CN101451108B - 一种防治蝇类害虫的蜡蚧轮枝菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种虫生真菌蜡蚧轮枝菌(Verticillium lecanii)，尤其防治常见的双翅目蝇类害虫有效。从被虫生真菌自然侵染的棕尾别麻蝇成虫虫体上分离获得野生菌株，在马铃薯葡萄糖琼胶培养基(PDA)上培养，并回接于棕尾别麻蝇成虫复壮获得一菌株，对该菌株进行单菌丝分离获得纯化的菌株，即Verticilliumlecanii KMZW-1(CGMCC No.2728)。该菌株在温度为28℃～29℃、相对湿度90％以上生长状况良好，产孢量大，孢子萌发率高。其孢子悬浮液对棕尾别麻蝇、丝光绿蝇、家蝇、酪蝇、果蝇成虫致病力较好。
Description
技术领域：
本发明属于微生物农药技术领域，具体涉及一种杀蝇类害虫的真菌蜡蚧轮枝菌及其应用。
背景技术：
蝇类是重要的卫生害虫，它不仅能通过其机体携带病原微生物传播疾病，而且在其种群密度高时，还能对视觉环境造成严重的“污染”。就蝇类防治工作来讲，它不但是预防医学的重要内容，同时也是建设文明卫生城镇的重要内容，为发展旅游事业、创造良好的投资环境、吸引外资所必需。经过几代科学家的努力，卫生害虫的分类、生活史及生态习性已基本明确，同时，杀虫剂的研制也从第一代有机氯开发到了第四代拟除虫菊酯卫生杀虫剂。化学杀虫剂虽然具有见效快、成本低的优点，但蝇类的生活周期短(15-18天)，分布范围广，繁殖能力强，无滞育现象。若常年用药防治次数过多，不仅会造成严重的环境污染，而且易杀死蝇类的天敌，并使目标害虫产生抗药性。这些负面影响使人们在防治中更加关注起生物防治。生物防治对人、畜、植物安全，害虫极少或不产生抗性，有利于环境保护。因此，研究蝇类的生物防治，避免或减少因不合理使用化学农药所带来的抗药性问题，已成为蝇类科学治理和可持续控制的重要课题。
蜡蚧轮枝菌(Verticillium lecanii)作为一种昆虫病原真菌，属于半知菌亚纲丝孢菌类轮枝菌属匍匐组，其寄主范围包括鞘翅目、鳞翅目、半翅目、缨翅目、直翅目、膜翅目和弹尾目、瘿螨、线虫，甚至还能寄生植物病菌。遗传稳定性较好，对人、畜、禽类、植物均未发现毒害，本菌在蝇类害虫防治方面还未见报道。因此，在防治卫生害虫时又有很大的发展前景。
发明内容：
本发明的目的在于克服现有方法的不足，提供了一种高效、无毒、安全、无残留、使用简便的防治蝇类害虫的蜡蚧轮枝菌。
本发明所提供的蜡蚧轮枝菌(Verticillium lecanii)KMZW-1已于2008年10月29日保藏于中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为No.2728。从罹病棕尾别麻蝇成虫上分离获得蜡蚧轮枝菌野生菌株，将野生菌株回接于棕尾别麻蝇成虫上复壮得到蜡蚧轮枝菌菌株，对该菌株采用按常规方法进行单孢分离、培养得到纯的、致病力强的蜡蚧轮枝菌。在光学显微镜(400倍)可以看到在该菌株的菌丝上长着分生孢子梗，分生孢子梗直立，锥形瓶颈轮生于菌丝体中间或顶部。分生孢子呈椭圆至圆柱形，大小为(2.4-)3.2-4.8(-6.4)×1.6-2.0(-2.8)μm。在PDA培养基上菌落圆形展开，白色，气生菌丝绒毛状致密如絮，背面微显黄，奶油黄至浅褐色，气生菌丝无色，有隔，宽1.1-2.5μm，分生孢子梗单生、对生或3-5根轮生，在菌丝末端孢子梗数较多。蜡蚧轮枝菌菌落直径平均每天都有1cm左右的生长速度，属于快速生长的类型。从第七天开始产孢量就可以达到1×108孢子/ml，产孢量较高。24小时孢子的萌发率可以达到80％左右。该菌分生孢子对棕尾别麻蝇、丝光绿蝇、家蝇、酪蝇、果蝇成虫致死中浓度(LC50)为9.50×105、4.58×107、4.06×107、4.10×103、1.05×107孢子/ml。
本发明的有益效果为：该菌株是分离得到的新菌株，培养比较简单，生长快速，产孢量大，孢子萌发率高。其孢子悬浮液对棕尾别麻蝇、丝光绿蝇、家蝇、酪蝇、果蝇成虫致病力较好，环保无污染、不易产生抗药性，可以广泛地用于蝇类的防治。
具体实施方式：
实施例一、病原菌的分离、鉴定
1.1材料与方法
1.1.1材料
在昆明市采集到被一种虫生真菌侵染后的罹病棕尾别麻蝇Boettcheriscaperegrine(Diptera：Sarcophagidae)成虫。
马铃薯葡萄糖琼胶培养基(PDA)：200g马铃薯+17～20g琼脂+17～20g葡萄糖+1000ml水。
无菌操作条件：所有的器皿和用具均经高温灭菌锅(121℃，30min)，接种等操作均在超净工作台内进行。
培养条件：置于29℃光照(12L:12D)恒温箱中培养，待菌落形成后，转移到试管PDA斜面，培养2～3天，转入4℃冰箱储存。
1.1.2病原菌的分离和纯化
分离从罹病棕尾别麻蝇成虫尸体上分离病原菌。将棕尾别麻蝇成虫尸体按顺序依次经过70％酒精浸泡30秒、再经过0.1％升汞溶液浸泡3分钟(彻底消毒)、最后用无菌水冲洗三次，将处理好的棕尾别麻蝇成虫尸体接种于PDA培养基上。在温度为29℃条件下培养，长出菌丝后按常规方法进行单孢分离、培养得到纯的、致病力强的菌株蜡蚧轮枝菌，转移到PDA斜面上生长3～4天，在4℃冰箱储存。
复壮将分离到的菌株在PDA上培养12～14天后，加入含1％吐温-80的无菌水收集孢子，后转移到烧杯内，用玻璃棒搅拌均匀，得到适当浓度(108孢子/ml)的孢子悬浮液，用小型喷雾器均匀喷于棕尾别麻蝇成虫体表(以虫体表面湿润为度)，保持相对湿度90％以上。收集死虫并保湿，得到的成虫虫尸再按以上方法分离得到致病力更强的菌株。
纯化挑取培养基上菌落边缘上的菌丝，再次接种在新的培养基上。如此多培养几代，菌株就得到了纯化。
1.1.3病原菌的鉴定
根据病原菌的培养性状、菌丝和分生孢子的形态进行鉴定。利用40×10倍显光学微镜，镜检菌丝和分生孢子的形态。
1.2结果
从被虫生真菌自然侵染的棕尾别麻蝇成虫虫体上分离获得野生菌株，在马铃薯葡萄糖琼胶培养基(PDA)上培养，并回接于棕尾别麻蝇成虫复壮获得一菌株，对该菌株进行单菌丝分离获得纯化的菌株，即Verticillium lecanii KMZW-1CGMCC No.2728。
在光学显微镜(400倍)可以看到在该菌株的菌丝上长着分生孢子梗，分生孢子梗直立，锥形瓶颈轮生于菌丝体中间或顶部。分生孢子呈椭圆至圆柱形，大小为(2.4-)3.2-4.8(-6.4)×1.6-2.0(-2.8)μm。在PDA培养基上菌落圆形展开，白色，气生菌丝绒毛状致密如絮，背面微显黄，奶油黄至浅褐色，气生菌丝无色，有隔，宽1.1-2.5μm，分生孢子梗单生、对生或3-5根轮生，在菌丝末端孢子梗数较多。
根据观察到的菌落、菌丝和孢子形态，与《昆虫真菌学》上的有关蜡蚧轮枝菌的形态特征描述和图谱进行对比分析，鉴定为蜡蚧轮枝菌。
实施例二、蜡蚧轮枝菌纯化菌株生物学特性
2.1材料与方法
2.1.1供试菌株选择纯化后长得均匀且生长旺盛的一皿作为供试菌株。取菌丝再次接种到PDA上，于29℃的恒温光照(12L:12D)培养箱中培养。
2.1.2菌落生长速率和产孢量的测定将事先培养好的蜡蚧轮枝菌取一皿用8mm的打孔器打孔，接种于新的培养基上，做三个重复，置于29℃的恒温光照(12D:12L)培养箱中培养，每天定时测定其直径并记录，直到菌落长满培养基为止。用直径为8mm的打孔器在培养基相同的位置取菌饼，加1％吐温-80和20ml无菌水，将孢子洗下，制成孢子悬浮液，用血球计数板测定产孢量。
2.1.3孢子萌发率的测定将菌株培养12～14天，分别用无菌水收集分生孢子，制成悬浮液，用带凹槽的载玻片测定孢子萌发率。将孢子悬浮液直接滴在无菌载玻片上，置于底铺滤纸的培养皿内，滴加几滴无菌水保持湿度在100％RH，培养24小时后镜检，每个处理三次重复。
2.2结果
由表1可以看出，8天内菌落直径平均生长速度为0.89cm/d，属于快速生长的类型。而第二天及第三天生长缓慢，是因为菌株刚接种时需要一段时间适应，菌落从第四天开始直径以0.7cm/d的速度生长。由表2可以看出，从第七天开始产孢量就可以达到1×108孢子/ml。产孢量较高。由表3可以看出，24小时孢子的萌发率可以达到80％左右。这些均说明该菌株的生物学特性较好，生长情况较好。
表1菌落直径的生长速度
表2产孢量测定结果
表3分生孢子萌发率(24小时)
实施例三、蜡蚧轮枝菌纯化菌株对棕尾别麻蝇、丝光绿蝇、家蝇、酪蝇、果蝇的室内致病性测定
3.1材料与方法
3.1.1供试虫源
选择刚羽化4天同一批次、无病、大小一致的棕尾别麻蝇、丝光绿蝇、家蝇、酪蝇、果蝇成虫作为试虫，将供试用虫单独分开装入小型养虫笼里，喂以水和白砂糖，在29±1℃和12L:12D的光周期条件下饲养。
3.1.2孢子悬浮液的制备
取长势良好的纯化蜡蚧轮枝菌用无菌水将孢子洗下并过滤(一般滤液内孢子数都能达到108孢子/ml)，用无菌毛细滴管取滤液一滴滴于血细胞计数板上，在显微镜下数孢子并记录数据，用无菌水依次稀释为108、107、106、105、104五个浓度梯度的孢子悬浮液，以无菌水为对照。孢子悬浮液和对照中均加入1％吐温-80和5％甘油，用于蜡蚧轮枝菌致病力测定。
3.1.3喷雾法
将制备的浓度梯度孢子悬浮液用小型喷雾器均匀喷于5种蝇成虫体表(以虫体表面湿润为度)，每个剂量三次重复，每个重复30头试虫，按下述方法进行接种：吸取10ml蜡蚧轮枝菌孢子悬浮液于小型喷雾器中，用喷雾法对试虫喷雾，以虫体表面湿润为宜，喷好后将养虫笼放到养虫室，将空调温度调为29℃、相对湿度控制在85％以上，每天光照培养12小时，暗培养12小时。每天记录观察试虫的死亡率。保持相对湿度85％以上，提供糖和水，观察并记录供试虫的死亡情况。
3.2结果
由表4可以看出，蜡蚧轮枝菌对酪蝇成虫的LC50最小，为4.10×103孢子/ml，其次是棕尾别麻蝇成虫，为9.50×105孢子/ml；对棕尾别麻蝇成虫的LC50最大，为4.58×107孢子/mL。由表5可以看出，蜡蚧轮枝菌对果蝇的LT50最小，为3.2天，其次是果蝇和棕尾别麻蝇，丝光绿蝇、家蝇和酪蝇LT50相差不大，均约为8天。
表4蜡蚧轮枝菌对5种蝇致死中浓度LC50比较
表5蜡蚧轮枝菌对5种蝇致死中时间LT50比较
3.3结果分析
我们首次从双翅目蝇类昆虫上分离纯化获得蜡蚧轮枝菌(Verticilliumlecanii)KMZW-1 CGMCC No.2728，该菌株在温度为28℃～29℃、相对湿度90％以上在PDA培养基上生长快速，产孢量大，孢子萌发率高。其孢子悬浮液对棕尾别麻蝇、丝光绿蝇、家蝇、酪蝇、果蝇成虫致病力较好，可以广泛地用于蝇类的防治。另外，该菌株培养原料来源广泛，价格便宜，培养技术简单，容易大量生产，有很大的发展潜力。同时，用该菌株进行蝇类的生物防治，可避免或减少因不合理使用化学农药所带来的抗药性问题，将为蝇类科学治理和可持续控制做出重要贡献。
Claims (2)
1.一种防治蝇类害虫的蜡蚧轮枝菌(Verticillium lecanii)KMZW-1，保藏号为CGMCC No.2728。
2.根据权利要求1所述的蜡蚧轮枝菌(Verticillium lecanii)KMZW-1菌株在防治棕尾别麻蝇、丝光绿蝇、家蝇、酪蝇、果蝇成虫的应用。
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