CN110272832A - 棘孢木霉fj069及其应用 - Google Patents

棘孢木霉fj069及其应用 Download PDF

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    • C12R2001/885—Trichoderma

Abstract

本发明涉及的是棘孢木霉FJ069及其应用，这株棘孢木霉（Trichodema asperellum）FJ069，该菌株的保藏编号为CGMCC No.17976。本发明所提供的棘孢木霉菌株具有良好的促进种子萌发、促进农作物根部生长及防治番茄灰霉病的效果，使辣椒根部重量提升了117%，对番茄灰霉病防治效果达84.74%。

Description

棘孢木霉FJ069及其应用
一、技术领域
本发明首次发现了一株棘孢木霉FJ069，该菌株的拉丁文分类命名为：Trichodemaasperellum，该菌株已于2019年6月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，保藏编号：CGMCCNo.17976。
本发明涉及的是用于农业生产的棘孢木霉菌，具体涉及的是一株棘孢木霉FJ069及其应用。
二、背景技术
目前植物病害的防治仍然是以化学药剂防治为主，化学药剂的使用导致植物病原菌产生抗药性，增加防治难度，并且化学农药会污染和破坏环境，导致生物链的破坏，农药残留对人体产生极大的危害。因此，寻找对环境友好、无污染的防治技术越来越受重视。
木霉菌属于半知菌亚门(Deuteromycotina)、丝孢纲(Hyphomycetes)、丝孢目(Hyphomycetales)、丛梗孢科(Moniliales)、木霉属(Trichoderma)，是一类分布广泛的腐生真菌，存在于土壤、根围、叶围和种子等生态环境中，据报道目前从自然环境中发现300多种木霉菌。研究发现棘孢木霉菌是农业生产中重要的菌种，例如中国发明专利申请CN108207944A公开了棘孢木霉HN组合物的可湿性粉剂，刘照莹等(植物研究，2018，38(1):64-74)报道了棘孢木霉组合应用对杨树生长和光合特性影响，中国发明专利申请CN107142213A公开了棘孢木霉的促生长作用。因此，寻找新的棘孢木霉菌株对农业生产，特别对农作物的病害防治来讲具有重要的意义。
三、发明内容
本发明的一个目的是提供棘孢木霉FJ069，这株棘孢木霉FJ069用于促进农作物根部生长、抑制植物病原菌生长；本发明的另一个目的是提供一株棘孢木霉FJ069的应用。
本发明采用的技术方案是：一株棘孢木霉(Trichodema asperellum)FJ069，该菌株的保藏编号为CGMCC No.17976。
上述方案中棘孢木霉(Trichodema asperellum)FJ069的几丁质酶活性为0.9132U/ml，在固体发酵基质(麦麸：玉米粉：稻壳＝5：3：2)中培养72小时，其产孢量为100亿/克，固体发酵基质中麦麸：玉米粉：稻壳质量比为5：3：2。
上述棘孢木霉(Trichodema asperellum)FJ069用于促进农作物根部生长。
上述方案中棘孢木霉(Trichodema asperellum)FJ069用于促进辣椒根部生长，相比于清水对照组，使辣椒根部重量提升了117％。
上述棘孢木霉(Trichodema asperellum)FJ069用于促进种子萌发。
上述棘孢木霉(Trichodema asperellum)FJ069用于抑制了植物病原菌生长。
上述方案中病原菌是香蕉枯萎病菌、芒果炭疽病菌、番茄灰霉病菌、白绢病菌、豇豆枯萎病菌、苹果轮纹病菌、稻瘟病菌、芒果蒂腐病菌、小麦赤霉病菌、小麦纹枯病菌、蔓枯病菌、立枯丝核菌中的任意一种或多种。
上述方案中棘孢木霉(Trichodema asperellum)FJ069对番茄灰霉病防治效果达84.74％。
有益效果：
本发明所提供的棘孢木霉菌株具有良好的促进种子萌发、促进农作物根部生长及防治番茄灰霉病的效果。
保藏说明
菌种名称：棘孢木霉FJ069；
拉丁名：Trichodema asperellum；
保藏编号：CGMCC No.17976；
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院；
保藏日期：2019年6月19日。
四、附图说明
图1为本发明棘孢木霉菌株β-1,3-葡聚糖酶活性测定所用葡萄糖标准曲线；
图2为本发明棘孢木霉菌株几丁质酶活性测定所用N-乙酰氨基葡萄糖标准曲线。
五、具体实施方式：
下面结合具体实施例详细描述本发明，所述实施例用于理解而不是限制本发明。
一株新的棘孢木霉(Trichodema asperellum)FJ069，它在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.17976。
这种棘孢木霉(Trichodema asperellum)FJ069菌落呈同心圆形，初期气生菌丝呈白色，羊毛状，后期产生分生孢子，分生孢子深绿色，孢子簇棉絮状；分生孢子球形、近圆形、分生孢子梗常呈现对称分布，也见单个孢子梗分支，顶端具有两个以上瓶梗，瓶梗与主轴夹角约90°距顶端较远处产生至多三级分枝；瓶梗产生于分枝顶端，2-3个呈漩涡状排列，瓶梗直、中间稍有加粗，顶部、基部缢缩。
实施例1：棘孢木霉FJ069的分离和保藏
1、棘孢木霉菌株FJ069，采集自福建省厦门市的姜地中。
土样采集：土壤的采集选用五点对角线取样法。即在采集地块的对角线选5等分点，然后用深度25cm的的取土器在每一个点钻取约15-20cm的土样，再将5份土混合均匀，四分法取约50g的土样装入自封袋。在实验室内分装到50ml的塑料瓶中，4℃保存待用。
木霉菌分离：采用稀释平板法，从冰箱中取10g土壤样品装入盛有90ml灭菌水和5-10粒直径4mm玻璃珠的三角瓶，然后在200r/min的摇床上摇30min。取5ml倒入盛有45ml灭菌水的三角瓶中，混匀后，再吸取5ml转入盛有45ml灭菌水的三角瓶中，充分混匀后吸取0.2ml于直径9cm的平板上，用涂布器涂抹均匀，放于28℃恒温培养箱中培养。48-72h后挑取产绿色分生孢子的菌落，转接到PDA平板上，28℃恒温培养箱中继续培养，待菌落直径长到4-5cm时再次转接PDA平板28℃恒温培养。
2、棘孢木霉菌株FJ069菌种保藏
棘孢木霉菌株FJ069于2019年6月19日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)进行真空冻干保藏，保藏编号为CGMCC No.17976，保藏期限为30年。
3、通过形态学鉴定结合分子生物学(基因测序)鉴定结果为棘孢木霉。TEF序列见序列表1。
实施例2：β-1,3-葡聚糖酶酶活测定
DNS试剂的配制：称取酒石酸钾钠91g溶于500mL蒸馏水中，向溶液中依次加入3,5-二硝基水杨酸3.15g和NaOH 20g，加热搅拌，使之溶解，再加入苯酚2.5g，无水亚硫酸钠2.5g，搅拌使之溶解，冷却后定容至1000ml，贮于棕色瓶中。
β-1,3-葡聚糖酶产酶培养基配制：酵母粉3g，NaNO3 0.3g，MgSO4·7H2O 0.05g，K2HPO4 0.1g，FeSO4·7H2O 0.001g，KCl 0.05g，用蒸馏水定容至100ml，121℃高压蒸汽灭菌。
葡萄糖标准曲线的制定：准确称取经105℃烘干至恒重的无水葡萄糖1000mg，溶于蒸馏水中，定容至1000ml，得到1mg/ml的葡萄糖标准溶液。取7支带刻度的试管，分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1、1.2ml的葡萄糖溶液，后加入3ml DNS，最后定容至5ml，置于沸水中水浴5min，冷却后加蒸馏水定容至25ml，摇匀，于540nm波长下测OD值。以葡萄糖实际含量(mg/ml)为横坐标，OD值为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线，结果如附图1所示。
将棘孢木霉FJ069接种PDA平板培养，48h后用直径5mm打孔器打取菌落边缘三块菌饼于PD培养液中。将100ml PD培养液装入250ml三角瓶，置于28℃，180rpm摇床培养。72h后用真空抽滤器抽干菌丝，取1g菌丝接种于100ml产酶培养基，置于28℃，180rpm摇床培养，设置三个重复。于第三天测定β-1,3-葡聚糖酶酶活。取粗酶液0.5ml，置于40℃水浴锅中预热2min后加入经40℃预热的0.1mg/ml的昆布多糖溶液lmL，50mM乙酸钠缓冲液(pH＝5)0.5ml，混匀。于40℃准确反应1h后，立即加入0.75mLDNS溶液以终止反应，混匀后沸水浴准确反应15min，立即取出放入冰水浴中冷却至室温，25℃放置2min，再加入5ml蒸馏水混匀。反应液混匀后，取150μl反应混合液加入96孔加样板，在540nm测定吸光度，与标准曲线对比，计算酶活数值。
一个β-1,3-葡聚糖酶酶活单位定义：在特定条件下(40℃，pH＝5)，以1h催化分解昆布多糖产生l u g葡萄糖酶量。
表1棘孢木霉FJ069的β-1,3-葡聚糖酶活性
可以看出，本发明棘孢木霉菌株FJ069具有较好的β-1,3-葡聚糖酶活性。
实施例3：几丁质酶酶活测定
胶态几丁质的制备：取10g几丁质加入少许蒸馏水研磨，然后溶解于375ml浓盐酸中。4℃冰箱放置24h，使几丁质完全溶解，然后用纱布过滤，滤液用蒸馏水定容至1000ml，并不断搅拌。3000rpm离心10min，弃上清液，沉淀用蒸馏水冲洗，溶解后再离心，反复操作10-15次直至溶液pH值呈中性为止，最后定容至1000ml。
几丁质产酶培养基：几丁质0.5g，MgSO4·7H2O 0.06g，FeSO4·7H2O 0.01g，NH4NO30.3g，KH2PO4 0.2g，用蒸馏水定容至100ml，121℃高温灭菌。
N-乙酰葡萄糖标准曲线的制定：配制N-乙酰氨基葡萄糖(NAG)1mg/ml的标准溶液，取7支容积＞25ml试管，加入0，0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2ml试剂，后加入1.5ml DNS试剂，最后定容为5ml。将各管混匀，在沸水中准确加热5min，取出后立即用冷水冷却至室温，再向每个试管加入20ml蒸馏水，摇均。依次取混匀液150μL加入到96孔板中，使用酶标仪在540nm下按照NAG浓度从低到高测定吸光值，以NAG浓度(mg/mL)为横坐标，OD值为纵坐标，绘制出标准曲线，结果如附图2所示。
几丁质酶酶活测定：将棘孢木霉FJ069接种PDA平板培养，48h后用直径5mm打孔器打取菌落边缘三块菌饼于PD培养液中。将100ml PD培养液装入250ml三角瓶，置于28℃、180rpm摇床培养。72h后用真空抽滤器抽干菌丝，取1g菌丝接种于100ml产酶培养基，置于28℃，180rpm摇床培养，每样品三个重复。分别于第三天测定几丁质酶酶活。取1％胶态几丁质2ml、粗酶液5ml和50mM磷酸盐缓冲液(pH值＝6)2ml加入玻璃管中，以及37℃水浴3h，对照组在两者加入玻璃管后迅速沸水浴5min灭活酶，取出后立即加入1.5ml DNS试剂，迅速放入沸水中煮沸10min，取最终反应液150μl，最后测540nm OD值，与标准曲线对比，计算其几丁质酶活大小。
表2棘孢木霉FJ069的几丁质酶活性
可以看出，本发明棘孢木霉菌株FJ069具有较高的几丁质酶活性。
实施例4：固体发酵基质中的产孢量测定
将棘孢木霉FJ069在PDA培养基上活化，28℃培养72h，用灭菌蒸馏水洗下分生孢子，制成孢子悬浮液，孢子悬浮液中孢子数为106-108个/mL；然后接种到灭菌的固体发酵基质(麦麸：玉米粉：稻壳＝5：3:2)中，放在温度28℃，湿度80％条件下培养72小时；发酵干燥后进行粉碎机中粉碎，粉碎后经过100目振荡筛后，收集孢子粉，对其孢子粉采用皿球计数板法和稀释涂平板法计算得到棘孢木霉FJ069产孢量为100亿/克。该菌株产孢速度快，产孢数量大，合适应用于工业化木霉孢子粉的生产，节约成本和生产时间。
实施例5：棘孢木霉(Trichodema asperellum)FJ069用于促进种子萌发。
孢子悬浮液制备：将棘孢木霉FJ069菌株接种于PDA平板，28℃培养72-96h后，然后用涂布器刮取PDA平板上的木霉孢子，制成孢子悬浮液浓度为1×107CFU/ml。
孢子悬浮液对种子萌发的影响：选健康和大小均一的黄瓜、青菜、水稻、甜瓜、番茄种子，经75％酒精消毒10min后，再用无菌水冲洗3次。每皿分别加入30粒黄瓜种子、50粒青菜种子、50粒水稻、30粒甜瓜和50粒番茄种子，然后向每个培养皿中分别加入孢子悬浮液(1×107CFU/ml)15ml，使其完全没过种子，处理2h后，将处理后的种子放入垫有双层滤纸的直径为90mm的无菌培养皿中。以清水处理作为对照(CK)，共设置5个处理和1个对照，每个处理和对照重复3次。7d后测量发芽率。
表3本发明棘孢木霉FJ069促种子萌发效果
通过表3可以看出，本发明棘孢木霉FJ069能够提高种子萌发率，具有促进种子萌发效果。
实施例6：棘孢木霉(Trichodema asperellum)FJ069促进作物的根生长。
筛选200粒大小基本相同，饱满的西瓜、茄子、番茄、辣椒种子经75％乙醇和1％(v/v)的次氯酸钠消毒10min后，用无菌水冲洗3遍，装入5个培养皿(每皿40粒)进行催芽，待出芽后，选择具有相同出芽状态的种子播种于装有灭菌育苗土的苗盘。生长30d后，选取大小、生长一致幼苗为实验材料。
将棘孢木霉FJ069菌株接种于PDA平板，28℃培养72-96h后，然后用涂布器刮取PDA平板上的木霉孢子，制成孢子悬浮液浓度为1×107CFU/ml。将孢子悬浮液50ml灌入幼苗根部，以清水处理作为对照(CK)，共设置5个处理和1个对照，重复3次。于15d后将幼苗拔出，用清水清洗干净，晾干表面水分后收集作物的根，测量根的长度。然后剪下作物的根，将根部擦干，称其鲜重。
表4本发明棘孢木霉FJ069促根生长效果
本发明棘孢木霉FJ069对4种农作物根系均有促进效果，其中对番茄和辣椒的促进效果尤为明显，对辣椒根部重量提升了117％。
实施例7：棘孢木霉(Trichodema asperellum)FJ069抑菌活性和重寄生能力测定
将棘孢木霉FJ069菌株和植物病原真菌接种于PDA平板上，28℃培养72-96h，分别从菌落边缘用5mm的打孔器打取菌饼，然后同时转接在PDA平板上，两菌饼相距5cm；将平板置于28℃培养10天后观察计算抑菌率及重寄生能力，不接木霉菌的，只接病原菌的为对照，试验重复3次。抑菌率及重寄生能力，按以下公式和标准计算：
抑菌率(％)＝((对照病原菌半径-对峙病原菌半径)/对照病原菌半径)×100％
重寄生能力分级标准：
+++++：木霉菌完全覆盖病原菌。
++++：木霉菌丝中等覆盖病原菌。
+++：木霉菌丝微弱覆盖病原菌。
++：木霉菌丝极微弱覆盖病原菌。
+：木霉菌丝与病原菌丝之间互不覆盖。
表5本发明棘孢木霉FJ069的抑菌效果和重寄生能力
本发明棘孢木霉FJ069对香蕉枯萎病菌、芒果炭疽病菌、番茄灰霉病菌、白绢病菌、豇豆枯萎病菌、苹果轮纹病菌、稻瘟病菌、芒果蒂腐病菌、小麦赤霉病菌、小麦纹枯病菌、蔓枯病菌、立枯丝核菌等常见农作物病原菌均具有较高的抑菌效果。尤其是对番茄灰霉病菌的抑菌率高达94.33％。
重寄生能力，棘孢木霉FJ069的菌丝对香蕉枯萎病菌、芒果炭疽病菌、番茄灰霉病菌、白绢病菌、豇豆枯萎病菌、苹果轮纹病菌、稻瘟病菌、芒果蒂腐病菌、小麦纹枯病菌、蔓枯病菌、立枯丝核菌等常见作物病原菌均具有一定的重寄生能力，其中，香蕉枯萎病菌、番茄灰霉病菌、白绢病菌、豇豆枯萎病菌、苹果轮纹病菌、稻瘟病菌、蔓枯病菌、立枯丝核菌重寄生能力较强。
实施例8：棘孢木霉(Trichodema asperellum)FJ069对番茄灰霉病的防治效果测定
以番茄灰霉病防治为例，试验采用棘孢木霉FJ069孢悬液浓度为1×107CFU/ml。番茄种植密度约为3500株/亩，土壤为砂壤土。以喷雾清水为对照，每个处理小区面积为4m2，各小区植株长势基本一致，随机区组排列，3次重复。选择灰霉病前茬发病较严重的田块进行试验，于发病中期进行第1次喷雾孢悬液，采用手动喷雾器对叶片及植株均匀喷雾施药，每个处理喷施孢悬液3L，连续喷洒2次，每隔10d喷一次。在第2次喷药10d后，调查叶片的番茄灰霉病发病情况。
番茄灰霉病病情分级标准：
0级，叶片无病斑；1级，病斑面积占整个叶面积的5％以下；2级，病斑面积占整个叶面积的6％～15％；3级，病斑面积占整个叶面积的16％～25％；4级，病斑面积占整个叶面积的26％～50％；5级，病斑面积占整个叶面积的51％以上。按照如下公式计算病情指数及防效。
可以看出，本发明棘孢木霉FJ069能够显著降低番茄灰霉病发生，对番茄灰霉病具有良好的防治效果。
序列表1：
序列表
<110> 海南大学
<120> 棘孢木霉FJ069及其应用
<130> 1
<141> 2019-08-02
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 608
<212> DNA
<213> 棘孢木霉(Trichoderma asperellum)
<400> 1
cagggaattt tcggcctcga ttctccctcc aaattcaatt gtgcccgacg attctgaaga 60
gaattttcgt gtcgacaatt tttcgtcacc ccgctttcca ttacccctcc tttgcagcga 120
cgcaaatttt ttttgctgtc ttttggtttt agtggggttt cttgtgcacc ccactagctc 180
actgcttttt tttttttttg ggttcccccc cccttccccc cccttaaaag gttctggggt 240
ttttgggttt tccagaaggc caaacctttt tcccaaaaaa agaaaccccc aaaacccgaa 300
agggttcctt caaaaaccct tgggtttttg aaaaacccaa gggcaaaggg ggggggggga 360
acccccccca aatttccttg gggaaattca aaacccccaa aaaatttttc cccccctttg 420
ggattttttt ttccacaact tccggcttca attggaaacc cggggtaaaa gggaatttca 480
aaaacccccc ggcccccggg attttcttaa aaaaaataac ccggggattt cccaggggaa 540
atgccccttt tccaattttt cccccgggac tgggaaattc aagggtggtt ttccccaaag 600
gagggaaa 608

Claims (8)

1.一种棘孢木霉（Trichodema asperellum）FJ069，该菌株的保藏编号为CGMCCNo.17976。
2.根据权利要求1所述的棘孢木霉（Trichodema asperellum）FJ069，其特征在于：所述的棘孢木霉（Trichodema asperellum）FJ069几丁质酶活性为0.9132 U/ml，在固体发酵基质（麦麸：玉米粉：稻壳=5：3:2）中培养72小时，其产孢量为100亿/克，其产孢速度快，产孢量大，用于工业化木霉菌孢子粉的生产。
3.一种权利要求1或2所述的棘孢木霉（Trichodema asperellum）FJ069的应用，其特征在于：棘孢木霉（Trichodema asperellum）FJ069用于促进农作物根部生长。
4.根据权利要求3所述的棘孢木霉（Trichodema asperellum）FJ069的应用，其特征在于：棘孢木霉（Trichodema asperellum）FJ069用于促进辣椒根部生长，相比于清水对照组，使辣椒根部重量提升了117%。
5.一种权利要求1或2所述的棘孢木霉（Trichodema asperellum）FJ069的应用，其特征在于：棘孢木霉（Trichodema asperellum）FJ069用于促进种子萌发。
6.一种权利要求1或2所述的棘孢木霉（Trichodema asperellum）FJ069的应用，其特征在于：棘孢木霉（Trichodema asperellum）FJ069有效抑制植物病原菌生长。
7.根据权利要求6所述的棘孢木霉（Trichodema asperellum）FJ069的应用，其特征在于：所述的病原菌是香蕉枯萎病菌、芒果炭疽病菌、番茄灰霉病菌、白绢病菌、豇豆枯萎病菌、苹果轮纹病菌、稻瘟病菌、芒果蒂腐病菌、小麦赤霉病菌、小麦纹枯病菌、蔓枯病菌、立枯丝核菌中的任意一种或多种。
8.根据权利要求7所述的棘孢木霉（Trichodema asperellum）FJ069的应用，其特征在于：所述的棘孢木霉（Trichodema asperellum）FJ069对番茄灰霉病防治效果达84.74%。
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