CN104371945A - 一种具有解磷、解钾能力的弗氏柠檬酸杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株高效解磷的弗氏柠檬酸杆菌及应用。从大豆植物根际筛选出一株解磷能力较强的菌株ZSW-4，利用紫外线-等离子体复合诱变技术对该菌株进行多次复合诱变，选育出一株高效解磷且稳定性好的菌株ZSW-4-2-5C，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCCNo.8748。用含有该菌的液体或固体菌剂接种玉米、大豆和芥菜等农作物，能够促进植物对土壤中磷元素的吸收，提高农作物产量。

Description

一种具有解磷、解钾能力的弗氏柠檬酸杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及一种高效解磷弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter fredndii）及其应用，属于农业微生物技术领域。 

技术背景

磷是植物营养三大要素之一，而磷供应不足已逐渐成为限制农作物产量和品质的最重要因素之一。土壤中总磷含量充足，含有0.02-0.5%的总磷，但大多以难溶性无机磷酸盐的形式存在(主要是磷酸钙、磷酸铝、磷酸铁，在碱性土壤中以磷酸钙为主)，只有1%是以植物能够直接吸收利用的可溶性磷盐形式存在。为满足作物生长需要，全世界每年要向土壤施用近3000万吨磷肥，但其中的80%由于吸附、沉积或固定作用成为植物难以吸收利用的无效磷，成为土壤磷的主体。据统计，我国有74 %的耕地土壤缺磷，但是很多土壤全磷含量却很高。张福锁等对我国黄土高原7省区的调查，土壤有效磷含量平均为 6mgP /Kg，而全磷量则达到1230mgP/Kg，为有效磷的205倍。我国从1949年到1992年间累计施入农田的磷肥有7880.9×10⁴t(P₂O₅)，其中大约有 6000×10⁴t(P₂O₅)积累在土壤中没有被利用，其当季利用率仅为5%～25%。而停留在土壤的磷素又易随雨水或灌溉流失进入水体，导致水体富营养化污染。因此，如何挖掘土壤潜在的磷库资源，提高磷的利用率，一直是科学工作者研究的热点课题之一。 

土壤磷素分为无机态磷和有机态磷两大类。矿质土壤以无机磷为主，有机磷约占全磷的20%～50%。植物主要利用土壤中的无机态磷，其吸收磷素的化学形态主要是H₂PO₄ ^-和HPO₄ ^2-，而土壤中的磷却主要以非溶态存在。影响土壤中磷利用率的因素很多，其中微生物对土壤中磷的利用率影响最大。研究证明：土壤中存在大量的微生物，其中一些微生物能够通过代谢物活化难溶性磷，增加土壤中有效磷含量，促进作物生长，具有这种能力的微生物称为解磷菌或溶磷菌(phosphate solubilizing microorganisms，PSM)。解磷菌除了溶解土壤中难溶性或不溶性的磷素外，部分解磷菌还具有解钾、产生吲哚乙酸、铁载体、合成ACC脱氨酶等促进植物生长作用。具有解磷能力的微生物种类很多，目前报道的解磷菌主要有芽孢杆菌属、欧文氏菌属、假单胞菌属、土壤杆菌属、沙雷氏菌属、青霉菌属和黄杆菌属等，但对具有解磷能力的不动杆菌属的报道甚少。陈守文等[专利号：CN101851596 B]报道了一株具有解无机磷能力的丁酸梭菌，其解无机磷能力为204.70±25.78mg/L,解植酸钙能力为52.31±12.60mg/L。林启美等报道：溶解磷矿粉能力较强的细菌溶磷能力为26.92-43.34mg/L，大多数真菌则为59.64-145.36 mg/L。由此可见，目前我国用于生产的解磷菌株，其解磷能力较低，应用效果不稳定。另外，从自然界分离的大部分野生的解磷菌都存在生长缓慢、存活性弱、有效期短、解磷和促生长能力较低以及对土壤环境要求苛刻等缺点，不能满足作为促生微生物肥料的需要。为此，进行野生菌种的改性，打破野生菌种的正常代谢，使之产生所需要的目标代谢产物（如提高解磷、解钾能力等）、提高其抗性能力等，要达到此目的，主要措施就是需要进行菌种的选育，如进行物理和化学诱变等。 

目前，微生物的改性主要有诱变和基因工程的方法，但是对于微生物肥料，因为是将活的菌体直接施入土壤和环境中，因此在我国的菌肥标准中明确限制基因工程菌的应用。射线、核辐射和化学诱变是目前普遍使用的诱变育种手段，但长期使用一种诱变剂往往会使菌株产生抗性，要想获得更大的变异就必需采用新的诱变源。等离子体辐射是直接在生物分子上沉积能量，引起基因突变，从而达到诱变育种的目的。采用该方法诱变具有突变频率高、突变谱广、生理损伤小等优点。另外，采用等离子体和紫外线两种诱变剂的交替和复合使用, 可以有效避免使用单一诱变剂产生的诱变饱和效应。 

发明内容

本发明的目的之一是针对现有技术存在的不足，通过紫外线-等离子体复合诱变获得一株具有较高解无机磷能力的弗氏柠檬酸杆菌，该菌株还具有一定的解有机磷和解钾能力，具有ACC脱胺酶活性，能够产生一定量的吲哚乙酸，促进植物生长； 

本发明的目的之二是提供含有上述弗氏柠檬酸杆菌的微生物菌剂及其制备方法；

本发明的目的之三是提供上述弗氏柠檬酸杆菌在农业生产中的应用。

本发明实现过程如下： 

弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter fredndii） ZSW-4-2-5C，已于2014年1月20日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所），CGMCC No.8748。

本发明在具体使用时，是将其制成微生物菌剂。 

含有弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter fredndii） ZSW-4-2-5C微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤： 

1)菌种发酵

①将冻存的ZSW-4-2-5C在37℃条件下快速解冻，按照0.5-1%的接种量接入装有10-15ml液体培养基A的试管中，28-32℃，静置培养8-16小时，得到ZSW-4-2-5C的一级种子液；

液体培养基A组成为：胰蛋白胨5 g，酵母粉 5 g，NaCl 10g，蒸馏水1000ml，pH值 7.2；

②二级三角瓶液体培养

将一级种子液按照3-5%的接种量接入装有50-100ml液体培养基A的三角瓶中，28-32℃，150-200rpm培养8-16小时；

③发酵罐发酵

将ZSW-4-2-5C的一级培养液按照5-10%的接种量分别接入装有发酵培养基E的发酵罐中，进行发酵培养，罐温28-32℃，培养pH 6.8-7.5，通气培养48-72小时，得菌悬液，有效活菌数可达1.8-3.0×10⁹ CFU/ml，即为解磷液体菌剂；

发酵培养基E组成为：葡萄糖10-15g，麸皮5-10g，豆粕30-50g ，玉米粉3-5g，(NH₄)₂SO₄ 0.2-0.4g，KH₂PO₄ 5-10g，K₂HPO₄ 0.1-0.2g，KCl 0.2-0.5 g ，Ca₂(PO₄)₃ 10-13 g，MgSO₄·7H₂O 0.25-0.5g ，MgCl₂·6H₂O 5-10g，水1000ml，pH 6.8~7.5；

2）将秸秆粉、草炭土、麸皮和豆粕粉碎过60目筛，按照质量百分比为20-30：20-30：10-20：20-30的比例均匀混合再加入30-50%的发酵培养基E，混合均匀后，用布袋或耐高温塑料袋装，1-2Kg/袋，0.1MPa高压灭菌2-3小时，取出冷却即得固态基质；

3）将步骤1）中得到的菌悬液按照50-100ml/kg的剂量与步骤2）中所制的固态基质混匀，28-32℃发酵5-7天，即得到固体菌剂，菌体密度达到1×10⁹ CFU/g。

本发明提供的微生物菌剂的使用方法为： 

解磷液体菌剂在植物浸种时或植物移栽时以100-500倍的液体菌剂稀释液浸泡种子或植物根部2-4小时，育苗期或生长期灌根采用1000-5000倍的液体菌剂稀释液10-40ml/Kg土壤剂量浇灌稀释液，整个生长期灌根1-3次；固体解磷菌剂作为基肥和追肥使用，使用剂量为5-15g/Kg土壤。

所述的液体菌剂稀释液为步骤3）所得的弗氏柠檬酸杆菌液体菌剂与发酵培养基C按照1:100-500或1:1000-5000的比例混合制备所得，固体解磷菌剂为步骤3）所得的固体解磷菌剂。 

本发明弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter fredndii） ZSW-4-2-5C在促进植物生长中的应用，所述农作物如玉米、大豆和芥菜等。 

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果： 

1）采用等离子体诱变和紫外诱变多次循环处理的方法，传代10次遗传性状稳定，保证了突变菌株的稳定性；

2）提供的解磷菌与现有解磷菌相比，既具有较高的解无机磷能力，又具有一定的解有机磷和解钾能力，能够分泌吲哚乙酸，具有ACC脱胺酶活性等促进植物的生长，提高农作物的产量；

3）本发明的菌剂营养要求简单、易培养、生长周期短、能够进行规模化的大生产。

附图说明

图1：A为ZSW-4-2-5C在培养基上A的菌落形态；B为ZSW-4-2-5C在培养基B上的菌落形态；C为ZSW-4-2-5C革兰氏染色照片； 

图2为ZSW-4-2-5C传代过程中解无机磷能力的稳定性测定；

图3为ZSW-4-2-5C在液体培养基B中产生有机酸的高效液相色谱图；

图4为ZSW-4-2-5C对抗生素的敏感性；

图5为ZSW-4-2-5C的系统发育树；

图6为ZSW-4-2-5C对土壤速效磷和速效钾含量的影响：其中图6A为施入液体或固体ZSW-4-2-5C菌剂对土壤中速效磷的影响；其中图6B为施入液体或固体ZSW-4-2-5C菌剂对土壤中速效钾的影响。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的保护范围。 

实施例1 

按照本发明提供的解磷菌株的筛选方法，选育解磷能力强的菌株，制备的步骤如下：

1）以实验室从植物根际筛选的弗氏柠檬酸杆菌ZSW-4作为出发菌株；

2）诱变选育

（1）本发明提供的具有解磷能力的弗氏柠檬酸杆菌通过诱变选育方法获得，包括以下步骤：

1）以实验室从植物根际筛选的具有较高解磷能力的弗氏柠檬酸杆菌ZSW-4作为出发菌株；

2）诱变选育

（1）制备出发菌株ZSW-4的单细胞悬液

将出发菌株ZSW-4接种于液体培养基A中，28℃，180rpm培养16小时，离心，用无菌生理盐水洗涤，置于装有玻璃珠的三角瓶内，振荡，使其分散成单细胞的菌悬液；

所述液体培养基A组成为：胰蛋白胨5 g，酵母粉 5 g，NaCl 10g，蒸馏水1000ml，pH值 7.2。

（2）紫外线诱变 

将步骤（1）所得的菌悬液分别调节浓度至10⁷CFU/ml，取0.1ml涂布于固体培养基B上，进行紫外诱变，紫外诱变的频率为15W，照射距离为30cm，照射时间10min；28℃静置培养7天，挑选30个透明圈较大的单菌落，进行摇瓶复筛，用钼蓝比色法测定各菌株的解磷能力，选择10株解磷活性最高的菌株，再分别作摇瓶复筛，选出一株解磷活性高且稳定性好的菌株ZSW-4-2，制成菌悬液用于下一步等离子体的诱变；

所述的摇瓶发酵复筛的步骤是：首先对上述分离得到的30个透明圈直径D与菌落直径d比值较高的菌株接种到100ml 上述的液体培养基A中，培养16小时。取5ml 菌液接种到装有100ml液体培养基B的250ml的锥形瓶中，28℃，150rpm摇床振荡培养7天；

所述的固体培养基B组成为：葡萄糖10 g，Ca₃(PO₄)₂ 13 g，MgCl₂·6H₂O 8g，MgSO₄·7H₂O 0.25 g，KCl 0.2 g，(NH₄)₂SO₄ 0.2g，琼脂粉15 g，蒸馏水1000mL, pH 7.2。

（3）等离子体诱变 

将步骤（2）所得的ZSW-4-2菌株，制成10⁷CFU/ml的菌悬液，取0.1ml均匀涂布于无菌培养皿中，将培养皿放到等离子下面的电极上，调节上电极的位置，使得上下电极之间的距离控制在8mm左右，调节电压为5V，电流为0.8A，使空气放电，得到均匀的空气介质阻挡放电等离子体，放电时间为7min。诱变后立即用无菌生理盐水或磷酸盐洗脱，涂布于固体培养基B上，再进行摇瓶复筛，挑出一株解磷活性最高的一株菌ZSW-4-2-5，制成菌悬液用于下一步的诱变；所述的摇瓶复筛的方法同步骤（2）；

（4）将步骤（3）所得的菌悬液活菌数调至10⁵-10⁷CFU/ml，循环重复紫外线诱变→等离子体诱变2次，最后得到一株解磷活性最高的菌株ZSW-4-2-5C， ZSW-4-2-5C解磷能力比野生解磷菌株ZSW-4增加了43.93%。其解无机磷能力比较如表1所示。

本发明ZSW-4-2-5C菌株具有以下特性：在固体培养基A上菌落颜色呈灰褐色，圆形凸起，边缘整齐，ZSW-4-2-5C在固体培养基A上生长的菌落形态如图1A所示；在固体培养基B上菌落较小，呈圆形，乳白色，透明圈大而明显，ZSW-4-2-5C在固体培养基B上生长的菌落形态如图1B所示；G^-，细长杆状，好氧或兼性厌氧，其革兰氏染色照片如图1C所示；其最适的生长温度28~32℃，最适的pH值为6.8~7.5；在液体培养基B中解磷酸钙能力为647.1±25.2 mg/l，在液体培养基C中解卵磷脂能力为105±6.4 mg/l，在液体培养基D中解植酸钙能力为900 ±7.3 mg/l。该菌株稳定性好，传代10次其解磷酸钙能力仍较为稳定，其结果见图2。ZSW-4-2-5C在液体培养基B中能够产生草酸、乳酸、柠檬酸和琥珀酸，ZSW-4-2-5C产生有机酸的高效液相色谱图如图3所示。该菌株产吲哚乙酸的能力为44.6±3.2mg/l，ACC脱氨酶活性为0.493~0.550μmol α-KA·（mg Pr·h）^-1，无铁载体产生；能够抗氯霉素、先锋霉素和青霉素生长，对红霉素、氨苄青霉素、诺氟沙星、复方新诺明也具有一定的耐受能力，在土壤环境中具有一定的生长优势，ZSW-4-2-5C抗抗生素生长能力如图4所示。 

所述固体培养基A组成为：胰蛋白胨5-10 g，酵母粉 3-5 g，NaCl 5-10 g，蒸馏水 1000 mL，琼脂粉15-20g，蒸馏水1000ml，pH值 6.8-7.5。 

所述的固体培养基B组成为：葡萄糖10-15 g，Ca₃(PO₄)₂ 5-13 g，MgCl₂·6H₂O 5-8g，MgSO₄·7H₂O 0.25-0.5 g，KCl 0.2-0.5 g，(NH₄)₂SO₄ 0.1 -0.2g，琼脂粉 12-15 g，蒸馏水1000mL, pH 6.8-7.5。 

所述的液体培养基C组成为：蛋白胨5-10g, 牛肉膏3-5g,  NaCl 5-10g，大豆卵磷脂2-3g, 蒸馏水1000 ml, pH 6.8-7.0。 

所述的液体培养基D组成为：葡萄糖10-15g, (NH₄)₂SO₄ 0.5g, NaCl 0.3g, KCl 0.3g, MgSO₄·7H₂O 0.3g,  FeSO₄·7H₂O 0.3g, MnSO₄·H₂O 0.03g, 植酸钙5g，蒸馏水1000 ml, pH 7.0-7.5。 

本发明提供的具有解磷解钾能力的弗氏柠檬酸杆菌通过诱变选育方法获得，为了鉴定ZSW-4-2-5C的系统发育地位，测定了其16Sr RNA部分序列。 

16Sr RNA序列采用通用引物27FP1（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1429R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）。PCR反应体系为：10mMol的dNTP 0.5μl，模板DNA1μl，10×PCR buffer 5μl，25mMol MgCl2 3μl，引物各1μl，TaqDNA 聚合酶0.25μl，ddH2O 37.5μl；预变性：95℃ 3分钟，循环一次；变性：95℃ 1分钟，退火55℃1分钟，延伸72℃ 2分钟，循环35次；终延伸：72℃ 5分钟。1.0%的琼脂糖凝胶电泳分离、提取目标条带，送北京三博远志公司测序。测序结果如附录中SEQ ID No：1所示， 

CTGCAGTCGACGGTAGCACAGAGGAGCTTGCTCCTTGGGTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCCGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCGGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAACGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGAGGAGGAAGGTGTTGTGGTTAATAACCGCAGCAATTGACGTTACTCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCGAAACTGGCAGGCTAGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGAACTTAGCAGAGATGCTTTGGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCAT

选取以上部分序列输入NCBI Genebank数据库中进行序列对比，利用Mega4.0.2处理比对结果并建立系统发育树（如图5所示），该序列与弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter fredndii strain DSM 30039）同源性高达99%，因此鉴定ZSW-4-2-5C属于弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter fredndii）。

实施例2  ZSW-4-2-5C解磷酸钙、卵磷脂和植酸钙能力测定 

将液体培养基B、C或D按每瓶100ml 分装到250ml的三角瓶中，灭菌备用。将ZSW-4-2-5C接种于50ml液体培养基A中，28℃，静置培养36小时后，取100μl（用液体培养基稀释A菌液，使其OD600为0.7）菌液接种于上述的液体培养基B、C或D中，每组三个平行，28℃，150rpm培养7天，取上述摇床培养的菌液，10000rpm离心10分钟，取上清液，用钼锑抗法测定上清液中磷含量。实验结果表明：ZSW-4-2-5C在液体培养基B中解磷酸钙能力为647.1±25.2 mg/l，在液体培养基C中解卵磷脂能力为105±6.4 mg/l，在液体培养基D中解植酸钙能力为900 ±7.3 mg/l。

所述的液体培养基A组成为：胰蛋白胨5 g，酵母粉 5 g，NaCl 10 g，，蒸馏水 1000 ml，pH值 6.8-7.5。 

所述的液体培养基B组成为：葡萄糖10g，Ca₃(PO₄)₂ 5 g，MgCl₂·6H₂O 5 g，MgSO₄·7H₂O 0.25 g，KCl 0.2 g，(NH₄)₂SO₄ 0.1 g，蒸馏水1000 ml，pH 7.0。 

所述的液体培养基C组成为：蛋白胨：10g, 牛肉膏：3g, NaCl: 5g，大豆卵磷脂2g, 蒸馏水1000 ml, pH 7.0。 

所述的液体培养基D组成为：葡萄糖10g, (NH₄)₂SO₄ 0.5g, NaCl 0.3g, KCl 0.3g, MgSO₄·7H₂O 0.3g,  FeSO₄·7H₂O 0.3g, MnSO₄·H₂O 0.03g, 植酸钙5g，蒸馏水1000 ml, pH 7.0。 

实施例3 ZSW-4-2-5C产吲哚乙酸（IAA）能力的测定 

向装有100ml液体培养基A的250ml三角瓶中加入浓度为200μg·ml-1的无菌L-色氨酸，将ZSW-4-2-5C接种于50ml 液体培养基A中，28℃，150rpm 培养20小时后，取100μl（用培养基 A 稀释菌液，使其 OD600 为 0.7）菌液接种于上述含有L-色氨酸的液体培养基A中，设三个平行，28℃，150 rpm 培养72小时，4000 g，离心10 min，采用分光光度法测定上清液中IAA的浓度。实验结果表明：ZSW-4-2-5C产生 IAA 浓度为44.6±3.2mg/l。

实施例4 ZSW-4-2-5C产 ACC 脱氨酶活性的测定 

将ZSW-4-2-5C接种于50ml液体培养基A活化中20小时后，取100 μ l（用培养基A稀释菌液，使其OD600为0.7）菌液接种于100ml液体培养基A中，28℃，150rpm培养24小时，离心收集菌体，在4℃下用DF 培养液（不含(NH₄)₂SO₄）洗涤2次，菌体悬浮于ADF培养液中，28℃，150rpm的条件下培养24h，诱导产生ACC脱氨酶，4℃离心收集菌体，0.1mol/L Tris-HCl缓冲液（pH  7.6）洗涤2次，重悬于600 μ l 0.1mol/L Tris-HCl缓冲液（pH 8.5）中，加入30 μl甲苯，并迅速震荡30s以破碎细胞，转移200μl含甲苯的细胞提取物，加入20μl 0.5mol/L ACC混匀后，测定ACC脱氨酶活性。结果表明：ZSW-4-2-5C产 ACC 脱氨酶活性为0.493~0.550μmol α-KA·（mg Pr·h）^-1。

所述的DF培养基组成为：KH₂PO₄ 4.0g，Na₂HPO₄ 6.0g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，FeSO₄·7H₂O 0.1mg，葡萄糖4.0g，柠檬酸2.0g，（NH₄）₂SO₄ 2.0g，0.1mL微量元素液，蒸馏水1000ml，pH值7.5。 

微量元素液组成为：H₃BO₃ 10mg ，MnSO₄ 11.2mg ，ZnSO₄ 124.6mg ，CuSO₄ 78.2mg，MoO₃10mg。 

所述的ADF培养基组成为：用3.0mmol/L ACC替代DF培养基中的（NH₄）₂SO₄为唯一氮源配制的DF培养基，即为ADF培养基。 

实施例5 

本发明还提供一种高效解磷菌剂，根据营养物载体不同可以为液体菌剂或固体菌剂。

菌剂的制备包括以下步骤： 

1)菌种发酵

①将冻存的ZSW-4-2-5C在37℃条件下快速解冻，按照1%的接种量接入装有10ml液体培养基A的试管中，28℃，静置培养16小时，得到ZSW-4-2-5C的一级种子液；

②二级三角瓶液体培养

将一级种子液按照5%的接种量接入装有100ml液体培养基A的三角瓶中，28℃，150rpm培养16小时；

③发酵罐发酵

将ZSW-4-2-5C的一级培养液按照5%的接种量分别接入装有发酵培养基C的发酵罐中，进行发酵培养，罐温28℃，培养pH7.2，通气培养72小时；

所述的发酵培养基C组成为：葡萄糖10g，麸皮10g，豆粕30g ，玉米粉5g，(NH₄)₂SO₄ 0.2g，KH₂PO₄ 5g，K₂HPO₄ 0.1g，KCl 0.2 g ，Ca₂(PO₄)₃ 13 g，MgSO₄·7H₂O 0.5g ，MgCl₂·6H₂O 10g，水1000ml，pH 7.2；

2）将秸秆粉、草炭土、麸皮和豆粕用高速粉碎机粉碎，过60目筛，按照质量百分比为20:20:10:50的比例混合，再加入40%的发酵培养基C，混合均匀后，用布袋或耐高温塑料袋装，1.0Kg/袋，0.1MPa高压灭菌2小时，取出冷却备用。

3）将步骤1）中得到的发酵液打入储液罐即得液态解磷菌剂，有效活菌数可达3.0×10⁹ CFU/ml；将发酵液按照100ml/kg的剂量与步骤2）中所得的固态基质混匀，28℃发酵7天，即得到固体菌剂，菌体密度达到1×10⁹ CFU/g。 

实施例6 

实验使用实施例5的液体菌剂，土壤采自陕西省长安县某农田较深层土壤，供试土壤pH为8.2，有机质含量为10.81g/kg，全氮含量为0.982g/kg，速效磷含量为17.42mg/kg，速效钾含量为5.36mg/kg。实验共设置3个处理，每个处理分别做3个平行。每个无菌平皿中分别加入20g土壤（上述土壤自然风干后，研磨）。处理1（CK1）为空白对照组，每个平皿中分别加入10ml发酵培养基C；处理2（固体菌剂组）为加入ZSW-4-2-5C固体菌体组，具体做法为：平皿中加入10ml无菌蒸馏水，然后再加入实施例5中制备的固体菌剂，每个平皿中分别加入1g，并混合均匀；处理3（液体菌剂组）为加入ZSW-4-2-5C液体菌剂，具体做法为：将实施例5中制备的液体菌剂用发酵培养基C按照1:1000的比例稀释，每个平皿中分别加入10ml；将上述平皿放入培养箱中，28℃培养，一周后每个平皿分别加入10ml无菌水，培养2周后采用0.5mol/l NaHCO₃浸提-钼锑抗比色法测定土壤中速效磷含量，采用醋酸铵浸提-火焰光度法测定土壤中速效钾的含量。

实验结果如图4所示，从图4中可以看出，ZSW-4-2-5C液体菌剂和固体菌剂均能明显提高土壤中速效磷和速效钾的含量，ZSW-4-2-5C液体菌剂使土壤中速效磷和速效钾含量分别比对照组增加了78.65%和150.23%，ZSW-4-2-5C固体菌剂使土壤中速效磷和速效钾含量分别比对照组增加了153.67%和92.67%，另外，空白对照组（CK）比原始土壤的速效磷和速效钾含量均稍有提高。 

实施例7 

盆栽土壤与实施例6相同，实验共设置3个处理，选取大小均匀的玉米种子放入灭菌小三角瓶中，用95%酒精浸5min，倒去酒精，加入3% NaClO溶液表面灭菌2 min，倒去次氯酸钠，用无菌水洗6～8次。实验共设置3个处理，每组共设3个平行。处理1（CK）为空白对照组；处理2为加入ZSW-4-2-5C液体菌剂组，处理3为加入ZSW-4-2-5C固体菌剂组。选用直径24 cm，高35cm的花盆每盆装土15 kg，加固体菌剂组每盆施用上述150 g固体菌剂，加液体菌剂组用发酵培养基C将实施例5制备的液体菌剂按照1:1000的比例稀释，每盆加入400ml；每个处理均做3个平行，种植玉米，每盆播种5-6粒种子，出苗后，选择长势均一的玉米，每盆定植2棵，每隔2周浇Holand无磷植物营养液一次，每盆浇500 ml。植株生长45天后收获，分别测定玉米地上部分高度、茎粗、地上和地下部分湿重和干重，测定玉米叶片中磷的含量。

所述的无磷植物营养液组成为：Ca(NO₃) ·H₂O 1.18g，KCl 1.4 g，MgSO₄·7H₂O 0.49 g，FeCl₃ 0.005 g，KNO₃ 0.51g，Gibson微量元素1 ml，蒸馏水 1000 ml，pH 6.8～7.0。 

Gibson 微量元素液的组成为：H₃BO₃ 2.86 g，ZnSO₄·7H₂O 0.22 g ，CuSO₄·5H₂O 0.08 g，MnSO₄·4H₂O 2.03 g ，Na₂MoO₄·2H₂O 1.26 g，H₂O 1000 ml。 

实验结果表2所示。从表2结果可以看出：ZSW-4-2-5C能够显著促进玉米的生长，玉米的各项生长指标均优于空白对照组和野生菌株ZSW-4。加ZSW-4-2-5C菌剂组玉米地上部分鲜重、干重和叶片磷含量比空白对照组分别增加3.85%、22.27%和42.42%，比野生菌株ZSW-4分别增加了2.62%、15.18%和25.89%。因此，ZSW-4经过诱变后筛选的ZSW-4-2-5C促生能力明显增强，具有开发为微生物肥料菌株的潜力。 

实施例8 

使用本发明提供的固体菌剂可用于促进大豆生长。

盆栽土壤与种子处理均与实施例6相同，实验共设置3个处理，处理1（CK）为空白对照组，处理2(ZSW-4)为加ZSW-4野生菌株固态菌剂组，处理3（ZSW-4-2-5C）为加ZSW-4-2-5C固态菌剂组。选用直径14 cm，高15cm的花盆每盆装土1.5 kg，将固体菌剂与土壤按照10g/kg土壤的用量加入土壤并充分混匀，种植大豆，出苗后，每盆保留1 株，植株生长45天后收获，分别测定植株鲜重和干重，测定大豆地上部分含磷量。 

实验结果如表3所示。结果表明：ZSW-4-2-5C能够显著促进大豆的生长，大豆的各项生长指标均优于空白对照组和野生菌株ZSW-4。加ZSW-4-2-5C菌剂组大豆株高、地上部分干重、根干重、叶片磷含量比空白对照组分别增加8.15%、42.4%、5.7%和23.17%，比野生菌株ZSW-4分别增加了5.45%、35.29%、24.15%和4.09%。 

实施例9 

使用本发明提供的液体菌剂可用于促进芥菜的生长。

盆栽土壤与种子预处理均与实施例5相同，实验分别设空白对照组（CK1）、加ZSW-4-2-5C死液体菌剂组(CK2)和加ZSW-4-2-5C液体菌剂组。种植芥菜，出苗后，每盆定植3棵，用1:200的液体菌剂灌根（用发酵培养基E稀释液体菌剂），每盆加入50ml菌剂，每隔2周浇Holand无磷植物营养液一次，每盆浇50 ml，植株生长45天后收获，分别测定植株株高、地上部分鲜重和干重、根鲜重和干重以及芥菜叶片部分磷含量。 

实验结果如表4所示。结果表明：ZSW-4-2-5C能够显著促进芥菜的生长，芥菜的各项生长指标均优于空白对照组。加ZSW-4-2-5C菌剂组芥菜地上部分鲜重、地上部分干重、根干重、根鲜重和叶片磷含量比空白对照组（CK1）分别增加45.62%、37.21%、44.88% 、40%和14.5%，比加ZSW-4-2-5C死液体菌剂组(CK2)分别增加了16.48%、22.92%、64.42%、62.79%和16.72%。因此，ZSW-4-2-5C菌剂促生长能力较强，能够作为微生物肥料使用，提高农作物产量，促进农业的可持续发展。 

<110> 西北大学

<120>一种具有解磷、解钾能力的弗氏柠檬酸杆菌及其应用

<160> 1

<170> PatentIn Version 2.1

<210> 1

<211> 999

<212> DNA

<213> 弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter freundii）

<220>

<400> 1

CTGCAGTCGA CGGTAGCACA GAGGAGCTTG CTCCTTGGGT GACGAGTGGC GGACGGGTGA 60

GTAATGTCTG GGAAACTGCC CGATGGAGGG GGATAACTAC TGGAAACGGT AGCTAATACC 120

GCATAACGTC GCAAGACCAA AGAGGGGGAC CTTCGGGCCT CTTGCCATCG GATGTGCCCA 180

GATGGGATTA GCTAGTAGGT GGGGTAACGG CTCACCTAGG CGACGATCCC TAGCTGGTCT 240

GAGAGGATGA CCAGCCACAC TGGAACTGAG ACACGGTCCA GACTCCTACG GGAGGCAGCA 300

GTGGGGAATA TTGCACAATG GGCGCAAGCC TGATGCAGCC ATGCCGCGTG TATGAAGAAG 360

GCCTTCGGGT TGTAAAGTAC TTTCAGCGAG GAGGAAGGTG TTGTGGTTAA TAACCGCAGC 420

AATTGACGTT ACTCGCAGAA GAAGCACCGG CTAACTCCGT GCCAGCAGCC GCGGTAATAC 480

GGAGGGTGCA AGCGTTAATC GGAATTACTG GGCGTAAAGC GCACGCAGGC GGTCTGTCAA 540

GTCGGATGTG AAATCCCCGG GCTCAACCTG GGAACTGCAT CCGAAACTGG CAGGCTAGAG 600

TCTTGTAGAG GGGGGTAGAA TTCCAGGTGT AGCGGTGAAA TGCGTAGAGA TCTGGAGGAA 660

TACCGGTGGC GAAGGCGGCC CCCTGGACAA AGACTGACGC TCAGGTGCGA AAGCGTGGGG 720

AGCAAACAGG ATTAGATACC CTGGTAGTCC ACGCCGTAAA CGATGTCGAC TTGGAGGTTG 780

TGCCCTTGAG GCGTGGCTTC CGGAGCTAAC GCGTTAAGTC GACCGCCTGG GGAGTACGGC 840

CGCAAGGTTA AAACTCAAAT GAATTGACGG GGGCCCGCAC AAGCGGTGGA GCATGTGTTT 900

AATTCGATGC AACGCGAAGA ACCTTACCTA CTCTTGACAT CCAGAGAACT TAGCAGAGAT 960

GCTTTGGTGC CTTCGGGAAC TCTGAGACAG GTGCTGCAT 999

Claims (5)

1.一种具有解磷、解钾能力的菌株ZSW-4-2-5C，其分类命名为弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter freundii），已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.8748。

2.含有权利要求1所述弗氏柠檬酸杆菌ZSW-4-2-5C的微生物菌剂。

3.权利要求2所述微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：

1)菌种发酵

①将冻存的ZSW-4-2-5C在37℃条件下快速解冻，按照0.5-1%的接种量接入装有10-15ml液体培养基A的试管中，28-32℃，静置培养8-16小时，得到ZSW-4-2-5C的一级种子液；

液体培养基A组成为：胰蛋白胨5 g，酵母粉 5 g，NaCl 10g，蒸馏水1000ml，pH值 7.2；

②二级三角瓶液体培养

将一级种子液按照3-5%的接种量接入装有50-100ml液体培养基A的三角瓶中，28-32℃，150-200rpm培养8-16小时；

③发酵罐发酵

将ZSW-4-2-5C的一级培养液按照5-10%的接种量分别接入装有发酵培养基E的发酵罐中，进行发酵培养，罐温28-32℃，培养pH 6.8-7.5，通气培养48-72小时，得菌悬液，有效活菌数可达1.8-3.0×10⁹ CFU/ml，即为解磷液体菌剂；

发酵培养基E组成为：葡萄糖10-15g，麸皮5-10g，豆粕30-50g ，玉米粉3-5g，(NH₄)₂SO₄ 0.2-0.4g，KH₂PO₄ 5-10g，K₂HPO₄ 0.1-0.2g，KCl 0.2-0.5 g ，Ca₂(PO₄)₃ 10-13 g，MgSO₄·7H₂O 0.25-0.5g ，MgCl₂·6H₂O 5-10g，水1000ml，pH 6.8~7.5；

2）将秸秆粉、草炭土、麸皮和豆粕粉碎过60目筛，按照质量百分比为20-30：20-30：10-20：20-30的比例均匀混合再加入30-50%的发酵培养基E，混合均匀后，用布袋或耐高温塑料袋装，1-2Kg/袋，0.1MPa高压灭菌2-3小时，取出冷却即得固态基质；

3）将步骤1）中得到的菌悬液按照50-100ml/kg的剂量与步骤2）中所制的固态基质混匀，28-32℃发酵5-7天，即得到固体菌剂，菌体密度达到1×10⁹ CFU/g。

4.权利要求1所述弗氏柠檬酸杆菌在促进植物生长中的应用。

5.权利要求2所述微生物菌剂的使用方法，其特征在于：

解磷液体菌剂在植物浸种时或植物移栽时以100-500倍的液体菌剂稀释液浸泡种子或植物根部2-4小时，育苗期或生长期灌根采用1000-5000倍的液体菌剂稀释液10-40ml/Kg土壤剂量浇灌稀释液，整个生长期灌根1-3次；固体解磷菌剂作为基肥和追肥使用，使用剂量为5-15g/Kg土壤。