CN105112315B - 一种烟草普通花叶病毒生防内生菌粪产碱菌菌株 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种烟草普通花叶病毒生防内生菌粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)菌株，菌株代号为L1，该菌株于2014年10月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC No.9758。该菌株能够抑制烟草普通花叶病毒(Tobacco mosaic virus)的侵染，生防实验表明能够防治烟草普通花叶病毒。同时本发明还同时提取该菌株胞内对烟草普通花叶病毒有防治作用的蛋白粗提液，在烟草普通花叶病毒防治方面，具有很高的应用价值。

Description

一种烟草普通花叶病毒生防内生菌粪产碱菌菌株

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种烟草普通花叶病毒生防内生菌粪产碱菌菌株，具体涉及一种粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)L1菌株，同时涉及由该菌株中得到的胞内粗蛋白成分的方法及在烟草普通花叶病毒防治方面的应用。

背景技术

中国是烟草种植大国，烟草种植面积及产量位居世界第一。同时，烟草也是我国的主要经济作物之一，在全国20多个省区均有种植，云南省、贵州省和四川省是我国烟草种植大省。

然而，各种烟草病虫害的发生、流行，在降低烟草的产量与质量的同时，也造成巨大的经济损失。其中，烟草病毒病因其危害严重，防治难度大，被喻为烟草的“癌症”。自20世纪50年代以来，烟草病毒病先后在世界各烟草主产区爆发流行，引起各产烟国的广泛关注。目前，病毒病已成为我国烟草生产上最为严重的病害之一，且呈现出逐年加重的发生趋势。2010-2014年进行的国家烟草专卖局资助科研项目“全国烟草有害生物调查研究”，查明引起我国烟草病毒病的病毒共有23种，病毒种类较1989-1991年进行的“全国烟草侵染性病害调查研究”的16种烟草病毒病的调查结果有了进一步的增加。其中，烟草普通花叶病毒(TMV)、烟草黄瓜花叶病毒(CMV)、马铃薯Y病毒(PVY)、烟草蚀纹病毒(TEV)，仍然是发生普遍，危害严重的烟草病毒病。由于烟草病毒病目前尚无有效的防治措施，其造成的经济损失已经大大超过烟草真菌性病害。2000年仅河南烟区，烟草病毒病造成的直接经济损失就超过4亿元人民币，全世界范围内，每年因烟草花叶病毒病产生的经济损失更是多达1亿多美元。

烟草普通花叶病毒(TMV)是烟草花叶病毒属(Tobamovirus)的代表成员，也是烟草生产上最主要的病毒病害。TMV是一种RNA病毒，病毒粒体呈直杆状，大小为300nm×18nm。病毒粒体相对分子质量3.9×10⁷，沉降系数为185～186S，等电点pH 3.4，核酸含量5％，沉降系数30S。烟草普通花叶病毒增殖的最适温度是28～30℃。其毒力和抗逆性都很强，含病毒的新鲜汁液稀释到100万倍仍有致病力，在汁液中病毒的钝化温度为75℃、40d，或82℃、24h，或93℃、10min。干病叶120℃处理30min后仍具有侵染能力，在140℃下处理30min才会完全失去活力。TMV寄主范围极广，可以侵染30科310种以上植物。除侵染烟草外，还常侵染番茄、茄子、辣椒、马铃薯等茄科作物，Thomberry则列出了烟草普通花叶病毒的350多种寄主植物。

烟草普通花叶病毒主要通过汁液摩擦传播，如通过打顶、抹杈、施药等田间农事操作过程中人为的汁液摩擦传播、机械摩擦传播，也可以通过田间病残体在土壤中传播。当病毒汁液达到叶片表面时，机械擦伤使得烟草叶片角质层出现微伤，病毒粒体通过该微伤口接触烟草叶片表皮细胞的外壁胞质，进而通过外壁胞质连丝转移到细胞内的细胞器受体上，病毒就可以复制增殖。烟草感染TMV后，先在新叶上产生“脉明”，即沿叶脉组织变成浅绿色，对光看呈半透明状，然后逐渐蔓延到整个叶片，形成黄绿相间的斑驳，继而形成花叶。病叶有时形成泡斑，叶片边缘多向背面卷曲，皱缩扭曲畸形。早期受害植株矮化，生长极为缓慢，重病植株花器变形、果实变形，种子萌发率降低，造成烟草产量损失和品质下降。

鉴于烟草普通花叶病毒病对农业造成的巨大损失，科研人员一直致力于烟草普通花叶病毒病的防治工作。逐步摸索出以预防为主，防治结合的措施。

选育和利用抗病品种。这也是最根本，最经济有效的措施。对TMV抗性较好的品种有吉烟5号、中烟90、辽烟8号、辽烟10号、CV91等，同时，还从国外引进一批具有较好抗性的烟草品种，如柯克86和白肋21等。近年来，随着生物技术的发展，科研人员还利用转基因的方法，获得抗病毒植株。

农业防治措施。生产实践中，通过选用无毒种子、培育无毒壮苗、加强苗床及田间管理、合理轮作等一系列农业措施，消除TMV的初侵染来源，阻断病毒传播途径，从而较少烟草普通花叶病毒病的发生。

药剂防治，早期病毒病的防治主要依赖于化学药剂。化学农药高毒、高残留和易产生抗药性的特点，使其在使用方便、见效快的同时也存在着污染环境、威胁人类健康等诸多不利因素。近年来，生物农药因其对人畜安全、无污染、不易产生抗药性等特点而逐步被人们所接受。生物农药的广泛应用，可以有效降低化学农药的使用，提高农民收入，保障食品安全。国际上，生物农药市场增长迅速，销售额占全部农药的20％左右(2000年)。我国生物农药行业也随之快速发展，未来生物农药所占农药份额预计可增加到30％左右。生物农药主要包括微生物源农药(细菌、真菌、病毒等)、植物源农药、生物化学农药等。目前微生物源生物农药应用普遍，涵盖了杀虫剂、杀菌剂、除草剂和植物生长调节剂等多个领域。苏云金芽孢杆菌(BT)、白僵菌、绿僵菌、宁南霉素、嘧肽霉素、枯草芽孢杆菌等一大批微生物源生物农药已经成功进入市场，并为人们所熟知与认可。

植物内生菌是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部、不引发植物产生明显病症的微生物。植物内生菌包括真菌、细菌和放线菌。研究表明，植物内生菌通过分泌生长素和增加宿主植物对于氮、磷等主要营养元素的吸收来促进植物生长；通过促进根的发育、调节气孔的闭合和调节渗透压等来提高植物对干旱及其他非生物胁迫的抵抗能力；通过分泌抗生素类、水解酶、生物碱等物质、与病原菌竞争营养物质和诱导宿主产生系统抗性(ISR)来实现对病虫害的生物防控作用。因此，植物内生菌作为一类重要的微生物也成为近年来的研究热点，被逐渐开发成天然医用和农用药物。

植物内生菌广泛存在与植物体内，分布广泛、种类繁多，作为新的筛选来源具有极大的开发潜力。植物内生菌易于在植株中定殖，寄主适应性更好，能更好地为实际生产中生物防治手段提供技术支持。

国内对于烟草普通花叶病毒病生物防治的报道，生防菌的筛选来源多来自于植物根际土壤、根围及其它微生物区系中，来源于植物内部的生防菌对于TMV的抑制作用报道较少，但尚未见烟草内生菌对于TMV的抑制作用报道。

因此本申请从烟草内生菌方向进行探索，筛选了防治效果好的TMV拮抗菌株，扩充抗TMV植物内生菌资源，为深入揭示烟草内生菌抗TMV机制和进一步研发微生物源抗病毒制剂提供保障。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术上的不足，从烟草内部分离、筛选出一种TMV拮抗菌株，制备该菌株的发酵液，同时提取该菌株胞内对TMV有防治作用的蛋白粗提液。

本发明所述菌株鉴定为粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)。菌株代号为L1，该菌株于2014年10月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC No.9758。

本发明菌株L1具有如下性质：

通过观察本发明菌株L1于28℃在LB培养基平板上培养24h后的菌落形态显示，该菌菌落为乳白色不透明，边缘整齐，表面光滑，无水溶性色素，参见图1，菌株L1菌体多以单个个体存在，菌体呈短杆状或球杆状，有荚膜，周生鞭毛，参见图2，革兰氏染色为红色。

生理生化特征见表1：

表1本发明菌株L1生化鉴定结果

注：+阳性结果；-阴性结果。

利用非发酵细菌生化鉴定管对L1进行生化鉴定。将鉴定结果在非发酵细菌生化鉴定编码手册上进行比对，菌株L1与粪产碱菌的相似性为0.4410。

通过分析本菌株遗传特征的保守序列16S rDNA，在GenBank(www.ncbi.nlm.nlh.gov)网站上应用BLAST软件进行分析，发现菌株L1测得的序列与粪产碱菌16S rDNA部分序列同源性达99％，同时应用MEGA4软件构建系统发育树(见图3)，发现菌株L1与粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)遗传距离最近。综合生理生化鉴定及ITS序列分子鉴定结果，确定本发明菌株L1为粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)，命名为L1。

该菌株L1发酵液的制备，方法如下：

1)挑取培养基平板上生长良好的菌株L1的单一菌落接种到LB液体培养基中进行活化，于28℃，180rpm，培养24h；

2)将活化后的菌液以2％的接种量接入LB液体培养基中进行发酵培养，获得发酵液。培养条件为：温度28℃，pH 7.0，时间22h，转速180rpm；

该菌株L1胞内对TMV有防治作用的蛋白粗提液制备，方法如下：

1)上述发酵液经8000rpm离心10min，沉淀加0.1M PBS洗涤3次，然后于4℃，8000rpm离心10min；

2)沉淀溶解在0.1M PBS中，经超声破碎仪破碎后，4℃，11000rpm离心10min。上清液过0.22μm滤膜，缓慢加入4倍于上清液体积的饱和硫酸铵，4℃静置过夜。；

3)液体在4℃下，8000rpm离心20min，沉淀用少量体积的PBS-叠氮化钠溶液溶解。然后置于分子量为8000Da的透析袋中，透析48h，每隔4h更换透析缓冲液一次(去离子水)，以彻底除去硫酸氨，最终获得胞内蛋白粗提液。

本发明的有益效果；

本发明获得的拮抗烟草普通花叶病毒病的生防内生菌粪产碱菌菌株L1，可应用于对烟草普通花叶病毒病的防治，采用接种枯斑寄主三生-NN烟的生物学测定表明，发酵液对TMV的抑制率为82.81％；涂抹发酵液12h后的预防作用为34.58％；接种TMV 12h后涂抹发酵液的治疗作用为21.81％。菌株L1的胞内蛋白粗提液对TMV的抑制率为87.84％；涂抹胞内蛋白粗提液12h后的预防作用为66.42％；接种TMV12h后涂抹胞内蛋白粗提液的治疗作用为29.26％。电镜下观察到发酵液在体外对TMV粒体具一定断裂和分散作用。菌株L1的发酵液及胞内蛋白粗提液对TMV具有体外钝化、抑制侵染和增殖的作用，具有实际的应用价值。

附图说明

通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。在附图中：

图1为本发明的菌株L1在LB固体平板培养基上的划线图；

图2为本发明的菌株L1透射电镜下的菌体形态；

图3为本发明的菌株L1的系统发育树；

图4为本发明菌株L1对TMV的拮抗活性效果图；

其中，左半叶为空白对照，右半叶为处理；

图5为发酵液处理后TMV的粒体形态图；

其中，A：TMV粒体(对照)B：与发酵液混和后的TMV粒体；

图6为本发明菌株L1的胞内蛋白粗提液的拮抗活性效果图。

具体实施方式

下面结合附图和具体的实施方式对本发明作进一步的描述。

实施例1防治TMV拮抗内生菌菌株L1的筛选

从山东省即墨市中国农业科学院烟草研究所试验基地取TMV抗性品种烟株，从烟株叶片用无菌刀切取1.0g的小块，用70％乙醇和1％次氯酸钠进行表面消毒。以组织表面消毒后的最后一次冲洗无菌水作为空白对照，以此检测表面消毒效果。在无菌操作台中，将消毒后的样品放入灭菌的研钵中研磨。将研磨液用无菌水稀释成1×10^-4，1×10^-5，1×10^-6，1×10^-7，1×10^-8的浓度。用移液枪吸取100μL各稀释液研磨液涂布于富集培养基平板上，置于28℃恒温培养箱中培养3d，挑选不同单菌落再次划线纯化3次，既得本发明菌株，-80℃甘油冷冻保存。

实施例2本发明菌株L1的鉴定

2.1本发明菌株L1的生理生化鉴定

菌株L1在LB培养基平板划线后生长状态见图1。

菌落乳白色不透明，边缘整齐，表面光滑，无水溶性色素。

菌株L1在透射电镜下的菌体形态见图2。

负染标本制作，取一环生长于LB培养基平板上的粪产碱菌，用无菌生理盐水制成菌悬液，加一滴到铜网载膜上，1％磷钨酸负染。

负染标本用H-600透射电镜，在加速电压80KV下观察。临界点观察。

菌株L1菌体多以单个个体存在，菌体呈短杆状或球杆状，有荚膜，周生鞭毛。

利用非发酵细菌生化鉴定管对L1进行生化鉴定。菌株L1的生化鉴定结果见表1。将鉴定结果在非发酵细菌生化鉴定编码手册上进行比对，菌株L1与粪产碱菌的相似性为0.4410。

表1本发明菌株L1生化鉴定结果

2.2本发明菌株L1的分子鉴定

参照文献(林万明主编细菌分子遗传学分类鉴定方法[M].上海，上海科学技术出版社1990)方法提取总体DNA，利用引物27F/1492R，参照(C.W.迪芬巴赫，G.S.德维克斯勒著，黄培堂等译.PCR实验技术实验指南[M]，北京科学技术出版社，2000)方法进行PCR扩增，扩增后测定该片段序列(PCR产物由英潍捷基上海贸易有限公司测序)。

测得菌株L1序列长度为1425bp。在GenBank(www.ncbi.nlm.nlh.gov)网站上应用BLAST软件进行分析，发现菌株L1测得的序列与粪产碱菌16S rDNA部分序列同源性达99％，同时应用MEGA4软件构建系统发育树(见图3)，发现菌株L1与粪产碱菌(Alcaligenesfaecalis)遗传距离最近。

综合生理生化鉴定及ITS序列分子鉴定结果，确定本发明菌株L1为粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)。

实施例3本发明菌株L1对烟草普通花叶病毒病的抑制作用

3-1发酵液的制备：挑取LB培养基平板上生长良好的单一菌落接种到LB液体培养基中，于28℃，180rpm，培养24h进行活化。然后将活化后的菌液以2％的接种量接入LB液体培养基中进行发酵培养，即可得到发酵液。培养条件为：温度28℃，pH 7.0，时间22h，转速180rpm。

3-2检测方法：利用接种枯斑寄主三生-NN烟的生物学测定方法，测定发酵液对烟草普通花叶病毒病(TMV)的抑制作用。取充分发病的TMV烟草上部嫩叶，用无菌研钵研磨成匀浆，用灭菌后的磷酸盐缓冲液(PH7.0)按1∶80比例稀释。选取长势一致的健康的4-6叶期枯斑寄主三生-NN烟进行摩擦接种。左半叶接种LB液体培养基与病毒等体积混和液作为对照，右半叶接种发酵液与病毒等体积混和液作为处理(混合时间为30min)，接种10min后立即用水喷洒叶面。每处理接种3-4个叶片，重复3次，3d后观察结果，计算抑制率，结果见表2，并结合参见如图4。

与TMV作用方式：设预防作用(12h)，治疗作用(12h)和钝化作用(30min)三个处理。

枯斑抑制率计算公式：

表2本发明菌株L1发酵液对烟草普通花叶病毒的抑制作用

由表2可知，菌株L1发酵液对于TMV的钝化作用最好，其枯斑抑制率为82.81％，其次为预防作用，枯斑抑制率为34.58％，再次为治疗作用，枯斑抑制率为21.81％。

实例4透视电镜下观察菌株L1发酵液对TMV病毒粒体的影响

(1)TMV粒体的粗提纯

参照PEG法(胡伟贞等，1989)提纯TMV粒体，具体操作步骤如下：

TMV活体毒源叶片80g，加入0.2M磷酸盐缓冲液(pH 7.0)，在无菌研钵中将叶片充分研磨至匀浆，尼龙纱布过滤后，1000rpm离心10min，保留上清液；

上清液60℃，水浴加热10min，7000rpm离心5min，弃去沉淀；

上清液加入4％PEG6000(0.1M NaCl)，边加边搅拌，4℃静置过夜；

4℃下，7000rpm离心20min，弃上清液；

沉淀加如匀浆量的1/10(V/V)量的0.01M磷酸盐缓冲液(pH7.0)，4℃悬浮2.5h；

4℃下，10000rpm离心10min，弃沉淀；

所得上清液为TMV提纯病毒。

(2)负染法电镜样品的制备与观察

将发酵液与等体积的TMV提纯病毒混合，室温下孵育30min，用无菌水与TMV提纯病毒等体积混合，作空白对照。

用带膜样品载网膜面向下吸附3min左右，用一片干净滤纸从网边吸去液体；

稍干后用镊子将载膜网转移到磷钨酸(2％，pH 6.7)中，染色1-2min，取出后用滤纸吸干染液，放在垫有滤纸的平皿中，干燥；

在H-600透射电镜下，观察TMV病毒粒体的形态。

TMV病毒粒体形态见图5，在透射电镜下观察，病毒粒体呈杆状，病毒粒体完整，排列相对集中，长度在400-500nm左右；观察发现，菌株L1发酵液与病毒粒体的混合30min后，TMV粒体排列分散，部分粒体发生断裂。

实施例5本发明菌株L1的胞内粗提蛋白抗TMV活性检测。

将实施例3中发酵液经8000rpm离心10min，沉淀加0.1M PBS洗涤3次，4℃，8000rpm离心10min。沉淀溶解在0.1M PBS中，经超声破碎仪破碎后，4℃，11000rpm离心10min。上清液过0.22μm滤膜，缓慢加入4倍于上清液体积的饱和硫酸铵溶液，4℃静置过夜。液体在4℃下，8000rpm离心20min，沉淀用少量体积的PBS-叠氮化钠溶液溶解。然后置于截留分子量为8000的透析袋中，透析48h，每隔4h更换透析缓冲液一次(去离子水)，以彻底除去硫酸氨。透析袋内物质在260-280nm紫外光附近具有吸收峰，因此可以初步判断终获得是胞内蛋白粗提液。

以上述胞内蛋白粗提液与80倍病毒汁液均匀混合30min，以0.1MPBS与病毒汁液混合为对照，半叶法接种到枯斑寄主三生-NN烟上，每处理接种3-4个叶片，重复3次，3d后观察结果，计算抑制率，结果见表3，并结合参见如图6。

表3本发明菌株L1胞内蛋白粗提液对烟草普通花叶病毒的抑制作用

由表3可知，菌株L1粗蛋白液的预防作用、治疗作用和钝化作用与发酵液相比均有所提高，三者的枯斑抑制率分别为66.42％，29.26％和87.84％。说明胞内蛋白经过初步提取后，可以有效的预防和钝化TMV，据此可以初步确定本发明菌株L1抗TMV有效成分为胞内蛋白。

Claims (6)

1.一种烟草普通花叶病毒生防内生菌粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)菌株，菌株代号为L1，该菌株于2014年10月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC No.9758。

2.如权利要求1所述菌株在防治烟草普通花叶病毒中的应用。

3.一种如权利要求1所述菌株L1的发酵液，其制备方法为：

1)挑取培养基平板上生长良好的菌株L1的单一菌落接种到LB液体培养基中进行活化，于28℃，180rpm，培养24h；

2)将活化后的菌液以2％的接种量接入LB液体培养基中进行发酵培养，获得发酵液，培养条件为：温度28℃，pH 7.0，时间22h，转速180rpm。

4.如权利要求3所述的菌株L1的发酵液，其特征在于：可用于提取菌株L1胞内对烟草普通花叶病毒有防治作用的蛋白粗提液，方法如下：

1)上述发酵液经8000rpm离心10min，沉淀加0.1M PBS洗涤3次，然后于4℃，8000rpm离心10min；

2)沉淀溶解在0.1M PBS中，经超声破碎仪破碎后，4℃，11000rpm离心10min， 上清液过0.22μm滤膜，缓慢加入4倍于上清液体积的饱和硫酸铵，4℃静置过夜；

3)液体在4℃下，8000rpm离心20min，沉淀用少量体积的PBS-叠氮化钠溶液溶解， 然后置于分子量为8000Da的透析袋中，透析48h，每隔4h更换透析缓冲液一次，以彻底除去硫酸氨，最终获得胞内蛋白粗提液。

5.如权利要求3中所述的菌株L1的发酵液在烟草普通花叶病毒病防治中的应用。

6.如权利要求4中所述的对烟草普通花叶病毒有防治作用的蛋白粗提液在烟草普通花叶病毒防治中的应用。