CN105767009A - 一种非致病性尖孢镰刀菌植物疫苗制剂的生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种非致病性尖孢镰刀菌植物疫苗制剂的生产方法，步骤如下：以非致病性尖孢镰刀菌FJAT‑9290为菌种，以马铃薯葡萄糖琼脂PDA培养基和查氏酵母培养液为液体菌种用培养基，制备生产用液体菌种；以猪粪废弃物为主要成份制备植物疫苗生产的固体培养基物，与麸皮、麦粒混合后，分装于聚丙烯塑料袋中，灭菌后，接种液体菌种，28‑30℃恒温培养发酵18‑20天，制备植物疫苗固体发酵产物，发酵结束后将其拌匀，即得非致病性尖孢镰刀菌植物疫苗。本发明制备的植物疫苗制剂对作物有促长、抗病的效果，可解决番茄枯萎病难以防治的问题，并达到减少化学农药使用的目的。

Description

一种非致病性尖孢镰刀菌植物疫苗制剂的生产方法

【技术领域】

本发明涉及一种非致病性尖孢镰刀菌植物疫苗制剂的生产方法。

【背景技术】

由尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)引起的作物枯萎病是一种世界性土传病害，也是造成作物连作障碍的主要原因之一(刘波等，2013)。一般造成10％-30％产量损失，严重者可导致绝收，及时有效防控成为茄科和瓜类作物安全生产的重大需求(Kaur等，2010；杨莹莹等，2012)。目前，防治枯萎病的主要策略为化学防治和培育抗病品种，化学防治污染环境且危害人类健康，抗病品种培育困难且存在抗性减弱的风险，因此，有必要开辟更多的防治途径。近年来，利用植物的免疫系统开发安全、高效、无残留的“植物疫苗”研究成为了热点。

随着植物免疫学研究的持续与深入，研究者发现植物在长期的演化过程中，逐步发展了类似于动物的“免疫系统”来抵抗病害(Ausubel，2005)。植物除了已具有的先天免疫的能力外，还可通过接种弱致病性或非致病性菌株诱导其产生主动抗病性，类似于动物的疫苗接种，激活植物的免疫系统和生长系统，提高作物自身免疫能力，从而增强植物抗病和抗逆能力(邱德文，2008)。因此，利用生物诱导抗性的原理，开发新型生物制剂“植物疫苗”防治病害，符合“生态文明”要求，有助于增产、增收及农产品品质提升。

非致病尖孢镰刀菌是天然的植物疫苗菌株。已有部分研究报道其能促进作物生长，并且能有效降低作物枯萎病的发生。Elmer(2004)研究表明，提前接种非致病菌株CS-20，7d后接种致病菌，84d观察发现菌株CS-20能够在芦笋植株根部定殖，并可提高根部鲜重和减少根部病斑。Abeysinghe(2006)研究表明，提前接种非致病性尖孢镰刀菌能显著降低黄瓜根腐病与茎腐病的发病率。杨猛等(2005)研究表明，提前在土壤中接种Fo47和Fo47B10能提高黄瓜和西瓜植株的抗逆性和生长发育，且对黄瓜霜霉病有明显的防治效果。钱晓雍等研究发现非致病性镰刀菌IF23、251/2和MSA35的接种浓度会影响番茄枯萎病的防治效果。

本发明所使用的菌株非致病性尖孢镰刀菌菌株FJAT-9290是一株天然的植物疫苗菌株，前期研究已表明，该菌株不会引起茄科、葫芦科、芭蕉科和百合科等作物发病，且在茄科、葫芦科及芭蕉科等作物上具有良好的定殖能力，可达40-90天。采用提前施用的方法能促进植物生长，且对番茄枯萎病有较好的防治效果，其中盆栽防治效果为76.70％，田间小区防治效果为69.56％，略高于化学农药50％多菌灵可湿性粉剂处理的防治效果68.64％(肖荣凤等，2015)。为本发明的实现提供了菌株基础。

【发明内容】

本发明要解决的技术问题，在于提供一种非致病性尖孢镰刀菌植物疫苗制剂的生产方法，其制备的植物疫苗制剂对作物有促长、抗病的效果，可解决番茄枯萎病难以防治的问题，并达到减少化学农药使用的目的。

本发明是这样实现的：

一种非致病性尖孢镰刀菌植物疫苗制剂的生产方法，所述方法步骤如下：

步骤(1)生产用液体菌种的制备：以非致病性尖孢镰刀菌FJAT-9290(Fusarium oxysporum)为菌种，以马铃薯葡萄糖琼脂PDA培养基和查氏酵母培养液为液体菌种用培养基，制备生产用液体菌种；

步骤(2)非致病性尖孢镰刀菌植物疫苗制剂的制备：以猪粪废弃物为主要成份制备植物疫苗生产的固体培养基物，与麸皮、麦粒混合后，分装于聚丙烯塑料袋中，灭菌后，接种步骤(1)所制备的液体菌种，28-30℃恒温培养发酵18-20天，制备植物疫苗固体发酵产物，发酵结束后将其拌匀，即得非致病性尖孢镰刀菌植物疫苗；

所述尖孢镰刀菌FJAT-9290(Fusarium oxysporum)，于2012年3月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.5910。

进一步地，所述步骤(1)中生产用液体菌种制作步骤具体为：

步骤A.菌种的活化：配置PDA培养基，121℃灭菌20min，冷却至45℃倒于灭菌平板中，备用；取-70℃保存的非致病性尖孢镰刀菌FJAT-9290(Fusarium oxysporum)菌株于PDA培养基平板上划线培养，28～30℃恒温培养5～7天；

步骤B.配置查氏酵母培养液，挑取步骤A中菌丝接种于查氏酵母培养液中，28～30℃，170～200rpm摇床培养5～7天，即为生产用液体菌种。

进一步地，所述步骤(2)中非致病性尖孢镰刀菌植物疫苗制剂的制备步骤具体为：

步骤C.以猪粪废弃物为主要成份的固体基础培养基配制：猪粪废弃物与麸皮按质量比为100:3～20:3配制形成固体基础培养基；

步骤D.基础培养基中麦粒、无机碳源和无机氮源的添加：在基础培养基中添加麦粒作为固体培养基的疏松物质，再添加蔗糖和硝酸钠，搅拌均匀后加水，调整含水体积比为30％～50％，转入聚丙烯塑料袋中，灭菌；

步骤F.非致病性尖孢镰刀菌植物疫苗制剂的培养与制备：往步骤D的培养基中接种步骤(1)中制备的液体菌种质量比为1-10％，28～30℃恒温下发酵18-20天，即植物疫苗固体发酵产物，发酵结束后将其通风干燥后拌匀，即得非致病性尖孢镰刀菌植物疫苗制剂。

进一步地，步骤C中猪粪废弃物与麸皮按质量比为19:1～3:1。

进一步地，步骤D中的麦粒需浸泡处理，浸泡时间12-24h，使麦粒充分吸水膨胀。

进一步地，每1000g基础培养基所需的麦粒为300～500g、蔗糖为20～40g、硝酸钠为1～3g。

进一步地，每1000g基础培养基所需的麦粒为400g、蔗糖为30g、硝酸钠为2g。

本发明具有如下优点：

本发明方法利用了非致病性尖孢镰刀菌FJAT-9290(Fusariumoxysporum)菌株的对植物有促长、免疫抗病作用；同时利用农业副产物——已腐熟的猪粪废弃物为培养基成分之一，生产植物疫苗制剂。一方面该植物疫苗制剂对作物有促长、抗病的效果，可解决番茄枯萎病难以防治的问题，并达到减少化学农药使用的目的；另一方面，以猪粪废弃物为生产原料之一，提高了农业副产物资源化再利用效率。本发明制备的植物疫苗制剂，符合“生态文明”要求，同时有助于增产、增收及农产品品质提升。

且本发明制备过程简单易行，制备的植物疫苗制剂的含菌量高、活性好，操作方便、成本低。

【附图说明】

下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的说明。

图1为本发明实施例分离出的尖孢镰刀菌菌株示意图。

图2为本发明实施例分离出的尖孢镰刀菌菌株的菌丝体示意图。

图3为本发明实施例分离出的尖孢镰刀菌菌株的孢子形态示意图。

图4为利用尖孢镰刀特异引物进行鉴定的9个菌株的电泳图。

【具体实施方式】

本发明涉及一种非致病性尖孢镰刀菌植物疫苗制剂的生产方法，其特征在于：所述方法步骤如下：

步骤(1)生产用液体菌种的制备：以非致病性尖孢镰刀菌FJAT-9290(Fusarium oxysporum)为菌种，以马铃薯葡萄糖琼脂PDA培养基和查氏酵母培养液为液体菌种用培养基，制备生产用液体菌种；

步骤(2)非致病性尖孢镰刀菌植物疫苗制剂的制备：以猪粪废弃物为主要成份制备植物疫苗生产的固体培养基物，与麸皮、麦粒混合后，分装于聚丙烯塑料袋中，灭菌后，接种步骤(1)所制备的液体菌种，28-30℃恒温培养发酵18-20天，制备植物疫苗固体发酵产物，发酵结束后将其拌匀，即得非致病性尖孢镰刀菌植物疫苗；

所述尖孢镰刀菌FJAT-9290(Fusarium oxysporum)，于2012年3月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.5910。

进一步地，所述步骤(1)中生产用液体菌种制作步骤具体为：

步骤A.菌种的活化：配置PDA培养基，121℃灭菌20min，冷却至45℃倒于灭菌平板中，备用；取-70℃保存的非致病性尖孢镰刀菌FJAT-9290(Fusarium oxysporum)菌株于PDA培养基平板上划线培养，28～30℃恒温培养5～7天；

步骤B.配置查氏酵母培养液，挑取步骤A中菌丝接种于查氏酵母培养液中，28～30℃，170～200rpm摇床培养5～7天，即为生产用液体菌种。

进一步地，所述步骤(2)中非致病性尖孢镰刀菌植物疫苗制剂的制备步骤具体为：

步骤C.以猪粪废弃物为主要成份的固体基础培养基配制：猪粪废弃物与麸皮按质量比为100:3～20:3配制形成固体基础培养基；

步骤D.基础培养基中麦粒、无机碳源和无机氮源的添加：在基础培养基中添加麦粒作为固体培养基的疏松物质，再添加蔗糖和硝酸钠，搅拌均匀后加水，调整含水体积比为30％～50％，转入聚丙烯塑料袋中，灭菌；

步骤F.非致病性尖孢镰刀菌植物疫苗制剂的培养与制备：往步骤D的培养基中接种步骤(1)中制备的液体菌种质量比为1-10％，28～30℃恒温下发酵18-20天，即植物疫苗固体发酵产物，发酵结束后将其通风干燥后拌匀，即得非致病性尖孢镰刀菌植物疫苗制剂。

较优的，步骤C中猪粪废弃物与麸皮按质量比为19:1～3:1。

较优的，步骤D中的麦粒需浸泡处理，浸泡时间12-24h，使麦粒充分吸水膨胀。

每1000g基础培养基所需的麦粒为300～500g、蔗糖为20～40g、硝酸钠为1～3g。

较优的，每1000g基础培养基所需的麦粒为400g、蔗糖为30g、硝酸钠为2g。

所述PDA培养基的制备：马铃薯去皮后称取200g，切成1cm×1cm的小块，煮沸30min，八层纱布过滤后加入20g蔗糖、17～20g琼脂，pH自然，充分溶解后定容于1000ml，按瓶装量200ml/250ml分装于三角瓶中灭菌；

所述查氏酵母培养液(czapek yeast exatract broth))的制备：查氏浓缩液10ml，酵母抽提物5g，蔗糖30g，K₂HPO₄ 1g，琼脂15g，蒸馏水定容于1000ml，按瓶装量200ml/250ml分装于三角瓶中灭菌。

查氏浓缩液制备：NaNO₃ 30.0g，KCl 5.0g，MgSO₄·7H₂O 5.0g，FeSO₄·7H₂O 0.1g，ZnSO₄·7H₂O 0.1g，CuSO₄·5H₂O 0.05g，蒸馏水定容于1000ml。

上述猪粪废弃物来源于零污染养猪技术的微生物发酵床养猪垫料，是一种已腐熟的有机质，该技术是以发酵床为载体，把微生物菌种、谷壳、锯末、木屑等按一定比例混合，作为猪舍垫料，铺设于猪舍中。通过微生物作用，将猪粪尿中的有机物质进行充分分解、转化、发酵、最终除去异味并达到无害化，是一种零污染、微生物发酵床的新型环保技术。

下面结合具体的实施例，进一步阐述本发明。

一、尖孢镰刀菌FJAT-9290(Fusarium oxysporum)菌株的分离和鉴定

1.1菌株的分离与鉴定

福建省闽侯采集番茄枯萎病病株，采用常规的组织分离法进行病菌的分离。切取植株茎基部变色的木质部，将病组织切成0.5×0.3cm大小的薄片，经75％酒精处理2s，再用0.1％升汞处理2～3min后，用无菌水清洗3遍，置于马铃薯蔗糖琼脂培养基(PSA)上培养，每皿放5片病组织，25±1.5℃培养。随机挑选10～20个组织块上的分离物进行单孢分离，分离物纯化培养后采用-80℃甘油冷冻保存，如图1所示。病原鉴定依据Booth(1971)的鉴定方法：单孢分离纯培养物，接在PSA培养基上，25℃培养4d，测定单孢菌落的生长速度，取培养7d的培养物进行孢子形态及产孢细胞观察，测量各类型分生孢子长度与宽度。

结果：所分离的菌株在PSA培养基上生长4d的菌落平均直径为40.3±2mm，菌丝淡紫色，棉絮状，如图2所示。小型分生孢子数量多，呈椭圆形或卵圆形，大小15.6(9.2-21.0)×2.5(2.2～3.0)μm；大型分生孢子镰刀型或纺锤型，稍弯，有足胞，1～4个隔膜，多为3个隔膜，大小为23.7(18.5～32.5)×2.5(2.2～3.5)μm，如图3所示。依据Booth(1971)的鉴定方法，确定镰刀菌(Fusarium spp.)。

1.2菌株的分子鉴定

菌株的DNA采用真菌基因组DNA试剂盒(Bioteke，DP2032)提取。尖孢镰刀菌种的鉴定：引物FOF1/FOR1序列ACATACCACTTGTTGCCTCG/CGCCAATCAATTTGAGGAACG。PCR反应体系(20μL)：2.5U/μL Taq酶0.2μL，10×Buffer 2μL，2.5mM dNTP0.4μL，100μM Primer各1μL，ddH2O 14.4μL，DNA模板1μL。PCR扩增程序：94℃预变性60s；94℃变性60s，58℃复性30s，72℃延伸60s，共25个循环；72℃最终延伸7min。

结果：从番茄植株上分离的9个菌株，利用尖孢镰刀特异引物FOF1/FOR1鉴定，均出现阳性条带，且与已知的阳性对照条带大小一致，如图4所示，图4中泳道编号1～8号为从番茄植株上分离的其他菌株；9号为菌株FJAT-9290；M：3000bp DNA ladder；+：阳性对照；－：阴性对照

二、尖孢镰刀菌FJAT-9290(Fusarium oxysporum)菌株的非致病性实验

2.1菌株FJAT-9290对不同作物的致病性检测

用菌株FJAT-9290的培养液浇灌处理供试的11种作物，接种的悬浮液分生孢子浓度为10⁷个/mL，每株浇灌100mL菌液，以清水处理作为阴性对照，每处理分别接菌50株苗；番茄、茄子、甜椒、香蕉、粉蕉、甜瓜、黄瓜和西瓜均相应接种各寄主专化型强致病性尖孢镰刀菌株作为阳性对照，分别处理30株苗。28～30℃温室内培养120d，跟踪观察作物的生长状况与发病情况。

2.2菌株FJAT-9290对不同作物的致病性检测结果分析

跟踪观察120d的结果表明：接种对应寄主专化型的强致病性尖孢镰刀菌后，不同作物的发病潜育期有所不同。番茄、茄子和甜椒的发病潜育期分别为17、25和21d；香蕉和粉蕉的发病潜育期分别为16和26d；甜瓜、黄瓜和西瓜的发病潜育期分别为14、20和15d。且接种强致病菌株60d时，其对应的寄主作物均全部发病，死亡率达100％。但接种非致病性菌株FJAT-9290的11种作物与清水对照植株生长正常，且均无植株死亡。

三、非致病性尖孢镰刀菌植物疫苗制剂的生产

实施例1

(1)生产用液体菌种的制备：

A.菌种的活化：配置马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基，121℃灭菌20min，冷却至45-50℃时倒于灭菌平板中，备用。取-70℃保存的非致病性尖孢镰刀菌FJAT-9290(Fusarium oxysporum)菌株于PDA平板上划线培养，28～30℃恒温培养5-7天；

所述PDA培养基：马铃薯去皮后称取200g，切成1cm×1cm的小块，煮沸30min，八层纱布过滤后加入20g蔗糖、17～20g琼脂，pH自然，充分溶解后定容于1000ml，按瓶装量200ml/250ml分装于三角瓶中灭菌；

B.挑取步骤A中菌丝接种于马铃薯葡萄糖液体培养基中，28～30℃，170～200rpm摇床培养4～5天；

所述查氏酵母培养液(czapek yeast exatract broth))的制备：查氏浓缩液10ml，酵母抽提物5g，蔗糖30g，K₂HPO₄ 1g，琼脂15g，蒸馏水定容于1000ml，按瓶装量200ml/250ml分装于三角瓶中灭菌。

查氏浓缩液制备：NaNO₃ 30.0g，KCl 5.0g，MgSO₄·7H₂O 5.0g，FeSO₄·7H₂O 0.1g，ZnSO₄·7H₂O 0.1g，CuSO₄·5H₂O 0.05g，蒸馏水定容于1000ml。

(2)非致病性尖孢镰刀菌植物疫苗制剂的制备：

C.按900g的猪粪废弃物与100g的麸皮进行混合作为基础培养基；

D.每1000g的基础培养基辅助添加400g的麦粒，30g的蔗糖及2g的硝酸钠，搅拌均匀后加水，调整含水体积比为50％，转入聚丙烯塑料袋中，培养基中心插入钻有孔的50ml离心管，灭菌；

所述猪粪废弃物是一种已腐熟的有机质原料，其以发酵床为载体，按体积比谷壳50％、锯末50％、米糠2公斤/m³、微生物菌种短短芽胞杆菌1：1000的比例稀释均匀喷洒并拌匀，控制水份45-50％，作为猪舍垫料，铺设于猪舍中。通过微生物作用，将猪粪尿中的有机物质进行充分分解、转化、发酵、最终除去异味并达到无害化。

所述麦粒需浸泡处理，浸泡时间12-24小时，使麦粒充分吸水膨胀。

F.培养基冷却后，接种质量比为7％的步骤(1)制备的种子液(液体菌种)，28～30℃恒温下发酵18-20天，即可结束发酵，将发酵产物通风干燥并搅拌均匀，即得到非致病性尖孢镰刀菌植物疫苗制剂。

该植物疫苗制剂的固体发酵产物，孢子含量可达10⁸个/g。

实施例2

(1)同实施例1步骤(1)

(2)利用实施例1相同的猪粪废弃物为主要培养基质生产植物疫苗制剂：

C.按900g的猪粪废弃物与100g的麸皮进行混合作为基础培养基；

D.每1000g的基础培养基辅助添加400g的麦粒，30g的蔗糖及2g的硝酸钠，搅拌均匀后加入适量的水，调整含水体积比为50％，转入聚丙烯塑料袋中，灭菌；

所述麦粒需浸泡处理，浸泡时间12-24小时，使麦粒充分吸水膨胀。

F.培养基冷却后，接种5份体积步骤(1)制备的种子液(液体菌种)，28～30℃恒温下发酵18-20天，即可结束发酵，将发酵产物搅拌均匀，即得到非致病性尖孢镰刀菌植物疫苗制剂。

该植物疫苗的固体发酵产物，孢子含量可达10⁸个/g。

四、以下是利用本发明制备的非致病性尖孢镰刀菌植物疫苗制剂的防治实验，请结合以下试验对本发明的植物疫苗制剂作进一步的说明。

试验一：非致病性尖孢镰刀菌植物疫苗制剂在番茄育苗中的应用

1.实验材料

番茄种子、育苗基质

2.方法

添加5％含量的非致病性尖孢镰刀菌植物疫苗制剂至育苗基质中，以纯基质处理为对照。待番茄种子露白后，分别播于含非致病性尖孢镰刀菌植物疫苗制剂的育苗基质的穴盘中和纯育苗基质的穴盘中，于30℃培育20天，并统计根长、株高、茎粗和成活率。

3.结果与分析

在番茄育苗中应用结果表明(如表1所示)，使用植物疫苗的处理组所育出的番茄苗在根长及株高分别为8.78cm和13.87cm，略高于纯基质对照组6.52cm和11.66cm；但在茎粗和成活率方面差异不显著，两种处理的成活率均可达95％以上。

表1植物疫苗制剂对番茄育苗中植株生长性状的影响

表中数据为平均数±标准误。同列数据后不同字母表示经Duncan氏新复极差法方法检验在P<0.05水平差异显著。

试验二：植物疫苗制剂对番茄盆栽苗枯萎病防效的测定

1.实验材料

番茄幼苗若干，致病性病原菌为番茄枯萎病菌FJAT-282

2.方法

2.1植物疫苗制剂对番茄盆栽苗的肥效实验

将植物疫苗制剂与基质土分别按一定体积比进行混合后，用于种植番茄苗，设以下6个处理组：

处理组1——基质土中含5％植物疫苗制剂；

处理组2——基质土中含10％植物疫苗制剂；

处理组3——基质土中含15％植物疫苗制剂；

处理组4——基质土中含20％植物疫苗制剂；

处理组5——基质土中含100％植物疫苗制剂；

处理组6—纯基质土；

以上每组处理30株番茄幼苗，定期观察番茄植株的生长情况，筛选出最适番茄苗生长的植物疫苗制剂含量。

2.2植物疫苗制剂对番茄枯萎病盆栽苗的发病率的影响

番茄枯萎病原菌FJAT-282采用摇瓶发酵，并将发酵液稀释成10⁶cfu/mL，备用。实验设以下6个处理组：

处理组1’——番茄苗采用含5％植物疫苗菌剂基质土种植，于7d后伤根浇灌清水；

处理组2’——番茄苗采用纯基质土种植，于7d后伤根浇灌清水，作为阴性对照；

处理组3’——番茄苗采用含5％植物疫苗菌剂基质土种植，于7d后伤根浇灌接种枯萎病原菌；

处理组4’——番茄苗采用含5％植物疫苗菌剂基质土种植，同时浇灌接种枯萎病原菌；

处理组5’——番茄苗采用纯基质土种植，于7d后伤根浇灌接种枯萎病原菌，作为阳性对照；

处理组6’——番茄苗采用纯植物疫苗菌剂基质土种植，于7d后伤根浇灌清水。

以上每组处理30株番茄幼苗，各处理的其他栽培管理方式均一致，接菌后观察番茄植株生长和发病情况，第40天时调查其发病率，计算防治效果。防治效果(％)＝(阳性对照组发病率－处理组发病率)/阳性对照组发病率×100％

2.3植物疫苗对番茄枯萎病的田间小区防治效果

试验在福建省福州市闽候大棚试验基地进行，往年发病率20％～30％，移栽前试验地土壤已翻晒和适量生石灰浸泡处理，并于2012年11月2日移栽。试验设3个处理组：

处理1”——植物疫苗菌剂按5％拌土穴施处理；

处理2”——50％多菌灵可湿性粉剂按800倍液浇灌处理；

处理3”——清水对照。

每组处理种植150株番茄实生苗，设3个重复。分别于移栽时和移栽后15d和30d时各使用1次，处理60d后调查发病率，每30天调查1次，于移栽后180d调查结束，计算防治效果。防治效果＝(对照发病率－处理发病率)/对照发病率×100％。

3.结果与分析

3.1植物疫苗制剂对番茄盆栽苗肥力的影响

试验结果见表2，在育苗基质中添加不同含量的FJAT-9290植物疫苗，移栽培养40d后，不同含量的FJAT-9290植物疫苗对番茄盆栽苗有不同程度的影响。从株高方面，含5％FJAT-9290植物疫苗(处理组1)和含10％FJAT-9290植物疫苗(处理组2)长势较好，株高分别为25.33cm和23.61cm，其他处理组株高介于13.80-22.01cm之间，均低于处理组1和处理组2；从茎粗方面，处理组1的茎粗为3.29mm，其他处理组的茎粗介于2.28-2.90mm；从叶片数方面，处理组1和处理组2长势较好，平均叶片数分别为7.77片和7.55片，其他处理组叶片数介于5.00-6.88片之间；而含100％FJAT-9290植物疫苗(处理组5)的番茄盆栽苗不能正常生长，从株高、茎粗和叶片数，处理组1与其他各处理组均存在显著差异(p<0.05)，说明含5％FJAT-9290植物疫苗对番茄生长促进作用最大。

表2不同处理间番茄盆栽苗的生长指标

表中数据为平均数±标准误。同列数据后不同字母表示经Duncan氏新复极差法方法检验在P<0.05水平差异显著。

选择添加5％和10％含量的两个处理，比较发酵产物和发酵前培养物分别对植株生长情况的影响表明，发酵产物处理的植株株高明显高于发酵前培养基处理的，对茎粗与叶片数影响不显著(表3)。

表3不同含量发酵产物及发酵前培养物处理番茄盆栽苗的生长情况

表中数据为平均数±标准误。同列数据后不同字母表示经Duncan氏新复极差法方法检验在P<0.05水平差异显著。

3.2植物疫苗制剂对番茄枯萎病的盆栽苗发病率影响

试验结果表明(表4所示)，处理组5’第15d开始发病，28d时的发病率为100％。处理组3’较处理组4’推迟发病，第40d的二者的发病率分别为28.50％和60.50％。其他处理1’、2’和6’均未出现发病株。但番茄苗采用纯植物疫苗菌剂基质土种植(处理6’)不利于作物的生长。

表4不同处理间番茄枯萎病的盆栽苗的发病率

3.3植物疫苗对番茄枯萎病的田间小区防治效果

对番茄苗的发病情况调查表明(表5)，处理1”(植物疫苗制剂处理)和处理2”(多菌灵处理)的发病率分别为12.6％和13.4％，均低于处理3”的32.4％，校正防治效果分别为61.11％和58.64％，植物疫苗处理的防治效果与多菌灵处理的相近，说明植物疫苗对番茄枯萎病的防治效果能达到化学药剂防治效果。

表5植物疫苗防治番茄枯萎病各处理的发病率及防治效果

本发明方法利用了非致病性尖孢镰刀菌FJAT-9290(Fusariumoxysporum)菌株的对植物有促长、免疫抗病作用；同时利用农业副产物——已腐熟的猪粪废弃物为培养基成分之一，生产植物疫苗制剂。一方面该植物疫苗制剂对作物有促长、抗病的效果，可解决番茄枯萎病难以防治的问题，并达到减少化学农药使用的目的；另一方面，以猪粪废弃物为生产原料之一，提高了农业副产物资源化再利用效率。本发明制备的植物疫苗制剂，符合“生态文明”要求，同时有助于增产、增收及农产品品质提升。

且本发明方法操作简便，成本低，可获得大量的发酵产物，所获得产物中植物疫苗制剂的孢子含量能达到10⁸个/g以上。

本发明中所涉及的尖孢镰刀菌种引物FOF1序列如SEQ ID NO：1所示，引物FOR1序列如SEQ ID NO：2所示，具体情况参见序列表。

虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解，我们所描述的具体的实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化，都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。

Claims (7)

1.一种非致病性尖孢镰刀菌植物疫苗制剂的生产方法，其特征在于：所述方法步骤如下：

步骤(1)生产用液体菌种的制备：以非致病性尖孢镰刀菌FJAT-9290(Fusarium oxysporum)为菌种，以马铃薯葡萄糖琼脂PDA培养基和查氏酵母培养液为液体菌种用培养基，制备生产用液体菌种；

步骤(2)非致病性尖孢镰刀菌植物疫苗制剂的制备：以猪粪废弃物为主要成份制备植物疫苗生产的固体培养基物，与麸皮、麦粒混合后，分装于聚丙烯塑料袋中，灭菌后，接种步骤(1)所制备的液体菌种，28-30℃恒温培养发酵18-20天，制备植物疫苗固体发酵产物，发酵结束后将其拌匀，即得非致病性尖孢镰刀菌植物疫苗；

所述尖孢镰刀菌FJAT-9290(Fusarium oxysporum)，于2012年3月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.5910。

2.根据权利要求1所述的一种非致病性尖孢镰刀菌植物疫苗制剂的生产方法，其特征在于：所述步骤(1)中生产用液体菌种制作步骤具体为：

步骤A.菌种的活化：配置PDA培养基，121℃灭菌20min，冷却至45℃倒于灭菌平板中，备用；取-70℃保存的非致病性尖孢镰刀菌FJAT-9290(Fusarium oxysporum)菌株于PDA培养基平板上划线培养，28～30℃恒温培养5～7天；

步骤B.配置查氏酵母培养液，挑取步骤A中菌丝接种于查氏酵母培养液中，28～30℃，170～200rpm摇床培养5～7天，即为生产用液体菌种。

3.根据权利要求1所述的一种非致病性尖孢镰刀菌植物疫苗制剂的生产方法，其特征在于：所述步骤(2)中非致病性尖孢镰刀菌植物疫苗制剂的制备步骤具体为：

步骤C.以猪粪废弃物为主要成份的固体基础培养基配制：猪粪废弃物与麸皮按质量比为100:3～20:3配制形成固体基础培养基；

步骤D.基础培养基中麦粒、无机碳源和无机氮源的添加：在基础培养基中添加麦粒作为固体培养基的疏松物质，再添加蔗糖和硝酸钠，搅拌均匀后加水，调整含水体积比为30％～50％，转入聚丙烯塑料袋中，灭菌；

步骤F.非致病性尖孢镰刀菌植物疫苗制剂的培养与制备：往步骤D的培养基中接种步骤(1)中制备的液体菌种质量比为1-10％，28～30℃恒温下发酵18-20天，即植物疫苗固体发酵产物，发酵结束后将其通风干燥后拌匀，即得非致病性尖孢镰刀菌植物疫苗制剂。

4.根据权利要求3所述的一种非致病性尖孢镰刀菌植物疫苗制剂的生产方法，其特征在于：步骤C中猪粪废弃物与麸皮按质量比为19:1～3:1。

5.根据权利要求3所述的利用非致病性尖孢镰刀菌植物疫苗制剂的方法，其特征在于：步骤D中的麦粒需浸泡处理，浸泡时间12-24h，使麦粒充分吸水膨胀。

6.根据权利要求3所述的一种非致病性尖孢镰刀菌植物疫苗制剂的生产方法，其特征在于：每1000g基础培养基所需的麦粒为300～500g、蔗糖为20～40g、硝酸钠为1～3g。

7.根据权利要求6所述的一种非致病性尖孢镰刀菌植物疫苗制剂的生产方法，其特征在于：每1000g基础培养基所需的麦粒为400g、蔗糖为30g、硝酸钠为2g。