CN113388519A - 一种促进通关藤生长的内生菌筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种促进通关藤生长的菌株筛选方法，具体包括以下步骤：步骤1，分离通关藤根、茎、叶中的内生细菌；步骤2，分离通关藤根、茎、叶中的内生真菌；步骤3，鉴别获得的内生菌菌株种类；步骤4，检测获得的内生菌的促生潜力；步骤5，检测内生菌株对促进通关藤生长的效果；本发明通过从通关藤中分离内生菌，通过全面的系统化检测筛选出对促进通关藤生长效果较好的内生菌，将筛选结果应用于通关藤栽培，能获得较好的作用效果。
Description
技术领域
本发明属于通关藤栽培技术领域，特别是涉及一种促进通关藤生长的内生菌筛选方法。
背景技术
通关藤[Marsdenia tenacissima(Roxb.)Wight et Arn.]为萝藦科牛奶菜属多年生木质藤本植物，通关藤主要分布于云南南部、广西西部、贵州西南部及四川南部等地，根据资源集中程度可依次分为滇东南、桂西片区、滇西南片区、黔西南片区等四大片区，分布于海拔850～1250m的喀斯特地石灰岩山区，喜光，适生于温暖湿润的环境，是西南地区常用的民族药之一。通关藤的药用部位为干燥藤茎，有效成分为甾体皂苷、生物碱和多糖。研究发现C21甾体类化合物是通关藤中具有抗肿瘤作用的主要活性物质，具有抗肿瘤、降压、平喘等作用。
随着通关藤药用价值的开发利用，生产上的原材料仅来自于野生资源和自然繁育，野生资源被大幅度的胡乱开采而造成资源的破坏严重，野生资源越来越不能满足市场需求，蕴藏量在急剧地下降急需对其进行保护。利用人工种植通关藤代替野生资源刻不容缓，在人工种植如何提高通关藤生长速度，提高药用品质等问题上仍有待突破。萝藦科植物的花粉以花粉块的形式存在，这是该科植物的典型特征，通关藤尤为典型。萝藦科植物的坐果率一般都比较低，平均0.33％～5.00％。目前，规范化栽培和野生抚育种植的通关藤苗均以种子直播和扦插为繁殖方式。但由于通关藤坐果率普遍都比较低，使通关藤花多果少，产生的种子数量也少，种子萌发率不高，种子在浸泡过程中，吸水过多，会发生腐烂，成为利用种子进行扩大繁殖的一个限制因素，通关藤在自然环境下从种子到用药需要3-4年，生长速度缓慢；而扦插的方法成活率虽然较高，但在后期容易感病。并且，通关藤的扦插繁育技术的条件还在摸索阶段，很多问题还没得到解决，难以满足市场的需求。还有研究者通过组织培养的方式来繁殖通关藤，只有中部茎的成功率较高，而且由于通关藤的根、茎、叶中都含有丰富的乳汁，在转接过程中会造成褐变，也不能很好的满足大量繁殖。植物组织培养技术不受季节、气候和地区等因素影响，可实现快速繁殖，但鲜见通关藤通过组培技术成功繁殖的报道。
内生菌可以促进植物生长，促进养分吸收，保护植物免受生物胁迫和非生物胁迫。内生菌还能产生内毒素或者植物生长调节剂或者获取更多营养保护植物免受病原菌的侵染。内生菌与宿主药用植物长期的协同进化过程中，也会使自身产生一些与宿主药用植物相似或相同的活性成分极具药用开发价值的潜力,克服了药用植物生长年限长等问题。内生菌除了自身产生与寄主相同的次生代谢物以外，内生菌还能刺激宿主植物产生次生代谢物，对人类健康和医学具有重要意义。目前农民使用农用化学农药促进通关藤生长，然而农用化学品的使用对环境造成污染，并且大大影响了通关藤的品质，因此需要寻找替代的环保微生物来源以促进通关藤生长。
发明内容
为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种促进通关藤生长的内生菌筛选方法。
为达到上述目的，本发明的技术方案为：
一种促进通关藤生长的菌株筛选方法，包括以下步骤：步骤1，分离通关藤根、茎、叶中的内生细菌；步骤2，分离通关藤根、茎、叶中的内生真菌；步骤3，鉴别获得的内生菌菌株种类；步骤4，检测获得的内生菌的促生潜力；步骤5，检测内生菌株对促进通关藤生长的效果。
进一步的，所述的一种促进通关藤生长的菌株筛选方法，包括以下步骤：
步骤1，分离通关藤根、茎、叶中的内生细菌；
将采回的健康通关藤材料用流动自来水冲洗干净，并用滤纸吸干表面水分；先用75％乙醇浸泡1min，无菌水漂洗3次，再用有效氯为5％的次氯酸钠溶液浸泡3min，最后无菌水清洗3-4次至消毒液彻底洗掉，取最后一次清洗的无菌水作对照；分别将通关藤的不同组织放置于已灭菌的研钵中磨碎，加无菌水混匀后转移到装有5mL LB液体培养基的EP管中；摇床设置为30℃、200rpm、震荡培养1.5-2h，再稀释制成10-3、10-4和10-5三个不同浓度梯度的菌悬液；取100μL上述菌悬液涂布于LB平板培养基上，另取最后一次清洗的无菌水100μL作为对照，每个梯度设三个重复，放置于30℃培养箱倒置培养24-48h；待有细菌菌落长出，选取形态和颜色不同特征的单菌落，用牙签挑取单菌落在LB固体培养平板上进行划线培养，并分别编号；经过几次划线纯化后摇菌将菌液和50％的灭菌甘油按1:1的比例保存于-80℃，编号存菌，备用；
步骤2，分离通关藤根、茎、叶中的内生真菌；
用自来水冲洗新鲜通关藤的根、茎、叶；70％乙醇漂1min，后用无菌水反复冲洗5次，而后用5％Naclo消毒5min，之后再用无菌水反复冲洗5次，用灭菌滤纸吸干多余水分；最后用灭菌的刀片将根茎切成小块；准备PDA培养基(加练霉素)，将切好的小块段置于培养基内，每个培养皿放置4块组织，在30℃的恒温下培养；从最后一次洗涤的无菌水中提取100μL接种在PDA平板上进行植物组织样本的表面灭菌检查；培养5-10d后及时采用尖端菌丝挑取法，挑取形态不同的菌丝或菌落移种到新鲜PDA培养基上进行纯化，纯化后转接到斜面上保存备用；
步骤3，鉴别获得的内生菌菌株种类
利用细菌16S rRNA基因和真菌ITS rDNA重新连接子扩增及序列分析进行分子鉴定。对扩增产物进行DNA序列测序，对测序结果进行BLAST序列对比和同源性分析，确定纯化内生菌株的种类。采用CTAB法提取通关藤内生基因组DNA；PCR鉴定所用引物序列是针对细菌的通用引物：27F：(5'-GAGTTTGATCACTGGCTCAG-3')1492R(5'-TACGGCTACCTTGTTACGA-3')，真菌的通用引物：ITS1：5′-TCCGTGGACTGACTCGG-3′；ITS4：5′-TCCTCGG-CTTATGATGC-3′(El-Dinhassan 2017)，PCR混合反应液中含有22.5ul的金牌mix,每个引物1ul,基因组DNA0.5ul,扩增程序为95℃预变性3min,95℃变性1min,50℃30s,72℃延伸30s,最后72摄氏度延伸5min,总共30个循环；反应结束后，1％琼脂糖凝胶，180伏电压电泳20min左右，电泳检测扩增效果；根据检测结果评价其质量，送昆明硕擎有限公司测序。将测序结果在NCBI数据库中进行BLAST比对，搜索同源序列，找出相似性最高的菌株确定生物学分类地位；
步骤4，检测获得的内生菌的促生潜力：
(1)内生菌固氮能力测定；
(2)内生菌解钾能力测定；
(3)内生菌溶磷能力测定；
(4)内生菌产IAA能力检测；
步骤5，检测内生菌株对促进通关藤生长的效果
内生细菌浇灌菌悬液的制备：在超净工作台内，吸取1ml纯化后的内生细菌进入装有500ml经高压灭菌的LB液体培养基的三角瓶内，封好瓶口，200rpm，37℃震荡培养至OD600为0.5-0.6；500ml无菌离心管5000rpm，离心5min，倒入500ml无菌水重悬，即制成菌悬液；
内生真菌浇灌孢子悬浮液的制备：在超净工作台内，无菌环境下往经121℃高压灭菌处理过的培养瓶内倒500ml PDB液体培养基，之后挑取新鲜菌丝放于培养瓶内，仔细封好瓶口，避免污染；200rpm·min-1，30℃震荡培养6d，对菌液有效活菌数测定达到1×108CFU/ml后用于浇菌；
2020年6月移栽通关藤3个月生的苗，移栽30天后，8个菌株处理以菌悬液灌根的方式浇灌通关藤苗，以无菌水作为对照，共9个处理，每个处理种植9盆，每盆种植1株通关藤3个月生幼苗，每盆浇灌菌悬液50ml；共培养60d后，将通关藤连根取出，清水清洗干净，用擦镜纸吸干表面水分，对相关数据进行统计分析；
共培养60天后，用精确度为0.1cm的直尺测量通关藤幼苗的自然株高；精确度为0.1g用电子天平准确称量通关藤幼苗的鲜重。
进一步的，所述步骤4中，内生菌固氮能力测定具体为：低氮培养基：硝酸钙0.03g，磷酸氢二钠1g，氯化钙0.1g，硫酸镁0.12g，磷酸二氢钾0.1g，柠檬酸铁0.05g，硫酸亚铁0.3g，琼脂20g，蒸馏水定容至1L；微量元素：硼酸2.86g，硫酸锰1.81g，硫酸铜0.8g，钼酸0.02g，定容至1L；配置好的低氮培养基配制好过后加入10ml微量元素溶液，用接种针将分离得到的细菌接种于固氮固体平板培养皿上，每个菌株5个皿重复，28℃倒置培养14d，观察是否生长，无细菌生长即无固氮能力。
进一步的，所述步骤4中，
内生菌解钾能力测定具体为：
解钾培养基：葡萄糖10g，磷酸二氢钠1g，硝酸铵3g，硫酸镁3g，钾长石粉1.5g，硫酸锰0.3g，硫酸亚铁0.3g，琼脂20g，PH＝7.0蒸馏水定容至1L；用接种针将内生细菌接种于解钾固体平板培养皿上，每个菌株5个皿重复，28℃倒置培养14d，观察是否生长，无细菌生长即无解钾能力。
进一步的，所述步骤4中，
内生菌溶磷能力测定具体为：
有机磷培养基：葡萄糖10g，硫酸铵0.5g，氯化钠0.3g，氯化钾0.3g，硫酸镁0.3g，硫酸锰0.03g，硫酸亚铁0.03g，磷酸三钙5g，卵磷脂0.2g，酵母浸粉0.5g，琼脂20g，调节pH为7.0，蒸馏水定容至1L，121℃灭菌20min；将内生细菌接种于有机磷固体平板培养皿上，每个菌株每皿接3个点，每点取1ul，5个皿重复；28℃恒温倒置培养7d，观察有无溶磷圈及其大小，溶磷圈的大小是反应菌株溶磷能力的指标之一，一般溶磷圈越大代表溶磷能力越好。
进一步的，所述步骤4中，内生菌产IAA能力检测具体为：
查氏液体培养基：硝酸钠3g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁0.5g，氯化钠0.5g，硫酸亚铁0.01g，色氨酸0.5g，蔗糖30g，定容至1L；Salkowski显色剂：浓硫酸150ml，蒸馏水250ml，0.5mol/LFeCl3.6H2O 7.5ml；将内生细菌接种在1.5ml查氏液体培养基，30℃，200rpm，培养四天，用无菌枪头取出1mL菌液于灭菌的5mL离心管中，加入2mL Salkowski显色剂，室温黑暗显色20min，出现粉红色为阳性，说明有IAA产生，颜色越深说明产IAA的能力越强；用分光光度计在530nm处对混合物的吸光度进行了标定，使用相同的溶剂校准(对照)，用计算得到的标准曲线y＝40.063x-1.9228(r2＝0.9469)，测定菌株产IAA的浓度。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：
一种促进通关藤生长的菌株筛选方法，具体包括以下步骤：步骤1，分离通关藤根、茎、叶中的内生细菌；步骤2，分离通关藤根、茎、叶中的内生真菌；步骤3，鉴别获得的内生菌菌株种类；步骤4，检测获得的内生菌的促生潜力；步骤5，检测内生菌株对促进通关藤生长的效果；本发明通过从通关藤中分离内生菌，通过全面的系统化检测筛选出对促进通关藤生长效果较好的内生菌，将筛选结果应用于通关藤栽培，能获得较好的作用效果。
附图说明
图1是本发明的流程图。
图2是本发明提纯内生细菌的电泳图。
图3是本发明提纯内生真菌的电泳图。
图4是本发明提纯内生细菌的促生潜力图。
图5是本发明提纯内生真菌的促生潜力图。
图6是本发明内生菌对通关藤促生效果图。
图7是本发明内生菌对通关藤株高效果图。
图8是本发明内生菌对通关藤鲜重效果图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明技术方案做进一步详细描述：
如图1-8所示，一种促进通关藤生长的内生菌筛选方法，包括如下步骤，步骤1，分离通关藤根、茎、叶中的内生细菌；
将采回的健康通关藤材料用流动自来水冲洗干净，并用滤纸吸干表面水分；先用75％乙醇浸泡1min，无菌水漂洗3次，再用有效氯为5％的次氯酸钠溶液浸泡3min，最后无菌水清洗3-4次至消毒液彻底洗掉，取最后一次清洗的无菌水作对照；分别将通关藤的不同组织放置于已灭菌的研钵中磨碎，加无菌水混匀后转移到装有5mL LB液体培养基的EP管中；摇床设置为30℃、200rpm、震荡培养1.5-2h，再稀释制成10-3、10-4和10-5三个不同浓度梯度的菌悬液；取100μL上述菌悬液涂布于LB平板培养基上，另取最后一次清洗的无菌水100μL作为对照，每个梯度设三个重复，放置于30℃培养箱倒置培养24-48h；待有细菌菌落长出，选取形态和颜色不同特征的单菌落，用牙签挑取单菌落在LB固体培养平板上进行划线培养，并分别编号；经过几次划线纯化后摇菌将菌液和50％的灭菌甘油按1:1的比例保存于-80℃，编号存菌，备用；
步骤2，分离通关藤根、茎、叶中的内生真菌；
用自来水冲洗新鲜通关藤的根、茎、叶；70％乙醇漂1min，后用无菌水反复冲洗5次，而后用5％Naclo消毒5min，之后再用无菌水反复冲洗5次，用灭菌滤纸吸干多余水分；最后用灭菌的刀片将根茎切成小块。准备PDA培养基(加练霉素)，将切好的小块段置于培养基内，每个培养皿放置4块组织，在30℃的恒温下培养；从最后一次洗涤的无菌水中提取100μL接种在PDA平板上进行植物组织样本的表面灭菌检查；培养5-10d后及时采用尖端菌丝挑取法，挑取形态不同的菌丝或菌落移种到新鲜PDA培养基上进行纯化，纯化后转接到斜面上保存备用。
步骤3，鉴别获得的内生菌菌株种类
利用细菌16S rRNA基因和真菌ITS rDNA重新连接子扩增及序列分析进行分子鉴定。对扩增产物进行DNA序列测序，对测序结果进行BLAST序列对比和同源性分析，确定纯化内生菌株的种类。采用CTAB法提取通关藤内生基因组DNA。PCR鉴定所用引物序列是针对细菌的通用引物：27F：(5'-GAGTTTGATCACTGGCTCAG-3')1492R(5'-TACGGCTACCTTGTTACGA-3')，真菌的通用引物：ITS1：5′-TCCGTGGACTGACTCGG-3′；ITS4：5′-TCCTCGG-CTTATGATGC-3′(El-Dinhassan 2017)，PCR混合反应液中含有22.5ul的金牌mix,每个引物1ul,基因组DNA0.5ul,扩增程序为95℃预变性3min,95℃变性1min,50℃30s,72℃延伸30s,最后72摄氏度延伸5min,总共30个循环。反应结束后，1％琼脂糖凝胶，180伏电压电泳20min左右，电泳检测扩增效果(图2-3)。根据检测结果评价其质量，送昆明硕擎有限公司测序。将测序结果在NCBI数据库中进行BLAST比对，搜索同源序列，找出相似性最高的菌株确定生物学分类地位。分离得到22种内生真菌、37种内生细菌。
步骤4，检测获得的内生菌的促生潜力
(1)内生菌固氮能力测定
低氮培养基：硝酸钙0.03g，磷酸氢二钠1g，氯化钙0.1g，硫酸镁0.12g，磷酸二氢钾0.1g，柠檬酸铁0.05g，硫酸亚铁0.3g，琼脂20g，蒸馏水定容至1L。微量元素：硼酸2.86g，硫酸锰1.81g，硫酸铜0.8g，钼酸0.02g，定容至1L。配置好的低氮培养基配制好过后加入10ml微量元素溶液，用接种针将分离得到的细菌接种于固氮固体平板培养皿上，每个菌株5个皿重复，28℃倒置培养14d，观察是否生长，无细菌生长即无固氮能力。
(2)内生菌解钾能力测定
解钾培养基：葡萄糖10g，磷酸二氢钠1g，硝酸铵3g，硫酸镁3g，钾长石粉1.5g，硫酸锰0.3g，硫酸亚铁0.3g，琼脂20g，PH＝7.0蒸馏水定容至1L。用接种针将内生细菌接种于解钾固体平板培养皿上，每个菌株5个皿重复，28℃倒置培养14d，观察是否生长，无细菌生长即无解钾能力。
(3)内生菌溶磷能力测定
有机磷培养基：葡萄糖10g，硫酸铵0.5g，氯化钠0.3g，氯化钾0.3g，硫酸镁0.3g，硫酸锰0.03g，硫酸亚铁0.03g，磷酸三钙5g，卵磷脂0.2g，酵母浸粉0.5g，琼脂20g，调节pH为7.0，蒸馏水定容至1L，121℃灭菌20min。将内生细菌接种于有机磷固体平板培养皿上，每个菌株每皿接3个点，每点取1ul，5个皿重复。28℃恒温倒置培养7d，观察有无溶磷圈及其大小，溶磷圈的大小是反应菌株溶磷能力的指标之一，一般溶磷圈越大代表溶磷能力越好。
(4)内生菌产IAA能力检测
查氏液体培养基：硝酸钠3g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁0.5g，氯化钠0.5g，硫酸亚铁0.01g，色氨酸0.5g，蔗糖30g，定容至1L；Salkowski显色剂：浓硫酸150ml，蒸馏水250ml，0.5mol/L FeCl3.6H2O 7.5ml。将内生细菌接种在1.5ml查氏液体培养基，30℃，200rpm，培养四天，用无菌枪头取出1mL菌液于灭菌的5mL离心管中，加入2mL Salkowski显色剂，室温黑暗显色20min，出现粉红色为阳性，说明有IAA产生，颜色越深说明产IAA的能力越强。分离得到的37种内生细菌25种具有固氮能力、8种具有溶磷能力、28种具有解钾能力、10种能产生IAA(图4),选择4种促生潜力较强的内生细菌来盆栽试验：XG13、XG41、XY11、XG352。22种内生真菌中，22种都没有固氮能力，22种有解钾能力、2种具有溶磷能力、11种能产IAA，选择4种促生潜力较强的内生真菌来盆栽试验：ZJ1、ZG7、ZG1、ZG10(图5)。
步骤5，检测内生菌株对促进通关藤生长的效果
内生细菌浇灌菌悬液的制备：在超净工作台内，吸取1ml纯化后的内生细菌进入装有500ml经高压灭菌的LB液体培养基的三角瓶内，封好瓶口，200rpm，37℃震荡培养至OD600为0.5-0.6。500ml无菌离心管5000rpm，离心5min，倒入500ml无菌水重悬，即制成菌悬液。
内生真菌浇灌孢子悬浮液的制备：在超净工作台内，无菌环境下往经121℃高压灭菌处理过的培养瓶内倒500ml PDB液体培养基，之后挑取新鲜菌丝放于培养瓶内，仔细封好瓶口，避免污染。200rpm·min-1，30℃震荡培养6d，对菌液有效活菌数测定达到1×108CFU/ml后用于浇菌。
2020年6月移栽通关藤3个月生的苗，移栽30天后，8个菌株处理以菌悬液灌根的方式浇灌通关藤苗，以无菌水作为对照，共9个处理，每个处理种植9盆，每盆种植1株通关藤3个月生幼苗，每盆浇灌菌悬液50ml。共培养60d后，将通关藤连根取出，清水清洗干净，用擦镜纸吸干表面水分，对相关数据进行统计分析。所有的处理都健康生长，且内生菌处理后明显促进生长(图6)。
共培养60天后，用直尺(精确度为0.1cm)测量通关藤幼苗的自然株高，所有内生菌处理后株高都有所增加(图7)；用电子天平(精确度为0.1g)准确称量通关藤幼苗的鲜重，所有内生菌处理后鲜重都有所增加(图8)。其中对通关藤生长效果最好的为ZG7。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。
Claims (6)
1.一种促进通关藤生长的菌株筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，分离通关藤根、茎、叶中的内生细菌；步骤2，分离通关藤根、茎、叶中的内生真菌；步骤3，鉴别获得的内生菌菌株种类；步骤4，检测获得的内生菌的促生潜力；步骤5，检测内生菌株对促进通关藤生长的效果。
2.根据权利要求1所述的一种促进通关藤生长的菌株筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，分离通关藤根、茎、叶中的内生细菌；
将采回的健康通关藤材料用流动自来水冲洗干净，并用滤纸吸干表面水分；先用75％乙醇浸泡1min，无菌水漂洗3次，再用有效氯为5％的次氯酸钠溶液浸泡3min，最后无菌水清洗3-4次至消毒液彻底洗掉，取最后一次清洗的无菌水作对照；分别将通关藤的不同组织放置于已灭菌的研钵中磨碎，加无菌水混匀后转移到装有5mL LB液体培养基的EP管中；摇床设置为30℃、200rpm、震荡培养1.5-2h，再稀释制成10-3、10-4和10-5三个不同浓度梯度的菌悬液；取100μL上述菌悬液涂布于LB平板培养基上，另取最后一次清洗的无菌水100μL作为对照，每个梯度设三个重复，放置于30℃培养箱倒置培养24-48h；待有细菌菌落长出，选取形态和颜色不同特征的单菌落，用牙签挑取单菌落在LB固体培养平板上进行划线培养，并分别编号；经过几次划线纯化后摇菌将菌液和50％的灭菌甘油按1:1的比例保存于-80℃，编号存菌，备用；
步骤2，分离通关藤根、茎、叶中的内生真菌；
用自来水冲洗新鲜通关藤的根、茎、叶；70％乙醇漂1min，后用无菌水反复冲洗5次，而后用5％Naclo消毒5min，之后再用无菌水反复冲洗5次，用灭菌滤纸吸干多余水分；最后用灭菌的刀片将根茎切成小块；准备PDA培养基(加练霉素)，将切好的小块段置于培养基内，每个培养皿放置4块组织，在30℃的恒温下培养；从最后一次洗涤的无菌水中提取100μL接种在PDA平板上进行植物组织样本的表面灭菌检查；培养5-10d后及时采用尖端菌丝挑取法，挑取形态不同的菌丝或菌落移种到新鲜PDA培养基上进行纯化，纯化后转接到斜面上保存备用；
步骤3，鉴别获得的内生菌菌株种类
利用细菌16S rRNA基因和真菌ITS rDNA重新连接子扩增及序列分析进行分子鉴定。对扩增产物进行DNA序列测序，对测序结果进行BLAST序列对比和同源性分析，确定纯化内生菌株的种类。采用CTAB法提取通关藤内生基因组DNA；PCR鉴定所用引物序列是针对细菌的通用引物：27F：(5'-GAGTTTGATCACTGGCTCAG-3')1492R(5'-TACGGCTACCTTGTTACGA-3')，真菌的通用引物：ITS1：5′-TCCGTGGACTGACTCGG-3′；ITS4：5′-TCCTCGG-CTTATGATGC-3′(El-Dinhassan 2017)，PCR混合反应液中含有22.5ul的金牌mix,每个引物1ul,基因组DNA0.5ul,扩增程序为95℃预变性3min,95℃变性1min,50℃30s,72℃延伸30s,最后72摄氏度延伸5min,总共30个循环；反应结束后，1％琼脂糖凝胶，180伏电压电泳20min左右，电泳检测扩增效果；根据检测结果评价其质量，送昆明硕擎有限公司测序。将测序结果在NCBI数据库中进行BLAST比对，搜索同源序列，找出相似性最高的菌株确定生物学分类地位；
步骤4，检测获得的内生菌的促生潜力：
(1)内生菌固氮能力测定；
(2)内生菌解钾能力测定；
(3)内生菌溶磷能力测定；
(4)内生菌产IAA能力检测；
步骤5，检测内生菌株对促进通关藤生长的效果
内生细菌浇灌菌悬液的制备：在超净工作台内，吸取1ml纯化后的内生细菌进入装有500ml经高压灭菌的LB液体培养基的三角瓶内，封好瓶口，200rpm，37℃震荡培养至OD600为0.5-0.6；500ml无菌离心管5000rpm，离心5min，倒入500ml无菌水重悬，即制成菌悬液；
内生真菌浇灌孢子悬浮液的制备：在超净工作台内，无菌环境下往经121℃高压灭菌处理过的培养瓶内倒500ml PDB液体培养基，之后挑取新鲜菌丝放于培养瓶内，仔细封好瓶口，避免污染；200rpm·min-1，30℃震荡培养6d，对菌液有效活菌数测定达到1×108CFU/ml后用于浇菌；
2020年6月移栽通关藤3个月生的苗，移栽30天后，8个菌株处理以菌悬液灌根的方式浇灌通关藤苗，以无菌水作为对照，共9个处理，每个处理种植9盆，每盆种植1株通关藤3个月生幼苗，每盆浇灌菌悬液50ml；共培养60d后，将通关藤连根取出，清水清洗干净，用擦镜纸吸干表面水分，对相关数据进行统计分析；
共培养60天后，用精确度为0.1cm的直尺测量通关藤幼苗的自然株高；精确度为0.1g用电子天平准确称量通关藤幼苗的鲜重。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤4中，内生菌固氮能力测定具体为：低氮培养基：硝酸钙0.03g，磷酸氢二钠1g，氯化钙0.1g，硫酸镁0.12g，磷酸二氢钾0.1g，柠檬酸铁0.05g，硫酸亚铁0.3g，琼脂20g，蒸馏水定容至1L；微量元素：硼酸2.86g，硫酸锰1.81g，硫酸铜0.8g，钼酸0.02g，定容至1L；配置好的低氮培养基配制好过后加入10ml微量元素溶液，用接种针将分离得到的细菌接种于固氮固体平板培养皿上，每个菌株5个皿重复，28℃倒置培养14d，观察是否生长，无细菌生长即无固氮能力。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤4中，
内生菌解钾能力测定具体为：
解钾培养基：葡萄糖10g，磷酸二氢钠1g，硝酸铵3g，硫酸镁3g，钾长石粉1.5g，硫酸锰0.3g，硫酸亚铁0.3g，琼脂20g，PH＝7.0蒸馏水定容至1L；用接种针将内生细菌接种于解钾固体平板培养皿上，每个菌株5个皿重复，28℃倒置培养14d，观察是否生长，无细菌生长即无解钾能力。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤4中，
内生菌溶磷能力测定具体为：
有机磷培养基：葡萄糖10g，硫酸铵0.5g，氯化钠0.3g，氯化钾0.3g，硫酸镁0.3g，硫酸锰0.03g，硫酸亚铁0.03g，磷酸三钙5g，卵磷脂0.2g，酵母浸粉0.5g，琼脂20g，调节pH为7.0，蒸馏水定容至1L，121℃灭菌20min；将内生细菌接种于有机磷固体平板培养皿上，每个菌株每皿接3个点，每点取1ul，5个皿重复；28℃恒温倒置培养7d，观察有无溶磷圈及其大小，溶磷圈的大小是反应菌株溶磷能力的指标之一，一般溶磷圈越大代表溶磷能力越好。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤4中，内生菌产IAA能力检测具体为：
查氏液体培养基：硝酸钠3g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁0.5g，氯化钠0.5g，硫酸亚铁0.01g，色氨酸0.5g，蔗糖30g，定容至1L；Salkowski显色剂：浓硫酸150ml，蒸馏水250ml，0.5mol/LFeCl3.6H2O 7.5ml；将内生细菌接种在1.5ml查氏液体培养基，30℃，200rpm，培养四天，用无菌枪头取出1mL菌液于灭菌的5mL离心管中，加入2mL Salkowski显色剂，室温黑暗显色20min，出现粉红色为阳性，说明有IAA产生，颜色越深说明产IAA的能力越强；用分光光度计在530nm处对混合物的吸光度进行了标定，使用相同的溶剂校准(对照)，用计算得到的标准曲线y＝40.063x-1.9228(r2＝0.9469)，测定菌株产IAA的浓度。
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