CN105296364A - 一种草酸青霉及制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种草酸青霉及制备方法和应用，其步骤：A、拮抗真菌的分离纯化：取健康油茶根际土样加入到盛有无菌水和玻璃珠的瓶中，在摇床下振荡后制成悬浮液；B、初筛：采用平板对峙法筛选能拮抗油茶病原菌的真菌，将病原菌饼和拮抗菌菌饼放置平板中心线上，分别距离平板中心1.5？cm，恒温培养后筛选抑菌直径大于8？mm的菌株；C、复筛：将初筛的菌株经液体培养基培养后，离心，除菌体，取无菌滤液与灭菌后的PDA固体培养基混匀后倒平板，平板中央接入油茶病原菌菌饼，获得拮抗作用最强菌株草酸青霉。草酸青霉在制备治疗或预防油茶病害中的应用，对油茶炭疽病、油茶溃疡病、油茶黑斑病等多种病害的抑菌率均达到90%以上。

Description

一种草酸青霉及制备方法和应用

技术领域

本发明涉及植物保护领域，尤其涉及一种能拮抗油茶主要病害的生防菌株。同时还涉及一种草酸青霉PeniciliumoxalicumstrainF217-3的制备方法，还涉及一种草酸青霉PeniciliumoxalicumstrainF217-3在制备治疗或预防油茶主要病害药物中的应用。

背景技术

油茶(Camelliaoleifera)属山茶科(Theaceae)山茶属(Camellia)，是我国南方特有的一种木本油科树种，请见(庄瑞林.中国油茶[M].北京：中国林业出版社，2008：1-2.)。油茶全身都是宝，种子是优质、高级食用油的原料；茶油在医药、工业上应用广泛；茶枯也是优质的有机肥料，提取后的固体残渣可作为猪的精饲料。因此，油茶具有很好的应用开发前景，是我国很重要的经济作物之一。

随着我国南方各地油茶种植面积逐年增加，各类油茶病害也日趋严重。油茶炭疽病、叶枯病、软腐病是由病原物引起的3种毁灭性病害，在我国各油茶产区普遍发生，请见(束庆龙，张良富.中国油茶栽培与病虫害防治[M].北京：中国林业出版社，2009：147-148.)。同样，油茶其他病害如根腐病、茶饼病、黑斑病等也时常发生，每年油茶产业因病害造成了巨大的经济损失。寻求安全、高效和经济的生物源农药是当前防治油茶病害的当务之急，其中拮抗微生物在植物病害生物防治中起到十分重要的作用。

在植物病害的生物防治中研究和应用较多的微生物主要有细菌类、真菌类和放线菌。真菌类主要有木霉属的哈茨木霉、康宁木霉、青霉、丝核菌、酵母菌等。MelgarejoP等报道了从桃枝条分离的penicilliumpurpurogenum对桃褐腐病原菌的防效果(MelgarejoP,CalAD,M.-SagastaE.InfluenceofPenicilliumfrequentansandtwoofitsantibioticsonproductionofstromatabyMonilinialaxainculture[J].Canadianjournalofbotany,1989,67(1):83-87.)；申光辉等筛选到灰黄青霉(Penicilliumgriseofulvum)和土曲霉(Aspergillusterreus)两种拮抗真菌对草莓根腐病有较强的拮抗作用(申光辉，薛泉宏，张晶，等.草莓根腐病拮抗真菌筛选鉴定及其防病促生作用[J].中国农业科学，2012(22)：4612-4626.)；王国平等从南方红豆杉分离到的一种新内生真菌紫杉木霉Trichodermataxi菌株，该内生真菌通过菌丝缠绕附着等重寄生方式，导致水稻纹枯病菌菌丝断裂或其内含物降解直至死亡(王国平，鲁书玲，郑必强，等.内生真菌紫杉木霉ZJUF0986菌株及其活性代谢产物防治水稻纹枯病的效果[J].中国生物治2009(01)；30-34.)；同时也有生物农药草酸青霉水剂对玉米小斑病的防治研究(王勇，张文革，何璐，等.生物农药草酸青霉水剂对玉米小斑病的防治效果[J].安徽农业科学，2007，35(7)：1965-1966.)。然而，关于青霉菌在油茶主要病害上的防治研究及应用报道很少，且还未见对防治油茶黑斑病及油茶溃疡病两种病害的报道。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种草酸青霉PeniciliumoxalicumstrainF217-3，该菌株分离自健康油茶根际土壤，对油茶主要病害均具有高效的拮抗作用，是一株广谱性生防青霉菌，填补了利用草酸青霉防治多种油茶病原真菌的技术空白，并具有较强溶解多种无机磷的能力和促进作物生长的作用，对油茶无公害防治具有一定的实际意义。

本发明的另一个目的是在于提供了一种草酸青霉PeniciliumoxalicumstrainF217-3生防菌剂的制备方法，方法易行，操作简便，涉及到的固体培养基是生活中容易获得且成本低廉的原料，实用性强。

本发明的第3个目的是在于提供了一种草酸青霉PeniciliumoxalicumstrainF217-3在制备治疗或预防油茶主要病害药物中的应用，该菌株的生防菌剂可高效防治油茶炭疽病、叶斑病、黑斑病、溃疡病等，平板对峙实验表明，该草酸青霉PeniciliumoxalicumstrainF217-3对油茶主要病害的抑菌率达到90％以上。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

其技术构思是：采用常规法进行分离、纯化和保存对油茶主要病害有拮抗作用的生防菌株。请见(姚丽瑾，王琦，付学池，等.小麦纹枯病生防芽孢杆菌的筛选及鉴定[J].中国生物防治，2008，24(1)：53-57.)。以油茶病原真菌为指示菌，分离得到的菌株为待检菌，采用平板对峙法筛选其中能拮抗油茶病原菌的拮抗菌。平板对峙法请见(T,BanhegyiI,HerpaiZ,etal.IsolationofBacillusstrainsfromtherhizosphereofcerealsandinvitroscreeningforantagonismagainstphytopathogenic,food-bornepathogenicandspoilagemicro-organisms[J].JournalofAppliedMicrobiology,2000,89(5):840-846.)然后采用发酵法进行复筛，将初筛到的菌株分别在液体培养基中培养24-50h后，培养液用0.22μm微孔过滤器过滤得到培养滤液。分别将培养滤液与约50℃的PDA固体培养基按照1:19混匀后倒入培养皿，冷却后在平板中央放入直径为7mm的油茶主要病原菌菌饼，以无菌水为对照，每个处理三次重复。5天后测量病原菌菌落直径。筛选出对油茶主要病害有拮抗作用的菌株。最终确定F217-3对油茶主要病害的拮抗作用最强，筛选得到效果明显且稳定的1株拮抗菌F217-3。发酵法请见(姚丽瑾，王琦，付学池，等.小麦纹枯病生防芽孢杆菌的筛选及鉴定[J].中国生物防治，2008，24(1)：53-57.)。

所述草酸青霉PeniciliumoxalicumstrainF217-3固体菌剂按下述方法获得：将青霉的保藏菌种置入试管斜面培养基中进行活化，再置入装有80mL液体培养基的250mL三角瓶中在摇床上培养36-50h，转速150-180rpm，温度25-30℃；结束后以3％-6％接种量(V/W)接入固体培养基在25-30℃环境中继续培养3-5d，每隔24-36h翻拌一次，至产孢；自然风干或者30-35℃烘干后粉碎过10-20目筛，获得固体菌剂，固体菌剂中的含菌量为10^9-11cfu/g。在获得草酸青霉PeniciliumoxalicumstrainF217-3固体菌剂的过程中，所述试管斜面培养基为：称取马铃薯200g，去皮，切成小块煮沸30min，两层纱布过滤后加入葡萄糖20g，融化后补足水至1000mL，琼脂15-20g，121℃高压灭菌20min获得试管斜面培养基；液体培养基去掉上述试管斜面培养基中琼脂成分获得；所述固体培养基为：麦麸、草炭、壳聚糖，它们的质量比为1：2：1。

一种拮抗油茶病害的草酸青霉PeniciliumoxalicumstrainF217-3的制备方法，其步骤是：

A、拮抗真菌的分离纯化：取健康油茶根际土样加入到盛有无菌水和玻璃珠的三角瓶中，制成悬浮液，在20-30℃温度下摇床中振荡。将土壤悬浮液移入盛有无菌水的试管中，制成10^-1菌悬液，依次类推，获得10^-2，10^-3，10^-4，10^-5以及10^-6菌悬液。梯度稀释后，涂布在分离培养基上，培养基配方如下(1L)：称取马铃薯200g，去皮，切成小块煮沸30min，两层纱布过滤后加入葡萄糖20g，融化后补足水至1000mL，琼脂15-20g，121℃高压灭菌20min。将涂布有菌悬液的平板置于培养箱中，观察分离培养基上菌落状态，用三步划线法进行分离纯化，分离到20株菌株统一编号登记如下：F217-1、F217-2、F217-3…F217-20。菌种保藏：接种斜面后，可在4℃短暂保藏。用50％(V/V)甘油(上海振兴化工一厂)作为保护剂，可在-80℃长久保藏。

B、拮抗真菌的初筛：采用平板对峙法筛选其中能拮抗油茶病原菌的拮抗真菌，将打好的病原菌饼和拮抗菌菌饼放置平板中心线上，分别距离平板中心1.5cm，置于恒温培养箱培养，观察抑菌带有无及大小，每个处理重复3次。进一步筛选抑菌直径大于8mm的菌株。通过上述步骤共获得3株对油茶主要病害有拮抗效果的菌株F217-1、F217-3、F217-15。

C、拮抗真菌的复筛：将初筛有拮抗作用的菌株经液体培养基培养后，10000r/min室温离心，用0.22μm的微孔滤膜过滤除去菌体，取拮抗菌滤液与灭菌后约50℃的PDA固体培养基按照1:19混匀后倒入培养皿，冷却后在平板中央放入直径为7mm的油茶主要病原菌菌饼，以无菌水为对照，每个处理三次重复。测量病原菌菌落直径。最后获得拮抗效果明显且稳定的1株拮抗菌草酸青霉(PeniciliumoxalicumstrainF217-3)

通过上述步骤获得了一种草酸青霉PeniciliumoxalicumstrainF217-3菌株。申请人从健康油茶根际土壤筛选得到一株青霉菌，结合生理生化特征和分子特征鉴定为草酸青霉，并命名为PeniciliumoxalicumstrainF217-3。该菌株PeniciliumoxalicumstrainF217-3已于2015年10月20日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，湖北省武汉市武昌珞珈山)，保藏编号为M2015625。

所述的一种草酸青霉PeniciliumoxalicumstrainF217-3菌株中含有SEQIDNO：1所示的核苷酸序列。

一种草酸青霉PeniciliumoxalicumstrainF217-3菌株有如下特征：PDA培养基上菌落圆形，边缘白色，孢子形成后菌落呈黄绿至深绿色；其显微图片显示，该菌分生孢子梗直立，无色，有分隔，分生孢子球形至椭圆形、无色至着色、光滑，大小为4-6μm×2-4μm；常成链状生长。

一种草酸青霉PeniciliumoxalicumstrainF217-3菌株在制备治疗或预防油茶主要病害药物中的应用，其应用基本过程是：

采用平板对峙培养法研究草酸青霉PeniciliumoxalicumstrainF217-3对油茶主要病害的拮抗作用。将打好直径为7mm的病原菌饼和拮抗菌菌饼放置平板中心线上，病原菌饼置于平板中央，拮抗菌饼分别距离平板中心1.5cm，置于28℃恒温培养箱培养，3-5天后观察抑菌带有无及大小，每个处理重复3次。抑菌率＝(对照菌落直径－处理菌落直径)/(对照菌落直径－7)×100％。

一种防治油茶主要病害的草酸青霉及其应用，它包括：

所述的一种草酸青霉PeniciliumoxalicumstrainF217-3在制备治疗或预防油茶主要病害药物中的应用，所述的油茶病为油茶炭疽病、油茶叶斑病、油茶软腐病、油茶黑斑病、油茶溃疡病。

所述的一种草酸青霉PeniciliumoxalicumstrainF217-3菌株应用于抑制油茶炭疽病、黑斑病病原菌分生孢子萌发，抑制或致畸油茶炭疽病菌、溃疡病菌和叶斑病菌菌丝。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

1.本发明的菌株草酸青霉PeniciliumoxalicumstrainF217-3，分离自油茶健康植株根际土壤，具有稳定的生态环境和生防作用。

2.本发明的生防菌株草酸青霉PeniciliumoxalicumstrainF217-3，可通过单一菌株同时防治多种油茶病害，包括鲜未报到的油茶黑斑病和油茶溃疡病，抗菌谱广泛，可有效降低防治成本。

3.平板对峙实验表明：该草酸青霉PeniciliumoxalicumstrainF217-3对油茶主要病害的抑菌率达到90％以上。

4.平板对峙实验表明：该草酸青霉PeniciliumoxalicumstrainF217-3对油茶主要病害具有明显的抑制作用；可以抑制油茶主要病原菌菌丝正常生长和孢子萌发。

附图说明

图1为一种草酸青霉PeniciliumoxalicumstrainF217-3菌落形态和显微形态示意图。

图2为一种F217-3与其他菌株的18SrDNA基因序列系统发育树示意图。

图3为一种拮抗真菌F217-3对炭疽病菌的形态影响示意图。

其中：A为正常生长状态下病原菌丝及孢子形态，B为在受到F217-3拮抗过程中病原菌的菌丝及孢子形态，下同。

图4为一种拮抗真菌F217-3对胶孢炭疽病菌的形态影响示意图。

图5为一种拮抗真菌F217-3对溃疡病菌的形态影响示意图。

图6为一种拮抗真菌F217-3对黑斑病菌的形态影响示意图。

图7为一种拮抗真菌F217-3对叶斑病菌的形态影响示意图。

一种草酸青霉PeniciliumoxalicumstrainF217-3在PDA培养基上菌落圆形，边缘白色，孢子形成后菌落呈黄绿至深绿色；其显微形态显示，该菌分生孢子梗直立，无色，有分隔，分生孢子球形至椭圆形、无色至着色、光滑，大小为4-6×2-4μm；常成链状生长，如图1所示。对菌株F217-3进行分子鉴定，将测得的18SrDNA序列(片段长度为680bp)与Genbank中己知序列进行比对，选取9株菌株用ClustalX2.1进行多序列比对分析，利用MEGA6.0软件采用邻接法进行系统发育树构建和聚类分析，MEGA6的Neighbor-Joining法构建系统进化树，如图2所示。菌株F217-3与GenBank中登录号为KP780809.1和EF103451.1菌株的同源性达到100％。结合上述形态和部分生理生化特征，可初步判定拮抗菌株F217-3属于草酸青霉。图3，图5和图7显示了拮抗菌F217-3对炭疽病菌、溃疡病菌和叶斑病菌菌丝的生长的抑制作用，其正常生长的病原菌菌丝丰富，光滑(如图3A，5A，7A)，F217-3的孢子可分别包围和散落在炭疽病菌、溃疡病菌和叶斑病菌菌丝周围，拮抗后的菌丝更细、畸形、断裂，菌丝数量明显减少(如图3B，5B，7B)。图4和图6显示了拮抗菌F217-3对胶孢炭疽病菌和黑斑病菌孢子产生的影响，图4和图6的A图是正常状态下病原菌孢子和菌丝的状态，有大量孢子散落在菌丝周围，经过F217拮抗作用后，胶孢炭疽病菌和黑斑病菌孢子产生量极少甚至被完全抑制(如图4B，6B)。

具体实施方式

本发明所用的试剂或原料，均购自商业渠道。

菌株来源：油茶胶胞炭疽病Colletotrichum.gloeosporioides，同文献中报道菌株(孟庆敏，周国英，刘君昂，等.油茶炭疽病拮抗细菌Y13主要抑菌物质分离纯化及作用方式[J].植物保护，2014，40(2)：36-42.)；油茶炭疽病Colletotrichumnicotianae同文献中报道菌株(李东升，张一扬.烟草炭疽病的形态特征和致病性研究[J].湖南农业科学，2009(5)：97-98.)；油茶叶斑病Phyllostictacapitalensis，同文献中报道菌株(马成,彭丽娟,吴石平.银杏叶点霉叶斑病病原菌鉴定[J].贵州农业科学,2014,42(12):126-128.)；油茶软腐病Agaricodochiumcamellia，同文献中报道菌株(赵丹阳,秦长生,廖仿炎.5种杀菌剂对油茶软腐病的防治研究[J].广东林业科技,2013,29(2):28-31.)；油茶黑斑病Altermariaalternate同文献中报道菌株(KobilerI,AkermanM,HubermanL,etal.采前与采后处理结合控制柿子贮藏过程中链格孢菌(Alternariaalternata)引起的黑斑病的研究[J].保鲜与加工,2011,5:025.)，油茶溃疡病Bothyosphaeriadothidea，同文献中报道菌株(SlippersB,CrousPW,DenmanS,etal.CombinedmultiplegenegenealogiesandphenotypiccharactersdifferentiateseveralspeciespreviouslyidentifiedasBotryosphaeriadothidea[J].Mycologia,2004,96(1):83-101.)本发明所述技术方案，如未特备说明，均为常规技术，所用试剂或原料，如未特别说明，均购自商业渠道。

供试培养基：Ⅰ.马铃薯蔗糖培养基(PSA)：马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂粉20g，蒸馏水1000mL；Ⅱ.燕麦培养基(OA)：燕麦片30g，琼脂粉20g，蒸馏水1000mL；Ⅲ.清水洋菜培养基(WA)：琼脂粉20g，蒸馏水1000mL；Ⅳ.玉米粉培养基(CMM)：玉米粉40g，蔗糖10g，琼脂20g，蒸馏水1000mL；Ⅴ.查氏培养基(CA)：蔗糖30g,硝酸钠3g，氯化钾0.5g，硫酸铁0.01g，硫酸镁0.5g，磷酸二氢钾1g，琼脂20g，蒸馏水1000mL。

实施例1：

草酸青霉PeniciliumoxalicumstrainF217-3的分离、筛选及鉴定，其步骤如下：

A、拮抗真菌的分离纯化：取健康油茶根际土样10g加入到盛有90mL无菌水和30-50颗玻璃珠的三角瓶中，制成1：10浓度的悬浮液，在28℃，180rpm摇床中振荡30min后，将菌悬液放置在80℃水浴中保持15min。将lmL土壤悬浮液移入盛有9mL无菌水的试管中，制成10^-1菌悬液，依次类推，获得10^-2，10^-3，10^-4，10^-5以及10^-6菌悬液。梯度稀释后，吸取100μL稀释倍数为10^-3-10^-6的菌悬液均匀涂布在分离培养基上，培养基配方如下(1L)：称取马铃薯200g，去皮，切成小块煮沸30min，两层纱布过滤后加入葡萄糖20g，融化后补足水至1000mL，琼脂15-20g，自然pH为6-7，121℃高压灭菌20min。将涂布有菌悬液的平板置于28℃培养箱中1周，24h后随即观察分离培养基上菌落状态，用三步划线法进行分离纯化，分离到20株菌株统一编号登记如下：F217-1、F217-2、F217-3…F217-20。菌种保藏：接种斜面后，可在4℃短暂保藏。用50％(V/V)甘油(上海振兴化工一厂)作为保护剂，可在-80℃长久保藏。

B、拮抗真菌的初筛：采用平板对峙法筛选其中能拮抗油茶病原菌的拮抗真菌，将打好直径为7mm的病原菌饼和拮抗菌菌饼放置平板中心线上，分别距离平板中心1.5cm，置于28℃恒温培养箱培养，3-5天后观察抑菌带有无及大小，每个处理重复3次。进一步筛选抑菌直径大于8mm的菌株。通过上述两步初筛共获得3株对油茶主要病害有拮抗效果的菌株F217-1、F217-3、F217-15。

C、拮抗真菌的复筛：将初筛有拮抗作用的菌株经液体培养基培养48h后，10000r/min室温(20℃-30℃)离心20min，用0.22μm的微孔滤膜过滤除去菌体，取拮抗菌滤液与灭菌后约50℃的PDA固体培养基按照1:19混匀后倒入培养皿，冷却至室温(20℃-30℃)后在平板中央放入直径为7mm的油茶主要病原菌菌饼，以无菌水为对照，每个处理三次重复。5天后测量病原菌菌落直径。最后获得拮抗效果明显且稳定的1株拮抗菌草酸青霉(PeniciliumoxalicumstrainF217-3)

通过上述的步骤制备获得了一种草酸青霉PeniciliumoxalicumstrainF217-3菌株，通过检测一种草酸青霉PeniciliumoxalicumstrainF217-3菌株中含有SEQIDNO：1所示的核苷酸序列。

该菌株草酸青霉PeniciliumoxalicumstrainF217-3已于2015年10月20日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，湖北省武汉市武昌珞珈山)，保藏编号为M2015625。

一种对油茶主要病害具有拮抗作用的草酸青霉PeniciliumoxalicumstrainF217-3，CCTCCNO：M2015625的鉴定：

一种草酸青霉PeniciliumoxalicumstrainF217-3的分子学鉴定：

对菌株PeniciliumoxalicumstrainF217-3进行分子鉴定，将测得的18SrDNA序列(片段长度为680bp)与Genbank中己知序列进行比对，选取9株菌株用ClustalX2.1进行多序列比对分析，利用MEGA6.0软件采用邻接法进行系统发育树构建和聚类分析，MEGA6的Neighbor-Joining法构建系统进化树，如图2所示。菌株F217-3与GenBank中登录号为KP780809.1和EF103451.1菌株的同源性达到100％。依据16SrDNA分类标准，一般认为16SrDNA序列同源性大于97％，可认为属于同一个种，结合上述形态和部分生理生化特征，可初步判定拮抗菌株F217-3属于草酸青霉。

实施例2：草酸青霉PeniciliumoxalicumstrainF217-3的生物学特性研究

A、最佳培养基配方：

沿PSA培养基上培养5d的拮抗菌菌落边缘打取菌龄一致的菌饼(直径7mm)，分别接种在5种供试培养基平板中央，置于28℃培养。培养6d后用十字交叉法测量菌落直径或者目测法估计菌落面积占整个平皿面积的百分比，每个处理5皿，试验重复3次(下同)。

草酸青霉菌在不同培养基上菌落生长情况如表1所示，结果表明该青霉菌在查氏培养基(CA)上生长最好，菌落最大，其次是PSA培养基，在清水洋菜培养基上不生长。

表1不同培养基对青霉菌生长的影响

B、最佳碳源：

以查氏培养基为基础，以不加碳源作对照，用含有相当碳的多种碳源如60g葡萄糖，30g麦芽糖，54g淀粉代替查氏培养基中的30g蔗糖，配制成不同碳源的固体培养基。沿PSA培养基上培养5d的拮抗菌菌落边缘打取菌龄一致的菌饼(直径7mm)，分别接种在不同碳源培养基平板中央，置于28℃培养5-7天。

草酸青霉菌在不同碳源培养基上菌落生长情况如表2所示，结果表明F217-3在无碳源的菌落稍小，菌丝稀疏，菌落颜色不深，在以蔗糖、麦芽糖、葡萄糖和淀粉为碳源时生长状况都很好，其菌落生长速率及菌丝密集程度无明显差异。

表2不同碳源对青霉菌菌丝生长的影响

C、最佳氮源：

以查氏培养基为基础，以不加氮源作对照，用含有相当氮的多种氮源如3g硝酸铵和1.5g尿素代替查氏培养基中的3gNaNO₃，配制成不同氮源的固体培养基。沿PSA培养基上培养5d的拮抗菌菌落边缘打取菌龄一致的菌饼(直径7mm)，分别接种在不同氮源培养基平板中央，置于28℃培养5-7天。

表3不同氮源对青霉菌菌丝生长的影响

草酸青霉菌在不同氮源培养基上菌落生长情况如表3所示，青霉菌在以尿素为氮源的培养基上菌落最大，生长速率最高；在无机氮源硝酸钠和硝酸铵培养条件下较差，而在无氮源的情况下生长相对最差。

D、最佳温度

沿PSA培养基上培养5d的拮抗菌菌落边缘打取菌龄一致的菌饼(直径7mm)，分别接种在PSA培养基平板中央，设置5、13、21、28、37℃共5个温度，分别培养5-7天。

表4温度对青霉菌生长的影响

温度对草酸青霉菌生长的影响如表4所示，其在28℃培养条件下菌落生长速率最高，生长状况最佳，在37和21℃条件下生长次之，也可在13℃的低温状态下缓慢生长，但是在5℃条件下已经不能生长。

E、最佳pH

将PSA培养基的pH分别调节为3、4、5、6、7、8、9、10共8个梯度后制成平板。沿初始PSA培养基上培养5d的拮抗菌菌落边缘打取菌龄一致的菌饼(直径7mm)，分别接种在不同pH的PSA培养基平板中央，培养5-7天。

pH对草酸青霉菌生长的影响如表5所示，结果显示草酸青霉耐受pH范围广，在pH3-10条件下均生长良好，其最适pH范围是4-7，在pH为3和8时生长次之，在pH为9和10条件下生长相对较差，且菌落稀疏，颜色较淡。

表5pH对青霉菌菌丝生长的影响

F、致死温度

沿PSA培养基上培养5d的拮抗菌菌落边缘打取菌龄一致的菌饼(直径7mm)，移取上述菌饼至装有1.5mL无菌水的EP管中，分别置于40、45、50、55、60、65、70、75、80、100℃的水浴锅中水浴10min，取出后立即在冰水中冷却至室温。将处理后的菌饼分别接种到PSA平板中央，置于28℃培养箱，培养5-7天。

青霉菌在40～80℃的温度范围内水浴后均生长良好，只有在100℃水浴处理后不生长，该青霉菌致死温度为100℃，相对其他菌株有耐高温的优势。

G、光照和通气

沿PSA培养基上培养5d的拮抗菌菌落边缘打取菌龄一致的菌饼(直径7mm)，分别接种在PSA培养基平板中央，设置4种不同光照条件(光/暗，h)：0/24、8/16、16/8、24/0。不通气条件下用Parafilm封口，通气条件下培养皿不封口。在28℃的培养箱中分别培养5-7天。

结果表明：通气对青霉菌菌丝生长均无明显影响。在光照为0、8h、16h条件下青霉菌菌丝生长较好，但光照24h条件下菌丝生长较差，说明24h昼夜全部光照条件不利于菌丝生长。

实施例3：

草酸青霉PeniciliumoxalicumstrainF217-3与多种油茶病原菌体平板对峙实验。

分别打好直径为7mm的病原菌饼和F217-3菌饼，病原菌饼放置平板中心，拮抗菌F217-3菌饼等距离(距平板中央1.5cm)放置在中心两侧，与病原菌成一条直线，置于28℃恒温培养箱培养，5天后观察抑菌带有无及大小，每个处理重复3次。结果见表1。结果表明BacillusamyloliquefaciensD2WM对油茶炭疽病、叶斑病、软腐病、黑斑病和溃疡病的拮抗作用均达到90％以上，尤其是对油茶炭疽病、溃疡病和黑斑病效果显著。

表6PeniciliumoxalicumstrainF217-3对油茶主要病害病原菌的抑菌率

所述的油茶病原菌具体为油茶炭疽病菌、油茶炭胶胞疽病菌、油茶叶斑病菌、油茶软腐病菌、油茶黑斑病菌、油茶溃疡病菌。表中数据为平均值±标准差(下同)，抑菌率＝(对照菌落直径－处理菌落直径)/(对照菌落直径－7)×100％。

实施例4：

草酸青霉PeniciliumoxalicumstrainF217-3对油茶病原菌形态影响。

在实施例3的平板对峙实验中，分别挑取未接F217-3菌饼的PDA平板上的病原菌和已接F217-3菌饼的PDA平板上的病原菌相同位置的菌丝置于显微镜下观察，结果如图3-图7所示，结果表明拮抗菌F217-3能抑制炭疽病菌、溃疡病菌和叶斑病菌菌丝的生长，其正常生长的病原菌菌丝丰富，光滑(如图3A，5A，7A)，F217-3的孢子可分别包围和散落在炭疽病菌、溃疡病菌和叶斑病菌菌丝周围，拮抗后的菌丝更细、畸形、断裂，菌丝数量明显减少(如图3B，5B，7B)。另外，拮抗菌F217-3可充分抑制胶孢炭疽病菌和黑斑病菌孢子的产生(图4和图6)，图4和图6的A图是正常状态下病原菌孢子和菌丝的状态，有大量孢子散落在菌丝周围，经过F217拮抗作用后，胶孢炭疽病菌和黑斑病菌孢子产生量极少甚至被完全抑制(如图4B，6B)。

以上所述为本发明的较佳实施例而已，但本发明不应该局限于该实施例所公开的内容。所以凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效或修改，都落入本发明保护的范围。

SEQUENCELISTING

<110>湖北工程学院

<120>一种草酸青霉及制备方法和应用

<130>一种草酸青霉及制备方法和应用

<160>1

<170>PatentInversion3.1

<210>1

<211>680

<212>DNA

<213>草酸青霉PeniciliumoxalicumF217-3

<400>1

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Claims (3)

1.一种草酸青霉PeniciliumoxalicumF217-3菌株，其特征在于：该菌株为草酸青霉PeniciliumoxalicumF217-3，CCTCCNo：M2015625。

2.根据权利要求1所述的一种草酸青霉PeniciliumoxalicumF217-3，其特征在于：所述的草酸青霉中含有SEQIDNO：1所示的核苷酸序列。

3.权利要求1所述的一种草酸青霉PeniciliumoxalicumF217-3在制备治疗或预防油茶病害药物中的应用；

所述的油茶病为油茶炭疽病、油茶叶斑病、油茶软腐病、油茶黑斑病、油茶溃疡病。