CN110272833B - 哈茨木霉hl119及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及的是哈茨木霉HL119及其应用，这株哈茨木霉（Trichoderma harzianum）HL119，该菌株的保藏编号为CGMCC No.17980。本发明所提供的哈茨木霉菌株具有良好的促进种子萌发、促进作为根部生长以及防治植物病原菌所导致的病害的效果，这株哈茨木霉HL119对番茄灰霉病菌的抑菌率高达93.85%。

Description

哈茨木霉HL119及其应用
一、技术领域
本发明首次发现了一株哈茨木霉HL119，该菌株的拉丁文分类命名为：Trichoderma harzianum，该菌株已于2019年6月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，保藏编号：CGMCC No.17980。
本发明涉及一株可用于农业生产的哈茨木霉菌及其用途，具体涉及的是一株哈茨木霉HL119及其应用。
二、背景技术
木霉菌(Trichoderma spp.)属半知菌亚门(Deuteromycotina)，丛梗孢目(Moniliales)，木霉属(Trichoderma)，是一种在土壤中分布极为广泛的真菌，也是一种对植物根际环境有益的重要生防菌，可促进植物生长发育，在植物抗病抗逆等方面起着重要作用。自1932年Weindling发现木素木霉菌可寄生在多种土传病原菌，人们开始意识到木霉菌对植物病原菌具有潜在的防治效果。
目前报道哈茨木霉菌是农业生产中重要的生防菌种，例如中国发明专利申请CN109337829A公开了哈茨木霉菌剂的制备，中国发明专利申请CN201811271848.2公开了哈茨木霉的促生长作用。因此，寻找新的哈茨木霉菌株对农业生产来讲具有重要的意义。
三、发明内容
本发明的一个目的是提供哈茨木霉HL119，这种哈茨木霉HL119用于促进农作物根部生长、抑制植物病原菌生长；本发明的另一个目的是提供这株哈茨木霉HL119的应用。
本发明采用的技术方案是：这株哈茨木霉(Trichoderma harzianum)HL119，该菌株的保藏编号为CGMCC No.17980。
上述方案中哈茨木霉(Trichoderma harzianum)HL119的几丁质酶活性为0.8867U/ml。
上述哈茨木霉(Trichoderma harzianum)HL119用于促进农作物种子萌发。
上述方案中哈茨木霉(Trichoderma harzianum)HL119用于促进种子萌发，青菜萌发率97.68％。
上述哈茨木霉(Trichoderma harzianum)HL119用于促进农作物根生长。
上述哈茨木霉(Trichoderma harzianum)HL119用于抑制植物病原菌生长。
上述方案中病原菌是香蕉枯萎病菌、芒果炭疽病菌、番茄灰霉病菌、白绢病菌、豇豆枯萎病菌、苹果轮纹病菌、稻瘟病菌、芒果蒂腐病菌、小麦赤霉病菌、小麦纹枯病菌、蔓枯病菌、立枯丝核菌中的任意一种或多种。
上述方案中哈茨木霉HL119对番茄灰霉病菌的抑菌率高达93.85％。
所述的哈茨木霉HL119对芒果炭疽病防效77.39％
有益效果：
本发明所提供的哈茨木霉菌株具有良好的促进种子萌发、促进作为根部生长以及防治植物病原菌所导致的病害的效果。
保藏说明
菌种名称：哈茨木霉HL119；
拉丁名：Trichoderma harzianum；
保藏编号：CGMCC No.17980；
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院；
保藏日期：2019年6月19日。
四、附图说明
图1为本发明哈茨木霉菌株β-1,3-葡聚糖酶活性测定所用葡萄糖标准曲线；
图2为本发明哈茨木霉菌株几丁质酶活性测定所用N-乙酰氨基葡萄糖标准曲线。
五、具体实施方式：
下面结合具体实施例详细描述本发明，所述实施例用于理解而不是限制本发明。
一株新的哈茨木霉(Trichoderma harzianum)HL119，它在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.17980。
哈茨木霉HL119菌落呈绒毛状，菌株呈同心圆环，菌丝呈金字塔形，分生孢子梗常呈现以主轴对称分布，顶端具有3或5个瓶梗，少数具有成对瓶梗(2或4个)。主轴两端间隔的侧生分支，每分支直接产生瓶梗或产生次级分支，最多产生三次级分支，次级分支少数成对，成对瓶梗横向不对称，瓶梗顶部缢缩，6.2-7.5μm×3.2-3.5μm中间稍有加粗，基部缢缩，产孢细胞1.7-2.2μm宽，瓶梗长度与产孢细胞宽比例为2.0-2.9，瓶梗最宽部与产包宽度比为1.1-1.2。分生孢子表面光滑，呈绿色，2.5-3.0μm×2.7-3.5μm，长宽比为1.0-1.2。
实施例1：哈茨木霉HL119的分离和保藏
1、哈茨木霉HL119，采集自黑龙江省伊春市的玉米地中。
土样采集：土壤的采集选用五点对角线取样法。即在采集地块的对角线选5等分点，然后用深度25cm的的取土器在每一个点钻取约15-20cm的土样，再将5份土混合均匀，四分法取约50g的土样装入自封袋。在实验室内分装到50ml的塑料瓶中，4℃保存待用。
木霉菌分离：采用稀释平板法，从冰箱中取10g土壤样品装入盛有90ml灭菌水和5-10粒直径4mm玻璃珠的三角瓶，然后在200r/min的摇床上摇30min。取5ml倒入盛有45ml灭菌水的三角瓶中，混匀后，再吸取5ml转入盛有45ml灭菌水的三角瓶中，充分混匀后吸取0.2ml于直径9cm的平板上，用涂布器涂抹均匀，放于28℃恒温培养箱中培养。48-72h后挑取产绿色分生孢子的菌落，转接到PDA平板上，28℃恒温培养箱中继续培养，待菌落直径长到4-5cm时再次转接PDA平板28℃恒温培养。
2、哈茨木霉HL119菌种保藏
哈茨木霉菌株HL119于2019年6月19日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)进行真空冻干保藏，保藏编号为CGMCC No.17980，保藏期限为30年。
3、通过形态学鉴定结合分子生物学(基因测序)鉴定结果为哈茨木霉。TEF序列见序列表1。
实施例2：β-1,3-葡聚糖酶活性测定
DNS试剂的配制：称取酒石酸钾钠91g溶于500mL蒸馏水中，向溶液中依次加入3,5-二硝基水杨酸3.15g和NaOH 20g，加热搅拌，使之溶解，再加入苯酚2.5g，无水亚硫酸钠2.5g，搅拌使之溶解，冷却后定容至1000ml，贮于棕色瓶中。
β-1，3-葡聚糖发酵产酶培养基配制：酵母粉3g，NaNO3 0.3g，MgSO4·7H2O 0.05g，K2HPO4 0.1g，FeSO4·7H2O 0.001g，KCl 0.05g，用蒸馏水定容至100ml，121℃高压蒸汽灭菌。
葡萄糖标准曲线的制定：准确称取经105℃烘干至恒重的无水葡萄糖1000mg，溶于蒸馏水中，定容至1000ml，得到1mg/ml的葡萄糖标准溶液。取7支带刻度的试管，分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1、1.2ml的葡萄糖溶液，后加入3ml DNS，最后定容至5ml，置于沸水中水浴5min，冷却后加蒸馏水定容至25ml，摇匀，于540nm波长下测OD值。以葡萄糖实际含量(mg/ml)为横坐标，OD值为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线，结果如附图1所示。
将哈茨木霉HL119接种PDA平板培养，48h后用直径5mm打孔器打取菌落边缘三块菌饼于PD培养液中。将100ml PD培养液装入250ml三角瓶，置于28℃，180rpm摇床培养。72h后用真空抽滤器抽干菌丝，取1g菌丝接种于100ml产酶培养基，置于28℃，180rpm摇床培养，设置三个重复。于第三天测定β-1,3-葡聚糖酶酶活。取粗酶液0.5ml，置于40℃水浴锅中预热2min后加入经40℃预热的0.1mg/ml的昆布多糖溶液lmL，50mM乙酸钠缓冲液(pH＝5)0.5ml，混匀。于40℃准确反应1h后，立即加入0.75mLDNS溶液以终止反应，混匀后沸水浴准确反应15min，立即取出放入冰水浴中冷却至室温，25℃放置2min，再加入5ml蒸馏水混匀。反应液混匀后，取150μl反应混合液加入96孔加样板，在540nm测定吸光度，与标准曲线对比，计算酶活数值。
一个β-1,3-葡聚糖酶酶活单位定义：在特定条件下(40℃，pH＝5)，以1h催化分解昆布多糖产生lug葡萄糖酶量。
表1哈茨木霉HL119的β-1,3-葡聚糖酶活性
Figure BDA0002155981970000051
可以看出，本发明棘孢木霉菌株HL119具有较好的β-1,3-葡聚糖酶活性。
实施例3：几丁质酶活性测定
胶态几丁质的制备：取10g几丁质加入少许蒸馏水研磨，然后溶解于375ml浓盐酸中。4℃冰箱放置24h，使几丁质完全溶解，然后用纱布过滤，滤液用蒸馏水定容至1000ml，并不断搅拌。3000rpm离心10min，弃上清液，沉淀用蒸馏水冲洗，溶解后再离心，反复操作10-15次直至溶液pH值呈中性为止，最后定容至1000ml。
几丁质产酶培养基：几丁质0.5g，MgSO4·7H2O 0.06g，FeSO4·7H2O 0.01g，NH4NO3 0.3g，KH2PO4 0.2g，用蒸馏水定容至100ml，121℃高温灭菌。
N-乙酰葡萄糖标准曲线的制定：配制N-乙酰氨基葡萄糖(NAG)1mg/ml的标准溶液，取7支容积＞25ml试管，加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2ml试剂，后加入1.5ml DNS试剂，最后定容为5ml，将各管混匀，在沸水中准确加热5min，取出后立即用冷水冷却至室温，再向每个试管加入20ml蒸馏水，摇均。依次取混匀液150μL加入到96孔板中，使用酶标仪在540nm下按照NAG浓度从低到高测定吸光值，以NAG浓度(mg/mL)为横坐标，OD值为纵坐标，绘制出标准曲线，结果如附图2所示。
几丁质酶的酶活测定：将哈茨木霉HL119接种PDA平板培养，48h后用直径5mm打孔器打取菌落边缘三块菌饼于PD培养液中。将100ml PD培养液装入250ml三角瓶，置于28℃、180rpm摇床培养。72h后用真空抽滤器抽干菌丝，取1g菌丝接种于100ml产酶培养基，置于28℃，180rpm摇床培养，每样品三个重复。分别于第三天测定几丁质酶酶活。取1％胶态几丁质2ml、粗酶液5ml和50mM磷酸盐缓冲液(pH＝6)2ml加入玻璃管中，以及37℃水浴3h，对照组在两者加入玻璃管后迅速沸水浴5min灭活酶，取出后立即加入1.5ml DNS试剂，迅速放入沸水中煮沸10min，取最终反应液150μl，最后测540nm OD值，与标准曲线对比，计算其几丁质酶活大小。
表2哈茨木霉HL119的几丁质酶活性
Figure BDA0002155981970000061
可以看出，本发明哈茨木霉菌株HL119具有较高的几丁质酶活性。
实施例4：哈茨木霉HL119用于促进种子萌发。
孢子悬浮液制备：将哈茨木霉HL119菌株接种于PDA平板，28℃培养72-96h后，然后用涂布器刮取PDA平板上的木霉孢子，制成孢子悬浮液浓度为1×107。
孢子悬浮液对种子萌发的影响：选健康和大小均一的黄瓜、青菜、水稻、甜瓜、番茄种子，经75％酒精消毒10min后，再用无菌水冲洗3次。每皿分别加入30粒黄瓜种子、50粒青菜种子、50粒水稻、30粒甜瓜和50粒番茄种子，然后向每个培养皿中分别加入孢子悬浮液15ml，使其完全没过种子，处理2h后，将处理后的种子放入垫有双层滤纸的直径为90mm的无菌培养皿中。以无菌水处理作为对照(CK)，共设置5个处理和1个对照，每个处理和对照重复3次。7d后测量发芽率。
表3本发明哈茨木霉HL119促种子萌发效果
Figure BDA0002155981970000071
通过表3可以看出，本发明哈茨木霉HL119能够明显提高种子萌发率，具有显著的促种子萌发效果，其中青菜种子萌发率为97.68％。
实施例5：哈茨木霉HL119促进作物的根生长。
筛选200粒大小基本相同，饱满的西瓜、茄子、番茄、辣椒种子经75％乙醇和1％(v/v)的次氯酸钠消毒10min后，用无菌水冲洗3遍，装入5个培养皿(每皿40粒)进行催芽，待出芽后，选择具有相同出芽状态的种子播种于装有灭菌育苗土的苗盘。生长30d后，选取大小、生长一致幼苗为实验材料。
将哈茨木霉HL119菌株接种于PDA平板，28℃培养72-96h后，然后用涂布器刮取PDA平板上的木霉孢子，制成孢子悬浮液浓度为1×107。将孢子悬浮液50ml灌入幼苗根部，以清水处理作为对照(CK)，共设置5个处理和1个对照，每个处理和对照重复3次。于15d后将幼苗拔出，用清水清洗干净，晾干表面水分后收集作物的根，测量根的长度。然后剪下作物的根，将根部擦干，称其鲜重。
表4本发明哈茨木霉HL119促根生长效果
Figure BDA0002155981970000072
Figure BDA0002155981970000081
本发明哈茨木霉HL119对4种作物根生长有一定的促进作用。
实施例6：哈茨木霉HL119抑菌活性和重寄生能力测定
将哈茨木霉HL119菌株和植物病原真菌接种于PDA平板上，28℃培养72-96h，分别从菌落边缘用5mm的打孔器打取菌饼，然后同时转接在PDA平板上，两菌饼相距5cm；将平板置于28℃培养10天后观察计算抑菌率及重寄生能力，不接木霉菌的，只接病原菌的为对照，试验重复3次。抑菌率及重寄生能力，按以下公式和标准计算：
抑菌率(％)＝((对照病原菌半径-对峙病原菌半径)/对照病原菌半径)×100％
重寄生能力分级标准：
+++++：木霉菌完全覆盖病原菌。
++++：木霉菌丝中等覆盖病原菌。
+++：木霉菌丝微弱覆盖病原菌。
++：木霉菌丝极微弱覆盖病原菌。
+：木霉菌丝与病原菌丝之间互不覆盖。
表5本发明哈茨木霉HL119的抑菌效果和重寄生能力
Figure BDA0002155981970000082
Figure BDA0002155981970000091
本发明哈茨木霉HL119对香蕉枯萎病菌、芒果炭疽病菌、番茄灰霉病菌、白绢病菌、豇豆枯萎病菌、苹果轮纹病菌、稻瘟病菌、芒果蒂腐病菌、小麦赤霉病菌、小麦纹枯病菌、蔓枯病菌、立枯丝核菌等常见作物病原菌均具有较高的抑菌效果。尤其是对芒果炭疽病菌抑制率为94.31％。
重寄生能力，哈茨木霉HL119的菌丝对香蕉枯萎病菌、芒果炭疽病菌、番茄灰霉病菌、白绢病菌、豇豆枯萎病菌、苹果轮纹病菌、稻瘟病菌、芒果蒂腐病菌、小麦纹枯病菌、蔓枯病菌、立枯丝核菌等常见作物病原菌均具有一定的重寄生能力，其中，番茄灰霉病菌、豇豆枯萎病菌、苹果轮纹病菌、稻瘟病菌、小麦纹枯病菌、蔓枯病菌、立枯丝核菌重寄生能力较强。
实施例7：哈茨木霉HL119对芒果炭疽病的防效。
试验采用哈茨木霉HL119孢悬液浓度为1×107CFU/ml，分别用70％酒精和无菌水擦拭果实表面进行清洁，然后用注射器注射芒果炭疽菌孢子悬浮液，每果接种5个位置，重复5次。将接种的果实在28±1℃的湿室中培养，相对湿度为85±5％，光周期为12小时，培养9天，每天观察记录芒果的发病情况。与病原菌接种的对称位置用无菌棉蘸木霉菌发酵液覆盖接种点1min，共3次，然后自然晾干。以无菌水处理的芒果为对照。重复5次。将接种的果实28±1℃的湿室中培养，相对湿度为85±5％，光周期为12小时，培养3天后观察记录芒果的发病情况，测量并记录病斑大小。
Figure BDA0002155981970000101
Figure BDA0002155981970000102
Figure BDA0002155981970000103
Figure BDA0002155981970000111
序列表
<110> 海南大学
<120> 哈茨木霉菌株及用途
<130> 1
<141> 2019-08-02
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 620
<212> DNA
<213> 哈茨木霉(Trichoderma harzianum )
<400> 1
atttcgggct ccttccaatc atttttggca caatcatatg cccgacaatt ctgctctcag 60
tttttgtctt ttttttccag cgtcaccccg ctttgccagt ctacctaccc ctcctttggc 120
acagcaaaaa ttttctggct gccttgtttg gcttttagtg gggtgtcaaa ttttttggca 180
gcaaccccgc tatcgccact gcacctcttc catcacccac cacatgctat ttgctcaatc 240
gcgtcgtctt tttttgttca ttatgctgat catgcttcaa tcaataggaa gccgccgaac 300
tcggcaaggg ttccttcaag tatgcgtggg ttcttgacaa gctcaaggcc gagcgtgagc 360
gtggtatcac catcgacatt gccctctgga agttcgagac tcccaagtac tatgtcaccg 420
tcattggtat gttttggact cttctctcta gctatcgaca ttccaagtcc gccattctaa 480
catgctcttc ccacagacgc tcccggtcac cgtgatttca tcaagaacat gatcactggt 540
acctcccagg ctgactgcgc tatcctgatt atcgctgccg gtactggtga gttcgaggct 600
ggtatctccc aaggatggca 620

Claims (7)

1.一株哈茨木霉（Trichoderma harzianum）HL119，该菌株的保藏编号为CGMCC No.17980。
2.根据权利要求1所述的哈茨木霉（Trichoderma harzianum）HL119，其特征在于：所述的哈茨木霉（Trichoderma harzianum）HL119的几丁质酶活性为0.8867U/ml。
3.一种权利要求1或2所述的哈茨木霉（Trichoderma harzianum）HL119的应用，其特征在于：哈茨木霉（Trichoderma harzianum）HL119用于促进农作物根部生长，农作物为西瓜、茄子、番茄、辣椒。
4.一种权利要求1或2所述的哈茨木霉（Trichoderma harzianum）HL119的应用，其特征在于：哈茨木霉（Trichoderma harzianum）HL119用于促进黄瓜、青菜、水稻、甜瓜、番茄种子萌发。
5.根据权利要求4所述的哈茨木霉（Trichoderma harzianum）HL119的应用，其特征在于：所述的哈茨木霉（Trichoderma harzianum）HL119用于促进种子萌发，青菜种子萌发率为97.68%。
6.一种权利要求1或2所述的哈茨木霉（Trichoderma harzianum）HL119的应用，其特征在于：哈茨木霉（Trichoderma harzianum）HL119用于抑制植物病原菌生长；所述的病原菌是香蕉枯萎病菌、芒果炭疽病菌、番茄灰霉病菌、白绢病菌、豇豆枯萎病菌、苹果轮纹病菌、稻瘟病菌、芒果蒂腐病菌、小麦赤霉病菌、小麦纹枯病菌、蔓枯病菌、立枯丝核菌中的任意一种或多种。
7.根据权利要求6所述的哈茨木霉（Trichoderma harzianum）HL119的应用，其特征在于：所述的哈茨木霉HL119对芒果炭疽病菌的抑制率为94.31%，对芒果炭疽病防效高达77.39%。
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