CN102405770B - 一种利用大豆慢生根瘤菌促进平菇生长的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用大豆慢生根瘤菌促进平菇生长的方法，其包括以下步骤：①制备菌悬液：挑取适量大豆慢生根瘤菌斜面菌苔接种于YMA液体培养基中，20－30℃振荡培养12－18h，然后配制成密度3－8×107个/ml的菌悬液；②共培养：取平菇天达300斜面菌种块0.5cm×0.5cm接种于装有150－250g灭菌麦粒培养基的原种瓶中，同时在菌种块周围接入大豆慢生根瘤菌菌悬液1－5ml，20－30℃培养至菌丝发满全瓶，用作原种；③培养出菇：将原种培养成栽培种；然后把栽培种接种于栽培袋中培养至菌丝发满袋后，移入出菇房中培养出菇。采用该方法菌丝生长快，收获所得平菇子实体产量高，品质好。
Description
技术领域
本发明属于平菇栽培技术领域，具体涉及一种利用大豆慢生根瘤菌促进平菇生长的方法。
背景技术
平菇（Pleurotus ostreatu），味道鲜美、口感脆嫩，高蛋白、低脂肪，富含多种氨基酸，具有丰富的营养和药用保健功能。因其栽培工艺简单、投资少、周期短、效益好，从而成为我国栽培量最大、栽培范围最广的食用菌。传统的栽培方法产量低、品质差，不能满足市场的需求。因此如何提高平菇的产量和品质一直是研究的热点。
前人研究证明：通过对培养基和菌体中氮含量的衡算，发现一些子囊菌和担子菌能够固定大气中的氮气，包括平菇、凤尾菇、羊肚菌和香菇等。然而，进一步研究发现，这些真菌并非能够单独固氮，而是与固氮菌联合固氮，从而提高菌丝含氮量，增加干物质的积累。已报道能与食用菌共生固氮的固氮菌有荧光假单胞菌（Pseudomonas）、大豆慢生根瘤菌（Bradyrhizobium japonicum）、埃氏慢生根瘤菌（Bradyrhizobium elkanii）、茎瘤固氮根瘤菌（Azorhizobium caulinodans），维涅兰德固氮菌(Azotobacter
vinelandii)和高温固氮菌等。目前为止，固氮菌与食用菌联合固氮对出菇影响的研究还比较少，尤其是二者联合固氮对食用菌菌丝生长，子实体产量及品质影响的相关报道尚未发现。
发明内容
本发明目的在于提供一种利用大豆慢生根瘤菌促进平菇生长的方法，采用该方法菌丝生长快，收获所得平菇子实体产量高，品质好。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种利用大豆慢生根瘤菌促进平菇生长的方法，其包括以下步骤：
①制备大豆慢生根瘤菌菌悬液：用接种环挑取适量大豆慢生根瘤菌斜面菌苔（购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，大豆慢生根瘤菌菌种编号1.2550，Bradyrhizobium japonicum）接种于YMA液体培养基中，20－30℃振荡培养12－18 h，然后配制成密度3－8×107个/ml的菌悬液；
②平菇与根瘤菌共培养：取平菇天达300斜面菌种块（0.5cm×0.5cm）（P. ostreatus
Td 300，购自河南省农业科学院食用菌工程中心）接种于装有150－250g灭菌麦粒培养基的原种瓶中，同时在菌种块周围接入大豆慢生根瘤菌菌悬液1－5 ml，20－30℃培养至菌丝发满全瓶（一般需10－15天），用作原种；
③培养出菇：将原种培养成栽培种；然后把栽培种接种于栽培袋中培养至菌丝发满袋后，移入出菇房中培养出菇。
具体的，所述YMA液体培养基组成为：甘露醇10.0 g，酵母粉0.5g，K2HPO4 0.5
g，NaCl 0.1 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，水1000 ml，pH 7.2。
步骤③中培养出菇具体操作为：将5－10g原种接入装有200－350g灭菌棉籽壳培养料的塑料袋中，20－30℃培养至菌丝发满全袋（一般需10－20天）用作栽培种；然后把10－20g栽培种接种于装有300－500g灭菌棉籽壳培养料的栽培袋中，20－30℃培养至菌丝发满袋（一般需20－40天）后移入出菇房中，20－25℃培养出菇（一般需5－15天）。其中，麦粒培养基和棉籽壳培养料的组成及制备采用本领域的常规方法即可。
本发明方法以栽培量最大、栽培范围最广泛的平菇为材料，通过其与大豆慢生根瘤菌进行联合固氮，试验结果证实该方法能够有效促进平菇菌丝的生长，缩短平菇栽培周期，提高平菇子实体的产量和品质。本发明通过探讨大豆慢生根瘤菌对平菇菌丝生长、子实体产量及品质的影响，为利用生物固氮栽培生产优质、高效的食用菌提供理论依据。
附图说明
图1为接种大豆慢生根瘤菌对平菇子实体干物质和蛋白质含量的影响。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明的保护范围并不局限于此。其中实施例1中麦粒培养基和棉籽壳培养料的组成和制备均为本领域的常规方法。具体的，所述麦粒培养基由下述方法制得：将小麦置于是其重量2-3倍的清水中浸泡使麦粒吸足水分，以用手指搓捻无实心感觉为宜；然后将浸泡过的麦粒煮沸至麦粒无白心（一般需20-40min）；接着把煮好的麦粒滤去水，按比例添加碳酸钙和石膏（碳酸钙、石膏的添加量均为小麦重量的1/98），搅拌均匀后装入菌种瓶即得，经此处理制得的麦粒培养基中最终含水量控制在55-60%，每个菌种瓶装量150-250g。灭菌条件：1.1kg/cm2维持1.5～2h。所述棉籽壳培养料由下述方法制得：将物料棉籽壳、麸皮、石膏和石灰按重量比78:20:1:1混匀后，再按料水重量比1：1.1-1.3加入相应的水翻拌均匀，静置30min后再翻拌1次，装袋。制作栽培种时每袋装量200-350g，栽培时每袋装量300-500g。灭菌条件：1.1kg/cm2维持1.5～2h。
实施例
1
一种利用大豆慢生根瘤菌促进平菇生长的方法，其特征在于，包括以下步骤：
①制备大豆慢生根瘤菌菌悬液：用接种环挑取一环大豆慢生根瘤菌斜面菌苔（购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，大豆慢生根瘤菌菌种编号1.2550，Bradyrhizobium japonicum）接种于100mlYMA液体培养基（培养基组成为：甘露醇10.0 g，酵母粉0.5g，K2HPO4 0.5
g，NaCl 0.1 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，水1000 ml，pH 7.2）中，27℃、220 rpm振荡培养15 h（以使菌液在600 nm处的OD值处于0.8左右），然后取所需量的菌液，12000 rpm常温离心1 min，弃去上清液，用无菌水洗涤两次，弃上清，再用等量无菌水使菌体混匀配制成密度3.6×107个/ml的菌悬液；
②平菇与根瘤菌共培养：取平菇天达300斜面菌种块（0.5cm×0.5cm）（P. ostreatus
Td 300，购自河南省农业科学院食用菌工程中心）接种于装有200g灭菌麦粒培养基的原种瓶中，同时在菌种块周围接入大豆慢生根瘤菌菌悬液3 ml，27℃培养至菌丝发满全瓶，用作原种；
③培养出菇：将8g原种接入装有250g灭菌棉籽壳培养料的塑料袋中，27℃培养至菌丝发满全袋，用作栽培种；然后把15g栽培种接种于装有400g灭菌棉籽壳培养料的栽培袋中，27℃培养至菌丝发满袋后，移入出菇房中，20℃培养一周左右出菇。
为测试接种大豆慢生根瘤菌（记为试验组）后对平菇生长的促进作用，特进行了空白对比试验（即将步骤②中在菌种块周围接入
3 ml
大豆慢生根瘤菌菌悬液更换为接入
3ml
无菌水，其它同实施例
1
，记为对照组），试验组和对照组各
5
个重复，效果试验测定及结果如下。
测定项目与方法
1.1.1 菌丝生长速度、出菇时间和菇产量
栽培袋发菌期间，每天观察菌丝生长情况，接种6 d后在菌丝尖端对应的袋壁上画线，以后每隔4d在菌丝尖端对应的袋壁上画一次线，测量菌丝生长长度、菌丝满袋时间、出菇时间以及第一、二潮菇的产量等指标，结果见表1。
1.1.2 子实体干物质含量
采摘的子实体称鲜重后，放入60℃烘箱，烘至恒重。子实体干物质含量为干重占鲜重的百分比。
1.1.3 子实体蛋白质含量
参考李振亚等（用青霉素菌丝提取浓缩蛋白质，饲料工业，2002, 23(8):38-39）的方法进行测试。具体为：收集烘干的子实体，用粉碎机粉碎，过60目筛，充分混匀，加干物质重5%的氢氧化钠和干物质重量2倍的水，充分研磨碎，然后3000rpm离心10min，将残渣加水搅拌均匀，二次离心，混合两次离心所得溶液，用盐酸调pH至4.1，离心，弃上清，得蛋白质，加适量水溶解即得蛋白质溶液，用考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒（购自南京建成生物工程研究所）测定吸光度，计算蛋白质（粗蛋白）含量。
1.1.4 矿物质含量
将烘干的子实体用粉碎机粉碎，过60目筛，充分混匀，备用。N含量测定采用凯氏定氮法，P含量测定采用钒钼黄比色法。K含量测定采用火焰光度计法（张自坤等，铜胁迫对嫁接和自根黄瓜幼苗光合作用及营养元素吸收的影响，中国生态农业学报, 2009, 17(1):135−139）。Ca、Mg、Fe、Cu、Zn、Mn、B含量测定采用湿灰-火焰原子吸收分光光度法（黄婷婷等，湿法消化/火焰原子吸收法测定木菠萝的营养元素，广西民族师范学院学报, 2010,27 (3):20-21）。
试验结果
1.2.1 菌丝生长速度、出菇时间和菇产量
试验组菌丝生长速度和菇产量显著提高，菌丝满袋时间显著缩短，第一潮菇出菇时间缩短了6.2 d，第二潮菇出菇时间缩短了10.7 d，生物学效率提高18.80%（见表1）。
1.2.2 大豆慢生根瘤菌对平菇品质的影响
干物质含量、蛋白质含量和矿质元素含量的高低是衡量平菇品质优劣的重要指标。试验组子实体干物质、蛋白质含量分别比对照组提高9.73%和26.97%（见图1），矿质元素中大量元素氮、磷、钾、钙、镁和微量元素铁、铜、锰的含量较于对照组显著提高，分别提高12.28%、8.09%、9.34%、15.63%、12.50%、7.54%、22.11和15.98%，仅微量元素锌、硼的含量与对照相比差异不显著（见表2）。
讨论和结论
自生固氮菌和联合固氮菌除能够固氮外，还能够提高土壤矿质元素的有效性。经试验研究发现，大豆慢生根瘤菌与平菇共培养，不仅能够提高平菇菌丝生长速度和子实体的蛋白质、氮含量，还能提高子实体的矿物质含量，表明大豆慢生根瘤菌与平菇在联合固氮的同时，亦能提高培养料中矿质元素的有效性。大豆慢生根瘤菌是否产生其他促生物质如激素等，还需进一步研究。因此，大豆慢生根瘤菌对平菇的促生作用至少包括联合固氮和提高矿质元素的有效性二个方面。
平菇栽培常用的原料主要是棉籽壳和秸秆等，为了提高产量，往往添加较多的有机碳源、氮源和无机盐等，增加了成本，易污染杂菌，尿素添加不当还会影响发菌，并导致栽培料中含盐量高，对菌糠的进一步利用作植物栽培基质或有机肥料十分不利。接种根瘤菌栽培平菇，能够有效补充培养料中氮源的不足和提高培养料中矿质元素的有效性，从而可大幅度减少辅料的用量，降低生产成本，提高菌糠的可用性。根瘤菌只需在制备原种时接种一次即可，栽培时不需要再接种根瘤菌。因此，应用根瘤菌栽培平菇是一项能提高平菇经济效益和社会效益且简便有效的生物措施。
综上所述，栽培平菇时接入大豆慢生根瘤菌共培养，能促进平菇菌丝生长，缩短发菌时间，利于提前出菇，提高生物学效率及子实体干物质含量、蛋白含量和矿物质含量，改善品质。大豆慢生根瘤菌对平菇的促生作用包括至少联合固氮和提高矿质元素的有效性二个方面。利用大豆慢生根瘤菌与平菇的这种互生关系，能够广开栽培原料资源，减少辅料用量，创造食用菌良好的经济效益和社会效益。
Claims (2)
1.一种利用大豆慢生根瘤菌促进平菇生长的方法，其特征在于，包括以下步骤：
①制备大豆慢生根瘤菌菌悬液：挑取适量大豆慢生根瘤菌斜面菌苔接种于YMA液体培养基中，20－30℃振荡培养12－18 h，然后配制成密度3×107－8×107个/ml的菌悬液；
②平菇与根瘤菌共培养：取平菇天达300斜面菌种块0.5cm×0.5cm接种于装有150－250g灭菌麦粒培养基的原种瓶中，同时在菌种块周围接入大豆慢生根瘤菌菌悬液1－5ml，20－30℃培养至菌丝发满全瓶，用作原种；
③培养出菇：将原种培养成栽培种；然后把栽培种接种于栽培袋中培养至菌丝发满袋后，移入出菇房中培养出菇；
所述步骤①中YMA液体培养基组成为：甘露醇10.0 g，酵母粉0.5g，K2HPO4 0.5
g，NaCl 0.1 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，水1000 ml，pH 7.2。
2.如权利要求1所述利用大豆慢生根瘤菌促进平菇生长的方法，其特征在于，步骤③中培养出菇具体为：将5－10g原种接入装有200－350g灭菌棉籽壳培养料的塑料袋中，20－30℃培养至菌丝发满全袋，用作栽培种；然后把10－20g栽培种接种于装有300－500g灭菌棉籽壳培养料的栽培袋中，20－30℃培养至菌丝发满袋后移入出菇房中，20－25℃培养出菇。
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