CN105274007B - 一株金龟子绿僵菌小孢变种MaTS02及其在防治烟粉虱方面的应用 - Google Patents

一株金龟子绿僵菌小孢变种MaTS02及其在防治烟粉虱方面的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株金龟子绿僵菌菌株及其应用。菌株MaTS02是金龟子绿僵菌小孢变种，所述菌株已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏日期2015年3月31日，保藏号CCTCC M 2015167。所述菌株是从西藏自治区白朗县的土壤里分离，该菌株生长性状好，产孢能力强，对烟粉虱杀虫活性强，对2龄烟粉虱的致死中浓度LC50为5.15×106孢子/mL（处理后7天），致死中时间LT50为6.40天（107孢子/mL）。利用该菌生产杀虫真菌制剂，作为一种活体生物杀虫剂，能够安全、环保地控制烟粉虱的危害。

Description

一株金龟子绿僵菌小孢变种MaTS02及其在防治烟粉虱方面的 应用
技术领域
本发明涉及生物农药技术领域，具体地，涉及一株金龟子绿僵菌小孢变种MaTS02及其在防治烟粉虱中的应用。
背景技术
烟粉虱Bemisia tabaci(Gennadius)又称棉粉虱或甘薯粉虱，是一种多食性害虫，其寄主植物多达74科500多种。烟粉虱常在大田作物、温室蔬菜和园林植物上时发生与危害，植株使叶片褪绿、变黄、萎蔫，甚至整株枯死，而且其成虫和若虫还会分泌大量蜜露，引发煤污病和传播植物病毒病。目前防治烟粉虱的最主要方法是化学防治，但长期大量使用化学杀虫剂会导致烟粉虱种群抗性增加、生态失衡、环境污染等问题，而生物防治凭借对人畜安全，保护环境，对害虫具有长期抑制作用的优点，为人们防治害虫开辟了新的途径。
昆虫病原真菌是唯一具有触杀特性的微生物，是最早发现用于害虫防治的微生物，并且未发现抗性害虫产生，对解决害虫的抗药性问题极具潜力，且杀虫真菌具有较强的水平和垂直扩散能力，容易形成流行病，有助于害虫的持续控制，因此真菌作为重要的生物农药，越来越受到关注。目前，国内外先后登记注册的杀虫真菌农药已有100多个。绿僵菌Metarhizium anisopliae是一种重要的昆虫病原真菌，以其为主要生物活性成分的制剂具有无残留、易生产、持效期长、致病力强、应用效果好、对非靶标生物安全等优点，具有广阔的应用前景。自1879年Мечников大量繁殖绿僵菌，防治奥地利丽金龟Anisopliaaustriaca以来，该菌就成了害虫微生物防治的主角之一，目前超过200种农林害虫可被绿僵菌制剂控制危害。
现有技术中公开绿僵菌用于害虫的防治，如：专利申请号200910103950.6公开了一种杀虫绿僵菌菌株用于防治天牛、蛴螬等地下害虫；专利申请号201110105462.6公开了一种绿僵菌菌株用于防治稻纵卷叶螟；专利申请号201110134976.4公开了一种绿僵菌菌株用于防治稻飞虱；专利申请号201210274297.1公开了一种金龟子绿僵菌菌株用于防治甘蔗螟虫，并对椰心叶甲、东亚飞蝗、荔枝椿象及菠萝灰粉蚧具有较强的致病力；专利申请号CN201510055121公开了一种金龟子绿僵菌菌株用于防治油茶象幼虫；专利申请 号CN201310364795公开了一种绿僵菌菌株用于防治棕榈害虫红棕象甲；专利申请号CN200810219404一种金龟子绿僵菌菌株用于防治椰心叶甲。可见，目前国内外分离的金龟子绿僵菌菌株主要用于防治蝗虫、棉铃虫、菜青虫、小菜蛾以及地下害虫等，用金龟子绿僵菌防治烟粉虱尚未见到相关报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是为开发新的真菌杀虫剂提供材料，提供一株对烟粉虱具有杀灭作用的金龟子绿僵菌小孢变种。。
本发明的另一个目的是提供所述金龟子绿僵菌小孢变种菌株在防治烟粉虱方面的应用。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
一株金龟子绿僵菌小孢变种小孢变种(Metarhizium anisopliaevar.anisopliae)菌株MaTS02，所述菌株于2015年3月26日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC No.M2015167，保藏地址为中国武汉武汉大学。
金龟子绿僵菌小孢变种菌株MaTS02在查氏培养基上培养初期，菌落呈现白色棉絮状，产孢时呈现橄榄绿色。产生较发达的气生菌丝，菌丝具有分隔和分支且透明，直径为2.49-4.12μm；分生孢子梗单生或者聚集，有些排列分散，有些排列紧密，分支呈现蒲公英状，末端产生瓶形小梗，长为10.31-17.09μm，宽为3.13-4.03μm，分生孢子梗产生串连的分生孢子，分生孢子单细胞，长椭圆形，易脱落，透明，浅绿色，长5.80-8.71μm，宽2.48-4.48μm。从以上特征看菌株MaTS02与金龟子绿僵菌小孢变种(Metarhizium anisopliaevar.Anisopliae)近似。
采用ITS1和ITS4通用引物扩增MaTS02菌株的ITS1-5.8S-ITS4 rDNA基因片断，序列如SEQ ID NO:1所示，序列长527bp，测定后与NCBI数据库中已知序列比对，构建系统发育树。证实MaTS02菌株为金龟子绿僵菌小孢变种(Metarhizium anisopliaevar.anisopliae)。
通过上述生物学性状及生理生化和分子鉴定可知，MaTS02菌株分类地位属于分类地位属于真菌门(Eumycota)、子囊菌亚门(Ascomycotina)、核菌纲(Pyrenomycetes)、球壳菌目(Sphaerizles)、麦角菌科(Clavicipitetaceae)、绿僵菌属(Metarhizium)。
本发明同时提供了所述金龟子绿僵菌小孢变种(Metarhizium anisopliae var.anisopliae)菌株MaTS02在防治烟粉虱中的应用。
优选地，所述防治烟粉虱是收获金龟子绿僵菌小孢变种的分生孢子，用0.05％吐温-80溶液配制成浓度为107分生孢子/mL的悬浮液，于烟粉虱若虫发生高峰期采用叶面喷雾法将悬浮液施用于田间。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供的金龟子绿僵菌小孢变种菌株MaTS02，具有对烟粉虱杀虫活性高，并且具备不污染环境、不产生抗药性等微生物农药的优点，能够用于蔬菜、水果与其他经济作物的有机农业与绿色农业生产。
附图说明
图1为菌株在察氏培养基上培养14天的菌落形态，A：菌落正面；B：菌落背面。
图2为菌株产孢结构与分生孢子。
图3为MaTS02菌株ITS1-5.8S-ITS4 rDNA基因特异性扩增电泳图。
图4为MaTS02菌株rDNA-ITS序列发育树。
图5为MaTS02菌株侵染2-3龄烟粉虱形态特征。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例来进一步详细阐述本发明。如下实施例为本发明较佳的实施方式，本发明主要阐述所述菌株的发明思想，实施方式不一一在实施例中追述，但并不因此限制本发明，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，应被视为等效的置换方式，包含在本发明内。
实施例1金龟子绿僵菌小孢变种菌株MaTS02的分离、筛选
采集甘肃省永登县中川镇的土壤，土壤样品过筛去掉石粒和杂物，取净土10g悬浮于90mL 0.05％的吐温80溶液中，摇匀，静置15min，取其上清液2mL稀释于8mL 0.05％吐温80中。
选择培养：将0.1mL上述悬浮液接种于选择培养基平板表面上，用三角玻棒均匀涂抹。25℃下，恒温培养3～6d，然后用接种环于单菌落上挑取菌丝，接种于PDA平板上继续培养，纯化后保存于4℃冰箱中备用。
经过上述操作，从土壤中筛选出一株对烟粉虱具有致病作用的真菌，编号MaTS02。
实施例2菌株MaTS02的鉴定
实施例1筛选的菌株MaTS02菌株的形态鉴定：将分离得到的绿僵菌菌株MaTS02接种在查氏培养基(硝酸钠3g；磷酸氢二钾1g；硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.5g；氯化钾0.5g；硫酸亚铁0.01g；蔗糖30g；琼脂20g；蒸馏水1000mL，121℃湿热灭菌30min)平板上，25±1℃培养14天观察菌落形态特征、产孢结构和孢子形态大小。结果显示在查氏培养基上培养初期菌落呈现白色棉絮状，产孢时呈现橄榄绿色。产生较发达的气生菌丝，菌丝具有分隔和分支且透明，直径为2.49-4.12μm；分生孢子梗单生或者聚集，有些排列分散，有些排列紧密，分支呈现蒲公英状，末端产生瓶形小梗，长为10.31-17.09μm，宽为3.13-4.03μm，分生孢子梗产生串连的分生孢子，分生孢子单细胞，长椭圆形，易脱落，透明，浅绿色，长5.80-8.71μm，宽2.48-4.48μm(附图2)。从以上特征看菌株MaTS02与金龟子绿僵菌小孢变种(Metarhiziumanisopliae var.Anisopliae)近似。
菌株的分子生物学鉴定：采用通用引物ITS1和ITS4扩增ITS1-5.8S-ITS4 rDNA基因片断(附图3)，序列(Seq.1，527bp)测定后与NCBI数据库中已知序列比对，构建系统发育树(附图4)。证实MaTS02菌株为金龟子绿僵菌小孢变种(Metarhizium anisopliaevar.anisopliae)。
该菌株于2015年3月26日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC No.M2015167，保藏地址为中国武汉武汉大学。
实施例3
供试虫源的饲养：选取长势良好且健康的扶桑苗，摘除老叶部分，留下20片左右的新叶，将叶片用清水清洗干净，放入养虫笼中。待叶片风干后，将经多代人工饲养纯化的B型烟粉虱成虫释放到养虫笼中，以每株释放50对烟粉虱成虫计算释放虫量。在光照14:10(L:D)、温度25±1℃、相对湿度70±10％条件下，让烟粉虱在笼中产卵1天，然后驱走全部成虫。继续培养，并观察烟粉虱卵孵化情况，待发育到2龄若虫期时(约7d)进行实验。
供试菌株孢子悬浮液的配制：将来自青藏高原地区土壤的不同真菌菌株作为供试菌株，对烟粉虱进行致病力测定，取各菌株的分生孢子，用0.05％吐温80溶液配制成1.0×108个孢子/mL的悬浮液，采用浸渍法处理，将孢子接种于盆栽扶桑苗上的2龄B型烟粉虱若虫上，以清水处理作为对照，重复3次，每隔48小时检查烟粉虱的死虫数，最后计算13天后烟粉虱的累积死亡率。
累积死亡率(％)＝调查时累积死亡虫数/处理前虫数×100％
校正死亡率(％)＝(处理死亡率-对照死亡率)/(1-对照死亡率)×100％
不同菌株对烟粉虱的累计校正死亡率如表1。结果显示处理13天绿僵菌属中MaTS02菌株对烟粉虱的累计死亡率89.72％，显著高于其他供试菌株。
表1 不同菌株对烟粉虱的致病力
实施例4菌株MaTS02对烟粉虱室内杀虫活性的测定
采用实施例3所述供试烟粉虱，将所述菌株用0.05％Tween-80水溶液配制成1.0×108孢子/mL的孢子悬液，以此作为母液分别稀释成浓度为107、5×106、106、5×105和105孢子/mL的浓度系列悬浮液，处理时将带虫扶桑叶片剪下，留下叶柄长约1cm，采用叶片浸渍法，将叶片在菌剂里浸渍20s，取出后自然风干叶片表面的水分，然后将叶柄用有植物营养液的棉花包被，放入直径为9cm的培养皿中，每个培养皿放1片叶，培养皿底铺滤纸保湿。置于光照14:10(L:D)、温度25±1℃、相对湿度70±10％的光照培养箱中培养。对照组为0.05％Tween－80水溶液处理，实验重复3次。从处理后第2天开始，每48小时在解剖镜下检查，若虫虫体干瘪、颜色变枯黄者即为死亡。统计死亡情况，经SPSS软件分析出菌株的致死中浓度LC50和致死中时LT50。
结果显示(表2)，绿僵菌MaTS02菌株对烟粉虱有明显的杀虫活性，接种 后5-9天出现死亡高峰期，烟粉虱幼虫死后虫体长满白色菌丝，随后出现了绿色孢子(附图5)。MaTS02菌株对烟粉虱处理7天时的LC50为5.15×106孢子/mL，在菌剂浓度为10×106孢子/mL时，LT50为6.40天。表现了对烟粉虱很好的防治效果。
表2 金龟子绿僵菌小孢变种MaTS02菌株对烟粉虱2龄若虫累积校正死亡率
表3 金龟子绿僵菌小孢变种MaTS02菌株对烟粉虱的LC50值
表4 金龟子绿僵菌小孢变种MaTS02菌株对烟粉虱的LT50值
SEQUENCE LISTING
<110> 华南农业大学
<120> 一株金龟子绿僵菌小孢变种MaTS02及其在防治烟粉虱方面的应用
<130>
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 527
<212> DNA
<213> ITS1-5.8S-ITS4 rDNA基因序列
<400> 1
ggggatcgac ttcactccca cccctgtgat tataccttta attgttgctt cggcgggact 60
tcgcgcccgc cggggaccca aaccttctga attttttaat aagtatcttc tgagtggtta 120
aaaaaatgaa tcaaaacttt caacaacgga tctcttggtt ctggcatcga tgaagaacgc 180
agcgaaatgc gataagtaat gtgaattgca gaattcagtg aatcatcgaa tctttgaacg 240
cacattgcgc ccgtcagtat tctggcgggc atgcctgttc gagcgtcatt acgcccctca 300
agtcccctgt ggacttggtg ttggggatcg gcgaggctgg ttttccagca cagccgtccc 360
ttaaattaat tggcggtctc gccgtggccc tcctctgcgc agtagtaaaa cactcgcaac 420
aggagcccgg cgcggtccac tgccgtaaaa ccccccaact ttttatagtt gacctcgaat 480
caggtaggac tacccgctga acttaagcat atcaaaagcc ggaggaa 527

Claims (3)

1.一株金龟子绿僵菌小孢变种(Metarhizium anisopliae var.anisopliae)菌株MaTS02，其特征在于，所述菌株于2015年3月26日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC No.M2015167。
2.权利要求1所述金龟子绿僵菌小孢变种(Metarhizium anisopliae var.anisopliae)菌株MaTS02在防治B型烟粉虱中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述防治B型烟粉虱是收获金龟子绿僵菌小孢变种的分生孢子，用0.05％吐温-80溶液配制成浓度为107分生孢子/mL的悬浮液，于B型烟粉虱若虫发生高峰期采用叶面喷雾法将悬浮液施用于田间。
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