CN103436465B - 一种粪产碱菌株 - Google Patents
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Abstract
一种粪产碱菌B137W(Alcaligenes faecalis)B137W，于2013年5月7日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2013176。该菌株的发酵滤液对水稻纹枯病菌、小麦赤霉病菌、辣椒炭疽病菌和烟草赤星病菌均具有抑制作用，其中对水稻纹枯病菌抑制作用最强，进一步研究发现本菌株B137W的发酵滤液在48h内对水稻纹枯病菌的抑制率为60.26%，与井冈霉素相当，说明本发明菌株具有开发生防制剂的潜力。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，主要涉及一种对水稻纹枯病菌具有良好抑制作用的粪产碱菌（Alcaligenes faecalis）菌株。
背景技术
水稻是我国重要的粮食作物，但在生长的过程中受各种因素的干扰，其中水稻纹枯病(Rhizoctonia solani)是影响水稻增产的重要因素之一，每年由其造成的损失可达10-30%。近年来，随着高产、矮秆、多蘖良种的推广以及直接抛秧等栽培技术的改进，致使纹枯病的发生日益严重。在生产上，过去主要采用化学农药防治，但因易造成农药残留、污染环境、破坏生态平衡等问题，现在主要施用井冈霉素，然而长期、大量、单一施用井冈霉素，常导致纹枯病菌产生抗药性。最近，欧盟也修改了农药使用新品种，并将井冈霉素列为危险性药剂。因此，探索防治水稻纹枯病的新途径十分必要。
多年的研究结果表明：采用“以菌制菌”防治水稻纹枯病，不仅可减轻环境污染，降低病菌抗药性，而且能提高水稻产量。因此，利用拮抗菌防治水稻纹枯病已成为目前研究的热点。目前，已有的研究结果表明：木霉菌、青霉菌、芽孢杆菌、假单胞菌、链霉菌等拮抗菌可有效控制水稻纹枯病的发生。然而，现有拮抗菌室内抑制效果比较理想，田间防效不稳定，且菌株容易退化，能真正开发生农药商品的很少。因此，重新筛选新的拮抗菌对控制水稻纹枯病的发生具有重要意义，不仅可解决筛选周期长，费用高、抗病单一的问题，而且能保护环境，安全高效。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：针对上述现有技术的不足，提供一种对水稻纹枯病菌具有良好抑制作用的粪产碱菌（Alcaligenes faecalis）B137W。
本发明所述的粪产碱菌（Alcaligenes faecalis）B137W，已于2013年5月7日保藏在中国典型培养物保藏中心（地址：中国武汉武汉大学），保藏编号为CCTCC NO：M2013176。
本发明菌株B137W具有如下性质：
本发明菌株B137W不仅可在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上生长，而且在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上也可以生长，其中在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上的生长速度最快。通过观察菌株B137W于28℃在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上培养24h的菌落形态显示，该菌菌落为圆形，白色，表面粗糙，非透明，边缘整齐，突起呈扁平状，参见图1。本发明菌株B137W为球杆状，菌体大小约为1μm，见图2，革兰氏染色为阴性。
生理生化特征见下表1：
表1本发明菌株B137W的生理生化特征
| 特征 | 结果 | 特征 | 结果 |
| 甲基红试验 | - | 吲哚试验 | - |
| 氧化酶 | + | 产H2S | - |
| 过氧化氢酶 | + | 硝酸盐还原 | - |
| 卵磷脂酶 | - | V-P试验 | - |
| 接触酶 | + | 葡萄糖 | + |
| 明胶液化 | - | 蔗糖 | - |
| 淀粉水解 | + | 木糖 | - |
| 纤维素分解 | - | 生长温度28℃ | + |
注：+阳性结果；－阴性结果。
通过分析本菌株遗传特征的保守序列16S rDNA，并采用MEGA4软件进行序列同源性分析，构建系统发育树（见图3）。发现本发明菌株B137W与Alcaligenes菌属的细菌处于一个大的分支内，与分支内A.faecalis ATCC8750(D88008.1)同源性较高。结合本发明菌株B137W的形态学和生理生化性状的检测结果，确定本发明菌株B137W为粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)的一新种，命名为粪产碱菌（Alcaligenes faecalis）B137W。
本发明菌株B137W对小麦赤霉病菌、辣椒炭疽病菌和烟草赤星病菌具有抑制作用，但对水稻纹枯病菌具有较强的抑制作用，而且本发明菌株的发酵滤液对水稻纹枯病菌的抑制效果较好，抑制率可达60.26%，与对照药剂井冈霉素的效果相当，这为下一步防控水稻纹枯病奠定了基础，并为进一步明确拮抗菌的生防潜力和开发生防制剂提供理论依据。
附图说明
图1是本发明菌株B137W的菌落形态(×1000)图。
图2是本发明菌株B137W的菌体照片(×1000)图。
图3是本发明菌株B137W的系统发育树。
图4是本发明菌株B137W对水稻纹枯病菌的拮抗作用图。
具体实施方式
下面实施例中用到的水稻纹枯病菌（Rhizoctonia solani）、小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)、辣椒炭疽病菌(Colletotrichum corchorum)、烟草赤星病菌(Alternaria alternata)由湖南农业大学植物病理学实验室提供；60%质量浓度的井冈霉素原药购自武汉科诺生物科技股份有限公司；98%的多菌灵原药购自上海吴淞化工厂；90%的菌核净原药购自浙江省禾益农化有限公司。
实施例1本发明菌株B137W的制备
采用稀释分离法分离菌株：从湖南省浏阳市乌龙村湖南农业大学科研基地稻鸭共养田采取土壤样品，取90mL无菌水加入含10g土壤样品的三角瓶中，振荡30min，使用滤纸过滤后静置10min，取悬浮液，按梯度浓度法稀释至1×10-7倍，然后将稀释液涂布在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基平板上，置入28℃培养箱中连续培养24h，待菌落长出后，用挑针逐一挑选大小、形状不同的菌落，分离获得单个菌株。
采用平板对峙法筛选：将得到的单个菌落用无菌水制成悬浮液，取直径为5mm的圆形无菌滤纸片，渗足量的悬浮液，使之成为带菌体的滤纸片。在马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板的中央置水稻纹枯病菌菌饼(Φ=5mm)，并将带菌体的滤纸片存放在距水稻纹枯病菌菌饼四周2cm处，连续培养48h，待水稻纹枯病菌菌落长满平板后，观察有无抑菌带出现，筛选水稻纹枯病拮抗细菌。
结果发现1株细菌对水稻纹枯病菌具有较好的抑制效果，即为本发明的菌株B137W；该菌株连续培养48h，对水稻纹枯病菌具有仍具有较稳定的抑制效果（见图4）。
实施例2本发明菌株发酵滤液的制备
用接种环挑取2-3环本发明菌株B137W，接入3000mL牛肉膏蛋白胨液体培养基（容积10000mL）中于28-30℃条件下连续振荡培养72h，获得本发明菌株B137W的发酵液。取发酵液先用滤纸过滤后，再用0.22μm细菌滤器过滤得到本发明菌株B137W的发酵滤液。
实施例3本发明菌株对水稻纹枯病菌的抑制作用
取上述制备的发酵滤液装入三角瓶中，于40℃水浴锅中蒸发除去水分，称量活性物质的量，再用无菌水制备成浓度为5mg/mL溶液，取1mL发酵滤液与9mL马铃薯葡萄糖琼脂培养基混合，摇匀制成平板。接种直径为5mm的水稻纹枯病菌菌饼置平板中央，同时以井冈霉素（60%质量浓度的井冈霉素原药用无菌水溶解后配制为75μg/mL）作药剂对照，无菌水作空白对照，每处理重复3次，于28-30℃下培养，48h后测量菌落直径，计算抑制率，结果见下表2。
抑菌率(%)＝[(对照组菌落直径-处理组菌落直径)/（对照组菌落直径-5）]×100%。
表2本发明菌株B137W对水稻纹枯病菌的抑制作用
注：不同小写字母表示显著差异(p<0.05)，不同大写字母表示极显著差异(p<0.01)
结果与分析：本发明菌株B137W的发酵滤液对水稻纹枯病菌具有较好的抑制作用。室内抑菌试验结果表明：在培养48h后，本发明菌株B137W的发酵滤液对水稻纹枯病菌抑制率为60.26%，与井冈霉素相当，说明本发明菌株B137W的发酵滤液对水稻纹枯病菌具有较强的抑制作用，可以进一步开发生防制剂。
实施例4本发明菌株对小麦赤霉病菌的抑制作用
取上述制备的发酵滤液装入三角瓶中，于40℃水浴锅中蒸发除去水分，称量活性物质的量，再用无菌水制备成浓度为5mg/mL溶液，取1mL发酵滤液与9mL马铃薯葡萄糖琼脂培养基混合，摇匀制成平板。接种直径为5mm的小麦赤霉病菌菌饼置平板中央，同时以多菌灵（98%的多菌灵原药用少量0.1mol/L稀盐酸溶解后配制成浓度为36μg/mL）作药剂对照，无菌水作空白对照，每处理重复3次，于28-30℃下培养，48h后测量菌落直径，计算抑制率，结果见下表3。
抑菌率(%)＝[(对照组菌落直径-处理组菌落直径)/（对照组菌落直径-5）]×100%。
表3本发明菌株B137W对小麦赤霉病菌的抑制作用
注：不同小写字母表示显著差异(p<0.05)，不同大写字母表示极显著差异(p<0.01)
结果与分析：本发明菌株B137W的发酵滤液对小麦赤霉病菌具有一定的抑制效果，但这种抑制作用效果不理想。室内抑菌试验结果表明：在培养48h后，本发明菌株B137W的发酵滤液对小麦赤霉病菌抑制率为50.74%，略低于对照药剂多菌灵的抑制效果，说明本发明菌株B137W的发酵滤液对小麦赤霉病菌抑制作用虽没有对照药剂强，但可通过蒸发浓缩获得高浓度的发酵滤液，具有进一步开发生防制剂的潜力。
实施例5本发明菌株对烟草赤星病菌的抑制作用
取上述制备的发酵滤液装入三角瓶中，于40℃水浴锅中蒸发除去水分，称量活性物质的量，再用无菌水制备成浓度为5mg/mL溶液，取1mL发酵滤液与9mL马铃薯葡萄糖琼脂培养基混合，摇匀制成平板。接种直径为5mm的烟草赤星病菌菌饼置平板中央，同时以菌核净（90%质量浓度的菌核净原药用丙酮溶解后配成浓度为45μg/mL）作药剂对照，无菌水作空白对照，每处理重复3次，于28-30℃下培养，48h后测量菌落直径，计算抑制率，结果见下表4。
抑菌率(%)＝[(对照组菌落直径-处理组菌落直径)/（对照组菌落直径-5）]×100%。
表4本发明菌株B137W对烟草赤星病菌的抑制作用
注：不同小写字母表示显著差异(p<0.05)，不同大写字母表示极显著差异(p<0.01)
结果与分析：本发明菌株B137W的发酵滤液对烟草赤星病菌具有抑制作用。室内抑菌试验结果表明：在培养48h后，本发明菌株B137W的发酵滤液对烟草赤星病菌抑制率为53.67%，也低于对照药剂菌核净的抑制效果，说明直接利用本发明菌株B137W的发酵滤液开发生防制剂的价值不大，可通过蒸发浓缩或与其他药剂复配能达到提高抑制烟草赤星病菌的目的。
实施例6本发明菌株对辣椒炭疽病菌的抑制作用
取上述制备的发酵滤液装入三角瓶中，于40℃水浴锅中蒸发除去水分，称量活性物质的量，再用无菌水制备成浓度为5mg/mL溶液，取1mL发酵滤液与9mL马铃薯葡萄糖琼脂培养基混合，摇匀制成平板。接种直径为5mm的辣椒炭疽病菌菌饼置平板中央，同时以多菌灵（98%的多菌灵原药用0.1mol/L稀盐酸溶解后配制成浓度为36μg/mL）作药剂对照，无菌水作空白对照，每处理重复3次，于28-30℃下培养，48h后测量菌落直径，计算抑制率，结果见下表5。
抑菌率(%)＝[(对照组菌落直径-处理组菌落直径)/（对照组菌落直径-5）]×100%。
表5本发明菌株B137W对辣椒炭疽病菌的抑制作用
注：不同小写字母表示显著差异(p<0.05)，不同大写字母表示极显著差异(p<0.01)
结果与分析：本发明菌株B137W的发酵滤液对辣椒炭疽病菌具有抑制作用。室内抑菌试验结果表明：在培养48h后，本发明菌株B137W的发酵滤液对辣椒炭疽病菌抑制率为45.67%，低于对照药剂多菌灵的抑制效果，说明本发明菌株B137W的发酵滤液可以通过蒸发浓缩或与其他药剂复配能达到提高抑制辣椒炭疽病菌的目的。
Claims (6)
1.一种粪产碱菌（Alcaligenes faecalis）B137W，于2013年5月7日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2013176。
2.如权利要求1所述的菌株在抑制水稻纹枯病菌（Rhizoctonia solani）中的应用。
3.如权利要求1所述的菌株在抑制小麦赤霉病菌（Fusarium graminearum）中的应用。
4.如权利要求1所述的菌株在抑制辣椒炭疽病菌（Colletotrichum corchorum)中的应用。
5.如权利要求1所述的菌株在抑制烟草赤星病菌（Alternaria alternata)中的应用。
6.如权利要求1所述的菌株在制备生防制剂中的应用。
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