CN109749961B - 一种修复大蒜重茬土壤的微生物菌剂及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种修复大蒜重茬土壤的微生物菌剂及其制备方法与应用。本发明中的修复大蒜重茬土壤的微生物菌剂，组分如下，均为重量份：弗氏链霉菌XFS孢子混合物15～35份、蚯蚓肽‑草炭土混合物15～25份、蚯蚓粪20～30份、硅藻土15～25份、谷糠12～20份、海藻酸钠5～12份、黄腐酸钾3～10份，微生物菌剂的有效活菌数为12‑45亿/g，蚯蚓活性肽及氨基酸含量为2.5‑5wt％，有机质含量为40‑60wt％。该微生物菌剂可用于修复大蒜重茬土壤，此外还可应用于蔬菜、茄果、瓜类、果树等作物，施用方法采用基肥或追肥的方式，也可与有机肥、复合肥、有机无机复混肥复配使用，每亩施用量10～100Kg。

Description

一种修复大蒜重茬土壤的微生物菌剂及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种修复大蒜重茬土壤的微生物菌剂及其制备方法与应用，属于肥料技术领域。

背景技术

由于长年连作，大蒜病害发生面积呈逐年上升趋势，目前已达1.6万多公顷，根据多年对大蒜连作病害的调查分析，大蒜连续种植15年以上的地块发生较重。大蒜连作障碍并非单一病害，而是一系列生理性病害及侵染性病害的综合表现。大蒜重茬病广义的讲包括根腐病、细菌软腐病、白腐病、菌核病、黄化等病害，这些病主要在2月中下旬开始爆发，4月末结束，以后随着气温升高，免疫力强的植株又逐步恢复生长，但感病重的植株无法恢复生长，给产量造成一定程度的损失，其症状表现为叶片失绿变黄、干枯、死亡；根系发育不良，根盘变褐色腐烂，严重的根系死亡；大蒜植株矮小、蒜薹细短、蒜头瘦小，严重的不能抽薹，一般蒜薹减产10％-40％，蒜头减产5％-30％。

由于大蒜多年的重茬种植，大蒜的病原微生物残留于土壤中或寄生在蒜叶、蒜根、蒜棵等大蒜残体内大量繁衍，数量逐年上升。连年重茬栽培，幼苗抵抗力弱，易于感病。如根结线虫在土壤中逐年成倍增加，破坏大蒜根系，影响大蒜的正常发育，使大蒜根腐病、菌核病逐年严重。大蒜在生长发育过程中，会产生一些对自身不利的有害物质，并通过根系分泌物和残茬分解物积累于土壤中。随着大蒜连作年限的增加，这些有害物质在大蒜田土壤中积累，达到一定程度后，就会抑制大蒜的正常生长，从而造成大蒜生长势变差、抗性下降、产量降低。过量施用化肥，导致土壤含盐量不断增加，加剧土壤盐渍化。土壤盐分积累，造成土壤溶液浓度增加，土壤的渗透势加大，使土壤板结，导致土壤结构破坏，透气性变差，大蒜根系的吸水吸肥能力减弱，影响大蒜的生长。

重茬病最有效的防治办法就是和非葱、蒜、韭菜类实行3年以上轮作。但是在很多大蒜种植区，如山东金乡、兰陵等地，大蒜为主要经济作物，轮作会给蒜农收益带来一定影响。因此需要从土壤和肥料等方面入手去解决大蒜重茬问题，一般通过增施有机肥、含生物有机肥、化学药剂拌种等方法来缓解重茬病害，目前市场上的此类产品鱼龙混杂，有机质、菌种、农药质量都难以保证，还有可能加重病害发生，带来一系列食品安全问题。土壤问题是近年来重茬问题的关键所在，想要减少病虫害，提高产量和品质，有针对性地改土是最基础的要求，是以后一切管理改进的前提。

中国专利文献CN104016807A公开了一种大蒜专用有机微生物菌肥，还涉及该大蒜专用有机微生物菌肥的生产方法。大蒜专用复合有机微生物菌肥包括下述的组分：糠醛渣、菌糠、复合微生物菌剂、碳酸氢铵、过磷酸钙、氯化钾、硫酸锌、草木灰、硫酸钾、畜粪、腐植酸钾、稻壳粉、菜籽饼。制备得到的大蒜专用有机微生物菌肥含有大量大蒜生长所需的营养成分，各种微量元素及氨基酸，具有高效、增效、持久、改良土壤、培肥地力、抗病等功效，另外，在有机质中添加土壤益生菌菌群，可使营养成分更好地被吸收利用，并持续修复土壤微生态环境。通过试验，该发明的大蒜专用有机微生物菌肥，可有效提高大蒜产量20-30％。但是该发明中复合微生物菌剂为芽孢杆菌和酵母菌，该篇专利中的有机微生物菌肥，所使用的原料中糠醛渣、过磷酸钙等为偏酸性，草木灰等偏碱性，生产过程涉及原料的酸碱反应，对微生物菌种的存活不利，另外，产品使用碳酸氢铵、过磷酸钙、氯化钾等无机盐类，成本偏高，且不适用于有机农业种植。

中国专利文献CN105294272A公开了一种适用于大蒜的复合微生物菌肥，由下列重量份组分制备而成：糠醛渣36.24份，菌糠10.36份，复合菌剂3.2份，氯化钾5.28份，硫酸锌1.2份，火土灰4.25份，硫酸钾4.28份，畜类粪便6.68份，禽类粪便5.26份，有机质5.2份，腐植酸4.18份，稻壳粉7.36份，豆粕粉6.51份。该发明适用于大蒜，并且可显著增加土壤肥力，提高大蒜产量和品质。该发明同专利CN104016807A中所用糠醛渣为酸性，火土灰为碱性，生产时易导致酸碱反应，不利于微生物存活，另外所用的复合菌剂未指明所用菌种及有效活菌数，且带入部分无机养分，不利于有机种植。

中国专利文献CN103074402A公开了一种弗氏链霉菌发酵生产泰乐菌素的培养基及发酵方法，涉及一种弗氏链霉菌发酵生产泰乐菌素的培养基、发酵方法及利用其生产泰乐菌素的方法，其特征在于上述一级种子培养基含有花生饼粉、玉米油，二级种子培养基和发酵培养基中均含有混合鱼粉、花生饼粉和玉米油。该发明通过采用玉米油替代豆油；混合鱼粉和花生饼粉代替鱼粉，优化其培养基配方。中国专利文献CN103484514A公开了一种弗氏链霉菌发酵生产泰乐菌素的培养基及发酵方法，涉及一种弗氏链霉菌发酵生产泰乐菌素的培养基和发酵方法，其摇瓶种子培养基、一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基中均含有啤酒酵母干渣和蚯蚓粉。现有技术通过优化弗氏链霉菌的培养基配方，从而解决了原辅料的成本问题，并且最大限度的降低原辅料来源不受环境影响，保证其供应充足，实现泰乐菌素稳定、高效的生产。同时利用该培养基可提高发酵单位、缩短发酵周期、提高泰乐菌素A组分。该发明所用的弗氏链霉菌为液体发酵泰乐菌素产生菌种，应用的为次生代谢产物，不适于菌剂生产。

发明内容：

针对现有技术的不足，本发明提供一种修复大蒜重茬土壤的微生物菌剂及其制备方法与应用。

发明概述：

本发明的修复大蒜重茬土壤的微生物菌剂以具有防病功能的弗氏链霉菌为生产菌株，通过固体发酵培养弗氏链霉菌获得孢子混合物，与蚯蚓肽、蚯蚓粪、硅藻土、草炭土、谷糠、海藻酸钠、黄腐酸钾复配而成，包括功能菌、助剂及增效成分；所述功能菌为弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)XFS，所述增效成分为蚯蚓活性肽、蚯蚓粪、黄腐酸钾、海藻酸钠，所述助剂为硅藻土、谷糠、草炭土。

该菌剂中含大量高活性弗氏链霉菌孢子、30多种活性肽、腐植酸、多糖、植物营养因子、有机质、氮、磷、钾等，养分含量丰富，菌体活性高，货架期达到2年，可应用于修复大蒜重茬土壤，对大蒜区土壤酸化、板结、重茬具有良好的改良效果，对大蒜根腐病、软腐病等都具有很好的防治效果，且能有效疏松土壤，降低土壤酸化、板结程度。

本发明的技术方案如下：

一株弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)XFS，2016年1月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCC No.11963。

一种修复大蒜重茬土壤的微生物菌剂，原料重量份组成如下：

弗氏链霉菌XFS孢子混合物15～35份、蚯蚓肽-草炭土混合物15～25份、蚯蚓粪20～30份、硅藻土15～25份、谷糠12～20份、海藻酸钠5～12份、黄腐酸钾3～10份。

根据本发明优选的，所述的微生物菌剂中，有效活菌数为12-45亿/g，蚯蚓活性肽及氨基酸含量为2.5-5wt％，有机质含量为40-60wt％。

根据本发明优选的，所述弗氏链霉菌XFS孢子混合物是按以下方法制备的：

以弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)XFS为发酵菌种，经斜面接种、种子液体发酵制得弗氏链霉菌XFS种子液，然后将弗氏链霉菌XFS种子液接种于固体发酵培养基中，于28-32℃条件下固体发酵72-120小时，烘干即得。

根据本发明优选的，所述弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)XFS，2016年1月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCC No.11963。

根据本发明优选的，所述蚯蚓肽为赤子爱胜蚯蚓降解得到的蛋白混合物。

上述一种修复大蒜重茬土壤的微生物菌剂的制备方法，步骤如下：

(1)弗氏链霉菌XFS种子液制备

A、孢子悬液制备：茄瓶斜面接种，30℃恒温静置培养6-10天，用灭菌蒸馏水洗脱制备孢子悬液；

B、种子液体发酵：将步骤(1)A中的孢子悬液接种到200mL豆粕粉培养基中进行液体发酵，30℃，150-220rpm恒温振荡培养24-36小时，即发酵液中菌丝体生长进入对数生长期，即得弗氏链霉菌XFS种子液；

(2)将步骤(1)制备的弗氏链霉菌XFS种子液按体积比1-10％的接种量接种于固体发酵培养基中，混合均匀，于28-32℃条件下固体发酵72-120小时，发酵结束后得到弗氏链霉菌XFS孢子混合物；

(3)将步骤(2)中的弗氏链霉菌XFS孢子混合物在40-60℃烘干至水分含量小于等于15wt％，含有孢子数80-130亿/g；

(4)蚯蚓肽-草炭土混合物的制备

A、将鲜活蚯蚓清洗、沥干，加入1-2倍重量的水，用胶体磨匀浆1-2分钟后得到蚯蚓浆；

B、将步骤(4)A中的蚯蚓浆置于玻璃容器内用保鲜膜密封，于45℃恒温培养箱预处理3-5h得处理液；

C、将步骤(4)B中的处理液加入1mol/L盐酸调整pH至5.0-6.0，再加入蛋白酶，蛋白酶的加量为处理液的0.1-0.2wt％，置于55-60℃恒温培养箱酶解15-20h，得到蚯蚓肽溶液；

D、将步骤(4)C中的蚯蚓肽溶液用等重量份的草炭土吸附后得到蚯蚓肽-草炭土混合物；

(5)将步骤(3)烘干后的弗氏链霉菌XFS孢子混合物、步骤(4)得到的蚯蚓肽-草炭土混合物与蚯蚓粪、硅藻土、谷糠、海藻酸钠、黄腐酸钾按照比例进行复配，搅拌均匀后粉碎过5-20目筛，即得修复大蒜重茬土壤的微生物菌剂。

根据本发明优选的，步骤(1)A中所述的茄瓶斜面为高氏一号固体培养基，培养基组分及重量百分比如下：可溶性淀粉2％，KNO₃ 0.1％，K₂HPO₄ 0.05％，MgSO₄·7H₂O 0.05％，NaCl0.05％，FeSO₄·7H₂O 0.001％，琼脂粉2％，溶剂为水，pH为7.4-7.6。

根据本发明优选的，步骤(1)B中所述的豆粕粉培养基的组分及重量百分比如下：豆粕粉2％，葡萄糖0.5％，溶剂为水。

根据本发明优选的，步骤(2)中所述的固体发酵培养基，按照重量份，组分如下：

玉米粉10份、豆粕粉5份、秸秆粉28.5份、草炭土15份、磷尾矿39份和碳酸钙2.5份，混合均匀，加入蔗糖、硫酸铵营养液，调整至水分含量为60-70wt％，于1.0-2.0kg/cm²压力、121℃条件下灭菌30min，冷却备用。

进一步优选的，所述的蔗糖、硫酸铵营养液的组分及重量百分比如下：蔗糖1％，硫酸铵3％，溶剂为水。

进一步优选的，所述草炭土的粒径为30-40目，有机质含量≥60wt％。

根据本发明优选的，步骤(2)中所述固体发酵包括发酵初期和产孢期，其中发酵初期固体发酵培养基的水分含量为40-60wt％，产孢期固体发酵培养基的水分含量小于35wt％。

根据本法明优选的，步骤(4)A中所述蚯蚓为赤子爱胜蚯蚓。

根据本发明优选的，步骤(4)C中所述蛋白酶的酶活为40000U/g。

上述微生物菌剂在修复大蒜重茬土壤中的应用，可以针对大蒜种植区大量施用化肥农药和连年重茬种植造成土壤板结硬化、毒素积累过多、病虫危害尤其是重茬病害、土壤微生物菌群失衡、土传病害愈加严重难治等现状，不仅可以应用于大蒜产区，还可应用于蔬菜、茄果、瓜类、果树等作物，施用方法采用基肥或追肥的方式，也可与有机肥、复合肥、有机无机复混肥复配使用，每亩施用量10～100Kg。

本发明制备方法中未详细限定的均按照现有技术，本发明制备方法pH条件中没有特别限定的均按pH自然即可。

本发明的优良效果如下：

1.本发明提供一株弗氏链霉菌XFS及高活性发酵孢子

本发明的弗氏链霉菌XFS为植物根际促生菌(PGPR)，较其他同类菌具有较强的定殖能力，弗氏链霉菌XFS能产生多种生物活性物质，例如蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、维生素(B12)、有机酸、抗生素等，是一株具有广泛实际用途的微生物资源。弗氏链霉菌XFS能够改善根际土壤微生态环境，保持优势菌种地位，占领有害菌的生存空间，菌株所产活性物质已用于马铃薯等作物，促进作物生长。此外，对镰刀菌等常见土传病原菌有良好的拮抗作用，有效缓解重茬病害，其产生的有机酸能够分解被固定的矿物元素，将无效磷转化为有效磷，提高土壤中磷的吸收利用效率，恢复生态平衡。本发明中的弗氏链霉菌XFS适用于固体发酵生产，作为农用微生物菌剂使用的是其休眠体孢子及代谢产物，兼具抗病、促生的效果。

本发明制备的菌剂含有大量高活性的弗氏链霉菌XFS孢子，产品每克含有12亿以上的高活性孢子，有效活菌数最高达45亿/g，其中由本发明首次提供的具有较强特异功能的弗氏链霉菌XFS孢子粉约占15-35％，液固双相发酵，得到的弗氏链霉菌XFS孢子成熟度高，抗逆性强，在作物根际定殖能力强，扩繁速度快，有效作用时间长。

2.本发明制备的菌剂具有缓解重茬病害、促进生长的功能

本发明提供的弗氏链霉菌XFS作为链霉菌属(Streptomyces)内的一个种类，在自然栽培条件下，其自身代谢产物可以有效地促进植物生长，可产生泰乐霉素、新霉素等有效活性成分，应用于果树、蔬菜等多种作物栽培中，对作物具有明显的促生、抗病作用。

蚯蚓水解产物中含17种氨基酸、活性酶，并且水解产物中含有抗病和促进生长等多种功能的活性多肽，蚯蚓体液含有广抗菌谱的抗菌物质，如抗菌肽--酸性四十肽，它是蚯蚓体液抗菌组分之一。本发明使用的蚯蚓粪中含有多种微生物，其中有两株拮抗球孢链霉菌和丁香苷链霉菌，对土传真菌植物病害有一定的控制作用，可以杀死土壤中的病毒、有害菌，分解对植物生长有抑制作用的物质。单独的蚯蚓粪可作为育苗或无土栽培的基质，不仅可使幼苗生长健壮、挺拔，而且可防治大蒜根腐病、立枯病、线虫病等多种病害。

3.本发明菌剂能够改良土壤，增产提质

本发明制备的菌剂由选育的弗氏链霉菌XFS与蚯蚓肽、蚯蚓粪、硅藻土、草炭土、谷糠、海藻酸钠、黄腐酸钾等复配而成，含有大量的生防菌株、30多种活性肽、腐植酸、多糖、植物营养因子、有机质、氮、磷、钾等，养分含量丰富，能够促进种子萌发、作物生长及根系发达。选用的蚯蚓粪具有较大孔隙的团粒结构，可改变土壤空气流通，加速微生物繁殖，有利于植物吸收养分，可增强保水、保肥性，防止土壤养分流失；能吸着盐基成分起交换作用，防止过量化肥的使用带来的危害，能分解土壤中的矿物质，供植物利用；与其它化学肥料混合使用，肥效长久；对植物、人、畜无害，还可以增强植物对病虫害抵抗力；抑制植物土传病害，改善作物品质，恢复农产品的自然风味。在大蒜区重茬土壤上应用，与不施菌剂相比能够减少病害发生36％以上，大田实验表明菌剂增产增收效果可达到10％以上。

4.本发明菌剂安全性高、货架期长

本发明制备的菌剂为纯生物制剂，对人体无害，不污染环境，可以缓解由于长期过量使用化肥带来的土壤盐渍化、酸化、碱化问题。菌剂中的弗氏链霉菌XFS为孢子状态，可以稳定的存在于菌剂产品中，货架期长，可达到2年以上。同时菌种施入土壤后定殖快、存活时间长，对提高根际土壤环境质量，减少重茬病害具有积极的作用。

5.本发明制备的菌剂工艺简单、生产周期短

本发明弗氏链霉菌XFS的发酵利用豆粕粉、草炭土等为原料进行固体发酵，无需精细化的无菌设备，只需配置蒸煮、种子、控温和通风设备即可，弗氏链霉菌接种固体发酵后整个发酵周期4-5天，在获得大量泰乐菌素等代谢产物的同时，还获得大量的弗氏链霉菌成熟孢子，再复配蚯蚓肽、蚯蚓粪、硅藻土、草炭土、谷糠、海藻酸钠、黄腐酸钾等助剂及增效成分，养分含量丰富，菌体活性高，而且配方中各组分协同增效，缺少任何一种组分，都不能达到预期效果。经过田间实验，取得了良好的效果。利用对两种作物进行的田间试验显示，与不施本发明菌剂的处理相比，本发明的菌剂在金乡重茬10年以上大蒜地块实验表明，蒜薹增产9.1-12.9％，蒜头增产10.9-16.07％，根腐病发生率可降低49％；在内蒙古马铃薯的增产率为12.6-24.3％，晚疫病发生率降低45％。

本发明修复大蒜重茬土壤的微生物菌剂可以作为基肥、追肥等使用，菌剂的使用量需根据病害严重程度、土壤状况、作物品种等因素进行确定。

附图说明

图1为弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)XFS的菌落形态；

图2为弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)XFS的显微镜照片，

其中：A为弗氏链霉菌XFS的菌丝形态，B为弗氏链霉菌XFS的孢子形态；

图3为弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)XFS的16S rDNA琼脂糖凝胶电泳图；

图4为根据16S rDNA序列获得的弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)XFS菌株的系统发育树图；

图5为弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)XFS对大蒜疫霉根腐病病菌的抑菌作用图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及有益效果更加清楚明白，下面以具体实施例来进一步清楚地解释本发明，但是不以任何方式构成对本发明的限制。下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法；下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为重量百分含量，下述实施例中的药品及原料，如无特别说明，均为普通市售产品；如无特殊说明，下述实施例中制备方法pH条件均按pH自然即可。

弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)XFS，2016年1月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCC No.11963。

蚯蚓肽为赤子爱胜蚯蚓降解得到的蛋白混合物。

草炭土购自哈尔滨泥炭基地生产，有机质含量70wt％，腐植酸含量45wt％。

硅藻土购自盛泰硅业。

谷糠为小米表皮，普通市购。

海藻酸钠购自青岛海之林公司，有效成分99％以上。

黄腐酸钾购自金正大生态工程集团股份有限公司。

蛋白酶购自Solarbio，酶活为40000U/g。

高氏一号液体培养基的组分及重量百分比如下：可溶性淀粉2％，KNO₃ 0.1％，K₂HPO₄0.05％，MgSO₄·7H₂O 0.05％，NaCl 0.05％，FeSO₄·7H₂O 0.001％，溶剂为水，pH为7.4-7.6；添加琼脂粉2％即为高氏一号固体培养基。

实施例1、弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)XFS的分离及鉴定

1、弗氏链霉菌XFS的分离

选择山东省兰陵县露天大蒜根际土壤样本，使用灭菌采样铲采集同一区域内生长情况良好的大蒜根际范围5～25cm深土壤，样品装于灭菌袋中，带回实验室后放于4℃冰箱保存。分离时称取10g土样放入装有无菌水和玻璃珠的三角瓶中，充分震荡30min，待土样均匀分散后，静置10min后，形成浓度为0.1g/mL的菌悬液，对此菌悬液进行稀释，依次得到浓度为10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6，10^-7g/mL的菌悬液。分别吸取各梯度稀释的土壤悬液各0.1mL，涂布于放线菌选择性培养平板上，30℃培养2～4d后，挑取单菌落纯化，作为待测菌株。

弗氏链霉菌的初筛：制备约1.5×10⁶个/mL的大蒜疫霉根腐病病菌孢子悬浮液，吸取2mL该孢子悬浮液涂布于高氏一号固体培养基平板中，预培养18h，用灭菌牙签均匀点接待测菌种于高氏一号固体培养基，并置于30℃的恒温培养箱中培养3d，观察有无抑菌圈。结合盆栽试验法进行筛选，从中筛选出一个对大蒜疫霉根腐病具有明显防治效果的菌株，定名为XFS。

菌株XFS的分类鉴定：

(1)形态特征鉴定

高氏一号固体培养基上，30℃，培养72h，形成圆形或近似圆形的白色菌落，菌落致密、干燥、不透明、菌丝难以挑取，当大量孢子覆盖于菌落表面时，就形成表面为白色粉末状的菌落，气生菌丝粉白色，基内菌丝浅黄色，无可溶性色素。菌落随培养时间延长逐渐增大，直径3～7mm表面粗糙，扁平，不规则。孢子丝柔曲，孢子卵圆形或椭圆形，如图1。另取培养72h后的菌落，适当稀释后涂布于载玻片，置于显微镜下观察，孢子呈椭圆形，如图2-B。挑取高氏一号液体培养基培养48h后的菌悬液涂布于载玻片，置于显微镜下观察，菌丝呈分枝丝状，菌丝直径约0.6μm，如图2-A。

(2)分子鉴定

PCR扩增菌株XFS的16S rDNA，扩增引物的核苷酸序列如下：

27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；

1429R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’；

经测序，菌株XFS的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示，全长为1487bp，琼脂糖凝胶电泳检测结果如图3，根据菌株XFS的16S rDNA序列获得的系统发育树如图4所示，经鉴定，菌株XFS为弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)。

弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)XFS，2016年01月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏号CGMCC No.11963。

实施例2、弗氏链霉菌XFS菌种的扩繁

上述弗氏链霉菌XFS的培养方法，步骤如下：

1)将弗氏链霉菌XFS接种于茄瓶斜面，茄瓶斜面为高氏一号固体培养基，温度为30℃静置培养6天，用灭菌蒸馏水洗脱制备孢子悬液；

2)将步骤1)制得的孢子悬液接种到200mL豆粕粉培养基中进行液体培养，孢子悬液的接种量为1只茄瓶孢子悬液，温度为30℃、摇床转速200rpm的条件下培养26h，即发酵液中菌丝体生长进入对数生长期，即得弗氏链霉菌XFS种子液；

所述豆粕粉培养基，每100毫升组分如下：

豆粕粉2g，葡萄糖0.5g，水定容至100mL；

3)将步骤2)制得的弗氏链霉菌XFS种子液按体积比9.0％的接种量接种于固体发酵培养基中，混合均匀，温度为29℃恒温静置培养，固体发酵培养96h，制得弗氏链霉菌XFS孢子混合物；

所述固体发酵培养基，每公斤组分如下：

玉米粉100g，豆粕粉50g，秸秆粉285g，草炭土150g，磷尾矿390g，碳酸钙25g，放入容器内混合均匀，加入1200mL蔗糖、硫酸铵营养液，调整至水分含量60％，于1.5kg/cm²压力、121℃条件下灭菌30min，得固体发酵培养基，冷却备用；

其中，蔗糖、硫酸铵营养液组分及重量百分比如下：蔗糖1％，硫酸铵3％，溶剂为水；

草炭土的粒径为40目。

实施例3、弗氏链霉菌XFS对大蒜疫霉根腐病病菌的抑制作用

1、在高氏一号培养基平板中央接种大蒜疫霉根腐病病菌菌块，在28℃预培养1d后，在距离中央1.5cm处接种弗氏链霉菌XFS，在28℃培养箱培养5d，观察抑菌带，抑菌情况如图5所示，实验重复三次，测量抑菌带平均宽度达15mm。

2、取500μL浓度为1.0×10⁷cfu/mL的大蒜疫霉根腐病病菌孢子悬浮液，分装至50mL离心管中，再向离心管中加入1g实施例2制备的弗氏链霉菌XFS孢子混合物，对照组加入等量的实施例2制备的固体发酵培养基，分别与大蒜疫霉根腐病病菌孢子悬浮液混匀后置于28℃恒温培养。每个实验重复3次，统计弗氏链霉菌XFS孢子在24h和48h对大蒜疫霉根腐病病菌分生孢子萌发的抑制率。

抑制率＝((对照组萌发率-实验组萌发率)/对照组萌发率)×100％

结果表明在24h时，弗氏链霉菌XFS孢子对大蒜疫霉根腐病病菌分生孢子萌发的抑制率是49.89％，在48h时，对大蒜疫霉根腐病病菌分生孢子萌发的抑制率是78.54％。

3、中国专利文献CN106399160A公开了一种酸性土壤活力修复菌剂，所述菌剂的有效成分为保藏编号为CGMCC No.5133的弗氏链霉菌CLIMAX-VSF和保藏编号为CGMCCNo.12499的地衣芽孢杆菌CLIMAX-VBL，该菌剂可有效改善和调理酸性土壤，显著改良作物根际土壤为生态环境。

采用上述实验方法检测保藏编号为CGMCC No.5133的弗氏链霉菌CLIMAX-VSF对大蒜疫霉根腐病病菌的抑制作用，结果显示，弗氏链霉菌CLIMAX-VSF抑菌带平均宽度为5mm；在24h时，弗氏链霉菌CLIMAX-VSF孢子对大蒜疫霉根腐病病菌分生孢子萌发的抑制率是18.65％，在48h时，对大蒜疫霉根腐病病菌分生孢子萌发的抑制率是37.32％。因此，与弗氏链霉菌CLIMAX-VSF相比，弗氏链霉菌XFS可有效抑制大蒜疫霉根腐病病菌，更适宜于修复大蒜重茬土壤。

实施例4、蚯蚓肽-草炭土混合物的制备

1)称取鲜活赤子爱胜蚯蚓，将其清洗、沥干，称取500g置于胶体磨中，再加入500mL蒸馏水，用胶体磨匀浆1.5分钟后得到蚯蚓浆；

2)将步骤1)制备的蚯蚓浆置于玻璃容器内用保鲜膜密封，于45℃恒温培养箱预处理3h，得到处理液；

3)将步骤2)制备的处理液加入1mol/L盐酸调整pH至5.5，再加入蛋白酶，蛋白酶的加量为处理液的0.15wt％，置于55℃恒温培养箱酶解18h，得到蚯蚓肽溶液；

4)将步骤3)制备的蚯蚓肽溶液用1kg的草炭土吸附后得到蚯蚓肽-草炭土混合物。

实施例5、修复大蒜重茬土壤的微生物菌剂的制备

修复大蒜重茬土壤的微生物菌剂按照如下步骤制备：

1)将实施例2制得的弗氏链霉菌XFS孢子混合物在45℃烘干至水分含量小于等于15wt％，进行孢子计数，得到孢子数为90亿/g；

2)用步骤1)烘干后的弗氏链霉菌XFS孢子混合物、实施例4制备的蚯蚓肽-草炭土混合物与蚯蚓粪、硅藻土、谷糠、海藻酸钠、黄腐酸钾按照比例进行复配，输送至混料机中，所有原料搅拌均匀，粉碎过5-20目筛后，即得到修复大蒜重茬土壤的微生物菌剂；其中各原料重量份分别为：弗氏链霉菌XFS孢子混合物20份，蚯蚓肽-草炭土混合物15份，蚯蚓粪20份，硅藻土15份，谷糠15份，海藻酸钠5份，黄腐酸钾10份。

修复大蒜重茬土壤的微生物菌剂菌种存活率测定：将步骤2)得到的微生物菌剂分装于密封袋中，室温存放；前三个月每隔20d取样测定一次活菌数，之后每隔30d取样测定一次，统计XFS菌株在菌剂中的存活率；

修复大蒜重茬土壤的微生物菌剂中弗氏链霉菌XFS活菌数的测定：制剂中初始的活菌数通过系列稀释涂板确定，使用高氏一号培养基；

制备的修复大蒜重茬土壤的微生物菌剂，在整个测定周期内，弗氏链霉菌XFS在前10个月内活菌数稳定不变；10个月后随着放置时间的增加，弗氏链霉菌XFS的存活率逐渐降低，在放置24个月时，弗氏链霉菌的存活率降至80％。

实施例6、修复大蒜重茬土壤的微生物菌剂对重茬大蒜应用效果的对比试验

(一)试验处理：

(1)微生物菌剂：实施例5制备的修复大蒜重茬土壤的微生物菌剂，播种时沟施入土；

(2)其他肥料产品对照：等量有机肥；

(3)空白对照：常规施肥；

(二)试验方法：本试验在山东省临沂市河东区一重茬10年、根腐病多发的大田内进行。该区域大蒜地块属于中性偏酸的黑土，重茬较严重的区域地势低洼，近三年来重茬大蒜存在根腐病等重茬病，所种大蒜品种为四六瓣。共设3个处理，每个处理10个重复，选择1个处理在常规施肥的基础上沟施实施例5所得的修复大蒜重茬土壤的微生物菌剂，按照亩用量20kg施用；同时以未用微生物菌剂的常规施肥和等量有机肥(临沂国丰，N-P-K≥5％)为对照处理。待次年4月份，空白对照充分发病后调查根腐病、软腐病等土传病害发病情况，计算防治效果，5-6月份收获时，测蒜薹、蒜头产量，结果见表1、表2。

其中，发病率＝(发病株数/处理总株数)×100％。

表1修复大蒜重茬土壤的微生物菌剂对大蒜病害防效的对比试验结果

表2修复大蒜重茬土壤的微生物菌剂对大蒜产量的对比试验结果

注：大蒜采收面积为0.86m²(0.4m×2.15m)。

结果表明，本发明微生物菌剂沟施后大大降低了大蒜的发病率，死棵、烂根、黄化等症状明显减轻，沟施微生物菌剂处理综合发病率为9.68％，不施微生物菌剂、有机肥处理发病率分别为49.63％、44.59％，说明修复大蒜重茬土壤的微生物菌剂对大蒜重茬病害具有很好的防治效果，有机肥对减少大蒜重茬病害、提高蒜薹、蒜头产量也有一定作用，但是效果不明显。使用本发明的菌剂大大提高了蒜薹、蒜头产量，其中蒜薹增产9.11，蒜头增产16.07％，大大提高了收益。

实施例7、修复重茬土壤的微生物菌剂对金乡重茬大蒜的应用效果对比试验

(一)试验处理：

(1)微生物菌剂：实施例5制备的修复大蒜重茬土壤的微生物菌剂，播种时沟施入土；

(2)其他肥料产品对照：等量有机肥；

(3)空白对照：习惯施肥；

(二)试验方法：2015年2-5月在山东省济宁市金乡县一重茬15年的大蒜地内进行，所种大蒜品种为杂交蒜。开始试验时整个地块近几年土传病害严重，为重度发生，土壤为潮土偏碱，保水保肥能力差，板结严重。农户用肥为习惯施肥。实验分三个小区进行，每小区四行，四次重复，随机区组排列。选择1个处理在习惯施肥的基础上沟施实施例5所得的修复大蒜重茬土壤的微生物菌剂，按照亩用量40kg施用；同时以未用微生物菌剂的习惯施肥和等量有机肥(临沂金粮丰，40kg/袋)为对照处理。待次年4月份，空白对照充分发病后调查根腐病、软腐病等土传病害发病情况，计算防治效果；5-6月份收获时，测蒜薹、蒜头产量，结果见表3、表4。

其中，发病率＝发病株数/处理总株数×100％

表3修复大蒜重茬土壤的微生物菌剂对大蒜病害防效的对比试验结果

表4修复大蒜重茬土壤的微生物菌剂对大蒜产量的对比试验结果

注：蒜薹采收面积为6.9m²(2.3m×3m)，蒜头采收面积为1.7m²(2.3m×0.75m)

结果表明，本发明微生物菌剂沟施后大大降低了大蒜的发病率，死棵、烂根、黄花等症状明显减轻，沟施微生物菌剂处理综合发病率为13.52％，不施微生物菌剂、有机肥处理发病率分别为62.68％、62.55％，说明修复大蒜重茬土壤的微生物菌剂对大蒜重茬病害具有很好的防治效果，大大降低了大蒜的发病率。有机肥在此重茬严重的地块对减少大蒜重茬病害基本没有效果。使用本发明的微生物菌剂大大提高了蒜薹、蒜头产量，其中蒜薹增产12.92％，蒜头增产10.9％，但是由于实验地块重茬较严重，在土壤修复、改良方面需要持续进行，所以需要连续使用才能体现出更明显的效果。

本发明菌剂能够高效拮抗大蒜重茬土壤病原菌，使土壤松软通透，增强土壤肥水渗透力，保水抗旱，增强根系活力从而提高植株抗病能力，有效缓解了大蒜重茬病害，修复重茬土壤。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 金正大生态工程集团股份有限公司

菏泽金正大生态工程有限公司

广东金正大生态工程有限公司

湖北沃夫特生态工程有限公司

安徽金正大生态工程有限公司

<120> 一种修复大蒜重茬土壤的微生物菌剂及其制备方法与应用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1487

<212> DNA

<213> 弗氏链霉菌（Streptomyces fradiae）

<400> 1

agtttgatca tggctcagga cgaacgctgg cggcgtgctt aacacatgca agtcgaacga 60

tgaagccctt cggggtggat tagtggcgaa cgggtgagta acacgtgggc aatctgccct 120

tcactctggg acaagccctg gaaacggggt ctaataccgg ataacactct ctctcgcatg 180

ggagagggtt gaaagctccg gcggtgaagg atgagcccgc ggcctatcag ctagttggtg 240

aggtagaagc tcaccaaggc gacgacgggt agccggcctg agagggcgac cggccacact 300

gggactgaga cacggcccag actcctacgg gaggcagcag tggggaatat tgcacaatgg 360

gcgaaagcct gatgcagcga cgccgcgtga gggatgacgg ccttcgggtt gtaaacctct 420

ttcagcaggg aagaagcgaa agtgacggta cctgcagaag aagcgccggc taactacgtg 480

ccagcagccg cggtaatacg tagggcgcaa gcgttgtccg gaattattgg gcgtaaagag 540

ctcgtaggcg gcttgtcacg tcggttgtga aagcccgggg cttaaccccg ggtctgcagt 600

cgatacgggc aggctagagt tcggtagggg agatcggaat tcctggtgta gcggtgaaat 660

gcgcagatat caggaggaac accggtggcg aaggcggatc tctgggccga tactgacgct 720

gaggagcgaa agcgtgggga gcgaacagga ttagataccc tggtagtcca cgccgtaaac 780

ggtgggaact aggtgtgggc gacattccac gtcgtccgtg ccgcagctaa cgcattaagt 840

tccccgcctg gggagtacgg ccgcaaggct aaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca 900

caagcggcgg agcatgtggc ttaattcgac gcaacgcgaa gaaccttacc aaggcttgac 960

atacaccgga aagcatcaga gatggtgccc cccttgtggt cggtgtacag gtggtgcatg 1020

gctgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaacccttg 1080

ttccgtgttg ccagcaagcc ccttcggggg tgttggggac tcacgggaga ccgccggggt 1140

caactcggag gaaggtgggg acgacgtcaa gtcatcatgc cccttatgtc ttgggctgca 1200

cacgtgctac aatggccggt acaatgagct gcgataccgc gaggtggagc gaatctcaaa 1260

aagccggtct cagttcggat tggggtctgc aactcgaccc catgaagtcg gagtcgctag 1320

taatcgcaga tcagcattgc tgcggtgaat acgttcccgg gcattgtaca caccgcccgt 1380

cacgtcacga aagtcggtaa cacccgaagc cggtggccca accccttgtg ggagggagct 1440

gtcgaaggtg ggactggcga ttgggacgaa gtcgtaacaa ggtaacc 1487

Claims (10)

1.一种修复大蒜重茬土壤的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂包括弗氏链霉菌（Streptomyces fradiae）XFS，于2016年1月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCC No.11963；所述微生物菌剂的原料重量份组成如下：

弗氏链霉菌XFS孢子混合物15~35份、蚯蚓肽-草炭土混合物15~25份、蚯蚓粪20~30份、硅藻土15~25份、谷糠12~20份、海藻酸钠5~12份、黄腐酸钾3~10份；

其中，弗氏链霉菌XFS孢子混合物是按以下方法制备的：

以弗氏链霉菌XFS为发酵菌种，经斜面接种、种子液体发酵制得弗氏链霉菌XFS种子液，然后将弗氏链霉菌XFS种子液接种于固体发酵培养基中，于28-32℃条件下固体发酵72-120小时，烘干即得；

所述蚯蚓肽-草炭土混合物按照以下方法制备得到：

A、将鲜活蚯蚓清洗、沥干，加入1-2倍重量的水，用胶体磨匀浆1-2分钟后得到蚯蚓浆；

B、将步骤A中的蚯蚓浆置于玻璃容器内用保鲜膜密封，于45℃恒温培养箱预处理3-5h得处理液；

C、将步骤B中的处理液加入1mol/L盐酸调整pH至5.0-6.0，再加入蛋白酶，蛋白酶的加量为处理液的0.1-0.2 wt%，置于55-60℃恒温培养箱酶解15-20h，得到蚯蚓肽溶液；

D、将步骤C中的蚯蚓肽溶液用等重量份的草炭土吸附后得到蚯蚓肽-草炭土混合物。

2.如权利要求1所述的微生物菌剂，其特征在于，所述蚯蚓肽为赤子爱胜蚯蚓降解得到的蛋白混合物。

3.权利要求1所述的一种修复大蒜重茬土壤的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，步骤如下：

（1）弗氏链霉菌XFS种子液制备

A、孢子悬液制备：茄瓶斜面接种，30℃恒温静置培养6-10天，用灭菌蒸馏水洗脱制备孢子悬液；

B、种子液体发酵：将步骤（1）A中的孢子悬液接种到200mL豆粕粉培养基中进行液体发酵，30℃，150-220rpm恒温振荡培养24-36小时，即发酵液中菌丝体生长进入对数生长期，即得弗氏链霉菌XFS种子液；

（2）将步骤（1）制备的弗氏链霉菌XFS种子液按体积比1-10%的接种量接种于固体发酵培养基中，混合均匀，于28-32℃条件下固体发酵72-120小时，发酵结束后得到弗氏链霉菌XFS孢子混合物；

（3）将步骤（2）中的弗氏链霉菌XFS孢子混合物在40-60℃烘干至水分含量小于等于15wt%，含有孢子数80-130亿/g；

（4）蚯蚓肽-草炭土混合物的制备

A、将鲜活蚯蚓清洗、沥干，加入1-2倍重量的水，用胶体磨匀浆1-2分钟后得到蚯蚓浆；

B、将步骤（4）A中的蚯蚓浆置于玻璃容器内用保鲜膜密封，于45℃恒温培养箱预处理3-5h得处理液；

C、将步骤（4）B中的处理液加入1mol/L盐酸调整pH至5.0-6.0，再加入蛋白酶，蛋白酶的加量为处理液的0.1-0.2 wt%，置于55-60℃恒温培养箱酶解15-20h，得到蚯蚓肽溶液；

D、将步骤（4）C中的蚯蚓肽溶液用等重量份的草炭土吸附后得到蚯蚓肽-草炭土混合物；

（5）将步骤（3）烘干后的弗氏链霉菌XFS孢子混合物、步骤（4）得到的蚯蚓肽-草炭土混合物与蚯蚓粪、硅藻土、谷糠、海藻酸钠、黄腐酸钾按照比例进行复配，搅拌均匀后粉碎过5-20目筛，即得修复大蒜重茬土壤的微生物菌剂。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）A中所述的茄瓶斜面为高氏一号固体培养基，培养基组分及重量百分比如下：可溶性淀粉2%，KNO₃ 0.1%，K₂HPO₄ 0.05%，MgSO₄·7H₂O 0.05%，NaCl 0.05%，FeSO₄·7H₂O 0.001%，琼脂粉2%，溶剂为水，pH为7.4-7.6。

5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）B中所述的豆粕粉培养基的组分及重量百分比如下：豆粕粉2%，葡萄糖0.5%，溶剂为水。

6.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述的固体发酵培养基，按照重量份，组分如下：

玉米粉10份、豆粕粉5份、秸秆粉28.5份、草炭土15份、磷尾矿39份和碳酸钙2.5份，混合均匀，加入蔗糖、硫酸铵营养液，调整至水分含量为60-70 wt%，于1.0-2.0kg/cm²压力、121℃条件下灭菌30min，冷却备用。

7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的蔗糖、硫酸铵营养液的组分及重量百分比如下：蔗糖1%，硫酸铵3%，溶剂为水；所述草炭土的粒径为30-40目，有机质含量≥60 wt%。

8.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述固体发酵包括发酵初期和产孢期，其中发酵初期固体发酵培养基的水分含量为40-60 wt%，产孢期固体发酵培养基的水分含量小于35 wt%。

9.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）中所述蚯蚓为赤子爱胜蚯蚓；所述蛋白酶的酶活为40000U/g。

10.权利要求1所述的微生物菌剂在修复大蒜重茬土壤中的应用。

Images