CN106148229B

CN106148229B - 一种弗氏链霉菌固体培养基、培养方法及农用微生物菌剂的制备方法

Info

Publication number: CN106148229B
Application number: CN201610538598.9A
Authority: CN
Inventors: 胡兆平; 李新柱; 邢芳芳; 高明夫; 禚优优
Original assignee: HEZE JINZHENGDA ECO-ENGINEERING Co Ltd; Kingenta Ecological Engineering Group Co Ltd
Current assignee: HEZE JINZHENGDA ECO-ENGINEERING Co Ltd; Kingenta Ecological Engineering Group Co Ltd
Priority date: 2016-07-08
Filing date: 2016-07-08
Publication date: 2020-01-10
Anticipated expiration: 2036-07-08
Also published as: CN106148229A

Abstract

本发明提供了一种弗氏链霉菌固体培养基、培养方法及农用微生物菌剂的制备方法，属于微生物发酵领域。以重量计，弗氏链霉菌固体培养基包括3～10份玉米粉、3～18份豆粕粉、18～45份秸秆粉、10～30份草炭土、20～50份磷尾矿、1～10份碳酸钙和40～50份营养液。利用该固体培养基，本发明通过液‑固双相发酵制备固体发酵培养基，并用于生产农用弗氏链霉菌菌剂。本发明提供的弗氏链霉菌产孢的发酵培养基适于弗氏链霉菌的生长，每克发酵原料可产生7.5*10⁹以上个孢子；制备的孢子粉萌发率可达95％，所制备的农用微生物菌剂符合农用微生物菌剂的国家标准，对作物的生长具有明显促进作用。

Description

一种弗氏链霉菌固体培养基、培养方法及农用微生物菌剂的制备方法

技术领域

本发明涉及微生物发酵领域，特别地，涉及一种弗氏链霉菌固体培养基，及其制备和发酵方法，以及利用该培养基制备农用弗氏链霉菌菌剂的方法。

背景技术

链霉菌(Streptomycetaceae)是抗生素类物质的主要生产菌，在微生物产生的20000多种活性物质中，链霉菌占到60％以上，是一类作物有益菌，在农业病害的生物防治上具有广阔的应用前景。弗氏链霉菌作为链霉菌属(Streptomyces)的一个种类，可产生泰乐霉素、新霉素等有效活性成分，对作物具有明显的促生、抗病作用，越来越多地被应用于果树、蔬菜等多种作物栽培中。

但是，土壤中自然生长的弗氏链霉菌数量太少，无法发挥上述作用。而现有技术中弗氏链霉菌多为液体发酵，发酵周期长、产孢量少，难以满足其作为农用微生物菌剂的工业化生产的要求。

中国专利CN 102329754 B公开了一种弗氏链霉菌新菌株的菌剂制备方法，包括先制备弗氏链霉菌新菌株的种子液，再将种子液转接到固体增殖培养基上培养7-10天后，经干燥获得弗氏链霉菌新菌株原菌菌剂。该菌剂的制备方法采用液体+固体联合发酵工艺进行菌种增殖，所制备菌剂中含有效活菌数为50亿/g以上，与传统的液体发酵吸附成固体制剂的方式相比，产孢量更高，代谢产物量大，其产品的生物活性更好，保存期更长。但是，该发明也存在缺点，譬如，其液体培养基和固体培养基的原料来源单一，养分不够丰富，造成菌种生长缓慢，菌剂生产周期长，从菌种的活化到固体发酵结束后干燥得到菌剂原液，需要30天左右，限制了其产业化生产。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种弗氏链霉菌固体培养基及其制备和发酵方法，以及利用该培养基制备农用弗氏链霉菌菌剂的方法，以解决现有技术中液体发酵弗氏链霉菌产孢量少、发酵周期长、难以制备农用固体微生物菌剂，以及有效利用磷矿资源的技术问题。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种弗氏链霉菌固体培养基，以重量份计，包括：3～10份玉米粉、3～18份豆粕粉、18～45份秸秆粉、10～30份草炭土、20～50份磷尾矿、1～10份碳酸钙、40～50份营养液。

根据本发明优选的，所述秸秆粉的粒径细度优选为30-50目；所述草炭土细度为40目；所述磷尾矿粉颗粒细度在80目以下；所述培养基的有机质含量≥60％。

根据本发明优选的，以重量份计，所述营养液包括1～10份的蔗糖、1～5份的硫酸铵、0.1～1份磷酸二氢钾、85～92份水。

根据本发明优选的，培养基以重量份计，包括：5～10份的玉米粉、8～10份的豆粕粉、18～25份的秸秆粉、20～30份的草炭土、30～40份的磷尾矿、2～3份的碳酸钙和43～48份蔗糖-硫酸铵营养液。

更进一步地，培养基包括以下重量份计的原料：10份玉米粉、10份豆粕粉、18份秸秆粉、30份草炭土、30份磷尾矿、2份碳酸钙和45份蔗糖-硫酸铵营养液。

更进一步地，培养基包括以下重量份计的原料：7份玉米粉、15份豆粕粉、20份秸秆粉、20份草炭土、35份磷尾矿、3份碳酸钙和43份蔗糖-硫酸铵营养液。

更进一步地，培养基包括以下重量份计的原料：5份玉米粉、8份豆粕粉、25份秸秆粉、25份草炭土、40份磷尾矿、2份碳酸钙和48份蔗糖-硫酸铵营养液。

一种上述弗氏链霉菌固体培养基的制备方法，包括以下步骤：

(A)按照上述质量比例，称取玉米粉、豆粕粉、磷尾矿、秸秆粉、草炭土、碳酸钙，混合各原料得到混合物；

(B)在上述混合物中加入营养液，机械搅拌混合均匀，自然pH，经灭菌处理，得到固体培养基。

根据本发明优选的，所述灭菌处理条件为115-122℃下施加1.0-2.0kg/cm²压力20～40分钟。

一种弗氏链霉菌孢子的固体发酵方法，包括以下步骤：

1)孢子悬液制备：从冰箱菌种斜面挑取孢子接种茄瓶斜面，培养后加入无菌水洗脱制备孢子悬液；2)液体发酵：将孢子悬液接种到液体发酵培养基中进行液体发酵，至所述液体发酵培养基中菌丝体生长进入所述弗氏链霉菌的对数生长期，得到液体发酵种子液；3)固体发酵：将所述液体发酵种子液接种到以上述方法制备的弗氏链霉菌固体培养基中，进行固体发酵，得到固体发酵培养基。

进一步地，所述孢子悬液的制备过程中，接种菌种为弗氏链霉菌，菌种保藏编号为CGMCC No.11963，于茄瓶斜面接种，28～32℃下恒温静置培养6～10天，用灭菌蒸馏水洗脱。

进一步地，所述液体发酵过程中，发酵条件为温度28～32℃，震荡频率150～220r/分钟，恒温振荡培养24～36小时。

更进一步地，所述液体发酵的条件为温度30～32℃，震荡频率180～200r/分钟。

进一步地，所述液体发酵过程中，以上一步骤制备的孢子悬液作为接种菌液，接种量为液体发酵培养基体积的3-6％；所述液体发酵培养基的成分以重量比计算，包括2％的豆粕粉和0.5％的葡萄糖悬液，其余为水。

进一步地，所述弗氏链霉菌固体培养基的发酵条件为在28～35℃下培养3～6天。

更进一步地，所述弗氏链霉菌固体培养基的发酵条件为在30～34℃下培养4～5天。

进一步地，所述弗氏链霉菌固体培养基的发酵过程包括发酵初期和产孢期；发酵初期固体培养基的水分含量为40～60％，进入产孢期后所述弗氏链霉菌固体培养基的水分含量小于35％；液体发酵种子液的接种量为所述弗氏链霉菌固体培养基质量的10～15％。发酵初期水分含量根据弗氏链霉菌固体培养基所含水分，液体发酵种子液以100％含水量计，补充液体发酵种子液至所需含水量；产孢期水分含量为将所得固体发酵培养基称重(W₀)，彻底烘干后再次称重(Wt)，根据以下公式计算含水量：含水量＝(W₀-Wt)/W₀。

根据本发明的另一方面还提供了一种农用弗氏链霉菌菌剂的制备方法，即在固体发酵结束后，将固体发酵产物孢子粉直接与褐煤以及磷尾矿粉复配得到弗氏链霉菌农用微生物菌剂粉剂产品。

进一步地，所述农用弗氏链霉菌菌剂的制备过程中，固体发酵产物与褐煤以及磷尾矿粉的复配比例为20～40：30～60：60～80，以重量份计比；孢子粉与褐煤以及磷尾矿粉混合均匀后得到的弗氏链霉菌菌剂，使菌剂的水分含量为8～15％；所述弗氏链霉菌菌剂的水分含量以湿度计测定，置于恒温控制培养室调整菌剂水分含量。

现有技术中常用的链霉菌固体发酵培养基组分存在以下问题：链霉菌固体发酵基质用到大量的玉米粉、麸皮，一般占总养分干重的40～80％。玉米粉、麸皮中含有丰富的纤维素、蛋白质、淀粉、维生素等，养分含量丰富，但在促进链霉菌生长繁殖的同时，容易滋生大量细菌，且细菌比链霉菌生长迅速，消耗掉大部分的养分，不利于链霉菌的孢子萌发和生长，致使产孢数量少，且生产的菌剂杂菌率严重超标。本发明选用少量玉米粉、豆粕粉以及秸秆粉代替玉米粉和麸皮作为固体培养基，一方面，秸秆粉为玉米秸秆收获籽实后的剩余部分磨成的粉状物，含有30％以上的碳水化合物、2％～4％的蛋白质和0.5％～1％的脂肪，与玉米粉、豆粕粉合理搭配后，可以为弗氏链霉菌提供充足的碳源、氮源，有利于其生长、产孢；另一方面，因玉米秸秆粉具有较强的吸水性、蓬松性，还具有减缓培养基质水分流失和提高固体培养基质透气性的效果。

常用固体培养基组成中的细沙、细土虽然廉价、易得，但是需要严格控制沙、土的颗粒细度、以及理化指标，原料的前处理工序较多，且沙、土的养分含量较低，作为农用微生物菌剂施到土壤中不能补充养分。本发明选择草炭土、磷尾矿粉作为土壤的替代原料，既能作为固体培养所需的支持体，还能为弗氏链霉菌提供丰富的氮源、碳源，促进微生物的代谢和产孢。而弗氏链霉菌代谢产生的泰乐霉素、新霉素能有效抑制土壤中的病原菌，缓解作物病虫害；合成的有机酸及酶类可以分解释放磷尾矿粉中的磷、钙、镁等矿物养分。整个培养过程中不需要提供无机盐，磷尾矿分解产生的无机养分不仅刺激弗氏链霉菌快速产孢，缩短发酵周期，还增加了菌剂的速效养分含量。

本发明使用的主要固相载体含有磷尾矿粉，其主要物相为CaMg(CO₃)₂及Ca₅F(PO₄)₃，P₂O₅含量在8％左右，MgO含量可高达19.0％。通过协调玉米粉、豆粕粉、秸秆粉、草炭土和磷尾矿粉的加入量，使得磷尾矿粉颗粒附近均能存在其余各原料，可以作为附着于磷尾矿粉颗粒上的菌体的营养物质，起到促进菌体生长的作用。磷尾矿粉与秸秆粉之间的接触面、孔隙增大也能起到促进菌体生长的作用。因磷尾矿粉的特殊来源与成分结构，此原料基本不含杂菌，从而降低了灭菌过程中的能量消耗，从而降低成本，提高了原料利用率。

本发明提供的固体培养基还包括营养液，该营养液含有碳源、氮源，无需添加无机盐成分，简单易配。营养液的加入量可根据常规加入量选取。优选采用45份的蔗糖-硫酸铵营养液，采用此配方营养液能有效提高菌体的生长能力。按此量加入营养液能避免加入过多的营养液导致菌体附着的磷尾矿粉、秸秆粉之间的距离过大，影响菌体的增殖、产孢。也能避免加入营养液过少，导致菌丝体因干燥导致的代谢途径阻遏，次生代谢物产生受到抑制，从而影响磷尾矿中无机元素的释放，影响菌体的生长。

本发明提供的固体培养基不需要进行调节pH，通过添加轻质碳酸钙粉进行缓冲、调控，使整个发酵过程维持在相对平衡的酸碱度，既维持了有利于弗氏链霉菌菌丝体的生长、抑制杂菌生长繁殖的环境，降低了杂菌率，又避免引入对菌体生长存在刺激或毒害作用的酸碱物质及离子。优选的碳酸钙的加入可缓冲整个发酵过程中的pH，对菌体无毒害作用，且有助于孢子产生，其中的钙还能起到促进弗氏链霉菌产孢的作用。

本发明所采用的固体培养基的灭菌处理条件为：在115-122℃下施加1.0-2.0kg/cm²的压力20～40分钟。按此条件进行灭菌，较常规固体发酵灭菌时间短、温度低，灭菌效率高，节约蒸汽用量，且能充分杀灭固体培养基内的杂菌。

根据本发明提供的优选配比制备的固体培养基，具有最优的孢子量、菌体数量和最低的杂菌含量。

本发明提供的弗氏链霉菌孢子的固体发酵过程中，孢子悬液的制备为先将斜面孢子接种到茄瓶斜面培养后，加入无菌水洗脱、混匀，后接种于含有豆粕粉、葡萄糖的液体发酵培养基发酵罐培养扩大种子液量。其中，孢子悬液的接种量为液体发酵培养基体积的3～6％。采用该比例接种在节约菌液的同时，提高液体发酵的效率。

本发明所述的固体培养基的发酵采用液-固双相发酵方法，先进行液体发酵，使得孢子悬液中的弗氏链霉菌孢子充分萌发。该液体发酵采用适宜于弗氏链霉菌生长的条件，孢子快速萌发，大大缩短了链霉菌的液体发酵周期，同时液降低了染菌几率。随着液体发酵的进行，弗氏链霉菌快速进入对数生长期，且持续保持高速增殖。将该液体发酵液接种至上述固体培养基后，由于固体培养基的pH、碳氮比环境波动不大，接种后的弗氏链霉菌菌丝体得以快速生长、产孢，极大地减少了染菌几率，降低了菌剂产品的杂菌数量。

其中，所述液体发酵条件优选：温度为28～32℃，振荡频率150～220r/分钟，恒温培养24～36小时。采用该培养条件有利于弗氏链霉菌的生长，缩短了发酵周期，降低染菌几率。

其中，所述固体发酵条件优选：在30～34℃下培养4～5天。按此条件发酵，能避免发酵周期过长导致的杂菌污染、繁殖从而增加菌剂中杂菌率。所述液体发酵液的接种量为固体培养基质的10～15％。采用该比例接种，能保证进入固体培养基中的菌体数量适宜，避免接种过量，导致后续固体发酵培养基水分过高产孢困难。

虽然此固体培养基组分不适宜细菌的繁殖，但作为农用微生物菌剂仍需对杂菌率有较严格的控制。对于杂菌的控制，还可以通过对固体培养过程中水分含量、接种量的控制实现。本发明的弗氏链霉菌孢子的固体发酵过程包括发酵初期和产孢期，发酵初期固体培养基的水分含量为40～60％，进入产孢期后固体培养基的水分含量小于35％。按此含水量调整固体培养基中的含水量，结合固体发酵的温度，使得发酵过程中的温湿度利于弗氏链霉菌的生长，而不利于各类杂菌的生长。

本发明提供的农用微生物菌剂的制备过程中，固体发酵结束后，无需进行烘干处理；按照该方法所制备的链霉菌农用微生物菌剂水分含量在8～15％，活菌数10～20亿/g，杂菌率＜5％，符合农用微生物菌剂GB2087-2006的指标要求。

采用本发明提供的方法，生产一批农用微生物菌剂的周期为8-10天，液体发酵为1-2天，固体发酵约4-5天，掺混一天，菌剂活菌数检测3-5天。采用本发明提供的方法生产时间得到有效缩短，生产效率得到提高。

本发明的有益效果在于：

1、本发明提供的固体培养基加入豆粕粉玉米粉和秸秆粉，并协调草炭土和磷尾矿的混合量，使其在保证供给微生物充足有机质的同时，磷尾矿中的矿物元素通过菌种的发酵作用活化出来，提高磷尾矿中的有效养分含量，从而促进微生物的生长。通过加入碳酸钙和秸秆粉，分别可以调控培养基的酸碱环境、增加发酵过程的稳定性，以及提高固体培养基质的疏松度和透气性，从而抑制杂菌生长，为弗氏链霉菌的生长和产孢营造最佳环境，促进菌丝体快速繁殖及提高孢子产生量。本发明提供的弗氏链霉菌产孢的发酵培养基适于弗氏链霉菌的生长，每克发酵原料可产生7.5*10⁹以上个孢子；制备的孢子粉萌发率可达95％。

2、本发明采用液体-固体联合发酵培养工艺制备弗氏链霉菌菌剂，与传统的固体发酵方式相比，菌种增殖的产孢量更高，发酵周期更短。该方法所提供的液体发酵液碳氮比搭配合理，促进孢子悬液接入液体培养基后快速萌发，24-48小时内即可产生大量菌丝体，进入对数生长期，不仅极大地缩短了发酵周期，还减少了染菌几率。

3、本发明采用磷尾矿粉与弗氏链霉菌复配制备农用微生物菌剂，利用微生物的作用活化磷尾矿粉中的矿质元素，提高菌剂的养分有效性，既增加了农用微生物菌剂的肥效，也实现了对磷资源的综合利用。

4、将微生物制成微生物肥料是农业生产上利用微生物的主要途径之一。在农业生产中，多以褐煤等含有微生物有机碳、氮营养源的物质作为固相载体，与菌剂复配生产农用微生物菌剂，作为微生物肥料。除褐煤外，本发明还将弗氏链霉菌的孢子粉与以磷尾矿粉为主要成分的菌剂固相载体复配，制备农用微生物菌剂。

磷尾矿粉来自工业选矿后的废矿粉，我国80％的磷矿为中低品位磷矿，难以满足湿法磷酸对原料矿石质量的高要求，每年因此产生的磷尾矿达到700万吨以上。而磷尾矿因无经济利用价值，被大量废弃，不仅占用大面积的土地资源，消耗高昂的堆场建设和维护费用，还产生巨大的环境淋溶风险。近几年虽然有一些磷尾矿综合利用的技术出现，但未从根本上解决磷矿选矿尾矿的利用问题。因此面对当今磷资源日渐匮乏的现状，此发明对实现磷尾矿作为二次资源的综合利用具有重大意义。

附图说明

图1是本发明制备的农用弗氏链霉菌微生物菌剂图。

具体实施方式

下面通过实施例并结合附图对本发明做进一步说明，但不限于此。

为使本发明更加清楚明白，以下结合实例对本发明进行详细说明，但是本发明可以由权利要求限定和覆盖的多种不同方式实施。

以下实施例和对比例中所用原料和设备均为市售，其中各类培养基均按常规方法配置。以下过程中接种均在无菌操作台上完成；液体发酵在数显恒温震荡培养箱上完成；灭菌处理在立式高压灭菌锅上完成；固体发酵在2m³的曲池内完成；菌剂复配过程采用不锈钢粉剂搅拌机完成。接种菌种为弗氏链霉菌，菌种保藏编号为CGMCC No.11963。

农用微生物菌剂活菌数、杂菌率检测方法：培养基为改良高氏一号培养基，1000ml培养基含可溶性淀粉20g、KNO₃ 1g、K₂HPO₄ 0.5g、MgSO₄·7H₂O 0.5g、NaCl 0.5g、FeSO₄·7H₂O0.01g，琼脂20g，pH值7.2-7.5，120℃高压灭菌30分钟冷却至50-55℃，每300ml培养基中加入3％重铬酸钾1ml，混匀，倾入无菌平皿。将制备好的农用微生物菌剂按照GB2087-2006方法进行梯度稀释后，取10^-7稀释度涂布平板，培养3-5天后计数。

实施例1：

弗氏链霉菌固体培养基的制备方法：

(A)以重量计，称取10份玉米粉、10份豆粕粉、18份秸秆粉、30份草炭土、30份磷尾矿和2份碳酸钙，其中秸秆粉的粒径为-40目，草炭土的粒径为-40目。将各物质混合均匀；

(B)加入45份蔗糖-硫酸铵营养液，用不锈钢搅拌系统充分混合均匀，并在115℃加1.2kg/cm²压力灭菌40分钟，得到固体培养基。所述蔗糖-硫酸铵营养液的组成以重量份计包括：1份蔗糖、1份硫酸铵、0.6份磷酸二氢钾和92份水。

弗氏链霉菌孢子的发酵方法：

1)菌种斜面孢子转接至茄瓶斜面，30℃条件下培养6天，斜面加入适量无菌水，孢子在无菌水内均匀分散，没有团聚，制成孢子悬液；

2)液体发酵：将孢子悬液接种到液体发酵培养基中，所述液体发酵培养基的成分以重量比计算，包括2％的豆粕粉和0.5％的葡萄糖悬液，其余为水。接种量为液体发酵培养基体积的6％，在温度30℃，振荡频率180r/分钟的条件下，装恒温振荡摇床培养24小时进行液体发酵。至液体发酵中菌体生长进入弗氏链霉菌对数生长期，即闻到菌液有一股特殊抗生素味道时，得到液体发酵种子液；

3)固体发酵：将液体发酵种子液接种所得固体培养基中，液体发酵种子液的接种量为弗氏链霉菌固体培养基质量的10％，在30℃下培养4天。在此过程中通过无菌取样观察培养基质表面是否出现白色孢子，在出现孢子之前，控制固体培养基的水分含量为45～55％，待弗氏链霉菌固体培养基表面出现孢子后，将固体培养基的水分含量降低至35％以下。固体发酵结束后，得到固体发酵培养基。

农用弗氏链霉菌微生物菌剂的制备：

固体发酵结束后，按照孢子粉(w)：褐煤：(w)磷尾矿粉(w)为1:2:4的比例称量好各组分，使用不锈钢搅拌系统充分混合均匀，得到弗氏链霉菌农用微生物菌剂粉剂产品。

实施例2：

弗氏链霉菌固体培养基的制备方法：

(A)以重量计，称取7份玉米粉、15份豆粕粉、20份秸秆粉、20份草炭土、35份磷尾矿和3份碳酸钙，其中草炭土的粒径为-40目，玉米秸秆粉的粒径为-30目。将各物质混合均匀；

(B)加入43份蔗糖-硫酸铵营养液，用不锈钢搅拌系统进行充分混合均匀，并在122℃加1.5kg/cm²压力20分钟，得到固体培养基。所述蔗糖-硫酸铵营养液的组成以重量份计包括：5份蔗糖、3份硫酸铵、1份磷酸二氢钾和85份水。

弗氏链霉菌孢子的发酵方法：

同实施例1，不同之处在于，孢子悬液接种到液体发酵培养基后，在温度28℃，振荡频率220r/分条件下，装恒温振荡摇床培养36小时；所述液体发酵种子液的接种量为弗氏链霉菌固体培养基质量的15％；所述液体发酵种子液接种到弗氏链霉菌固体培养基后，在30℃下培养6天。

弗氏链霉菌农用微生物菌剂的制备：

固体发酵结束后，按照孢子粉(w)：褐煤(w)：磷尾矿粉(w)为1:1.5:3的比例称量好各组分，使用不锈钢搅拌系统充分混合均匀，得到弗氏链霉菌农用微生物菌剂粉剂产品。

实施例3：

弗氏链霉菌固体培养基的制备方法：

(A)以重量计，称取5份玉米粉、8份豆粕粉、25份秸秆粉、25份草炭土、40份磷尾矿和2份碳酸钙；其中草炭土的粒径为-40目，玉米秸秆粉的粒径为-50目。将各物质混合均匀；

(B)加入48份蔗糖-硫酸铵营养液，用不锈钢搅拌系统进行充分混合均匀，并在120℃加1.3kg/cm²压力30分钟，得到固体培养基。所述蔗糖-硫酸铵营养液的组成以重量份计包括：7份蔗糖、2份硫酸铵、0.8份磷酸二氢钾和89份水。

弗氏链霉菌孢子的发酵方法：

同实施例1，不同之处在于，孢子悬液接种到液体发酵培养基后，在温度30℃，振荡频率200r/分条件下，装恒温振荡摇床培养30小时；液体发酵种子液的接种量为弗氏链霉菌固体培养基质量的12％；所述发酵好的液体培养基接种到弗氏链霉菌固体培养基后，在30℃下培养5天。

弗氏链霉菌农用微生物菌剂的制备：

固体发酵结束后，按照孢子粉(w)：褐煤(w)：磷尾矿粉(w)为1:1:2的比例称量好各组分，使用不锈钢搅拌系统充分混合均匀，得到弗氏链霉菌农用微生物菌剂粉剂产品。

实施例4：

弗氏链霉菌固体培养基的制备方法同实施例1；

弗氏链霉菌孢子的发酵方法：同实施例1，不同之处在于，孢子悬液接种到液体发酵培养基后，在温度32℃，振荡频率150r/分钟条件下，装恒温振荡摇床培养34小时。

弗氏链霉菌农用微生物菌剂的制备：同实施例1。

实施例5：

弗氏链霉菌固体培养基的制备方法同实施例1；

弗氏链霉菌孢子的发酵方法：同实施例1，不同之处在于，固体发酵时，将液体发酵种子液接种到所得弗氏链霉菌固体培养基后，弗氏链霉菌固体培养基的发酵条件为在28℃下培养5天。

实施例6：

弗氏链霉菌固体培养基的制备方法同实施例1；

弗氏链霉菌孢子的发酵方法：同实施例1，不同之处在于，固体发酵时，将液体发酵种子液接种到所得弗氏链霉菌固体培养基后，弗氏链霉菌固体培养基的发酵条件为在28℃下培养6天。

实施例7：

弗氏链霉菌固体培养基的制备方法同实施例1；

弗氏链霉菌孢子的发酵方法：同实施例1，不同之处在于，固体发酵时，将液体发酵种子液接种到所得弗氏链霉菌固体培养基后，弗氏链霉菌固体培养基的发酵条件为在35℃下培养3天。

实施例8：

弗氏链霉菌固体培养基的制备方法同实施例1；

弗氏链霉菌孢子的发酵方法：同实施例1，不同之处在于，制备孢子悬液时，于茄瓶斜面接种，28℃下恒温静置培养10天。

实施例9：

弗氏链霉菌固体培养基的制备方法同实施例1；

弗氏链霉菌孢子的发酵方法：同实施例1，不同之处在于，制备孢子悬液时，于茄瓶斜面接种，32℃下恒温静置培养6天。

对比例1

与实施例1-7的区别在于，弗氏链霉菌固体培养基组分用麸皮100份、微量元素营养液15份、磷酸氢二钾0.3份、氯化钠0.25份、硝酸钾0.1份、碳酸钙0.8份，自然pH值。液体种子用高氏培养基，液体菌种龄84h，接种量10％，发酵温度30℃，料水比10：6。

固体发酵结束后以空气作为干燥介质在50℃下干燥固体培养基，得到孢子粉。

对比例2

与实施例1-7的区别在于，弗氏链霉菌固体培养基组分用40重量份的玉米粉、10重量份的米糠、50重量份的沙土，其中沙土为由重量比为4:1的细土和沙子组成。细土的粒径为-80目，沙子的粒径为-60目。混合均匀各物质；加入30重量份的高氏一号培养液，用稀硫酸或石灰水调节pH值至7，并在130℃下施加2.5kg/cm²压力70分钟，得到固体培养基。

实验例

表1实施例1-7和对比例1-2菌粉中产孢量、杂菌含量、固体发酵周期表

由表1可见，实施例1-7的产孢量比对照提高27～89％。对比例1-2中杂菌率是实施例1-7的1.4～7倍，本发明大大降低了杂菌含量，提高菌剂质量和使用效果。

采用本发明提供的弗氏链霉菌固体培养基、培养方法能有效抑制培养过程中杂菌的生长，同时还能提高孢子粉中的孢子数量，而且缩短了发酵周期，提高了生产效率。此外还充分利用了磷尾矿资源，通过微生物作用，制备一种新型的富含磷及多种矿物元素的农用微生物菌剂，符合国家大力发展循环经济的需要，实现二者的综合利用，为农业生产提供有利条件。

Claims

1.一种弗氏链霉菌固体培养基，其特征在于，以重量份计，包括：3～10份玉米粉、3～18份豆粕粉、18～45份秸秆粉、10～30份草炭土、20～50份磷尾矿、1～10份碳酸钙、40～50份营养液；

以重量份计，所述营养液包括1～10份的蔗糖、1～5份的硫酸铵、0.1～1份磷酸二氢钾、85～92份水。

2.根据权利要求1所述的弗氏链霉菌固体培养基，其特征在于，所述秸秆粉的粒径细度为30-50目；所述草炭土细度为40目；所述磷尾矿粉颗粒细度在80目以下。

3.根据权利要求2所述的弗氏链霉菌固体培养基，其特征在于，培养基以重量份计，包括：5～10份的玉米粉、8～10份的豆粕粉、18～25份的秸秆粉、20～30份的草炭土、30～40份的磷尾矿、2～3份的碳酸钙和43～48份蔗糖-硫酸铵营养液。

4.根据权利要求3所述的弗氏链霉菌固体培养基，其特征在于，培养基包括以下重量份计的原料：10份玉米粉、10份豆粕粉、18份秸秆粉、30份草炭土、30份磷尾矿、2份碳酸钙和45份蔗糖-硫酸铵营养液；

或，培养基包括以下重量份计的原料：7份玉米粉、15份豆粕粉、20份秸秆粉、20份草炭土、35份磷尾矿、3份碳酸钙和43份蔗糖-硫酸铵营养液；

或，培养基包括以下重量份计的原料：5份玉米粉、8份豆粕粉、25份秸秆粉、25份草炭土、40份磷尾矿、2份碳酸钙和48份蔗糖-硫酸铵营养液。

5.一种如权利要求1-4任意一项权利要求所述弗氏链霉菌固体培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(B)在上述混合物中加入营养液，机械搅拌混合均匀，自然pH，经灭菌处理，得到弗氏链霉菌固体培养基。

6.一种如权利要求5所述弗氏链霉菌固体培养基的制备方法，其特征在于，步骤(B)中，所述灭菌处理条件为115-122℃下施加1.0-2.0kg/cm²压力20～40分钟。

7.一种利用权利要求1-4任意一项权利要求所述弗氏链霉菌固体培养基进行弗氏链霉菌孢子的固体发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)孢子悬液制备：从菌种斜面挑取孢子接种茄瓶斜面，培养后加入无菌水洗脱制备孢子悬液；

2)液体发酵：将孢子悬液接种到液体发酵培养基中进行液体发酵，至所述液体发酵培养基中菌丝体生长进入所述弗氏链霉菌的对数生长期，得到液体发酵种子液；所述液体发酵过程中，以步骤1)制备的孢子悬液作为接种菌液，接种量为液体发酵培养基体积的3-6％；所述液体发酵培养基的成分以重量比计算，包括2％的豆粕粉和0.5％的葡萄糖悬液，其余为水；

3)固体发酵：将所述液体发酵种子液接种到弗氏链霉菌固体培养基中，进行固体发酵，得到固体发酵培养基。

8.根据权利要求7所述的弗氏链霉菌孢子的固体发酵方法，其特征在于，步骤1)中，于茄瓶斜面接种，28～32℃下恒温静置培养6～10天，用灭菌蒸馏水洗脱。

9.根据权利要求7所述的弗氏链霉菌孢子的固体发酵方法，其特征在于，步骤2)中，所述液体发酵过程中，发酵条件为温度28～32℃，振荡频率150～220r/分钟，恒温振荡培养24～36小时。

10.根据权利要求9所述的弗氏链霉菌孢子的固体发酵方法，其特征在于，步骤2)中，所述液体发酵的条件为温度30～32℃，振荡频率180～200r/分钟。

11.根据权利要求7所述的弗氏链霉菌孢子的固体发酵方法，其特征在于，步骤3)中，所述弗氏链霉菌固体培养基的发酵条件为在28～35℃下培养3～6天。

12.根据权利要求11所述的弗氏链霉菌孢子的固体发酵方法，其特征在于，步骤3)中，所述弗氏链霉菌固体培养基的发酵条件为在30～34℃下培养4～5天。

13.根据权利要求7所述的弗氏链霉菌孢子的固体发酵方法，其特征在于，

步骤3)中，所述弗氏链霉菌固体培养基的发酵过程包括发酵初期和产孢期；发酵初期弗氏链霉菌固体培养基的水分含量为40～60％，进入产孢期后所述弗氏链霉菌固体培养基的水分含量小于35％；液体发酵种子液的接种量为所述弗氏链霉菌固体培养基质量的10～15％。

14.一种农用弗氏链霉菌菌剂的制备方法，其特征在于，根据权利要求7所述的弗氏链霉菌孢子的固体发酵方法，固体发酵结束后，将固体发酵产物孢子粉与褐煤以及磷尾矿粉复配得到农用弗氏链霉菌菌剂粉剂产品；

所述农用弗氏链霉菌菌剂的制备过程中，固体发酵产物与褐煤以及磷尾矿粉的复配比例为20～40：30～60：60～80，以重量份计比。