CN114258923A

CN114258923A - 一种棘孢木霉微生物菌剂在防治农作物病害中的应用

Info

Publication number: CN114258923A
Application number: CN202111662228.3A
Authority: CN
Inventors: 蒋羽佳; 刘岩松; 姜岷; 信丰学; 章文明; 姜万奎
Original assignee: Nanjing Tech University
Current assignee: Nanjing Tech University
Priority date: 2021-12-30
Filing date: 2021-12-30
Publication date: 2022-04-01
Anticipated expiration: 2041-12-30
Also published as: CN114258923B

Abstract

本发明公开了一种棘孢木霉微生物菌剂在防治农作物病害中的应用，所述菌株的分类命名为棘孢木霉（Trichoderma asperellum），已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20211179，保藏日期为2021年9月15日。所述棘孢木霉可抑制诸多病原真菌的生长，可有效防治尖孢镰刀菌、小麦全蚀病菌、黄瓜褐斑病菌、西瓜枯萎病菌、南瓜叶斑病菌、辣椒疫霉病菌、黄瓜枯萎病菌等引起的农作物病害。该微生物菌剂对环境及植物无毒害作用，并对农作物生长具有一定的促生作用，可应用在制备防止农作物致病菌拮抗菌剂中。

Description

一种棘孢木霉微生物菌剂在防治农作物病害中的应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种棘孢木霉微生物菌剂在防治农作物病害中的应用。

背景技术

植物病原真菌会影响农作物的生长。而化学农药的使用会在作物、水和土壤中有残留，导致农药残留超标和环境污染等为题。同时化学农药也会抑制甚至杀死土壤中的其它有益微生物，使土壤有机质含量下降，降低土壤肥力，带来诸多社会、经济和生态问题。随着生活水平的提高和环保意识的增强，创建绿色微生物菌剂以实现生物防控，受到越来越多的关注。

木霉属(Trichoderma)是自然界中普遍存在的一类丝状真菌，腐生性强，适应性广，对植物病原真菌，如腐霉菌、镰刀菌、丝核菌等具有拮抗作用，目前已广泛用于病原真菌引起的植物病害的防治中。棘孢木霉(Trichoderma asperellum)属于半知菌门，丝孢目，木霉属。是一类分布广、繁殖快、适应性强、抗菌谱广的生防有益真菌，开发生物农药和菌肥的潜力，在生物防治方向具有重要的经济意义。

发明内容

本发明提供了棘孢木霉微生物菌剂在防治农作物病害中剂促进植物生长中的应用，以玉米芯等木质纤维素为原料生产棘孢木霉微生物菌剂，可应用于农作物病原真菌的防治，同时实现废弃碳资源的循环利用。

本发明使用的菌株为棘孢木霉(Trichoderma asperellum)LYS1，已于2021年9月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20211179。

所述棘孢木霉(Trichoderma asperellum)LYS1是从木梳子上筛选获得的，其在PDA平板上培养时，72h内，菌落生长为白色，中心变为浅绿色，气生菌丝纤细、羊毛状，由中心向四周散布。72-96h菌丝可铺满直径为9cm的PDA平板，菌落中心逐渐呈现深绿色，气生菌丝变为棉絮状。96h后，菌落整体呈深绿色。

所述菌株的培养包括如下步骤：

(1)取保种管中的棘孢木霉在PDA平板上划线，分离出单菌落；

(2)棘孢木霉在PDA平板上生长96-120h后，挑取2-3个菌块加入PD培养基中，放入100-200rpm的摇床震荡培养48h，作为种子液；

(3)将活化好的种子液按照1-10％的接种量加入发酵培养基中培养；

(4)将菌液离心或无菌过滤后，冷冻干燥处理，制为微生物菌剂。

马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基(PDA)和马铃薯葡萄糖液体培养基(PD)，PDA培养基配方为：土豆200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉15-20g/L。PD培养基配方为：土豆200g/L，葡萄糖20g/L。

发酵培养基以40-100g/L的玉米芯等农业废弃木质纤维素原料为碳源，加入5-20g/L的葡萄糖促进菌落生长，并加入MgSO₄·7H₂O 0.1～0.5g/L，CaCl₂ 0.1～0.5g/L；优选为玉米芯80g/L，葡萄糖10g/L，MgSO₄·7H₂O 0.3g/L，CaCl₂ 0.3g/L。

所述培养的温度为25～35℃，培养时间为72～168h。

所述棘孢木霉(Trichoderma asperellum)LYS1在防治农作物病害中的应用。

所述棘孢木霉(Trichoderma asperellum)LYS1在防治尖孢镰刀菌的黄瓜幼苗病害及促进黄瓜生长中的应用。

在营养培养基上培养棘孢木霉菌(Trichoderma asperellum)LYS1，将发酵液离心或无菌过滤后为微生物菌剂，冷冻干燥处理后可直接用于农作物病害防治。

本发明中，可以将发酵液直接用于植物的喷洒，也可以将发酵液经过离心处理后，配置成一定浓度的菌液对植物进行喷洒。还可以以发酵液或者菌液对植物进行浸种处理；还可以将发酵液离心后的菌体直接与其他植物肥料复合后施用。

棘孢木霉孢子量为10⁹-10¹⁰CFU/g，直接施于农作物或者其周围的土壤。

所述发酵液中包含棘孢木霉菌菌体、几丁质酶、葡聚糖酶、蛋白酶和拮抗化合物，对植物病害有较好的防治效果，同时可以为植物生长提供营养，促进植物的生长。

所述农作物病害包括但不限于各类病原真菌对农作物的病害；例如：尖孢镰刀菌、小麦全蚀病菌、黄瓜褐斑病菌、西瓜枯萎病菌、南瓜叶斑病菌、辣椒疫霉病菌、黄瓜枯萎病菌等引起的农作物病害。

所述棘孢木霉(Trichoderma asperellum)LYS1在促进农作物生长中的应用。

所述的棘孢木霉菌株生长迅速，培养条件简单，对培养条件要求不严格。此外，棘孢木霉对尖孢镰刀菌、小麦全蚀病菌、黄瓜褐斑病菌、西瓜枯萎病菌、南瓜叶斑病菌、辣椒疫霉病菌、黄瓜枯萎病菌等有显著的抑制作用，而且对环境及植物无毒害作用，可有效防治尖孢镰刀菌、小麦全蚀病菌、黄瓜褐斑病菌、西瓜枯萎病菌、南瓜叶斑病菌、辣椒疫霉病菌、黄瓜枯萎病菌等引起的农作物病害，并对农作物生长具有一定的促生作用，可应用在制备防止农作物致病菌拮抗菌剂中。

本发明以废弃碳资源为主要原料，来源广、价格低，可减少环境污染的同时实现废弃碳资源的循环利用。基于所述棘孢木霉具有较强的纤维素及半纤维素酶酶活，其可在废弃木质纤维素原料中生长繁殖，且在还田后该基底仍可继续为棘孢木霉提供营养，为微生物菌剂功效发挥提供了保障。

有益效果：

本发明提供了棘孢木霉LYS1在防治农作物病害以及促进植物生长中的应用，所述菌株能够在废弃木质纤维素原料中生长繁殖，发酵液中含有大量的棘孢木霉菌菌体、几丁质酶、葡聚糖酶、蛋白酶和拮抗化合物，对尖孢镰刀菌、小麦全蚀病菌、黄瓜褐斑病菌、西瓜枯萎病菌、南瓜叶斑病菌、辣椒疫霉病菌、黄瓜枯萎病菌等有显著的抑制作用，而且对环境及植物无毒害作用，可有效防治尖孢镰刀菌、小麦全蚀病菌、黄瓜褐斑病菌、西瓜枯萎病菌、南瓜叶斑病菌、辣椒疫霉病菌、黄瓜枯萎病菌等引起的农作物病害，并对农作物生长具有一定的促生作用，可应用在制备防止农作物致病菌拮抗菌剂中，对于侵染了尖孢镰刀菌的黄瓜幼苗防治效果尤其突出。

具体实施方式

以下结合实施案例对本公开进行详细说明，但是本发明的实施方式并不限制于以下实施案例。

实施例1：棘孢木霉的分离、纯化及鉴定：

从木梳子上刮取0.5g木屑，加入到100mL的生理盐水中稀释，将不同稀释倍数的菌液涂布在PDA平板(土豆200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉15-20g/L)上，于28℃下培养3-4天。生长出的菌落划线纯化5代后，对菌株提取基因组，并通过ITS1和ITS4引物进行PCR扩增，序列测序后经过NCBI数据库比对，该菌株为棘孢木霉(Trichoderma asperellum)。

所述棘孢木霉菌落生长迅速。在PDA平板上培养时，72h内，菌落生长为白色，中心变为浅绿色，气生菌丝纤细、羊毛状，由中心向四周散布。72-96h菌丝可铺满直径为9cm的PDA平板，菌落中心逐渐呈现深绿色，气生菌丝变为棉絮状。96h后，菌落整体呈深绿色。该菌株已于2021年9月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M20211179。

实施例2：以玉米芯为碳源对棘孢木霉(Trichoderma asperellum)的培养

PDA平板：土豆200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉15-20g/L；

PD培养基：土豆200g/L，葡萄糖20g/L；

发酵培养基：玉米芯80g/L，MgSO₄·7H₂O 0.3g/L，CaCl₂ 0.3g/L。

取保种管中的棘孢木霉在PDA平板上划线，分离出单菌落后，转在PDA平板上生长96-120h后，挑取2-3个菌块加入PD培养基中，放入100-200rpm的摇床震荡培养48h，作为种子液；

将种子液按照5％v/v的接种量加入发酵培养基中，28℃，120r·min^-1震荡培养，每隔24h调节pH至5.5。经过7天的培养后，所述棘孢木霉的玉米芯降解率达到43％左右。发酵液中包含棘孢木霉菌菌体、几丁质酶、葡聚糖酶、蛋白酶和拮抗化合物。

实施例3：以玉米秸秆为碳源对棘孢木霉(Trichoderma asperellum)的培养

PDA平板：土豆200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉15-20g/L；

PD培养基：土豆200g/L，葡萄糖20g/L；

发酵培养基：玉米秸秆80g/L，MgSO₄·7H₂O 0.3g/L，CaCl₂ 0.3g/L。

将种子液按照5％v/v的接种量加入发酵培养基中，28℃，120r·min^-1震荡培养，每隔24h调节pH至5.5。经过7天的培养后，所述棘孢木霉的玉米秸秆降解率达到21％左右。48h内，棘孢木霉可以在仅有玉米秸秆为碳源的培养基中生长，通过内切型-β-葡聚糖酶酶活、木聚糖酶酶活以及β-葡萄糖苷酶酶活的测定，其木聚糖酶酶活最高达到278IU/mL；内切型-β-葡聚糖酶酶活最高可达1.58IU/mL，β-葡萄糖苷酶最高可达1.05IU/mL，表明其在玉米秸秆中可以生长，但生长比玉米芯为碳源时慢。

实施例4：在玉米芯为主要碳源的培养基中添加葡萄糖对棘孢木霉(Trichodermaasperellum)的培养

PDA平板：土豆200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉15-20g/L；

PD培养基：土豆200g/L，葡萄糖20g/L；

发酵培养基：玉米秸秆80g/L，葡萄糖10g/L，MgSO₄·7H₂O 0.3g/L，CaCl₂ 0.3g/L。

将种子液按照5％v/v的接种量加入发酵培养基中，28℃，120r·min^-1震荡培养，每隔24h调节pH至5.5。经过6天的培养后，所述棘孢木霉的玉米芯降解率达到46％左右。在12h内，棘孢木霉就可以在培养基中生长，葡萄糖的添加有利于菌株快速生长，且有利于缩短发酵周期。发酵液中包含大量棘孢木霉菌菌体、几丁质酶、葡聚糖酶、蛋白酶和拮抗化合物。

实施例5：棘孢木霉抑制病原真菌生长的平板对峙实验

取保种管中的棘孢木霉在PDA平板上划线，将活化后的棘孢木霉与病原菌分别接于PDA平板的中心两侧(分别距平板中心2-2.5cm)，以只接种病原真菌的PDA平板做为对照，置于30℃恒温培养5-7天，通过十字交叉法来测量菌株生长的直径，从而计算抑菌率。通过平板对峙实验，本发明中采用的棘孢木霉对病原真菌尖孢镰刀菌、小麦全蚀病菌、黄瓜褐斑病菌、西瓜枯萎病菌、南瓜叶斑病菌、辣椒疫霉病菌、黄瓜枯萎病菌均具有显著的拮抗作用。其中对尖孢镰刀菌、小麦全蚀病菌、黄瓜褐斑病菌的抑制率达80％以上，其余病原真菌的抑制率也均在60％以上，表明本发明中的微生物菌剂可利用范围较广。采用本发明的棘孢木霉微生物菌剂，能够有效防治诸多病原真菌对农作物的病害，且在减少环境污染的同时实现废弃碳资源的循环利用。

表1棘孢木霉对各病原菌的对峙结果

综上所述，本发明分离筛选到的棘孢木霉，抑菌谱广，对诸多植物病原真菌的生长均具有较强的抑制作用，可经过菌液离心或无菌过滤后，冷冻干燥处理，粉碎后制为微生物菌剂，直接用于农作物的生防应用。

实施例6：棘孢木霉微生物菌剂在防治尖孢镰刀菌中的效果

基于棘孢木霉对尖孢镰刀菌的生长抑制最为明显，故考察了棘孢木霉微生物菌剂在防治尖孢镰刀菌中的效果。

筛选大小相似的饱满黄瓜和番茄种子，经75％乙醇消毒、用无菌水冲洗后装入培养皿中催芽，生长30天后，选取生长情况基本一致的幼苗。

实验组1为将棘孢木霉微生物菌剂,棘孢木霉孢子量为10⁹-10¹⁰CFU/g，直接施于幼苗周围的土壤，并在土壤周围注入尖孢镰刀菌侵染液20mL。实验组2将棘孢木霉微生物菌剂(孢子量为10⁹-10¹⁰CFU/g)直接施于幼苗周围的土壤。对照组1既不注入尖孢镰刀菌侵染液也不施加棘孢木霉微生物菌剂。对照组2为只在土壤周围注入尖孢镰刀菌侵染液20mL而不加微生物菌剂。在培养15天后计算植物的发病率，并将幼苗拔出，测量根的生长长度与整个植株的干重。其中棘孢木霉微生物菌剂对侵染了尖孢镰刀菌的黄瓜幼苗防治效果显著。其对照组1无发病幼苗，对照组2幼苗发病率高达83.3％，而实验组1的幼苗发病率仅为13.3％，实验组2无幼苗发病率。说明棘孢木霉的微生物菌剂可有效防治尖孢镰刀菌。此外，通过对菌株游标根部长度和幼苗干重的测定，将实验组2与对照组1进行对比后，发现棘孢木霉对幼苗的根部生长及幼苗干重均有促进作用，其中黄瓜幼苗根部生长长度提升23％，幼苗干重提升17％，说明棘孢木霉微生物菌剂除了具有生物防治效果，还对农作物的生长有促进效果。

实施例7：棘孢木霉微生物菌剂悬液在防治尖孢镰刀菌中的效果

按照1:100w/v的在棘孢木霉微生物菌剂加入水，制成棘孢木霉微生物菌剂悬液，棘孢木霉孢子量为10⁷-10⁸CFU/mL。

筛选大小相似的饱满黄瓜种子，经75％乙醇消毒、用无菌水冲洗后装入培养皿中催芽，生长30天后，选取生长情况基本一致的幼苗。

实验组1为将棘孢木霉微生物菌剂悬液洒于黄瓜幼苗周围的土壤，并在土壤周围注入尖孢镰刀菌或黄瓜枯萎病菌侵染液20mL。实验组2将棘孢木霉微生物菌剂直接施于黄瓜幼苗周围的土壤。对照组1既不注入尖孢镰刀菌或黄瓜枯萎病菌侵染液也不施加棘孢木霉微生物菌剂悬液。对照组2为只在土壤周围注入尖孢镰刀菌或黄瓜枯萎病菌侵染液20mL而不加微生物菌剂悬液。发现在加入棘孢木霉微生物菌剂悬液后，抑制尖孢镰刀菌和黄瓜枯萎病菌的发病抑制率分别可达89.9％和66.7％，均具有较好的防治效果。而与棘孢木霉微生物菌剂相比，防治效果基本略有下降。且棘孢木霉微生物菌剂更适用于尖孢镰刀菌的防治。

Claims

1.棘孢木霉菌（Trichoderma asperellum）LYS1在防治农作物病害中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，在营养培养基上培养棘孢木霉菌（Trichoderma asperellum）LYS1，将发酵液离心或无菌过滤后，冷冻干燥处理为微生物菌剂，直接用于农作物病害防治。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述培养棘孢木霉菌（Trichoderma asperellum）LYS1的培养方法如下：

（1）取保种管中的棘孢木霉LYS1在PDA平板上划线，分离出单菌落；

（2）棘孢木霉在PDA平板上生长96-120 h后，挑取2-3个菌块加入PD培养基中，放入100-200 rpm的摇床震荡培养48 h，作为种子液；

（3）将活化好的种子液按照1-10%的接种量加入发酵培养基中培养，培养温度25~35℃，培养时间为72~168 h。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基为：木质纤维素类废弃碳资源40-100 g/L、葡萄糖5-20 g/L、MgSO₄·7H₂O 0.1~0.5 g/L、CaCl₂ 0.1~0.5 g/L。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述木质纤维素类废弃碳资源为玉米芯、玉米秸秆或者小麦秸秆。

6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述农作物病害的病原真菌为尖孢镰刀菌、小麦全蚀病菌、黄瓜褐斑病菌、西瓜枯萎病菌、南瓜叶斑病菌、辣椒疫霉病菌、黄瓜枯萎病菌。

7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述农作物为黄瓜、番茄、西瓜。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述农作物病害为侵染了尖孢镰刀菌的黄瓜幼苗。

9.棘孢木霉菌（Trichoderma asperellum）LYS1在促进植物生长中的应用。