CN110055182B - 对烟粉虱高致病能力的虫生真菌菌株sp433及其应用 - Google Patents

对烟粉虱高致病能力的虫生真菌菌株sp433及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物防治领域，尤其涉及一种对烟粉虱具有致病的优良菌株，其是球孢白僵菌(Beauveria bassiana)菌株SP433，保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），保藏编号为GDMCC NO:60589。本发明通过合理的实验方案，结合优良菌株筛选的指标综合考虑，筛选到对烟粉虱具有优异的致病力的菌株，其致病力相比其他供试菌株要更加稳定的菌株，具有较大潜力用于烟粉虱的生物防治。

Description

对烟粉虱高致病能力的虫生真菌菌株SP433及其应用
技术领域
本发明涉及植物保护领域，具体涉及生物防治领域，尤其涉及烟粉虱的生物防治中。
背景技术
化学农药在害虫防治中发挥着巨大作用，我国农药的使用量与产量长期位居世界首位。然而据统计，全球农药的有效利用率不足30％，我国每年化学农药使用面积在2.8亿hm2以上，施用量达50-60万吨，约80％的化学农药直接进入环境(李亮,张占英,孙慧英,等.农药危害与绿色植保技术探讨[J].湖北植保,2018,(4):63-64)。随着化学农药长期大量的使用，带来的“3R”问题即害虫抗药性(Resistance)、农药残留(Residue)和害虫再猖厥(Resurgence)以及环境污染问题越来越严重。因此，要改变使用化学农药为主的传统防治方式，贯彻“预防为主，综合防治”的植保方针，坚持农业防治为主、生物防治为基础，并结合其他防治措施对害虫进行综合治理的可持续建康发展具有极其重要的意义(杨运华,杜开书,石明旺.虫生真菌的生物防治研究进展[J].河南科技学院学报,2011,39(1):34-37)。
虫生真菌以种类多、安全有效、应用期长、不伤害天敌、不易产生抗性及能快速大量生产等优点著称，在生物防治中有着无可比拟的反复侵染性和生产便利性。文献记载的虫生真菌有100多个属，800个种，已知的虫生真菌主要包括虫草属真菌、捕食性真菌和寄生线虫真菌，并不断有一些新种被发现。我国已报道的约405种，其中寄生昆虫的真菌215种(李月,姜春杰,赵宇鹰,等.虫生真菌在林业害虫生物防治中的应用[J].植物保护,2016,10(20):10-24)。虫生真菌为农作物害虫的重要致病菌而广泛分布于自然界，据调查，野外越冬昆虫疾病中约60％都是由真菌引起，虫生真菌确实是虫口自然控制的重要因子和害虫防治的重要材料，在各种农林生态系统中有着重要的地位，对于维持生态系统的平衡起着不可或缺的作用，是IPM系统的重要组成部分(秦丽.绿僵菌和白僵菌防蝗菌株的分子鉴定及室内致病力测定[D].安徽农业大学,2013)。
虫生真菌具有百年的研究历史，尤其在欧美各国虫生真菌的基础研究较深、较广。1843年，Bassi用试验证明了白僵菌(Beauveria bassiana)能使蚕病在法、意等国流行，首创了昆虫疾病的微生物病原学说，并且奠定了昆虫病理学的基础，这也是虫生真菌研究的真正开始；Metch-nikoff于1879-1880年应用绿僵菌(Metarhizium anisopliae)防治奥地利金龟甲(Anisoplara austriace)，揭开了真菌防治害虫的序幕；Forbse等曾在美国应用球孢白僵菌较大规模地防治麦长蝽；在19世纪20-30年代，俄国Metalnikvo、美国Wallenger等人对白僵菌、黄曲霉和绿僵菌防治玉米螟(Ostrinia nubilalis)极感兴趣；Lefebver从我国东北引入侵染玉米螟的白僵菌进行室内和田间试验，并取得了进展(李增智.虫生真菌在害虫治理中应用现状[J].安徽农学院学报,1987,(2):59-66)；中国从20世纪50年代开始应用白僵菌大规模的大豆食心虫和玉米螟，取得了显著效果；虫生真菌在不断被推广，但也有走向低迷的时候，1956年那段时间，受到了有机磷农药的冲击，各种生物防治研究都被搁置，其中就包括虫生真菌；日本的两个真菌培养所也被迫倒闭了，当DDT滥用导致生态失衡、天敌受伤、害虫的抗药性、环境的破坏，人体健康等一系列问题；另外，美洲的植棉业，也因滥用杀虫剂，使害虫抗性增强导致经济效益的巨大损失，才使虫生真菌的研究又重新回到大众的视野(李增智.昆虫真菌学的发展[C].中国虫生真菌研究与应用,1996)；20世纪70年代，应用白僵菌防治松毛虫，获得了成功。我国拥有世界上最大的虫生真菌研究队伍；徐庆丰教授、李增智教授、樊美珍教授和陈祝安教授等在带动我国虫生真菌资源及应用研究方面发挥了重要的作用。随着俄、美、日等国利用虫生真菌开展生物防治获得成功，研究虫生真菌不仅对防治害虫有利，而且对人们的生产、生活以及环境的保护方面都有着非常重要的作用和意义，另外，化学农药防治农林业害虫对生态环境造成的破坏，使虫生真菌研究达到了繁荣时期。
烟粉虱Bemisia tabaci(Gennadius)属于半翅目(Homoptera)粉虱科(Aleyrodidae)小粉虱属，是热带、亚热带及相邻温带地区、寄主广泛性的世界上最重要的农业害虫之一，可通过直接刺吸及其有效传播病毒而对作物造成损害(吴乾兴,刘勇,张友军,等.烟粉虱常用药剂抗性监测研究[J].植物保护,2018,2(1):119-120)。自20世纪90年代中后期以来，该虫逐渐成为了我国重要农业害虫。烟粉虱分为不同的生物型，其中B型烟粉虱的危害范围广、危害程度严重。其成虫和若虫直接通过刺吸植物汁液，使植物营养缺乏，而影响正常的生理活动。另外，成虫和若虫常分泌蜜露，诱发煤汚病，虫口密度高时，叶片呈现黑色，严重影响光合作用和经济作物的外观品质；成虫高度杂食性，侵染1000多种植物，并传播来自菜豆金色黄花叶病毒属(Begomovirus)，毛形病毒属(Crinivirus)，香石竹潜隐病毒属(Carlavirus)，番茄托拉多病毒属(Torradovirus)和甘薯病毒属(Ipomovirus)的300多种病毒。近10年来，该属成员番茄黄化曲叶病毒Tomato yellow leaf curlvirus(TYLCV)对我国农业造成的危害最大。当棉花被危害时，叶正面出现褐色斑，虫口密度高时出现成片黄斑，严重时导致蕾铃脱落，影响棉花产量和纤维质量。
烟粉虱若虫拥有蜡质外壳，常固定吸附在作物表面，仅以刺吸式口器危害作物，因而增加了防治难度(刘召,雷仲仁.对烟粉虱具有高致病力的虫生真菌筛选[J].中国蔬菜,2014,1(3):37-40)；自2000年来就在我国大暴发且分布范围不断扩大、成灾，给重要经济作物造成重大损失(Chu D,Wan F H,Zhang Y J,et al.Change in the biotypecomposition of Bemisia tabaci in Shandong Province of China from 2005to 2008[J].Environmental Entomology,2010,39(3):1028-1036)。常用来防治烟粉虱的化学杀虫剂很难渗入其体内，往往为了达到防治效果只能加大药量，这样不但增加成本还污染环境，甚至还会对害虫产生抗药性。因此，研究有效的防治烟粉虱的替代技术显得特别重要。
昆虫病原真菌不但具备显著的流行潜力、对人畜和环境安全、害虫不易产生抗性而且有着生产的便利性，应用其防治烟粉虱有巨大潜力。玫烟色拟青霉对若虫尤其是低龄若虫侵染率很高菌，而在适宜环境下能在成虫中传播流行而被常用于烟粉虱的防治。据相关报道，虫生真菌对西红柿上烟粉虱若虫的防治已取得很好的效果。另外，白僵菌对烟粉虱若虫尤其低龄若虫也有较大的控制潜能，利用虫生真菌等生物防治手段来调节烟粉虱种群密度，控制烟粉虱的危害，已经引起众多研究工作者的兴趣。但要找到对烟粉虱高毒力的白僵菌需要大量收集白僵菌并进行筛选。
发明内容
为了获得烟粉虱生物防治效果的优良菌株，对前期收集的29株初步确定为白僵菌的菌株，本发明人采用浸叶法测定了其对烟粉虱2龄若虫的毒力，由此来获得数株烟粉虱若虫致病的优良菌株。
其中，实验发现不同属或者同种菌株对烟粉虱的致病力都可能存在差异，因而有着不同程度的致病效果。根据本发明的实验结果，结合优良菌株筛选的指标综合考虑，其中致病力是衡量真菌菌株生物防治潜力的重要指标，而菌落或菌丝的生长速率则是评价优良昆虫病原真菌的另一个重要评价指标，菌株SP433在107孢子/mL和108孢子/mL下对烟粉虱若虫都有较高的致病力，菌株SP433的致病力相比其他供试菌株要更加稳定，综合菌株的菌落生长速率考虑，菌株SP433为烟粉虱若虫致病的优良菌株。
该菌株是在四川省成都市青羊区文殊院树下土壤中分离而来，在PDA平板上，25℃，10天，菌落直径56.33mm，菌落中间绒状，边缘粉末状，表面白色，背面橘黄色，有少量皱褶。孢子卵圆形和近球形，菌丝长2.095μm，宽1.524μm。通过分子生物学进一步核实鉴定，其属于球孢白僵菌(Beauveria bassiana)。
进一步地，本发明还提供SP433菌株在烟粉虱的生物防治中的应用。
在具体实施时，可将所述菌株培养后制成孢子液、或含孢子的菌剂。优选地，在施用时菌株的孢子浓度为107孢子/mL至109孢子/mL，最优选为108孢子/mL。
进一步地，在预测烟粉虱将要发生时或发生初期施用的所述菌剂。
本发明通过合理的实验方案，结合优良菌株筛选的指标综合考虑，筛选到对烟粉虱具有优异的致病力的菌株SP433，108孢子/mL下对烟粉虱毒力达到82.93％，且其致病力相比其他供试菌株要更加稳定的菌株(在107孢子/mL下对烟粉虱毒力也比较高)，具有较大潜力用于烟粉虱的生物防治。
其中，菌株SP433于2019年2月21日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，分类命名名称为Beauveria bassiana，保藏编号为GDMCC NO:60589，保藏地址为中国广州。
附图说明
图1SP433菌落形态图
注:左图和右图为SP433菌落正面图和背面图
图2SP433孢子形态图
图3分子鉴定中PCR扩增产物电泳图
图4分子系统树
具体实施方式
下面通过本发明的研发过程和具体实施方式进行介绍，但不构成对本发明的限制。
1供试寄主植物
棉花“鲁棉研32号”购自山东省潍坊市种子管理站。自然条件下，用经高压灭菌的营养土钵栽培棉花种子，生长期间棉花苗置于干净的养虫笼(60×60×60cm)内，待苗长至6-8叶期时用于实验。
2供试昆虫
B型烟粉虱种群2005年采自华南农业大学教学实习农场，寄主植物为番茄。采回后被隔离饲养在生物防治教育部工程研究中心的棉花寄主上继代繁殖。饲养条件为温度(27±1)℃，光周期L14:D10，相对湿度(75±5)％。
3供筛选的白僵菌
本实验选取的虫生真菌共计29株，均为内部保藏于华南农业大学生物防治教育部工程研究中心继代保存的菌株。具体信息详见下表。
表1供试菌株
Figure GDA0002069501760000051
Figure GDA0002069501760000061
4实验方法
4.1孢子悬浮液溶液的配制
在PDA平板上26±1℃培养7d后，充分产孢的虫生真菌分生孢子用0.05％吐温-80无菌水洗脱孢子，用磁力搅拌器搅拌，再置于摇床180rpm 25℃振荡培养25min后用双层擦镜纸过滤，用血球计数板计数，测量母液的浓度，配制成1×107孢子/mL和1×108孢子/mL的孢子悬浮液。
4.2虫生真菌对烟粉虱2龄若虫的毒力测定
将带有烟粉虱2龄若虫的棉花叶片背面浸于配好的孢子悬浮液中，30s后取出，待叶片自然晾干后，将叶片背面朝上置于琼脂培养基中，用保鲜膜封口并扎孔通气，将培养皿倾斜放置，置于人工气候箱中，饲养条件为温度(27±1)℃，光周期L14:D10，相对湿度(75±5)％。以0.05％吐温-80无菌水为空白对照。每个处理重复4次，每个重复100头若虫。分别于第3d、第5d和第7d检查烟粉虱的死亡情况并记录死亡数，计算死亡率。
4.3数据处理
数据处理及统计分析采用SPSS17.0、Statistix 8与Excel软件，Duncan法进行显著性检验。
5结果与分析
实验结果表明，同一浓度，29株虫生真菌的致病力存在差异，若虫的死亡率随着处理时间的增加而上升；同一时间不同浓度，菌株对烟粉虱2龄若虫的致死率均随着孢子浓度增加而增加。具体结果见表2和表3。
表2 1×107孢子/mL的孢子悬浮液对烟粉虱2龄若虫的死亡率(％)
Figure GDA0002069501760000071
注:经Duncan检验,同一列的不同小写字母表示不同菌株间致病力差异显著(P＜0.05)
表3 1×108孢子/mL的孢子悬浮液对烟粉虱2龄若虫的死亡率(％)
Figure GDA0002069501760000081
注:经Duncan检验,同一列的不同小写字母表示不同菌株间致病力差异显著(P＜0.05)
其中，当孢子悬浮液浓度为1×108孢子/ml时(表2)，处理前期(3d)，各菌株的致死率表现出显著差异，菌株的致死率由2.13％至29.07％不等，菌株SP665、SB015、SP433、SB039的致死率在25％以上，致死率不到10％的占一半以，菌株SP031的致死率最低，只有2.13％；处理5d，菌株间的致死率最高可相差4倍，菌株间存在显著差异，菌株SB015、SB063、SP016、SP433、SP433、SB036、SB674的致死率已达50％以上，菌株SB015的最高，为61.76％，而菌株SB006、SB050、SB004、SP031的致死率却不到30％，菌株SP031的致死率最低，只有13.07％；处理7d，对照组的死亡率仅为13.3％，比较低，各菌株致死率的差异有所缩小，27株菌株的致死率在59.5-82.93％。其中菌株SP433、SP433、SB050、SB036、SB043的致死率达80％以上，菌株SP433的致死率最高，达87.37％，SP433次之也达82.93％，表明这5株虫生真菌对烟粉虱均有强的致死效果因而有着很好的防治潜力，属于潜在的优良生防菌。
但结合表2和表3可知，同一菌株不同浓度，各菌株对烟粉虱均有一定的防治效果且致死率随着浓度的增加而不同程度增加，而菌株SB039、SB063、SP031、SP670、SB671、SB035在浓度为1×107孢子/ml和1×108孢子/ml下处理烟粉虱若虫7d后得到相似的致死率，说明若选用这些菌株防治烟粉虱，低浓度即可达到良好效果；菌株SB043、SB050、SB036在孢子浓度为1×107孢子/ml时，致病力明显弱于其他供试菌株，当浓度为108孢子/ml时，致病力却强于其他菌株，说明这些菌株在害虫防治方面与环境中孢子浓度有较大关系。菌株SB039、SP433、SB063、SP433、SB674、SP670在孢子浓度为1×107孢子/ml时，致死率在65％以上，菌株SP433、SP433、SB050、SB036、SB043在孢子浓度为1×108孢子/ml时，致死率达80％以上，同时也表明菌株SP433和SP433的致病力强且稳定性优于其他供试菌株。
对照组为0.05％吐温-80处理烟粉虱若虫，致死率很低；当用浓度为108孢子/mL孢子悬浮液处理烟粉虱若虫时，各菌株不仅致病力存在差异，而且致病击倒时间也不一致。有些真菌尽管是同一个属甚至是同一个种，但菌株的致病力也会存在差异；一些菌株在烟粉虱若虫致死时间上也表现出较大差异，有些短时间效果不理想，但随着侵染时间延长致死率升高，而有些菌株致死率与击倒时间差异不大，说明在害虫的防治时要结合害虫发生情况合理的选择使用时间；另外，孢子浓度也是影响致病力的重要因素，有些菌株对的烟粉虱若虫的累计死亡率随着孢子浓度的增加逐渐增加，而有些菌株则表现致死率与测试浓度差异不大，选择低浓度就能达到相同的侵染效果。结合优良菌株筛选的指标综合考虑，菌落或菌丝的生长速率是评价优良昆虫病原真菌的一个重要评价指标，而致病力是衡量真菌菌株生物防治潜力的重要指标。综上在筛选到的菌株SP433和SP433表现优异，在烟粉虱的生物防治中具有较大潜力。
5菌株SP433进一步核实鉴定结果
本发明进一步针对上述筛选到效果好的菌株SP433作了进一步鉴定，以确定期分类位置。
(1)菌株SP433的采集
菌株SP433最初于2007年在内蒙古自治区呼伦贝尔市牙克石市土壤中分离而来，为中国本土菌株。
采集土壤样品，采样时取表土下10～15cm处土壤100g左右，用塑料袋封装后带回实验室处理。土壤样品过筛去掉石粒和杂物，然后取净土10g悬浮于90mL 0.1％的吐温80溶液中，摇匀，静置15min，取其上清液2mL稀释于8mL 0.05％吐温80中，配制为土壤悬浮液。将0.1mL土壤悬浮液接种于孟加拉红琼脂培养基平板上，用三角玻璃刮子将悬浮液推匀于平板表面下，25℃培养3～7d，然后用接种环切取单菌落，接种于PDA板上继续培养，得到球孢白僵菌菌株SP433。切取菌丝块移植于PDA斜面，继续培养，4℃下保藏于冰箱中。
(2)形态鉴定
菌株SP433在PDA平板上，25℃，10天，菌落直径53.0mm，菌落呈白色，厚绒状，背面橘黄色，有少量褶皱(图1)。孢子卵圆形和近球形，孢子长2.385μm，宽1.384μm(图2)。
(3)分子生物学鉴定
针对29株菌株均进行分子生物学鉴定。
采用CTAB法提取DNA，包括以下步骤：
(a)将球孢白僵菌菌株SP433在PDA平板上培养一周后，小心刮取菌丝体于研钵中，加入液氮迅速充分研碎；
(b)取适量研碎的菌丝体迅速转移到离心管中，加入300μL经65℃预热的DNA提取液裂解液，充分混匀，加入等体积的氯仿/异戊醇(24/1)混合液混匀，65℃下水浴1h，10min左右轻轻震荡一次，12000rpm常温条件下离心5min；
(c)缓慢吸取上清液于另一新离心管中，缓慢加入等体积的氯仿/异戊醇(24/1)混合液进行再次抽提，12000rpm常温条件下离心5min；
(d)缓慢吸取上清液于另一新离心管中，加入1/10体积的醋酸钠，等体积预冷的异丙醇，室温静止15min；
(e)加入70％乙醇洗涤沉淀2次；
(f)移液枪紧贴管壁缓慢吸出乙醇，置于超净工作台内吹干；
(g)所得沉淀溶于50μL的TE中；
(h)用1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，其余提取物置于-20℃条件下保存。
真菌DNA的PCR所用引物为通用引物：B5.1F：5’-cgacccggccaactactttga-3’和B3.1R：5’-gtcttccagtaccactacgcc-3’。扩增条件：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环；72℃延伸10min。
50μL反应体系如下：
Figure GDA0002069501760000111
PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳(含EB)，缓冲液为1×TAE，电压150V、电流220mA，Marker DL2000作为分子量标准参照物，电泳结束后，在凝胶成像仪上检测并拍照记录。
特异性PCR产物委托上海美吉生物医药科技有限公司进行测序。序列比对与发育树构建：测序结果用BLAST搜索同源性较高的相关序列，使用MEGA5.1软件中的Cluster W进行序列比对和多重序列比对。并在该软件中构建Neighbour-joining(NJ)系统发育树。
鉴定结果
(1)如图3所示，每个泳道的电泳条带比较清晰，可以根据PCR产物的迁移距离来准确判断该菌株的基因片段约为600bp，其中仅显示编号1至24的菌株，而编号23为SP433菌株。
(2)将得到的该菌株基因型的ITS序列和从GenBank下载的3株白僵菌菌相关序列组合，构建分子系统树，结果如图4所示，SP433菌株属于Beauveria bassiana，为球孢白僵菌。
综合形态学特征与生理生化特性鉴定结果显示，该SP433菌株属于球孢白僵菌属，并于2019年2月21日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏编号为GDMCC NO:60589，保藏地址为中国广州。

Claims (6)

1.一种对烟粉虱具有致病的优良菌株，其是球孢白僵菌(Beauveria bassiana)菌株SP433，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO: 60589。
2.如权利要求1所述的菌株在防治烟粉虱中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，将所述菌株培养后制成孢子液、含孢子的菌剂。
4.如权利要求2或3所述的应用，其特征在于，施用时菌株的孢子浓度为107 孢子/mL至109 孢子/mL。
5.如权利要求2或3所述的应用，其特征在于，施用时菌株的孢子浓度为108 孢子/mL。
6.如权利要求2或3所述的应用，其特征在于，在预测烟粉虱将要发生时或发生初期施用的所述菌剂。
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