CN105232580A - 一种利用脓病蚕生产药用白僵蚕的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用脓病蚕生产药用白僵蚕的方法，其包括以下步骤：步骤A：采集白僵病蚕，并清理其表面的污染物，烘干待用；步骤B：取白僵病蚕表面的孢子粉，用无菌水溶解；步骤C：进行菌株鉴定，该菌株为球孢白僵菌；步骤D：确定所述球孢白僵菌培养的最佳条件；步骤E：选取脓病蚕，利用上述球孢白僵菌对上述脓病蚕进行硬化处理；步骤F：确定脓病蚕的蚕体的硬化处理的最佳条件。本发明利用脓病蚕生产药用白僵蚕的方法，其提供了一条新的制备药用白僵蚕的途径，充分利用将被遗弃的脓病蚕，避免了养蚕过程中经济损失，开启了废物利用的新途径，且该制备方法简单，成本低，制备效率高，制备的药用白僵蚕质量好。

Description

一种利用脓病蚕生产药用白僵蚕的方法

技术领域

本发明涉及药用白僵蚕的制备方法，尤其是涉及一种利用脓病蚕生产药用白僵蚕的方法。

背景技术

球孢白僵菌(BeauveriaBassiana(Balsamo)Vuillemin)，是一种常见的昆虫寄生真菌，在分类学上属于属于半知菌亚门(Deuleromycotina)，丝孢纲(Hyphomycetes)，丛孢梗目(Moniliales)，丛梗孢科(Moniliaceae)，白僵菌属(Beauveria)。白僵菌寄主广泛，毒力强，能使多种昆虫在短时间内毙命，形成的白僵虫很多经炮制后都能作为中药，或单独入药或配伍治疗多种疾病，白僵菌侵染家蚕形成的白僵蚕就是其中一类。脓病是丝茧育生产中很常见，危害又极其严重的一类传染性蚕病。有统计数字表明因家蚕传染病造成丝茧生产欠收绝收的90％以上是脓病造成。它具有传染性强、蔓延快、根治难等特点，一旦染病，就会造成不可挽回的损失。

白僵蚕作为一味作用广泛的中药，其市场需求不言而喻，但是随着家蚕养殖技术的不断提高和完善，能够从家蚕养殖过程中收集足够的白僵蚕来满足市场需求的可能性越来越小，而且收集来的僵蚕成色不一，质量不能保证，其中也不乏弄虚作假者。目前，现有技术中生产药用白僵蚕的方法主要是采用健康的4龄或5龄蚕作为生产白僵蚕的原料，这样从经济效益的角度来说不可取，也与养蚕获取蚕丝的初衷不相符。

由此可见，现有的制备白僵蚕的方法存在明显的不足和缺陷，亟待进一步改进。

发明内容

本发明的目的是提供利用脓病蚕生产药用白僵蚕的方法，其具有方法简单，成本低，利用脓病蚕制备药用白僵蚕，避免了养蚕中的经济损失，制备的药用白僵蚕质量好，提供了一条新的制备药用白僵蚕的途径。

为解决上述技术问题，本发明提供一种利用脓病蚕生产药用白僵蚕的方法，其包括以下步骤：

步骤A：采集白僵病蚕，并清理其表面的污染物，烘干待用；

步骤B：取白僵病蚕表面的孢子粉，用无菌水溶解；

步骤C：进行菌株鉴定，该菌株为球孢白僵菌；

步骤D：确定所述球孢白僵菌培养的最佳条件；

步骤E：选取脓病蚕，利用上述球孢白僵菌对上述脓病蚕进行硬化处理；

步骤F：确定脓病蚕的蚕体的硬化处理的最佳条件；

步骤G：按照步骤F中确定的最佳条件硬化脓病蚕，得到合格的药用白僵蚕。

本发明的一个实施例中，所述步骤C中，确定菌株为球孢白僵菌是通过菌株的形态以及菌株的rRNAITS序列分子鉴定和系统发育树的构建进行鉴定的。

本发明的一个实施例中，所述菌株的rRNAITS序列片段扩增后的序列的测序结果与NCBI数据库中的白僵菌序列进行比对，用CLUSTALX软件进行序列比对分析，并用MEGA4.0软件的最大似然法构建系统发育树，选用蜡蚧轮枝菌LecanicilliumlecaniiFJ515771的同源序列作为外群，进行1000次重复。

本发明的一个实施例中，确定所述球孢白僵菌的最佳发酵时间，最佳碳源，最佳氮源以及最佳微量元素的用量；

所述球孢白僵菌最佳发酵时间为120小时；最佳碳源为马铃薯淀粉；最佳氮源为黄豆粉；最佳微量元素为CuSO₄，FeCl₃，MnSO₄的组合。

本发明的一个实施例中，所述步骤F中，对脓病蚕进行硬化处理时，75.0g干脓病蚕体的最佳接种量为0.1L/kg，脓病蚕体的最佳含水量为50％～55％，脓病蚕体上培养菌体的最佳培养温度为27℃。

本发明的一个实施例中，所述步骤F中，对脓病蚕进行硬化处理时，脓蚕体的最佳含水量为50％～55％。

本发明的一个实施例中，所述球孢白僵菌菌丝光滑，有隔，大小在2.5μm到3.5μm之间，产孢细胞基部膨大为瓶形或近球形，颈部明显延长成产孢轴，轴上产分生孢子。

本发明的一个实施例中，所述脓病蚕的蚕体的硬化处理过程中，通入氧气对所述球孢白僵菌进行培养。

本发明的有益效果：

本发明利用脓病蚕生产药用白僵蚕的方法，提供了一条新的制备药用白僵蚕的途径，利用将被遗弃的脓病蚕，避免了养蚕过程中经济损失，开启了废物利用的新途径，且该制备方法简单，成本低，制备效率高，制备的药用白僵蚕质量好。

附图说明

图1为本发明的球孢白僵菌在PDA培养基的菌落特征图；

图2为本发明的球孢白僵菌液生分生孢子形态的显微观察(10×40)图；

图3为本发明采用ML法构建的不同来源白僵菌基于rRNAITS基因序列的系统发育树的图；

图4为本发明的液生分生孢子随时间的变化曲线图；

图5为本发明的芽生分生孢子随时间的变化曲线图；

图6为本发明图的白僵菌菌丝显微形态的图；

图7为本发明的不同碳源对液生分生孢子形成的影响的图；

图8为本发明的不同碳源对芽生孢子形成的影响的图；

图9为本发明的不同氮源对液生分生孢子形成的影响的图；

图10为本发明的不同氮源对芽生孢子形成的影响的图；

图11为本发明图的不同微量元素对液生分生孢子产生的影响的图；

图12为本发明图的不同微量元素对芽生孢子产生的影响的图。

具体实施方式

本发明采集了八头自然发病的白僵病蚕，蚕体僵硬，表面密布白色粉末，头与身体间构成一定角度，断折面黑色晶亮，有自然发酵味道。

本发明中，采用的基础培养基为：白僵菌的分离采用普通PDA培养基：马铃薯200.0g，葡萄糖20.0g，琼脂20.0g，H₂O1000mL。

本发明的白僵菌的保藏采用改良的PDA培养基为：马铃薯200.0g，葡萄糖20.0g，牛肉膏20.0g，CaCO₃3.0g，(NH₄)₂SO₄1.0g，K₂HPO₄0.6g，MgSO₄1.0g，琼脂20.0g，H₂O1000mL。液体深层发酵最佳时间培养基：黄豆粉15g，蔗糖25g，KH₂PO₄1.50g，MgSO₄0.50g，CaCl₂0.01g，MnSO₄40μg，CuSO₄80μg，ZnSO₄400μg，FeCl₃500μg，VB₁30μg，VB₂5μg，VB₆2μg，烟酰胺100μg，右旋泛酸钙10μg，H₂O1000mL，吐温800.8％，pH6.5-7.0。

本发明的蚕体培养基，蚕体培养基采用从农户家收集个体完整、大小均匀的脓病蚕，取回后清理干净表面污物，烘干保存待用。

本发明的菌株通过稀释培养法进行分离，取自然发病的白僵蚕，清除表面的污物后，用接种刀轻轻刮取表面的孢子粉，放入盛有无菌水的试管中，再置于振荡器上面震荡15min，用移液枪吸取1mL孢子液，打入盛有9mL的无菌水中，得到10^-1梯度的孢子液，依次类推，得到10^-2到10^-7梯度的孢子液。用移液枪从10^-3到10^-7梯度的孢子液中吸取100μL稀释液均匀涂布于PDA平板，置于27℃环境下培养。

本发明的菌株的鉴定，形态鉴定分离得到白僵菌的观察：稀释孢子观察，切取一小块病原菌菌落，放入适量无菌水中震荡打散，用滴管移取一小滴在干净载玻片上，盖上盖玻片静置片刻后，进行显微观察。

盖玻片蔓延法观察：在超净工作台环境下，取无菌的盖玻片轻轻放置于倒好的PDA平板上，然后在空白处接入白僵菌病原菌，置于合适条件下培养，直到盖玻片表面覆盖满菌丝，再用镊子取出进行显微观察，查看其菌丝、孢子的形态和产孢子的方式。记录下两种鉴定原材料下观察得到的结果，参照《真菌鉴定手册》，对分离得到的白僵菌进行形态特征鉴定。

rRNAITS序列分子鉴定和系统发育树的构建，将扩增得到菌株rRNAITS序列片段的测序结果与NCBI数据库已登录中的白僵菌序列进行比对，下载部分菌株序列用于系统发育分析。用CLUSTALX软件进行序列比对分析；用MEGA4.0软件的最大似然法(maximumlikelihood，ML)构建系统发育树，选用蜡蚧轮枝菌LecanicilliumlecaniiFJ515771的同源序列作为外群，进行1000次重复。

请配合参阅图1和图6所示，该菌在PDA培养基培养表现为：菌落直径为20mm到30mm，近似圆形，中间有粒状凸起，边缘呈一定圆弧状，表面密生绒毛，绒毛高1mm到2mm，培养后期绒毛倒伏呈毛毡状，并且常有水滴形成，表面呈沟脊放射状，正面呈乳白色，背面淡黄色。

白僵菌显微观察形态表现为菌丝无色，细长，有隔，光滑，粗2.5μm到3.5μm，产孢细胞常簇生于菌丝或泡囊上，少数单生，产孢细胞基部膨大，多为瓶形，近球形。产孢细胞颈部明显延长成产孢轴，呈弯曲状，轴上具有小齿突，分生孢子位于小齿突上，培养后期，在底倍镜下可见球形的密集孢子头。分生孢子透明，光滑，多为球形和近球形，个别为长柱形，孢子半径约为4.5μm。请配合参阅图5所示，根据对培养菌株的观察总结，参照康曼等人的研究和《真菌鉴定手册》进行鉴定，初步确定该菌株属于：

半知菌亚门(Deuteromycotina)

丝孢纲(Hyphomycetales)

丛梗孢目(Moniliales)

丛梗孢科(Moniliaceae)

白僵菌属(Beauveria)

球孢白僵菌(Beauveriabassiana)

本发明中，根据菌落特征、产孢细胞的形态、产孢轴的发育过程以及孢子的形态等形态指标，鉴定菌株属于白僵菌属中的球孢白僵菌。

本发明的菌株的ITSrDNA序列分子鉴定和系统发育树的构建，PCR扩增获得供试白僵菌菌株的rRNAITS序列长度为607bp，通过NCBI数据库在线比对后发现该菌株rRNAITS序列与家蚕来源的球孢白僵菌Cordycepsbassiana(AJ564812)的序列相似度高达99％以上。

选取6株rRNAITS序列相似度99％以上的球孢白僵菌和1株布氏白僵菌，采用ML法构建系统发育树，可见供试菌株与家蚕来源的Cordycepsbassiana(AJ564812)和BeauveriabassianaBb16以及CordycepsbassianaAB079608聚为一类，亲缘关系最近。6株球孢白僵菌聚在一个较大的分支上，和布氏白僵菌BeauveriabrongniartiiCCRC32838分属于白僵菌的不同进化支，蜡蚧轮枝菌LecanicilliumlecaniiFJ515771作为外群处于一个单独的分支，与白僵菌的亲缘关系最远。结合对供试菌株分生孢子和菌落形态的观察结果，确定该菌株为球孢白僵菌(Beauveriabassiana)。

实施例1白僵菌液体发酵最佳时间的确定

白僵菌孢子悬浮液的制备，取培养了7d的成熟白僵菌斜面菌种，在无菌操作环境下加入灭菌的0.1％吐温-80溶液，进行表面孢子洗脱，经无菌纱布过滤，使得最终孢子含量约为1.0×10¹⁰个/L。

液体培养基配制，按照前面液体深层发酵最佳时间培养基配方配制相关培养基，在250ml规格的三角瓶中装49mL培养液，设置三个重复，包装灭菌，冷却后接入1mL上面制备的孢子悬浮液，置于27℃，150r/min条件下培养，每隔12h取样，用血球计数板进行液生分生孢子和芽生孢子计数。

表1液生分生孢子的形成描述

请配合参阅图4和图5所示，在接入孢子悬浮液36h后孢子数增加很快，呈现指数增长，在36h～84h是对数生长期，84h后孢子数量变化不明显，为稳定期，120h时达到最大值，之后菌丝自溶，孢子数逐渐减少且活力减弱，为衰退期，这时培养基中生物量逐渐减少，不适合做栽培种子液。芽生分生孢子在24h开始萌发，并逐渐增长，在培养了84h后达到最大值，之后便逐渐减少。

实施例2不同碳源对白僵菌液体深层发酵的影响

按照系统研究促进液生分生孢子培养基配方，配制成以黄豆粉为氮源，不同碳源的培养基，同时在各不同碳源培养基中加入基础盐、微量元素、复合维生素B和吐温-80。在250mL规格的三角瓶中装49mL培养液，每个碳源培养基设置三个重复，包装灭菌，冷却后接入1mL孢子悬浮液，置于27℃，150r/min条件下培养120h后用血球计数板测液生分生孢子数和芽生孢子数。

请配合参阅图7所示，不同碳源对白僵菌液生分生孢子的产生有不同影响，当以马铃薯淀粉作为唯一碳源时，对液生分生孢子的产生有明显的促进作用，产生的分生孢子大小均匀，整齐度高。其次是葡萄糖，也能产生较多的分生孢子，但数量不及马铃薯，最差是蔗糖。

请配合参阅图8所示，不同碳源对白僵菌芽生孢子的产生有不同影响，当以马铃薯淀粉作为唯一碳源时，对芽生孢子的产生有明显的促进作用，其次是蔗糖，最差是葡萄糖。

实施例3不同氮源对白僵菌液体深层发酵的影响

按照系统研究促进液生分生孢子培养基配方，配制成以蔗糖为碳源，不同氮源的培养基，同时在各不同氮源培养基中加入基础盐、微量元素、复合维生素B和吐温-80。在250mL规格的三角瓶中装49mL培养液，每个氮源培养基设置三个重复，包装灭菌，冷却后接入1mL孢子悬浮液，置于27℃，150r/min条件下培养120h后用血球计数板测液生分生孢子数和芽生孢子数。

请配合参阅图9所示，不同氮源对白僵菌液生分生孢子的产生有不同的影响，当以黄豆粉最为唯一氮源时发酵获得分生孢子数最大，且产生的孢子大小均匀，性状稳定。以(NH₄)₂SO₄作为供试氮源时，发酵产生的液生分生孢子虽然数量仅次于黄豆粉发酵得到的孢子数，但是产生的孢子大小不均匀，多畸形孢子。以玉米粉作为供试氮源时，产生的液生分生孢子大小不均匀，个体微小者占大多数。以麸皮作为供试氮源时产生的液生分生孢子大小均匀，但是数量稀少，不适合用作发酵氮源。

请配合参阅图10所示，当以黄豆粉作为唯一供试氮源时，对白僵菌芽生孢子的产生有明显的促进作用，其次是(NH₄)₂SO₄和麸皮，两种情况下产生的芽生孢子数大致相等，最差是玉米粉，产生的芽生孢子数远远小于其他供试氮源。

实施例4不同微量元素对白僵菌液体深层发酵的影响

按照系统研究促进液生分生孢子培养基配方，配制成以黄豆粉为氮源，以蔗糖为碳源的培养基设置只添加单一微量元素(CuSO₄，FeCl₃，MnSO₄，ZnSO₄)和不同的微量元素组合(CuSO₄+FeCl₃，CuSO₄+MnSO₄，CuSO₄+ZnSO₄，CuSO₄+FeCl₃+MnSO₄)，以及加入全部四种微量元素和不添加任何一种微量元素的不同处理。同时在各处理培养基中加入基础盐、复合维生素B和吐温-80。在250mL规格的三角瓶中装49mL培养液。每个处理设置三个重复，包装灭菌，冷却后接入1mL孢子悬浮液，置于27℃，150r/min条件下培养120h后用血球计数板测液生分生孢子数和芽生孢子数。

种子液的制备，以黄豆粉为氮源，蔗糖为碳源，并加入其他基础成分，在规格为250mL的三角瓶中分装39mL培养液，灭菌冷却后接入1mL孢子悬浮液(这里孢子悬浮液的浓度约为1×10¹⁰个/L)，置于27℃，150r/min条件下培养120h后取出待用。

请配合参阅图11所示，加入适量的微量元素有助于液生分生孢子的形成。在只加入四种微量元素其中一种的情况下，加入CuSO₄能产生更多的液生分生孢子，往后依次是MnSO₄、FeCl₃、ZnSO₄。在加入两种微量元素和三种微量元素的培养基中获得的液生分生孢子浓度相近，彼此差异不大。四种微量元素全部加入能获得最大的产孢量。

请配合参阅图12所示，只加入CuSO4对芽生孢子的生成有重要影响，其次加入ZnSO₄和微量元素组合CuSO₄+MnSO4、CuSO₄+FeCl₃、CuSO₄+FeCl₃+MnSO₄以及四种元素全部加入均能获得较高的芽生孢子数。

实施例6培养基质中不同含水量对培养过程的影响

准确称取75.0g干蚕体，加入适量干净饮用水，密封浸泡一天一夜，使蚕体含水量约为45％～50％(由前后质量差计算得出)，取出均匀分装在10个广口瓶中，包扎好灭菌，冷却后接入700μL种子液，置于27℃环境下培养，观察记录。

其他条件不变，依次设置含水量为50％～55％、55％～60％的培养梯度试验，培养过程中观察记录，确定三者中的最佳含水量。

实施例7不同培养温度对培养过程的影响

准确称取75.0g干蚕体，加入适量干净饮用水，密封浸泡一天一夜，使最终含水量约为50％(由前后质量差计算得出)，取出均匀分装在10个广口瓶中，包扎好灭菌，冷却后接入700μL种子液，置于23℃环境下培养，观察记录。

其他条件不变，依次设置培养为27℃、31℃的培养梯度试验，培养过程观察记录，确定三者中的最佳培养温度。

实施例8是否通氧对培养过程的影响

准确称取75.0g干蚕体，加入适量干净饮用水，密封浸泡一天一夜，使蚕体含水量约为50％(由前后质量差计算得出)，取出均匀分装在10个广口瓶中，包扎好灭菌，冷却后接入700μL种子液，置于27℃环境下培养，观察记录。

照此另外设置同样的10个广口瓶培养，在培养两天后打开瓶盖，使通气，并观察记录，确定通氧是否对菌丝生长有影响。

不同条件对蚕体培养过程的影响，表2蚕体硬化过程的描述

注：“--”未见孢子萌发；“-”有少量孢子萌发；“+”孢子大量萌发；“++”孢子萌发，连成菌苔；“+++”菌苔扩大；覆盖蚕体；“++++”覆盖蚕体，并侵入蚕体内，蚕体硬化

从表2可以看出，在接种量试验中，当其他条件相同时接种量的不同影响着蚕体的硬化，当接种量为0.1L/kg时，蚕体硬化速度最快，菌丝生长健壮，随着接种量的减少，蚕体硬化的速度逐渐减慢；

在含水量试验中，当其他条件相同时蚕体中不同的含水量对其硬化和菌丝生长有影响，含水量在50％～55％时培养情况最佳，蚕体硬化速度最快；在培养温度试验中，发现温度为27℃时最有利于菌丝的生长，23℃时菌丝也能生长，但速度较慢，环境温度为31℃时对白僵菌的生长有抑制作用；在是否通氧的试验中，发现通氧对白僵菌的生长有促进作用，孢子萌发较快，培养得到的蚕体硬化率更高。

对球孢白僵菌的生物学特征研究实验结果表明，球孢白僵菌菌丝光滑，有隔，大小在2.5μm到3.5μm之间，产孢细胞基部膨大为瓶形或近球形，颈部明显延长成产孢轴，轴上产分生孢子。分生孢子透明，光滑，多为球形和近球形，个别为长柱形，直径约为4.5μm。

在以黄豆粉、玉米粉、麸皮、(NH₄)₂SO₄为供选氮源的筛选试验中，发现以黄豆粉为唯一氮源的培养基产孢力最高，发酵后得到的液生分生孢子浓度和芽生孢子浓度都明显高于其他氮源培养基。以玉米粉为唯一氮源的培养基经接种发酵后得到的液生分生孢子和芽生孢子形态表现畸形，形态、大小各异，不适合做发酵培养基的氮源。在以马铃薯淀粉、蔗糖、葡萄糖为供选碳源的的筛选试验中，发现以马铃薯淀粉为唯一碳源的培养基产孢力最高，发酵后得到的液生分生孢子浓度和芽生孢子浓度都明显高于其他两个碳源培养基。以蔗糖为唯一碳源和以葡萄糖为唯一碳源的培养基产孢能力相当。在研究最佳微量元素和最适装液量对液生分生孢子产生的影响的试验中，得到的结果是MnSO₄、CuSO₄、ZnSO₄、FeCl₃四种微量元素同时加入的时候获得最好的结果，而最适宜的装液量是在250mL规格的三角瓶中装液40mL，得到最高孢子浓度。

在固体培养基质中，微生物的生长会经历三个时期，即延滞期、对数生长期和稳定期，在对数生长期，由于微生物的快速增殖会产生大量的生物热，如不能及时降温会对微生物生长产生影响，而微生物生长受到限制也会导致最后产物的减少。对于多数虫生真菌来说，适宜的生长温度在20～30℃之间。实验结果表明，培养温度控制在27℃的时候对白僵菌的生长有利，在此温度条件下菌丝能在7d内覆盖蚕体表面并侵入内部，使其硬化。

球孢白僵菌的生长需要较高的湿度。湿度过低不能满足白僵菌对生长的需求，生长缓慢，湿度过高则导致基质中含氧量降低，且容易被细菌污染。在发明的试验中设置了含水量为45％～50％、50％～55％、55％～60％三个梯度试验，其中当含水量在50％～55％区间时蚕体硬化情况最好。本发明发现白僵菌是好氧真菌，在生长过程中供应充足的氧气能加快白僵菌的生长。本发明发现最佳发酵条件以提高产孢力，再以脓病蚕为培养基质，初步研究了最佳培养条件，并获得了较好效果，为药用白僵蚕的人工培养提供了新的途径。

以上仅为本发明的较佳实施例，当不得以此限定本发明实施的技术范围，因此凡参考本发明的说明书内容所作的简单等效变化与修饰，皆应仍属本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种利用脓病蚕生产药用白僵蚕的方法，其特征在于包括以下步骤：

步骤A：采集白僵病蚕，并清理其表面的污染物，烘干待用；

步骤B：取白僵病蚕表面的孢子粉，用无菌水溶解；

步骤C：进行菌株鉴定，该菌株为球孢白僵菌；

步骤D：确定所述球孢白僵菌培养的最佳条件；

步骤E：选取脓病蚕，利用上述球孢白僵菌对上述脓病蚕进行硬化处理；

步骤F：确定脓病蚕的蚕体的硬化处理的最佳条件；

步骤G：按照步骤F中确定的最佳条件硬化脓病蚕，得到合格的药用白僵蚕。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

所述步骤C中，确定菌株为球孢白僵菌是通过菌株的形态以及菌株的rRNAITS序列分子鉴定和系统发育树的构建进行鉴定的。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，

所述菌株的rRNAITS序列片段扩增后的序列的测序结果与NCBI数据库中的白僵菌序列进行比对，用CLUSTALX软件进行序列比对分析，并用MEGA4.0软件的最大似然法构建系统发育树，选用蜡蚧轮枝菌LecanicilliumlecaniiFJ515771的同源序列作为外群，进行1000次重复。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

确定所述球孢白僵菌的最佳发酵时间，最佳碳源，最佳氮源以及最佳微量元素的用量；

所述球孢白僵菌最佳发酵时间为120小时；最佳碳源为马铃薯淀粉；最佳氮源为黄豆粉；最佳微量元素为CuSO₄，FeCl₃，MnSO₄的组合。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

所述步骤F中，对脓病蚕进行硬化处理时，75.0g干脓病蚕体的最佳接种量为0.1L/kg，脓病蚕体的最佳含水量为50％～55％，脓病蚕体上培养菌体的最佳培养温度为27℃。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

所述步骤F中，对脓病蚕进行硬化处理时，脓蚕体的最佳含水量为50％～55％。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

所述球孢白僵菌菌丝光滑，有隔，大小在2.5μm到3.5μm之间，产孢细胞基部膨大为瓶形或近球形，颈部明显延长成产孢轴，轴上产分生孢子。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

所述脓病蚕的蚕体的硬化处理过程中，通入氧气对所述球孢白僵菌进行培养。