CN107502572B - 地衣芽孢杆菌在秸秆降解中的应用、包含该菌的微生物菌剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及地衣芽孢杆菌在秸秆降解中的应用、包含该菌的微生物菌剂及其应用，本发明能够高效降解秸秆，克服深秋低温情况下秸秆腐熟慢的问题。

Description

地衣芽孢杆菌在秸秆降解中的应用、包含该菌的微生物菌剂 及其应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体涉及一种地衣芽孢杆菌在秸秆降解中的应用、包含该菌的微生物菌剂及其应用。

背景技术

秸秆还田是当今世界上普遍应用的农田耕作措施，该方法在降低了秸秆焚烧所造成的大气污染的同时还起到了增加土壤肥力、增加农作物产量的作用。田间实践表明，秸秆还田能增加土壤有机质、改良土壤结构，使土壤疏松、孔隙度增加、容量减轻，促进微生物活力和作物根系的发育，一般可增产5%~10%。

然而，我国北方地区由于茬口短造成秸秆还田后腐熟不彻底，导致下茬作物缺苗断垄、病害加重等不良现象。因此，需要采取合理的秸秆还田措施，以保证起到良好的还田效果。在众多秸秆还田促腐措施中，应用效果优良的秸秆腐熟剂是最为有效的方法。

秸秆腐熟菌剂中含有能够降解秸秆的微生物，微生物在田间的生长及其产生的酶能够加速秸秆的降解，以此实现秸秆的快速腐解，从而缓解秸秆腐熟慢对下茬作物的不良影响。但是，我国北方深秋季节气温偏低，使用一般腐熟菌剂无法对秸秆进行快速和彻底腐熟，容易给农作物带来影响。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够高效降解秸秆的地衣芽孢杆菌菌剂，克服现有秸秆腐熟菌种存在降解速度慢、对深秋低温适应性差的问题。

本发明采用如下技术方案：

一种地衣芽孢杆菌在秸秆降解中的应用，所述地衣芽孢杆菌的保藏号为CGMCCNo.11235，其可在刚果红培养基上产生直径4cm以上的透明圈。

一种包含上述地衣芽孢杆菌的微生物菌剂，可以是固体微生物菌剂、液体微生物菌剂或复合微生物菌剂。每克（毫升）该微生物菌剂中所述地衣芽孢杆菌的活菌数为2×10⁸-1×10¹¹ cfu/g(mL)，优选为5×10⁸-5×10⁹ cfu/g(mL)。

固体微生物菌剂包括，所述地衣芽孢杆菌、碳酸钙或可溶性淀粉等载体和氮磷钾无机营养成分，所述氮磷钾无机营养成分（N+P₂O₅+K₂O）占菌剂总质量的质量分数为10-15%。

液体微生物菌剂包括，所述地衣芽孢杆菌和氮磷钾无机营养成分水溶液，所述液体微生物菌剂中氮磷钾无机营养成分（N+P₂O₅+K₂O）占菌剂总质量的质量分数为10-15%。

其中，所述氮磷钾无机营养成分包括重量比为5-8∶1-3∶1-3的N、P₂O₅和K₂O。

其中，所述地衣芽孢杆菌菌粉和地衣芽孢杆菌菌体为培养地衣芽孢杆菌后所得的发酵液经喷雾干燥或板框压滤得到。

具体方法为：采用玉米浆培养基进行保藏号为CGMCC No.11235的地衣芽孢杆菌的培养，培养温度28℃-30℃、培养时间48h以上，显微镜观察产芽孢后进行喷雾干燥或板框压滤。

复合微生物菌剂中，包括保藏号为CGMCC No.11235的地衣芽孢杆菌、里氏木霉、黑曲霉、简青霉，所述各菌菌数比例为3-5∶1-2∶1-2∶1-2。所述里氏木霉、黑曲霉、简青霉均为市售微生物制剂产品。

所述的微生物菌剂在秸秆降解中的应用。

具体的，所述应用包括田间应用和秸秆堆垛发酵应用，所述微生物菌剂与秸秆的重量比为1：（500-2000），温度为18℃-30℃。

田间应用时，亩用量为1-5公斤，土壤的含水量为40-70 %。

秸秆堆垛发酵应用时，秸秆堆垛可以采用条式堆垛，底部宽度2m、堆高1.5 m以上、堆长3m以上；秸秆的含水量为50-70%。

本发明的有益效果在于：

1、保藏号为CGMCC No.11235的地衣芽孢杆菌，可以分泌纤维素酶类、促进秸秆的快速腐熟，从而达到改良土壤、促进植物生长的作用。该菌株在秸秆培养基中18℃、7天后，培养7d和15d的秸秆降解率分别为16.2%和31.8%。秸秆培养基的配制方法如下：采用100mL三角瓶，在瓶内装入粉碎玉米秸秆2 g、营养液30 mL（营养液配方：尿素 3.0 g、(NH₄)₂SO₄ 6.0 g、蛋白胨 3.0 g、CaCl₂ 0.1 g、MgSO₄·7H₂O 0.5 g、K₂HPO₄ 1.0 g、NaCl 0.1 g、FeSO₄·7H₂O 0.05 g、MnSO₄·7H₂O 0.016 g、ZnSO₄·7H₂O 0.014 g、CoCl₂· 6H₂O 0.037g、蒸馏水 1000 mL，自然 pH）。

2、含CGMCC No.11235的地衣芽孢杆菌的液体微生物菌剂、固体微生物菌剂及复合微生物菌剂，在室内条件下进行秸秆腐熟，7天的秸秆失重率大于14%、28天秸秆失重率大于55%，加快了秸秆的腐解。

3、所述固体微生物菌剂和液体微生物菌剂，保存6个月以上有效活菌数大于等于2亿/g（mL）。

具体实施方式

本发明所述地衣芽孢杆菌是本发明的发明人从北京延庆市肉鸡养殖鸡粪堆肥产物样品中分离的纯培养物，其保藏编号为CGMCC No.11235，保藏日期为2015年8月13日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）。

本发明的发明人意外发现，保藏编号为CGMCC No.11235的地衣芽孢杆菌，在10-30℃的温度范围生长较快，可以快速的降解秸秆，在田间应用的情况下可以实现秸秆的快速腐熟，从而达到改土、促长、增产的作用。

本发明所述微生物菌剂中含有的菌体量可以在一定范围内改变，例如每毫升或每克微生物菌剂中，保藏编号为CGMCC No.11235的地衣芽孢杆菌的活菌数可以为2×10⁸-1×10¹¹ cfu/g（mL），优选情况下，每毫升或每克微生物菌剂中，保藏编号为CGMCC No.11235的地衣芽孢杆菌的活菌数可以为优选为5×10⁸ -5×10⁹ cfu/g(mL)，该浓度在生产工艺和成本上最为适用。

根据本发明，保藏编号为CGMCC No.11235的地衣芽孢杆菌选择在玉米浆培养基中，该类培养基中含有多种生物因子使地衣芽孢杆菌生长迅速、容易产孢。其中，玉米浆培养基的配方为：玉米浆 2. 3%、豆粕 0.6%、MgSO₄·7H₂O 0.2%、K₂HPO₄ 0.05%、CaCO₃ 0.05%，pH 7.0。

本发明所述保藏编号为CGMCC No.11235的地衣芽孢杆菌的制备方法：将保藏编号为CGMCC No.11235的地衣芽孢杆菌接种于LB平板中进行活化，28℃培养36h。之后将活化的菌种接种到LB液体培养基中进行种子培养，28℃摇床培养24h。之后采用玉米浆培养基在发酵罐中进行扩大培养，培养温度28℃-30℃、培养时间48h以上，获得该菌的芽孢。

培养后的菌液可以通过与氮、磷、钾等营养元素直接复配后得到液体微生物菌剂；或者菌液经板框过滤后得到高浓度菌体，再与一定比例的氮、磷、钾等营养元素的水溶液混合得到液体微生物菌剂；也或者将菌液经喷雾干燥后得到高浓度菌粉，再与一定比例的氮、磷、钾等营养元素复配得到固体微生物菌剂。

本发明还提供了由地衣芽孢杆菌和里氏木霉、黑曲霉、简青霉中的一种或多种组成的复合微生物菌剂，所述各菌菌数比例为3-5∶1-2∶1-2∶1-2。

本发明还提供了如上所述的地衣芽孢杆菌和如上所述的微生物菌剂在秸秆腐熟中的应用。

本发明中，地衣芽孢杆菌和微生物菌剂在秸秆腐熟中的应用方法没有特别的要求，可以在田间喷撒使用，也可以在秸秆堆垛发酵中使用。秸秆腐熟菌剂的一般应用方法，例如，将菌剂与水按比例进行混合，直接喷撒于秸秆之上。

本发明中，秸秆与微生物菌剂的重量比可以在很大范围内变化，优选情况下，微生物菌剂与秸秆的重量比可以为1∶（500-2000），田间应用亩用量约为1-5公斤。优选的，可以在秸秆或田间补充一定量的氮素可加快秸秆的腐熟。

本发明中，菌剂在田间应用对土壤含水率没有特别的要求，可以为常规播种过程中的土壤含水量即可。优选情况下，土壤的含水量可以为40-70重量%。菌剂在秸秆堆垛腐熟中的应用，秸秆的含水量优选条件为50-70%。

本发明中，秸秆种类没有特别的要求，可以为北方普遍种植的小麦、玉米、花生、大豆等种类。

本发明中，该菌剂用于秸秆堆垛腐熟时对堆垛大小没有特别的要求，只要满足其内部温度可以使微生物菌剂正常发酵即可（18℃-30℃）。优选情况下，秸秆堆垛可以采用条式堆垛，底部宽度2m左右、堆高1.5 m以上、堆长大于等于3m。

下面结合实施例对本发明进行进一步说明。

实施例1

本实施例1用于说明本发明的地衣芽孢杆菌的初筛。

从北京延庆市肉鸡养殖鸡粪堆肥产物中采集样本5个，采用稀释涂平板的方法、利用LB培养基（含10g/L的胰蛋白胨、5g/L的酵母提取物和10g/L的NaCl）进行细菌分离，共分到不同菌落形态的菌株34个，将分离出的菌进行多次划线纯化获得纯培养菌株并进行保存。将纯化获得的34个菌株分别点接到纤维素钠-刚果红培养基上（羧甲基纤维素钠5g，（NH₄）₂SO₄ 2g，KH₂PO₄ 1g，MgSO₄·7H₂O 0.5 g，NaCl 0.5g，NaNO₃ 1g，蛋白胨 0.5g，酵母膏0.5g，刚果红 0.2g，琼脂 12g，水 1000mL，pH 7.0），分别在18℃和30℃进行培养，培养5d时测定菌落直径（d）和透明圈直径（D），计算D/d值，其中保藏编号为CGMCC No.11235的地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）在18℃和30℃时均最高，分别为6.8和5.4，说明该菌具有较高的秸秆降解能力，且具有较好的低温适应性。

实施例2

本实施例2用于说明本发明具有秸秆降解能力的地衣芽孢杆菌的复筛。

采用100mL三角瓶，在瓶内装入粉碎玉米秸秆2 g、营养液30 mL（尿素 3.0 g、(NH₄)₂SO₄ 6.0 g、蛋白胨 3.0 g、CaCl₂ 0.1 g、Mg SO₄·7H₂O 0.5 g、K₂HPO₄ 1.0 g、NaCl0.1 g、FeSO₄·7H₂O 0.05 g、MnSO₄·7H₂O 0.016 g、ZnSO₄·7H₂O 0.014 g、CoCl₂· 6H₂O0.037g、蒸馏水 1000 mL，自然 pH），121℃灭菌 30 min。将初筛获得的具有秸秆降解能力的菌株接种入LB培养基中摇床培养48h，之后吸取1mL菌液分别接种至秸秆培养基中，分别放置于18℃和30℃培养箱中培养，每天震荡两次，培养7d和15d时将瓶内的秸秆用蒸馏水冲洗3次并烘干至恒重，称取每个处理中的玉米秸秆重量，并计算降解率，每个处理3次重复。

秸秆降解率（%）=(W₀-W₁)/W₀×100％。[W₀接种前培养基中秸秆的重量（2g）；W₁培养结束烘干后秸秆的重量（g）]。

其中保藏编号为CGMCC No.11235的地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）在18℃培养时，培养7d和15d的秸秆降解率分别为16.2%和31.8%，30℃培养时，培养7d和15d的秸秆降解率分别为14.5%和28.6%，具有良好的降解能力。

实施例3

本实施例3用于说明本发明地衣芽孢杆菌的发酵培养。

将保藏编号为CGMCC No.11235的地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）在LB培养基上划线活化，培养48h，挑取菌苔接种于LB液体培养基中摇床培养24h，按照5%的接种量接种蛋白胨牛肉膏培养基（含20g/L的蛋白胨、5g/L的牛肉膏和5g/L的NaCl）中，10升种子罐进行培养，24h后按5%的接种量接种到200升发酵罐中采用玉米浆培养基（玉米浆 2. 3%、豆粕粉 0.6%、MgSO₄·7H₂O 0.2%、K₂HPO₄ 0.05%、CaCO₃ 0.05%，pH 7.0）进行发酵，每4h取样观察一次，直至80%以上的菌体形成芽孢。

实施例4

本实施例4用于说明本发明地衣芽孢杆菌固体菌剂的制备。

所得的保藏编号为CGMCC No.11235的地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）发酵菌液采用喷雾干燥获得菌粉，吸附载体选自但不限于可溶性淀粉或碳酸钙等；按照N:P₂O₅:K₂O重量比为5-8：1-3：1-3的比例进行无机营养成分的配制，称取地衣芽孢杆菌菌粉与无机营养进行混合，形成含有无机营养成分（N+P₂O₅+K₂O）的重量比（质量分数）为10%-15%的微生物腐熟菌剂，该微生物菌剂中活菌数为2×10⁸cfu-1×10¹¹ cfu/g。

实施例5

本实施例5用于说明本发明地衣芽孢杆菌液体菌剂的制备。

所得的保藏编号为CGMCC No.11235的地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）发酵菌液经板框过滤获得菌体，按照N:P₂O₅:K₂O重量比为5-8∶1-3∶1-3，配制成无机营养成分水溶液，并将菌体重悬于上述水溶液中，成为液体微生物腐熟菌剂。液体菌剂中，无机营养成分（N+P₂O₅+K₂O）的质量浓度为10-15%，微生物菌剂中活菌数为2×10⁸cfu/g-1×10¹¹cfu/mL。

实施例6

本实施例6用于说明本发明复合微生物菌剂的制备。

所得的保藏编号为CGMCC No.11235的地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）发酵菌液经喷雾干燥获得菌粉，与市场购买的里氏木霉菌剂、黑曲霉菌剂和简青霉菌剂按照菌数数量3-5∶1-2∶1-2∶1-2的比例进行配制，该微生物菌剂中总活菌数为2×10⁸cfu-1×10¹¹ cfu/g。

优选的，可按照N:P₂O₅:K₂O重量比为5-8∶1-3∶1-3的比例进行无机营养成分的配制并加入到复合菌菌剂中，形成含有无机营养成分（N+P₂O₅+K₂O）重量比（质量分数）为10%-15%的微生物腐熟菌剂。

实施例7

本实施例7用于说明本发明地衣芽孢杆菌菌剂的盆栽应用。

该实施例中选择的秸秆为玉米秸秆，土壤为玉米茬耕层土壤，采用直径为5cm、高5cm的圆形花盆进行盆栽条件下的菌剂促腐实验，秸秆和土壤的比例按重量比1∶20的比例进行掺混，并将菌剂均匀混拌入土壤及秸秆中至有效菌终浓度为1×10⁶cfu/g，在调节土壤湿度为60%左右后，将各处理花盆放置于18℃黑暗条件下培养。试验开始后，各处理每7d取样1次，直至第28天结束，共取样4次，每次每个处理取3个花盆。该试验共设3个处理，（1）土壤＋玉米秸秆＋不加菌剂（CK）、（2）土壤＋玉米秸秆＋地衣芽孢杆菌菌剂、（3）土壤＋玉米秸秆＋购买菌剂，每个处理3次重复，每个重复中有12个花盆，每次取样于各个重复中随机挑去3盆进行秸秆干重的测定，计算秸秆降解率，结果如表1所示。

表1 不同处理时间的秸秆降解率（花盆）

实施例8

本实施例8用于说明本发明地衣芽孢杆菌菌剂的田间应用。

该实施例为小麦秸秆全量还田后施用秸秆腐熟菌剂，亩用量2kg，水稀释后喷洒于田间，之后再进行旋耕。试验共设2个处理：地衣芽孢杆菌菌剂、市售秸秆腐熟菌剂，以不加菌剂的为对照。每处理20m²，三次重复，随机排列。玉米播种后测定施入腐熟菌剂后的7、15、21、30d耕层土壤中的秸秆腐熟度以及土壤微生物多样性；秸秆腐熟度通过秸秆降解率进行表征，结果如表2所示。

表2不同处理时间的秸秆降解率（田间）

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (4)

1.一种微生物菌剂在秸秆降解中的应用，其特征在于，所述微生物菌剂为液体微生物菌剂、固体微生物菌剂或复合微生物菌剂，每克或每毫升所述微生物菌剂中地衣芽孢杆菌的活菌数为2×10⁸cfu-1×10¹¹cfu；

所述地衣芽孢杆菌的保藏号为CGMCC No.11235；

所述固体微生物菌剂包括所述地衣芽孢杆菌、碳酸钙或可溶性淀粉载体和氮磷钾无机营养成分，所述氮磷钾无机营养成分占菌剂总质量的10-15%；

所述液体微生物菌剂包括所述地衣芽孢杆菌和氮磷钾无机营养成分水溶液，所述液体微生物菌剂中氮磷钾无机营养成分占菌剂总质量的10-15%；

所述氮磷钾无机营养成分包括重量比为5-8∶1-3∶1-3的N、P₂O₅和K₂O；

所述复合微生物菌剂包括所述地衣芽孢杆菌、里氏木霉、黑曲霉和简青霉，各菌菌数比例为3-5∶1-2∶1-2∶1-2。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，其包括田间应用和秸秆堆垛发酵应用，所述微生物菌剂与秸秆的重量比为1∶（500-2000），发酵温度为18℃-30℃。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，田间应用时，亩用量为1-5公斤，土壤的含水量为40-70 %。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，秸秆堆垛发酵应用时，秸秆堆垛采用条式堆垛，底部宽度2m、堆高1.5 m以上、堆长3m以上；秸秆的含水量为50-70%。