生长速率最高，后期未 出现菌体浓度下降，初始pH为8.0时初始生长速率较快与pH6.0时 接近，但是26h后出现菌体浓度下降的情况。

所述的一种多效植物促生菌的分离筛选方法，其特征在于所述的 分离筛选方法至少包括如下步骤：

A、采样：从浙江金华辣椒连作基地采集植株长势较好的根际土 样6袋，所述的采样时间为2016年；

B:菌株分离：采用LB固体培养基分离法进行分离，所述的LB 固体培养基分离法为：从每袋土样中称取5克的样品，分别置于45ml 无菌水中，在摇床上振荡30min，然后吸取振荡均匀的土壤溶液0.5ml 至9.5ml的无菌水中，如此稀释直至10^-6，吸取稀释倍数为10^-4、10^-5、 10^-6的溶液各0.1ml，涂布于LB固体培养基平板；涂布后的该平板在 30度培养箱中培养24h,根据菌落形态差异，最后挑取46株菌株，用 进一步的筛选；

所述的LB固体培养基：蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化钠5g， 琼脂2.0g，pH 7.0,121℃灭菌20min，冷却至60℃；用于平板或者 斜面的制备；

C：菌株鉴定及选择：用提取菌株的基因组DNA，扩增16S rDNA 序列，在NCBI数据库进行比对，对得到的菌株进行初步鉴定，选择 不同种属、生长速率较快的8株菌株；所述的初步鉴定方法为：采用 基因组提取试剂盒提取菌株的基因组DNA，采用16S rDNA通用引物上游引物【27F)：5’AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG 3’下游引物(1492R)： 5’TAC GGY TACCTT GTT ACG ACT T 3’】PCR扩增16S rDNA序列， 在NCBI数据库进行比对，所述的属性差异选择的原则是：根据序列 比对选择不同种的菌株；

D、菌株初筛：采用平板法初筛，对上述分离选出的8株菌株通 过其溶磷能力的比较进行初筛选；初筛选择采用改良的PVK固体培 养基进行：所述的PVK固体培养基葡萄糖10g，Ca₃(PO₄)₂ 5g， (NH₄)₂SO₄ 0.5 g，NaCl 0.2g，MgSO₄·7H₂O 0.1g，KCl 0.2g，酵母粉0.5g，MnSO₄·H₂O 0.002g，FeSO₄·7H₂O 0.002g，琼脂25g，0.4％ 溴酚蓝(pH 6.7)6mL，蒸馏水1000mL，pH 7.0-7.2；

平板法进行初筛过程是：用灭菌的牙签将8株菌株分别点接在改 良的PVK培养基上，30℃温度下培养3d，测量溶磷圈的直径(D) 和菌落的直径(d)，计算溶磷圈与菌落直径比(D/d)；平板初筛发现其 中的四株菌株溶磷圈大于其它菌株，溶磷效果好；

E、菌株复筛：采用摇瓶法对菌株的溶磷能力进行复筛，所述的复 筛采用NBRIP培养基，所述的NBRIP培养基组份：葡萄糖10g， Ca₃(PO₄)₂ 5g，MgCl₂·6H₂O 5g，MgSO₄·7H₂O0.25g，KCl 0.2g， (NH₄)₂SO₄ 0.1 g，蒸馏水1000mL，其pH 7.0；

所述的摇瓶法对菌株的溶磷能力进行复筛步骤为：于250mL三 角瓶中装入NBRIP培养基50mL，115℃、30min高压灭菌备用； 将在LB液体培养基中过夜培养的8株细菌离心收集菌体，用无菌水 悬浮制成菌悬液1×10⁶CFU·mL^-1，取0.5mL菌悬液接种于上述灭 菌的NBRIP培养基中，以接入等体积无菌水为对照CK；每个处理 重复3次，30℃、170r·min^-1摇床培养7d，发酵液经10000g离 心10min，上清液分别用钼锑抗比色法和雷兹PHS－3D pH计测定磷 含量和pH值；通过摇瓶法定量筛选发现欺其中的二株菌株有好的溶 磷作用；

F、菌株产NH₃能力测定

将选择的8株菌株在LB液体培养基活化后，将菌株转接到含10 mL蛋白胨水(10g/L)试管中，28℃±2℃培养48-72h，每管加入 0.5mLNessler’s试剂，颜色由褐色转为黄色的表明有NH₃产生。

G、菌株产植物激素吲哚乙酸IAA能力测定

采用Salkow ski比色法测定植物促生菌分泌IAA的能力：将8 株菌株接种在LB液体培养基中培养12h(37℃、170r/min)后，用无 菌水调节OD600值为0.05，取100μLPGPR菌悬浮液分别接到含有 100mg/L色氨酸的King培养液中，每三角瓶盛有50mL的培养液， 重复2次，以加100μL无菌水的培养液为空白对照，一起置于30℃、 转速为170r/min的控温振荡器中培养4d；分别取菌悬浮液和空白 对照200μL，10000rpm高速离心去除菌体后，向所得上清液中各加 入200μL的比色液，，置室温下避光静置，30min内观察其颜色变 化，2个重复均变红为阳性，表示能分泌IAA，颜色越深表示分泌 数量多；2个重复均不变色为阴性，表示不分泌IAA；

比色液根据IAA产生的浓度选择PC比色液或者S2比色液其中 一种加入；

所述的PC比色液的配制：称取FeCl₃ 12 g溶于300mL蒸馏水， 然后缓慢加入429.7mL 98％H₂SO₄，待冷却后定容至1L，测定范 围0.3～20mg/L；

所述的S2比色液的配制:将4.5gFeCl₃溶于300mL蒸馏水，然 后缓慢加入587.4mL98％H₂SO₄，待冷却后定容至1L，测定IAA 范围5～200mg/L；

所述的King培养基，含100mg/L色氨酸：蛋白胨20g，甘油10 mL，K₂HPO₄ 1.5 g，MgSO₄·7H₂O 1.5g，色氨酸100mg，去离子水 定容1000mL；

H、多效菌株的确定：综合比较8个菌株在溶磷、产氨和产植物 激素吲哚乙酸的能力，其中的一个菌株的多效效果明显，得到的该菌 株即为多效植物促生菌。

所述的多效菌株16S rDNA序列如序列表所示。序列比对结果： 属阿耶波多氏芽孢杆菌Bacillus aryabhattai。

序列表

<110> 浙江省农业科学院；浙江省耕地质量与肥料管理总站

<120> 一株多效植物促生菌及分离筛选方法

<130> 2019

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1411

<212> DNA

<213> 阿耶波多氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)

<400> 1

gctagctcct tacggttact ccaccgactt cgggtgttac aaactctcgt ggtgtgacgg 60

gcggtgtgta caaggcccgg gaacgtattc accgcggcat gctgatccgc gattactagc 120

gattccagct tcatgtaggc gagttgcagc ctacaatccg aactgagaat ggttttatgg 180

gattggcttg acctcgcggt cttgcagccc tttgtaccat ccattgtagc acgtgtgtag 240

cccaggtcat aaggggcatg atgatttgac gtcatcccca ccttcctccg gtttgtcacc 300

ggcagtcacc ttagagtgcc caactaaatg ctggcaacta agatcaaggg ttgcgctcgt 360

tgcgggactt aacccaacat ctcacgacac gagctgacga caaccatgca ccacctgtca 420

ctctgtcccc cgaaggggaa cgctctatct ctagagttgt cagaggatgt caagacctgg 480

taaggttctt cgcgttgctt cgaattaaac cacatgctcc accgcttgtg cgggcccccg 540

tcaattcctt tgagtttcag tcttgcgacc gtactcccca ggcggagtgc ttaatgcgtt 600

agctgcagca ctaaagggcg gaaaccctct aacacttagc actcatcgtt tacggcgtgg 660

actaccaggg tatctaatcc tgtttgctcc ccacgctttc gcgcctcagc gtcagttaca 720

gaccaaaaag ccgccttcgc cactggtgtt cctccacatc tctacgcatt tcaccgctac 780

acgtggaatt ccgcttttct cttctgcact caagttcccc agtttccaat gaccctccac 840

ggttgagccg tgggctttca catcagactt aagaaaccgc ctgcgcgcgc tttacgccca 900

ataattccgg ataacgcttg ccacctacgt attaccgcgg ctgctggcac gtagttagcc 960

gtggctttct ggttaggtac cgtcaaggta cgagcagtta ctctcgtact tgttcttccc 1020

taacaacaga gttttacgac ccgaaagcct tcatcactca cgcggcgttg ctccgtcaga 1080

ctttcgtcca ttgcggaaga ttccctactg ctgcctcccg taggagtctg ggccgtgtct 1140

cagtcccagt gtggccgatc accctctcag gtcggctatg catcgttgcc ttggtgagcc 1200

gttacctcac caactagcta atgcaccgcg ggcccatctg taagtgatag ccgaaaccat 1260

ctttcaatca tctcccatga aggagaagat cctatccggt attagcttcg gtttcccgaa 1320

gttatcccag tcttacaggc aggttgccca cgtgttactc acccgtccgc cgctaacgtc 1380

atagaagcaa gcttctaatc agttcgctcg a 1411

Claims (9)

1.一种多效植物促生菌，其特征在于，所述的多效植物促生菌保藏编号为CGMCCNo.14664。

2.根据权利要求1所述的一种多效植物促生菌，其特征在于所述的多效植物促生菌在肥料中的应用。

3.根据权利要求1所述的一种多效植物促生菌，其特征在于所述的肥料为微生物肥料。

4.根据权利要求1所述的一种多效植物促生菌，其特征在于所述的多效植物促生菌在促进农作物生长的微生物接种剂的应用。

5.根据权利要求1所述的一种多效植物促生菌，其特征在于根据菌株的菌落形态特征、培养特征和生理生化特征，利用其16S rDNA序列在NCBI数据库上进行核酸序列比对，并参照伯杰氏细菌鉴定手册，该菌株确认为属阿耶波多氏芽孢杆菌Bacillus aryabhattai。

6.根据权利要求1所述的一种多效植物促生菌，其特征在于保藏菌株的形态、培养、生理、生化特征为：细胞杆状、在LB培养基中生长良好，在牛肉膏蛋白胨琼脂平板上培养时菌落为白色，不透明，呈圆形，表面干燥，边缘不整齐。

7.根据权利要求1所述的多效植物促生菌，其特征在于所述的多效植物促生菌生长性能中不同接种量对所述菌株的生长的影响：在相同体积的液体LB液体培养基中，分别接种0.1％、0.5％、1.0％和2.0％的活化种子液，置于30℃摇床上，每隔1h，利用分光光度计测定OD600值，连续测定44h，设置1个空白对照；测定发现菌株的生长速率较快，接种后4h就进入对数生长期，10h时已经进入稳定期；不同接种量对菌株2-2生长的影响较小，菌株进入对数生长期和稳定期的时间无显著差异；在培养28h后，2％高接种量的处理出现菌体密度下降；培养结果说明，菌株2-2的代谢能力较强、生长速率较快，在定殖中快速的占领生态位；

所述的LB液体培养基：蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化钠5g，pH7.0,121℃灭菌20min，冷却后用于接种菌种。

8.根据权利要求1所述的多效植物促生菌，其特征在于所述的多效植物促生菌生长性能中不同pH对菌株生长的影响：调整初始LB液体培养基的pH为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，121℃灭菌20min后，并接种0.5％菌株种子液，置于30℃摇床上，每隔1h，利用分光光度法测定OD600值，连续测定44h，设置1个空白对照；pH对菌株的生长影响较大，pH为4.0时，菌株生长速率较低，在培养结束时都没有生长；菌株在初始pH6.0时的生长速率最高，后期未出现菌体浓度下降，初始pH为8.0时初始生长速率较快与pH6.0时接近，但是26h后出现菌体浓度下降的情况。

9.根据权利要求1所述的一种多效植物促生菌的分离筛选方法，其特征在于所述的分离筛选方法至少包括如下步骤：

A、采样：从浙江金华辣椒连作基地采集植株长势较好的根际土样6袋，所述的采样时间为2016年；

B:菌株分离：采用LB固体培养基分离法进行分离，所述的LB固体培养基分离法为：从每袋土样中称取5克的样品，分别置于45ml无菌水中，在摇床上振荡30min，然后吸取振荡均匀的土壤溶液0.5ml 至9.5ml的无菌水中，如此稀释直至10^-6，吸取稀释倍数为10^-4、10^-5、10^-6的溶液各0.1ml，涂布于LB固体培养基平板；涂布后的该平板在30度培养箱中培养24h,根据菌落形态差异，最后挑取46株菌株，用进一步的筛选；

所述的LB固体培养基：蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化钠5g，琼脂2.0g，pH 7.0,121℃灭菌20min，冷却至60℃；用于平板或者斜面的制备；

C：菌株鉴定及选择：用提取菌株的基因组DNA，扩增16S rDNA序列，在NCBI数据库进行比对，对得到的菌株进行初步鉴定，选择不同种属、生长速率较快的8株菌株；所述的初步鉴定方法为：采用基因组提取试剂盒提取菌株的基因组DNA，采用16S rDNA通用引物上游引物【27F)：5’AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG 3’下游引物(1492R)：5’TAC GGY TAC CTT GTTACG ACT T 3’】PCR扩增16S rDNA序列，在NCBI数据库进行比对，所述的属性差异选择的原则是：根据序列比对选择不同种的菌株；

D、菌株初筛：采用平板法初筛，对上述分离选出的8株菌株通过其溶磷能力的比较进行初筛选；初筛选择采用改良的PVK固体培养基进行：所述的PVK固体培养基葡萄糖10g，Ca₃(PO₄)₂5g，(NH₄)₂SO₄0.5 g，NaCl 0.2g，MgSO₄·7H₂O 0.1g，KCl 0.2g，酵母粉0.5g，MnSO₄·H₂O 0.002g，FeSO₄·7H₂O 0.002g，琼脂25g，0.4％溴酚蓝(pH 6.7)6mL，蒸馏水1000mL，pH7.0-7.2；

平板法进行初筛过程是：用灭菌的牙签将8株菌株分别点接在改良的PVK培养基上，30℃温度下培养3d，测量溶磷圈的直径(D)和菌落的直径(d)，计算溶磷圈与菌落直径比(D/d)；平板初筛发现其中的四株菌株溶磷圈大于其它菌株，溶磷效果好；

E、菌株复筛：采用摇瓶法对菌株的溶磷能力进行复筛，所述的复筛采用NBRIP培养基，所述的NBRIP培养基组份：葡萄糖10g，Ca₃(PO₄)₂ 5g，MgCl₂·6H₂O 5g，MgSO₄·7H₂O 0.25g，KCl 0.2g，(NH₄)₂SO₄0.1 g，蒸馏水1000mL，其pH 7.0；

所述的摇瓶法对菌株的溶磷能力进行复筛步骤为：于250mL三角瓶中装入NBRIP培养基50mL，115℃、30min高压灭菌备用；将在LB液体培养基中过夜培养的8株细菌离心收集菌体，用无菌水悬浮制成菌悬液1×10⁶CFU·mL^-1，取0.5mL菌悬液接种于上述灭菌的NBRIP培养基中，以接入等体积无菌水为对照CK；每个处理重复3次，30℃、170r·min^-1摇床培养7d，发酵液经10000g离心10min，上清液分别用钼锑抗比色法和雷兹PHS－3D pH计测定磷含量和pH值；通过摇瓶法定量筛选发现欺其中的二株菌株有好的溶磷作用；

F、菌株产NH₃能力测定

将选择的8株菌株在LB液体培养基活化后，将菌株转接到含10mL蛋白胨水(10g/L)试管中，28℃±2℃培养48-72h，每管加入0.5mLNessler’s试剂，颜色由褐色转为黄色的表明有NH₃产生；

G、菌株产植物激素吲哚乙酸IAA能力测定

采用Salkow ski比色法测定植物促生菌分泌IAA的能力：将8 株菌株接种在LB液体培养基中培养12h(37℃、170r/min)后，用无菌水调节OD600值为0.05，取100μLPGPR菌悬浮液分别接到含有100mg/L色氨酸的King培养液中，每三角瓶盛有50mL的培养液，重复2次，以加100μL无菌水的培养液为空白对照，一起置于30℃、转速为170r/min的控温振荡器中培养4d；分别取菌悬浮液和空白对照200μL，10000rpm高速离心去除菌体后，向所得上清液中各加入200μL的比色液，，置室温下避光静置，30min内观察其颜色变化，2个重复均变红为阳性，表示能分泌IAA，颜色越深表示分泌数量多；2个重复均不变色为阴性，表示不分泌IAA；

比色液根据IAA产生的浓度选择PC比色液或者S2比色液其中一种加入；

所述的PC比色液的配制：称取FeCl₃ 12g溶于300mL蒸馏水，然后缓慢加入429.7mL 98％H₂SO₄，待冷却后定容至1L，测定范围0.3～20mg/L；

所述的S2比色液的配制:将4.5gFeCl₃溶于300mL蒸馏水，然后缓慢加入587.4mL 98％H₂SO₄，待冷却后定容至1L，测定IAA范围5～200mg/L；

所述的King培养基，含100mg/L色氨酸：蛋白胨20g，甘油10mL，K₂HPO₄ 1.5g，MgSO₄·7H₂O1.5g，色氨酸100mg，去离子水定容1000mL；

H、多效菌株的确定：综合比较8个菌株在溶磷、产氨和产植物激素吲哚乙酸的能力，其中的一个菌株的多效效果明显，得到的该菌株即为多效植物促生菌。