CN101955886B

CN101955886B - 一种球孢白僵菌Bb-N1菌株及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN101955886B
Application number: CN2010101259373A
Authority: CN
Inventors: 黄振; 任顺祥
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2010-03-12
Filing date: 2010-03-12
Publication date: 2012-07-18
Anticipated expiration: 2030-03-12
Also published as: CN101955886A

Abstract

本发明公开了一种球孢白僵菌Bb-N1菌株及其制备方法和应用。本发明球孢白僵菌Bb-N1菌株(Beaueria bassaria(Balsamo)Vuillemin，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：B201005)，属丛梗孢目，丛梗孢科，球孢白僵菌属，其菌落背面无色或黄色，分生孢子梗单生或聚集成孢梗束，100×1.5~2μm，壁光滑透明，多由着生4~6个瓶梗组成轮生体的轮状分枝组成；瓶梗基部呈球形，或拟椭圆形膨大，上部细长，5.7~8×1~2μm；分生孢子呈柱形至梭形，光滑、透明至微淡红色，3~4×1~2μm，无厚垣孢子。本发明球孢白僵菌Bb-N1菌株可以作为一种活体生物农药，对防治园林植物或蔬菜上的螺旋粉虱有特效且对环境无污染、无残留，还可用于防治烟粉虱等害虫。

Description

一种球孢白僵菌Bb-N1菌株及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及植物保护领域，具体涉及一种球孢白僵菌Bb-N1菌株及其制备方法和应用。

背景技术

螺旋粉虱Aleurodicus disperses Russell，属同翅目Homoptera，粉虱科Aleyrodidae，是一种食性广、危害重、传播快的危险性入侵害虫。主要以若虫在叶背面吸食汁液，并分泌蜜露粘于叶面，诱发霉污病，阻碍叶片的光合、呼吸及散热功能，促使枝叶老化，甚至严重枯萎和落叶。

在螺旋粉虱的防治上，多采用传统的化学防治方法，该虫分泌蜡丝包裹着卵和低龄幼虫，因而对常用化学农药有很强的抗药性影响了防治效果，随农药使用时间的延长螺旋粉虱对农药的抗药性不断增强。在生物农药防治方面未发现有用于防治螺旋粉虱的球孢白僵菌菌株。

发明内容

本发明的目的在于根据现有的螺旋粉虱防治技术中存在的不足，提供一种可以防治螺旋粉虱的球孢白僵菌Bb-N1菌株。

本发明另一目的在于提供上述螺旋粉虱的球孢白僵菌Bb-N1菌株的制备方法。

本发明还有一个目的在于提供上述螺旋粉虱的球孢白僵菌Bb-N1菌株的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：

一种用于防治螺旋粉虱的球孢白僵菌Bb-N1菌株Beaueria bassaria(Balsamo)Vuillemin，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO：M2010005，属丛梗孢目，丛梗孢科，球孢白僵菌属。

本发明中球孢白僵菌Bb-N1菌株的菌落背面无色或黄色，分生孢子梗单生或聚集成孢梗束，100×1.5~2μm，壁光滑透明，多由着生4~6个瓶梗组成轮生体的轮状分枝组成；瓶梗基部呈球形，或拟椭圆形膨大，上部细长，5.7~8×1~2μm；分生孢子呈柱形至梭形，光滑、透明至微淡红色，3~4×1~2μm，无厚垣孢子。

本发明中球孢白僵菌Bb-N1菌株的制备方法是：从被虫生真菌侵染的烟粉虱虫体上分离获得球孢白僵菌菌株，再将菌株接种于螺旋粉虱虫体上，获得球孢白僵菌Bb-N1菌株，对该菌株采用单孢子分离获得纯化菌株。

作为一种优选方案，本发明中球孢白僵菌Bb-N1菌株可以通过如下方法制备得到：(1)分离：对被虫生真菌感染的烟粉虱虫体样品进行表面消毒，消毒后放入平板中培养，待菌落形成后贮存；(2)侵染：将分离到的菌株培养，待形成菌落后收集孢子，将孢子悬浮液搅拌均匀后喷于带有螺旋粉虱的植物叶片上，5~30天后挑取被感染的螺旋粉虱，按照步骤(1)所述分离菌株；(3)纯化：将步骤(2)分离到的菌株培养，待形成白色孢子后，挑取分生孢子制成孢子悬液，于PDA培养基上培养后再放在培养箱中培养，获得球孢白僵菌Bb-N1菌株。

本发明球孢白僵菌菌株在防治园林植物或蔬菜上的螺旋粉虱有特效，同时也可用于防治烟粉虱等害虫。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明球孢白僵菌Bb-N1菌株是我国本土的一种昆虫病原真菌，作为一种活体生物农药，具有不同于现有化学杀虫剂的全新的作用机理，对环境无污染、无残留；本发明球孢白僵菌Bb-N1菌株在防治害虫方面可以应用于各种生态环境，有利于环境保护。

附图说明

图1是球孢白僵菌丝和分生孢子形态。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。

实施例1

材料来源：

在广州地区的蔬菜黄瓜上采集到一种虫真菌侵染后的烟粉虱Bemisia tabaci虫尸。

马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)：将200g马铃薯+20g葡萄糖+17~20g琼脂粉倒入烧杯中并加入水使总体积为1000ml。经高压灭锅灭菌(121℃，30min)。

无菌操作条件：所有器皿和用具须经高压灭锅灭菌(121℃，30min)，接种等操作均在超净工作台内进行。

培养条件：置于26℃光照(14L∶10D)恒温箱中培养，待菌落形成后，转移到PDA斜面，再转入4℃冰箱贮存。

病原菌的分离、鉴定：

(一)病原菌的分离与纯化

(1)分离

从采回的被虫生真菌感染的烟粉虱虫尸样品上分离病原菌。利用5wt％的次氯酸钠溶液对样品进行表面消毒，消毒后的样品在灭菌水中洗涤3次，并放入PDA平板中，倒置于26℃恒温箱中培养，待菌落形成后，转移到PDA斜面，再转入4℃冰箱贮存。

(2)侵染

将分离到的菌株在PDA平板上培养20天，待形成菌落后加入0.3wt％吐温-80的无菌水收集孢子，将孢子悬浮液在磁力搅拌器上搅拌20分钟，用小型手动喷雾器将稀释成1×10⁷孢子/ml的孢子悬浮液均匀地喷于带有螺旋粉虱的番木瓜叶片上，保温90％以上。20天后挑取被感染的螺旋粉虱，按前面所述的方法分离到A分离株。

(3)纯化

对A分离株分别在PDA平板上培养20d，待形成白色孢子后，挑取分生孢子制成1×10⁴孢子/ml的孢子悬液，将悬液滴于放有盖玻片的载玻片上，在生物显微镜下观察，将一个液滴中只有一个分生孢子的玻片插入PDA培养基上，放在培养箱中培养，获得B、C、D、E、F、G、H、I共8个分离株。

(4)病原菌的鉴定

根据病原菌的培养性状、菌丝、分生孢子和产孢器的形态进行初步鉴定。

1、菌落形态描述

将获得的10个分离株接种到PDA平板上，于26℃条件下培养。2~3天可见到长出白色的菌丝，菌落长绒状、白色、中部隆起，第5d产生肉红色粉末状孢子。菌落背面无色或黄色。

2、菌丝和孢子形态描述

分生孢子梗单生或聚集成孢梗束，100×1.5~2μm，壁光滑，透明，大多由着生4~6个瓶梗组成轮生体的轮状分枝组成。瓶梗基部球形，或拟椭圆形膨大，上部细长，5.7`8×1~2μm。分生孢子柱形至梭形、光滑、透明至微淡红色，3~4×1~2μm，无厚垣孢子。如图1。

(二)球孢白僵菌分离株的筛选

虫生真菌在遗传、生态及生物学等方面具有多样性，又存在有准性生殖现象，同种真菌的不同菌株对目标害虫的致病力差异显著，菌株不同，其LD₅₀、LT₅₀可相差数倍至数十倍。高产优质菌株的筛选与获得是取得较好防治效果的首要前提。以常用的致病力、产孢量、孢子萌发率等3个指标为菌株筛选为依据，筛选优良的球孢白僵菌菌株。

(1)供试菌株的处理

经纯化后获得的球孢白僵菌B、C、D、E、F、G、H、I共8个分离株，在PDA平板于26±0.5℃的恒温箱(14L∶10D)中培养。

(2)供试昆虫与寄主植物

螺旋粉虱，将室外在印度紫檀、木瓜和番石榴上的螺旋粉虱成虫，接种到无虫的木瓜幼苗上，产卵48h后，清除成虫，将木瓜幼苗置于26±0.5℃的光照培养箱中，待螺旋粉虱发育至2龄若虫时待用。番木瓜Carica Papaya L.，购自广东省农科院蔬菜研究所，试验苗均采用5·6片展开叶的盆栽苗。

(3)产孢量的测定

将8个分离株分别配制成1×10⁸孢子/ml的分生孢子悬液，分别取1ml悬液滴入PDA培养基上，用三角玻璃棒涂匀，待2`3d长出菌丝后用直径为13mm的打孔器新鲜菌落，接种于PDA平板上，然后置于培养箱中培养(L∶D＝14∶10)。每个菌株5次重复。第20d加入0.1％吐温-80无菌水并收集孢子，在磁力搅拌器上搅拌20分钟，使孢子充分分散，制成孢子悬浮液，用血球记数板记数测定产孢量。

8个分离株的产孢量见表1，生长20d后，分离株E、F的产孢量与其它分离株之间的产孢量差异显著，其中E分离株的产孢量最高。

表1球孢白僵菌8个分离株生长速率和产孢量(20d)

分离株产孢量(分生孢子/mL)

B 2.16×10⁹b

C 2.25×10⁹b

D 2.41×10⁹b

E 3.29×10⁹a

F 1.42×10⁹c

G 2.04×10⁹b

H 2.58×10⁹b

I 2.61×10⁹b

注：表中同列数字后字母相同者表示差异不显著(DMRT法)。

(4)孢子萌发率的测定

将8个分离株分别培养20d后，用无菌水收集孢子并制成悬液，用载玻片萌发法试验。将孢子悬液滴在无菌载玻片上，置于底部铺有滤纸的培养皿内，在皿内滴加3~4滴无菌水保湿(100，RH)，培养24h后镜检。每个处理3个重复。

8个分离株中，E、F分离株与其它分离株之间的分生孢子萌发率差异显著(见表2)。其中E分离株的孢子平均萌发率最高，C分离株的孢子萌发率最低。

表2球孢白僵菌8个分离株分生孢子萌发率(24h)

注：表中同列数字后字母相同者表示差异不显著(DMRT法)。

(5)分离株对螺旋粉虱若虫的致病力的测定

将8个分离株培养20d后，用无菌水收集孢子，配制成浓度为10⁸分生孢子/mL的孢子悬液。将带有3龄螺旋粉虱若虫的木瓜叶片浸入悬液中，对照浸入无菌水中，20s后取出，自然晾干。每处理为3~4片叶，每叶50~100头若虫，3次重复。将叶片和幼苗一起置于26±0.5℃的光照培养箱中(L∶D＝14∶10)。在处理后第6、12天镜检并记录感染死亡率。上述所有试验数据均在数据处理软件SAS系统上处理完成。

致病力研究结果表明，所有分离株的侵染率与对照相比差异显著。8个分离株在第5d开始表现出侵染症状，从第6d的侵染率可看出E、F分离株显著高于B、C、D、F、H、I分离株，第12d时E分离株与其它分离株的侵染率差异显著。从总体而言，分离株E的致病力较强，平均为72.11％(12d)，I分离株的侵染率较低，为37.39％(12d)(表3)。

表3球孢白僵菌8个分离株的致病力

注：表中同列数字后字母相同者表示差异不显著(DMRT法)。

(6)球孢白僵菌分离株的筛选结果

在筛选优良分离株时，致病性和产孢量的高低是重要的参考指标，孢子萌发率次之。在本发明中，E、F分离株与其它分离株之间分生孢子萌发率差异显著。从产孢量和致病性上看，分离株E较为优良，具有致病性强、产孢量较高等特点(表1、表3)。综合比较各方面的因素，E分离株为最佳菌株，将其命名为Bb-N1菌株，其菌株保藏号：保藏号为CCTCC NO：M2010005，2010年1月15日在中国典型培养物保藏中心保藏。所述的球孢白僵菌Beaueria bassaria(Balsamo)Vuillemin菌株Bb-N1，属丝孢目，球孢白僵菌属。

实施例2球孢白僵菌Bb-N1菌株对螺旋粉虱的致病力测定

生物测定是检测虫生真菌对目标害虫的致死程度和致死速率的有效手段之一，能为综合评价该真菌的生物防治潜力提供重要的参考依据。本研究就球孢白僵菌Bb-N1菌株对螺旋粉虱的致病力进行测定，以筛选出在防治时所用的最佳浓度。

供试昆虫与寄主植物：螺旋粉虱，将室外采集到的螺旋粉虱成虫，接种到无虫的番木瓜幼苗上，产卵24h后，清除成虫，将番木瓜幼苗置于25±0.5℃的光照培养箱中，待螺旋粉虱发育至3龄若虫时待用。番木瓜Carica Papaya L.，购自广东省农科院蔬菜研究所，试验苗均采用5~6片展开叶的盆栽苗。

(1)供试菌株的处理

经纯化后获得的球孢白僵菌Bb-N1菌株，采用PDA平板，于25±0.5℃的恒温箱(14L∶10D)中培养20天，加入0.3％吐温-80的无菌水收集孢子，将孢子悬浮液在磁力搅拌器上搅拌20分钟，待孢子被打散均匀后，用医用纱布过滤去杂质，获得孢子悬浮液，用血球记数板记数确定孢子浓度后，再配成1×10⁷、5×10⁷、1×10⁸、5×10⁸、1×10⁹孢子/ml等5个浓度梯度待用。

(2)分离株对螺旋粉虱若虫的致病力测定

将带有螺旋粉虱3龄若虫的番木瓜叶片浸入5个梯度的孢子悬浮液中，对照浸入含0.3％吐温-80的无菌水中，20s后取出，自然晾干。每处理为3~4片叶，每叶50·100头若虫，3次重复。处理过的叶片连同番木瓜苗一起放置于25±0.5℃的光照培养箱中(L∶D＝14∶10)。第6、12天镜检并记录感染死亡率。上述所有试验数据均在数据处理软件SAS系统上处理完成。

(3)球孢白僵菌株对螺旋粉虱3龄的累计死亡率

接种后的第4`5d，各处理区的若虫开始表现出发病症状，如螺旋粉虱的体色由透明逐渐变为白色，随后可观察到虫体上有少量白色的菌丝长出，几天后虫体表面出现白色的孢子，最后螺旋粉虱死亡。表4为球孢白僵菌处理后3龄若虫第7d、14d的累计死亡率，结果表明随着浓度的增加螺旋粉虱3龄的死亡率也增加，同一浓度下随着时间的增加，螺旋粉虱3龄的死亡率也增加。其中5×10⁸和1×10⁹处理区，烟粉虱的累计死亡率差异不显著。

表4不同浓度的球孢白僵菌对螺旋粉虱3龄若虫的累计死亡率

注：表中同列数字后字母相同者表示差异不显著(DMRT法)。

实施例3球孢白僵菌Bb-N1菌株对烟粉虱若虫的致病力测定

供试昆虫与寄主植物：烟粉虱，将网室中饲养在芥蓝上的烟粉虱成虫，接种到无虫的小白菜幼苗上，产卵12h后，清除成虫，将小白菜幼苗置于25±0.5℃的光照培养箱中，待小菜蛾发育至2龄幼虫时待用。小白菜Brassica campestrisL.ssp.chinensis，购自广东省农科院蔬菜研究所，试验苗均采用6～8片展开叶的盆栽苗。

(1)供试菌株的处理

经纯化后获得的球孢白僵菌Bb-N1菌株，在PDA平板上于25±0.5℃的恒温箱(14L∶10D)中培养10天，加入0.3wt％吐温-80的无菌水收集孢子，将孢子悬浮液在磁力搅拌器上搅拌20分钟，待孢子被打散均匀后，用医用纱布过滤去杂质，获得孢子悬浮液，用血球记数板记数确定孢子浓度后，再配成1×10³、1×10⁴、1×10⁵、1×10⁶、1×10⁷孢子/ml等5个浓度梯度待用。

(2)分离株对烟粉虱若虫的致病力测定

将带有烟粉虱2龄若虫的小白菜叶片浸入6个梯度的孢子悬浮液中，对照浸入无菌水中，20s后取出，自然晾干。每处理为3~4片叶，每叶10头若虫，3次重复。处理过的叶片灭菌的托盘中(25cm×35cm)，并放置于25±0.5℃的光照培养箱中(L∶D＝14∶10)。每日镜检并记录感染死亡率，并更换新鲜的白菜时片，连续观察10d。上述所有试验数据均在数据处理软件SAS系统上处理完成。

(3)球孢白僵菌株对烟粉虱2龄的累计死亡率

接种后的第3~4d，各处理区的若虫开始表现出发病症状，如虫体体色变白，随后可观察到虫体上有少量白色的菌丝长出，几天后虫体表面出现白色的孢子，最后烟粉虱死亡。表4为球孢白僵菌处理后2龄若虫第5d、10d的累计死亡率，结果表明随着浓度的增加烟粉虱2龄的死亡率也增加，同一浓度下随着时间的增加，烟粉虱2龄的死亡率也增加。其中1×10⁶和1×10⁷处理区，烟粉虱的累计死亡率差异不显著。

表4不同浓度的球孢白僵菌对烟粉虱2龄若虫的累计死亡率

注：表中同列数字后字母相同者表示差异不显著(DMRT法)。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种球孢白僵菌Bb-N1菌株(Beaueria bassaria(Balsamo)Vuillemin)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2010005，属丛梗孢目，丛梗孢科，球孢白僵菌属。

2.权利要求1所述球孢白僵菌Bb-N1菌株在防治园林植物或蔬菜上的螺旋粉虱中的应用。

3.权利要求1所述球孢白僵菌Bb-N1菌株在防治园林植物或蔬菜上的烟粉虱中的应用。