CN109234173B - 一种长枝木霉、其固体微生物菌剂及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及工业微生物技术领域，具体公开一种长枝木霉、其固体微生物菌剂及应用。所述长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)JG9‑31，保藏号为CGMCC No.16280。本发明提供的长枝木霉JG9‑31可以分泌纤维素酶类，促进秸秆的快速腐熟，在10～35℃的低温范围内可快速繁殖，在低温条件下仍具有很强的降解纤维素的能力，可以快速降解秸秆。本发明还提供了一种固体微生物菌剂，包括长枝木霉菌JG9‑31、地衣芽孢杆菌和链霉菌，三种菌及其分泌的生物酶形成一个高效的协同体系，使得三者组成的复合微生物菌剂无需额外添加纤维素酶制剂，即可实现低温条件下秸秆的快速还田。

Description

一种长枝木霉、其固体微生物菌剂及应用
技术领域
本发明涉及工业微生物技术领域，尤其涉及一种长枝木霉、其固体微生物菌剂及应用。
背景技术
农作物秸秆是世界上最为丰富的物质之一，我国目前解决大面积秸秆问题主要靠直接还田。秸秆还田是一种充分利用秸秆中养分资源、改良土壤的有效方式。还田后的秸秆在土壤微生物作用下发生腐解，秸秆中的纤维素、半纤维素和木质素等成分转化为植物易于吸收的简单化合物，其他部分经转化成为腐殖质，从而改善土壤理化性质，提高土壤肥力，进而提高作物产量和质量。尤其在北方，玉米小麦两熟耕作制度下，大量玉米秸秆连年还田对麦田土壤生态系统已表现出诸多益处。
土壤中含有一些秸秆降解微生物，然而数量较少，仅能使植物秸秆低效率的腐解，在作物茬口紧张的情况下秸秆的自然降解不能够满足农作物种植的需求，因此为了加速秸秆在土壤中的腐解，需要进行高效秸秆降解菌的添加。秸秆腐熟菌剂中含有能够降解秸秆的微生物，微生物在田间的生长及其产生的酶能够加速秸秆的降解，从而缓解秸秆腐熟慢对下茬作物的不良影响。但是，我国北方玉米收割时期一般是深秋季节，气温偏低，使用一般腐熟菌剂无法对秸秆进行快速和彻底腐熟，容易给农作物带来不良影响。因此，寻找一种在低温条件下可以加速秸秆快速还田的微生物或者新型秸秆腐熟剂具有十分重要的意义。
发明内容
针对现有秸秆腐熟菌种降解速度慢、低温适应性差的问题，本发明提供一种长枝木霉、其固体微生物菌剂及应用。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是：
一种长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)JG9-31，其保藏编号为CGMCCNo.16280。
长枝木霉JG9-31是从内蒙古呼伦贝尔草原表层土壤中采用低温方法筛选出来的，分类命名为长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)，已于2018年9月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，菌种保藏号为CGMCC No.16280，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
本发明所提供的长枝木霉JG9-31可以分泌纤维素酶类，促进秸秆的快速腐熟，在10～35℃的低温范围内可快速繁殖，在低温条件下仍具有很强的降解纤维素的能力，可以快速降解秸秆，该菌株在秸秆培养基中16℃培养7d和15d的秸秆降解率分别为18.39％和40.45％；且本发明所提供的长枝木霉JG9-31适域性强，可应用于各地区田间的秸秆还田，实现秸秆的快速腐熟，从而达到改善土壤理化性质、提升农田有机质、促进植物生长以及增产的作用，为化学肥料减量奠定了基础。
本发明还提供了一种固体微生物菌剂，包含权利要求1所述的长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)JG9-31。
本发明提供的长枝木霉可广泛应用于中国各地区的秸秆降解，将其制成固体微生物菌剂方便运输和长期保存，同时方便使用，可以在田间喷撒使用，也可以在秸秆堆垛发酵中使用。
优选的，所述固体微生物菌剂中长枝木霉的活菌数为2×108～1×1010cfu/g。
更优选的，所述固体微生物菌剂中长枝木霉的活菌数为5×108～5×109cfu/g。
优选的长枝木霉活菌数可以使固体微生物菌剂具有最优的降解秸秆的能力，且生产成本较低。
优选的，所述微生物固体菌剂还包括地衣芽孢杆菌和链霉菌。
本发明中地衣芽孢杆菌和链霉菌均为市售微生物制剂产品。
长枝木霉、地衣芽孢杆菌和链霉菌三者之间互不拮抗，且能分泌合成降解纤维的复合酶系，三种菌及其分泌的生物酶形成一个高效的协同体系，使得三者组成的复合微生物菌剂无需额外添加纤维素酶制剂，即可实现低温条件下秸秆的快速还田。三种菌协同加速秸秆腐熟进程，尤其适用于玉米秸秆，将不能被作物完全吸收利用的有机成分，分解为可以能完全被作物吸收的小分子的营养物质，充分释放秸秆中的氮磷钾元素，提高腐熟效果，缩短腐熟时间；且这些菌剂还可以产生大量活性物质，对提高作物的抗性起到了积极的作用。本发明提供的微生物固体菌剂中的微生物与土壤接触后能迅速生长繁殖，适域性强，产酶活性高，能有效改善土壤理化性质，提高土壤有机质，提高土壤中速效养分含量，提高当季作物的产量。
优选的，所述长枝木霉、所述地衣芽孢杆菌和所述链霉菌的活菌数比为3～5:1～2:1～2。
地衣芽孢杆菌和链霉菌具有较高的木质素酶、半纤维素酶、纤维素酶的酶活，能有效分解秸秆，提高秸秆腐熟效果，且芽孢杆菌和链霉菌还能产生抑制真菌的代谢产物，能够有效抑制作物致病菌的生长，提高作物抗性。
本发明筛选的长枝木霉JG9-31具有较高的产纤维素酶能力，在较低温度下也可快速繁殖，快速启动腐熟，与地衣芽孢杆菌和链霉菌配合，可使微生物复合菌剂具有优异的低温降解性能。
优选的长枝木霉、地衣芽孢杆菌和链霉菌的活菌数比可使微生物复合菌剂具有最佳的低温降解性能。在田间应用进行秸秆腐熟，30天的秸秆失重率大于64％、45天秸秆失重率大于69％，加快了秸秆的腐解。
本发明提供的微生物复合菌剂保存期限较长，保存6个月以上有效活菌数仍可达到2亿/g以上。
本发明还提供了上述长枝木霉在农作物秸秆快速还田中的应用。
本发明还提供了上述固体微生物菌剂在农作物秸秆快速还田中的应用。
在田间应用时，若采用堆垛腐熟的方式，所述复合微生物菌剂与秸秆的重量比为1:(500～2000)。若采用喷撒的方式，复合微生物菌剂的用量为3～6公斤/亩。
优选的，可以在秸秆或田间补充一定量的氮素可加快秸秆的腐熟。
本发明提供的复合微生物菌剂在田间应用时，对土壤含水率没有特别的要求，可以为常规播种过程中的土壤含水量即可。
本发明中所述秸秆种类没有特别的要求，可以为北方普遍种植的小麦、玉米、花生、大豆等种类。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例所用培养基：
PDA培养基(1L)：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15g，硫酸庆大霉素注射液3mL，水1000mL，自然pH值，121℃灭菌20min后待用。
PD液体培养基(1L)：马铃薯200g、葡萄糖20g，硫酸庆大霉素注射液3mL，水1000mL，自然pH值，121℃灭菌20min后待用。
纤维素钠-刚果红培养基：羧甲基纤维素钠5g，(NH4)2SO4 2g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl 0.5g，NaNO3 1g，蛋白胨0.5g，酵母膏0.5g，刚果红0.2g，琼脂12g，水1000mL，pH 7.0，121℃、高压灭菌20min后待用。
木霉固体培养基：秸秆粉、米糠和麦麸皮(质量比为5:2:3)96.9％、蔗糖1％、MgSO4·7H2O 0.3％、(NH4)2SO4 1.5％、KH2PO4 0.3％，pH 6.0，121℃，高压灭菌20min后待用。
秸秆培养基：采用100mL三角瓶，在瓶内装入粉碎玉米秸秆2g、营养液30mL，营养液配方：尿素3.0g、(NH4)2SO4 6.0g、蛋白胨3.0g、CaCl2 0.1g、MgSO4·7H2O 0.5g、K2HPO4 1.0g、NaCl 0.1g、FeSO4·7H2O 0.05g、MnSO4·7H2O 0.016g、ZnSO4·7H2O 0.014g、CoCl2·6H2O0.037g、蒸馏水1000mL，自然pH，121℃灭菌30min待用。
实施例1
1.长枝木霉的初筛
从内蒙古呼伦贝尔草原采集表层土壤样品，采用稀释涂平板的方法，利用PDA培养基进行菌株分离，共分到不同菌落形态的木霉菌株129个，将分离出的菌进行多次划线纯化，获得纯培养菌株并进行保存。将纯化获得的29个菌株分别点接到纤维素钠-刚果红培养基上，分别在16℃和30℃进行培养，培养5d时测定菌落直径(d)和透明圈直径(D)，计算D/d值。
保藏编号为CGMCC No.16280的长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)可在纤维素钠-刚果红培养基上产生直径2.2cm以上的透明圈，D/d值在16℃和28℃时均最高，分别为2.2和2.4，说明该菌具有较高的秸秆降解能力，且具有较好的低温适应性。
2.长枝木霉的复筛
将初筛获得的具有秸秆降解能力的菌株接种入PD液体培养基中，28℃摇床培养48h，之后吸取1mL菌液分别接种至秸秆培养基中，放置于16℃培养箱中培养，每天震荡两次，培养7d和15d时将瓶内的秸秆用蒸馏水冲洗3次，烘干至恒重，称取每个处理中的玉米秸秆重量，并计算降解率，每个处理3次重复。
秸秆降解率(％)＝(W0-W1)/W0×100％
W0为接种前培养基中秸秆的重量；W1培养结束烘干后秸秆的重量。
保藏编号为CGMCC No.16280的长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)在16℃培养时，培养7d和15d的秸秆降解率分别为18.39％和40.45％。
实施例3
本实施例提供一种长枝木霉固体菌剂，其制备方法包括如下步骤：
将保藏编号为CGMCC No.16280的长枝木霉接种于PDA平板中进行活化，28℃培养48h；将活化的长枝木霉菌块5～10块接种到PD液体培养基中进行种子培养，28℃、200rpm摇床培养48h；按5％接种量将长枝木霉菌接种到木霉固体培养基中，湿度60％，室温浅盘进行扩大培养，时间5天以上，晾干即得长枝木霉菌剂。
该微生物菌剂中活菌数为2×108cfu～1×1010cfu/g。
实施例4
本实施例提供一种复合微生物菌剂，包括保藏编号为CGMCC No.12680的长枝木霉，地衣芽孢杆菌和链霉菌，所述长枝木霉、地衣芽孢杆菌和链霉菌的活菌数比为3～5:1～2:1～2。
其制备方法包括如下步骤：
步骤一、将保藏编号为CGMCC No.16280的长枝木霉接种于PDA平板中进行活化，28℃培养48h；将活化的木霉菌块5～10块接种到PD液体培养基中进行种子培养，28℃、200rpm摇床培养48h；按5％接种量将长枝木霉菌接种到木霉固体培养基中，湿度60％，室温浅盘进行扩大培养，5天后，晾干，得长枝木霉菌粉；
步骤二、取市售的地衣芽孢杆菌、链霉菌和步骤一中所得长枝木霉菌粉进行活菌测定，按照长枝木霉、地衣芽孢杆菌和链霉菌的活菌数比为3～5:1～2:1～2的比例将长枝木霉、地衣芽孢杆菌和链霉菌混合均匀，得所述复合微生物菌剂。
该复合微生物菌剂中的总活菌数为4×108cfu-2×1010cfu/g。
应用实施例1
该实施例中选择的秸秆为玉米秸秆，土壤为玉米茬耕层土壤，采用直径为5cm、高5cm的圆形花盆进行盆栽条件下的菌剂促腐实验。
玉米秸秆和土壤的比例按重量比1：20的比例进行掺混，将微生物菌剂均匀混拌入土壤及秸秆中至有效菌终浓度为1×106cfu/g，调节土壤湿度为60％左右，将各处理花盆放置于16℃黑暗条件下培养。设置3个实验组：实施例4制备的复合微生物菌剂作为实施例组、市售秸秆腐熟菌剂作为对照组，以不加菌剂的为空白组，每个实验组设置3组平行样，每组平行样中有12个花盆，每次取样于各组平行样中随机挑取3盆进行秸秆干重的测定，计算秸秆降解率，15d取样1次，直至第45天结束，结果如表1所示。
表1不同处理时间花盆中秸秆的降解率
Figure BDA0001852291540000071
应用实施例2
该实施例为玉米秸秆全量还田后，施用微生物菌剂进行田间菌剂促腐实验，微生物菌剂的亩用量为3kg，水稀释后喷洒于田间，然后进行旋耕。实验时间为11月份，当时的平均地表温度为14℃左右，随着实验时间的推移，到实验结束时，平均地表温度为0℃左右。
设3个实验组：实施例4制备的复合微生物菌剂作为实施例组、市售秸秆腐熟菌剂作为对照组，以不加菌剂的为空白组。每个实验组选择20m2的田间进行实验，设置三组平行样，随机排列。小麦播种后测定施入微生物菌剂后的15d、30d、45d耕层土壤中的秸秆腐熟度，结果如表2所示。
表2不同处理时间田间秸秆的降解率
Figure BDA0001852291540000081
实验45天结束后，取秸秆进行理化性质检测，结果如表3所示。
表3施入微生物菌剂45天后秸秆的理化指标
Figure BDA0001852291540000082
实验45天结束后，取土壤进行理化性质检测，结果如表4所示。
表4施入微生物菌剂45天后土壤的理化指标
Figure BDA0001852291540000083
Figure BDA0001852291540000091
由上表可以看出，施用实施例4制备的复合微生物菌剂的秸秆腐熟还田区中秸秆中的氮磷钾元素的含量以及土壤中有机质、全氮、碱解氮、速效磷、速效钾的含量比空白组和对照组均有所提高，说明本发明提供的复合微生物菌剂可以充分释放秸秆中的氮磷钾元素，提高土壤养分含量，改善土壤理化性质。
综上所述，本发明的提供的含有保藏号为CGMCC No.16280的长枝木霉的复合微生物菌剂，能显著加速秸秆在土壤中的腐化，尤其是在低温条件下仍具有很强的加速秸秆腐化的能力，可有效增加土壤肥力，抑制土壤土传病害，提高作物的产量与品质，具有广阔的应用前景。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)JG9-31，其特征在于，其保藏编号为CGMCC No.16280。
2.一种固体微生物菌剂，其特征在于，包含权利要求1所述的长枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)JG9-31。
3.如权利要求2所述的固体微生物菌剂，其特征在于，所述固体微生物菌剂中长枝木霉的菌落数为2×108～1×1010cfu/g。
4.如权利要求3所述的固体微生物菌剂，其特征在于，所述固体微生物菌剂中长枝木霉的菌落数为5×108～5×109cfu/g。
5.如权利要求3或4所述的固体微生物菌剂，其特征在于，还包括地衣芽孢杆菌和链霉菌。
6.如权利要求5所述的固体微生物菌剂，其特征在于，所述长枝木霉、所述地衣芽孢杆菌和所述链霉菌的活菌数比为3～5:1～2:1～2。
7.权利要求1所述的长枝木霉在农作物秸秆快速还田中的应用。
8.权利要求2-6任一项所述的固体微生物菌剂在农作物秸秆快速还田中的应用。
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