CN106010978A - 冬虫夏草无性型中国被毛孢纯菌种的培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物培养技术领域，涉及一种冬虫夏草无性型中国被毛孢纯菌种的培养方法。包括以下步骤：A、采样，采集子囊孢子未弹射的野生冬虫夏草子座，保存，B、分离，取冬虫夏草子座中的菌种于无菌条件下接种于平板中，C、培养，将含有菌种的平板在培养箱中恒温培养，得到中国被毛孢菌落，D、纯化，将步骤C中的菌落转移至新的平板中进行培养，获得中国被毛孢纯菌种。本发明较容易获得中国被毛孢纯菌种，适用于冬虫夏草菌种的分离。

Description

冬虫夏草无性型中国被毛孢纯菌种的培养方法
技术领域
本发明属于微生物培养技术领域，涉及一种冬虫夏草无性型中国被毛孢纯菌种的培养方法。
背景技术
冬虫夏草是我国独有珍贵的特产，又称作虫草。因其医疗保健功效强大，故与鹿茸、人参齐名，被列位于三大补品。研究初期，有人曾把冬虫夏草归于肉座目(Hypocreeales)，但是根据近期的系统分类，冬虫夏草应归属于真菌界(Fungi)、子囊菌门(Ascomycota)、子囊菌纲(Ascomycetes)、粪壳菌亚纲(Sordariomycetidae)、肉座菌目、麦角菌科(Clavicipifaceae)、虫草属(Cordyceps)。所以，冬虫夏草是麦角菌科真菌冬虫夏草菌寄生在蝙蝠科昆虫蝙幅蛾越冬幼虫上的子座及幼虫尸体的复合体。
冬虫夏草是由于蝙蝠蛾幼虫被中国被毛孢菌侵染，幼虫体沦为营养寄主而形成的。通常在初冬季节，蝙蝠蛾幼虫接触到中国被毛孢菌，便会被侵染。未僵死的幼虫逐渐蠕动到近地表处，直至虫体营养消耗殆尽，幼虫死亡，此时整个虫体被中国被毛孢菌丝体充满，形成僵虫。虫体僵死后，便进入了冬虫夏草的有性生长阶段，首先虫体头部会逐渐长出子座原基，等到春末夏初，子座原基便开始发育，长出形状如草的子座，即虫草的繁殖器官。
冬虫夏草对其生长环境条件的独特需求，致使其分布区域有局限性，仅分布于我国云南、贵州、西藏、青海、四川西部及甘肃南部地区，通常生长于海拔为3000-5000m的高山草甸中。由于其生长环境特殊、生长周期长等原因，目前还没有实现人工栽培。
每年夏秋季，冬虫夏草菌开始在侵染幼虫的体内生长，数月后菌丝充满幼虫体腔，入冬时形成僵虫，很快在土壤冻结前，从僵虫蜕裂线长出子座芽。到来年春夏，子座芽继续生长，伸出地面。到6月中下旬，子座头部渐渐膨大，子座和子囊发育成熟。当年入秋后冬虫夏草开始有性世代，在当年土壤冻结前从被侵染的寄主虫体头部长出短小的子座。在青海玉树，9月下旬就已经可以挖到被寄生的虫体，头部的子座高约1cm且不露出土面，次年5月化冻后，土壤温湿度适合子囊菌生长，子座以每天3-4mm的速度长出地面，形似小草，子座出土初为淡绿色，后变为紫红色，一般在露出地面部分达20-50mm时不再继续生长。到6月中旬，子座头部渐渐肥大，7月下旬子囊孢子长成。8－9月逐渐成熟并从子囊壳散发出来，继续对寄主幼虫进行寄生。
1980年以来，科研人员不断地对冬虫夏草菌的分离培养和冬虫夏草的人工栽培进行深入研究。研究人员先后分离、报道的与冬虫夏草有关的无性型菌种多达20多个学名，2005年的中国菌物学会对冬虫夏草及其无性型进行了研讨。中国菌物学会理事长李玉教授主持，中国科学院院士魏江春研究员作了冬虫夏草菌及其相关类群分子系统学分析的专题报告。会议确认冬虫夏草菌的拉丁学名是Cordyceps sinensis，其无性型是中国被毛孢。国际承认的无性型拉丁学名为Hirsrtella sinensisLiu,Guo,Yu et Zeng。
虽然大量科学研究证明冬虫夏草的无性型是中国被毛孢，然而仍存在只要分离自冬虫夏草的菌种即其无性型的认识。最常见的如蝙蝠蛾拟青霉Paecilomyces hepiali Chen et Dai,sp.Nov，目前已被广泛用于保健食品的生产。研究证明，它虽然分离自冬虫夏草，但不是冬虫夏草的无性型。
根据过去的经验，在冬虫夏草产区之外，通过冬虫夏草的组织或子囊孢子弹射分离出中国被毛孢菌种的成功率很低。所以，要实现冬虫夏草的人工栽培，做好冬虫夏草菌种的分离和培养工作十分重要。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种冬虫夏草无性型中国被毛孢纯菌种的培养方法。
为达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：一种冬虫夏草无性型中国被毛孢纯菌种的培养方法，包括以下步骤：
A、采样，采集子囊孢子未弹射的野生冬虫夏草子座，保存，
B、分离，取冬虫夏草子座中的菌种于无菌条件下接种于平板中，
C、培养，将含有菌种的平板在培养箱中恒温培养，得到中国被毛孢菌落，
D、纯化，将步骤C中的菌落转移至新的平板中进行培养，获得中国被毛孢纯菌种。
在上述的冬虫夏草无性型中国被毛孢纯菌种的培养方法中，在步骤B中，接种方法为：在无菌洁净区内，将冬虫夏草子座部分伸入到预先培养合格的平板中，盖上皿盖，使子囊孢子自然弹射至平板的培养基表面上。
在上述的冬虫夏草无性型中国被毛孢纯菌种的培养方法中，弹射时间不小于7天，每天光照12h，光照强度为300Lx。
在上述的冬虫夏草无性型中国被毛孢纯菌种的培养方法中，冬虫夏草子座的虫体部分露在平板外部，虫体部分用含有无菌水的无菌纱布覆盖包扎、保湿。
在上述的冬虫夏草无性型中国被毛孢纯菌种的培养方法中，在步骤C中，含有菌种的平板在程控霉菌培养箱培养，培养温度为15℃，培养时间为50天。
在上述的冬虫夏草无性型中国被毛孢纯菌种的培养方法中，在步骤D中，所述的菌落经过2-3次纯化培养。
在上述的冬虫夏草无性型中国被毛孢纯菌种的培养方法中，所述的平板的制备方法是：马铃薯去皮洗净，称取300g马铃薯，切成小块状，加水煮烂，过滤，加入琼脂和葡萄糖，继续加热，并搅拌混匀，冷却，加入蚕蛹粉提取液、酵母粉提取液、玉米粉提取液，再补加水定容至1000mL，即为PDA培养基，分装后灭菌，将灭过菌的PDA培养基在无菌环境下倒入培养皿中，凝固后形成平板。
在上述的冬虫夏草无性型中国被毛孢纯菌种的培养方法中，培养基在37℃培养箱培养24h，确定无菌生长后倒入到培养皿中。
在上述的冬虫夏草无性型中国被毛孢纯菌种的培养方法中，在步骤B中，接种方法还包括：子囊孢子弹射7d后将剩余子座内核用酒精消毒后，从子座和虫体连接处剪去虫体，在无菌条件下用消毒后的镊子剥去子座外层褐色菌丝组织，至露出类白色内部菌丝，用镊子撕下少许白色菌丝，用消毒后的剪刀剪成小段，放入平板中培养。
在上述的冬虫夏草无性型中国被毛孢纯菌种的培养方法中，在步骤B中，接种方法还包括：子囊孢子弹射7d后将剩余子座内核用酒精消毒后，从子座和虫体连接处剪去虫体，将虫体外部消毒后，用刀切开，取少量虫体内部组织放入平板中培养。
与现有的技术相比，本发明的优点在于：
1、子囊孢子分离法较容易获得中国被毛孢纯菌种，适用于冬虫夏草菌种的分离。
2、子囊孢子分离纯化或得菌种的方法方便快捷，且成功率高。
3、改良的PDA培养基对中国被毛孢的生长有显著的促进作用。
具体实施方式
下述实施例中所用的试剂，如无特殊说明，可以从常规生化试剂商店购买得到。以下实施例中的定量数据，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1
在本实施例中，平板的制备方法是：马铃薯去皮洗净，称取300g马铃薯，切成小块状，加水煮烂，过滤，加入琼脂15-20g和葡萄糖20g，继续加热，并搅拌混匀，冷却，加入蚕蛹粉提取液、酵母粉提取液和玉米粉提取液，再补加水定容至1000mL，PDA培养基，分装后灭菌，将灭过菌的PDA培养基在无菌环境下倒入培养皿中，凝固后形成平板。培养基在37℃培养箱培养24h，确定无菌生长后倒入到培养皿中。蚕蛹粉提取液、酵母粉提取液选用市售的蚕蛹粉提取物、酵母粉提取物、玉米粉提取物加水形成，市售产品的质量标准符合中国药典，其中蚕蛹粉提取液、酵母粉提取液和玉米粉提取液中的固形物与马铃薯的重量比为0.1-1：0.1-1：0.1-1：100，优选为0.5-0.7:0.6-0.8:0.3-0.5。
冬虫夏草无性型中国被毛孢纯菌种的培养方法，包括以下步骤：
A、采样，采集子囊孢子未弹射的野生冬虫夏草子座，保存，优选地，在4℃冷藏保存，在本实施例中，野生冬虫夏草子座来自四川省阿坝藏族羌族自治州黑水县，海拔3000-4000米，高寒草甸，
B、分离，取冬虫夏草子座中的菌种于无菌条件下接种于平板中，平板是指装有培养基的培养皿，
C、培养，将含有菌种的平板在培养箱中恒温培养，得到中国被毛孢菌落，
D、纯化，将步骤C中的菌落转移至新的平板中进行培养，获得中国被毛孢纯菌种。
在步骤B中，接种方法为：将超净工作台用0.1％新洁尔灭擦拭，保持10min后打开超净工作台风机和紫外灯自净30min以上，得到无菌洁净区，在无菌洁净区内，按照洁净区要求进行更衣和物料传递。将冬虫夏草子座部分伸入到预先培养合格的平板中，盖上皿盖，使子囊孢子自然弹射至平板的培养基表面上。优选地，弹射时间不小于7天，每天光照12h，光照强度为300Lx。冬虫夏草子座的虫体部分露在平板外部，虫体部分用含有无菌水的无菌纱布覆盖包扎、保湿。
在步骤C中，含有菌种的平板在程控霉菌培养箱培养，培养温度为15℃，培养时间为50天。
在步骤D中，所述的菌落经过2-3次纯化培养。需要说明的是，如果经过2次纯化，是指将前一个新的平板中培养的菌种移到另一个新的平板中继续培养，依次类推。
实施例2
本实施例与实施例1基本相同，不同之处在于，在步骤B中，接种方法为：子囊孢子弹射7d后将剩余子座内核用酒精消毒后，从子座和虫体连接处剪去虫体，在无菌条件下用消毒后的镊子剥去子座外层褐色菌丝组织，至露出类白色内部菌丝，用镊子撕下少许白色菌丝，用消毒后的剪刀剪成小段，放入平板中培养进行步骤C和D。
实施例3
本实施例与实施例1基本相同，不同之处在于，在步骤B中，接种方法为：子囊孢子弹射7d后将剩余子座内核用酒精消毒后，从子座和虫体连接处剪去虫体，将虫体外部消毒后，用刀切开，取少量虫体内部组织放入平板中培养进行步骤C和D。
实施例4
本实施例与实施例1基本相同，不同之处在于，在步骤C中，含有菌种的平板在程控霉菌培养箱培养，培养温度为15℃，培养时间为30天。
对比例1
本实施例与实施例1基本相同，不同之处在于，平板的制备方法是：马铃薯去皮洗净，称取300g马铃薯，切成小块状，加水煮烂，过滤，加入琼脂15-20g和葡萄糖20g，继续加热，并搅拌混匀，冷却，分装后灭菌，将灭过菌的PDA培养基在无菌环境下倒入培养皿中，凝固后形成平板。培养基在37℃培养箱培养24h，确定无菌生长后倒入到培养皿中。
其余步骤同实施例1。
对比例2
将实施例1获得的中国被毛孢纯菌种接种到对比例1的平板中，温度15℃培养20天。
对比例3
将实施例1获得的中国被毛孢纯菌种接种到实施例1的平板中，温度15℃培养20天。
分析
1、实施例1、实施例4与对比例1在分别按步骤D培养，得到不同固体培养基对中华被毛孢生长的影响表
中国被毛孢在普通PDA固体培养基中15℃培养30d，肉眼几乎不可见或仅可见针尖大小菌落，培养50d以上，菌落直径可达0.2-0.3cm左右，而在实施例1和实施例4的PDA固体培养基中15℃培养30d，菌落直径可达0.8-1.0cm左右，培养50d以上，菌落直径可达2.0-3.0cm左右。在实施例1和4的固体培养基上的中国被毛孢菌落，菌丝洁白、粗壮，富有光泽，呈现疏松的棉花糖状。实验表明，在PDA基础上，加入一定比例的蚕蛹粉提取液、酵母粉提取液、玉米粉提取液，制成改良PDA培养基，可显著促进中国被毛孢的生长。
2、实施例1、2和3的分析
实施例1-3均能获得中华被毛孢纯菌种。但实施例2和3组织分离操作费时费力，需要多次纯化(至少5次)，得到纯菌种的成功率不高，实施例1子囊孢子分离纯化或得菌种的方法方便快捷，且成功率高。因此用实施例1的方法获得中华被毛孢纯菌种的效果最好。
3、对比例2和3的分析
对比例2在显微镜下仅可见极少数菌丝，对比例3肉眼可见大量菌丝球。
菌丝观察方法：a，制备染色液：乳酸石炭酸棉蓝染色液(用于真菌固定和染色)：石炭酸(结晶酚)20g，乳酸20mL，甘油40mL，棉蓝0.05g，蒸馏水20mL。将棉蓝溶于蒸馏水中，再加入其他成分，微加热使其溶解，冷却后用；b，装片镜检：在载玻片上滴1mL乳酸石炭酸棉蓝染色液，从被侵染的蝙蝠蛾幼虫体内挑取适量带孢子的虫体液，混合入载玻片的液滴中，并将菌丝分散开。用低倍镜观察，必要时转换高倍镜镜检并记录观察结果。
将实施例1-3分离纯化获得纯培养物冷藏保存，取其中3个平板培养物进行菌种鉴定。经过DNA提取、扩增和测序，与DNA分子鉴定数据库进行序列比较分析，同时进行了宏观和微观形态观察，结果表明实施例1-3的人工培养物为冬虫夏草菌其无性型为中国被毛孢。
本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。

Claims (10)

1.一种冬虫夏草无性型中国被毛孢纯菌种的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、采样，采集子囊孢子未弹射的野生冬虫夏草子座，保存，
B、分离，取冬虫夏草子座中的菌种于无菌条件下接种于平板中，
C、培养，将含有菌种的平板在培养箱中恒温培养，得到中国被毛孢菌落，
D、纯化，将步骤C中的菌落转移至新的平板中进行培养，获得中国被毛孢纯菌种。
2.根据权利要求1所述的冬虫夏草无性型中国被毛孢纯菌种的培养方法，其特征在于，在步骤B中，接种方法为：在无菌洁净区内，将冬虫夏草子座部分伸入到预先培养合格的平板中，盖上皿盖，使子囊孢子自然弹射至平板的培养基表面上。
3.根据权利要求2所述的冬虫夏草无性型中国被毛孢纯菌种的培养方法，其特征在于，弹射时间不小于7天，每天光照12h，光照强度为300Lx。
4.根据权利要求2所述的冬虫夏草无性型中国被毛孢纯菌种的培养方法，其特征在于，冬虫夏草子座的虫体部分露在平板外部，虫体部分用含有无菌水的无菌纱布覆盖包扎、保湿。
5.根据权利要求1所述的冬虫夏草无性型中国被毛孢纯菌种的培养方法，其特征在于，在步骤C中，含有菌种的平板在程控霉菌培养箱培养，培养温度为15℃，培养时间为50天。
6.根据权利要求1所述的冬虫夏草无性型中国被毛孢纯菌种的培养方法，其特征在于，在步骤D中，所述的菌落经过2-3次纯化培养。
7.根据权利要求1所述的冬虫夏草无性型中国被毛孢纯菌种的培养方法，其特征在于，所述的平板的制备方法是：马铃薯去皮洗净，称取300g马铃薯，切成小块状，加水煮烂，过滤，加入琼脂和葡萄糖，继续加热，并搅拌混匀，冷却，加入蚕蛹粉提取液、酵母粉提取液和玉米粉提取液，再补加水定容至1000mL，即为PDA培养基，分装后灭菌，将灭过菌的PDA培养基在无菌环境下倒入培养皿中，凝固后形成平板。
8.根据权利要求7所述的冬虫夏草无性型中国被毛孢纯菌种的培养方法，其特征在于，培养基在37℃培养箱培养24h，确定无菌生长后倒入到培养皿中。
9.根据权利要求3所述的冬虫夏草无性型中国被毛孢纯菌种的培养方法，其特征在于，在步骤B中，接种方法还包括：子囊孢子弹射7d后将剩余子座内核用酒精消毒后，从子座和虫体连接处剪去虫体，在无菌条件下用消毒后的镊子剥去子座外层褐色菌丝组织，至露出类白色内部菌丝，用镊子撕下少许白色菌丝，用消毒后的剪刀剪成小段，放入平板中培养。
10.根据权利要求3所述的冬虫夏草无性型中国被毛孢纯菌种的培养方法，其特征在于，在步骤B中，接种方法还包括：子囊孢子弹射7d后将剩余子座内核用酒精消毒后，从子座和虫体连接处剪去虫体，将虫体外部消毒后，用刀切开，取少量虫体内部组织放入平板中培养。
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