CN113061534A - 一种中国被毛孢的菌株保藏方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种中国被毛孢的菌株保藏方法。将中国被毛孢(Hirsutella sinensis)接种到保藏培养基上,培养使其长出菌丝体,然后于4‑18℃保藏。本发明以中国被毛孢长在保藏培养基上的菌丝体为材料,“原位”置于合适的低温条件下,满足一年期的保藏。其优点在于,所用的材料易得、无需消耗液氮、操作简便、低温条件容易实现、保藏期较长、保藏后菌株活力无明显减退。
Description
技术领域:
本发明属于食用菌栽培技术领域,具体涉及一种中国被毛孢的菌株保藏方法。
背景技术:
中国被毛孢(Hirsutellasinensis)被证实是我国传统名贵药用真菌冬虫夏草(Ophiocordycepssinensis)的无性体之一。中国被毛孢的菌丝体可作与其孢子一起,增加对蝙蝠蛾幼虫的感染力,促进僵虫形成,是目前实验室规模人工栽培冬虫夏草的辅助手段。另外,中国被毛孢含有与冬虫夏草相似的化学物质,名列我国《可用于保健食品的真菌菌种》中,可作为保健食品开发之用。在菌种使用过程中,菌种保藏是保证优良菌种可长期使用的重要手段。
菌种保藏的形式主要有低温、干燥、降低氧分压等形式,其中低温是最为常用的手段。虽然低温条件(不含液氮保藏)容易实现,但应用于食药用菌菌种储藏技术,还有以下问题需要解决:要针对不同菌种或菌株生理特性;要选取合适的组织或细胞;要设置合适的温度范围;要设置合适的保藏时长。其具体是指:食药用菌具有不同的温度耐受性,如不适当的低温对高温型食药用菌是一种冻害,甚至会杀死菌种或菌株。食药用菌菌丝体和孢子都可作为保藏材料,但它们有不同的低温适应能力,需具体实验验证。保藏所指的低温是个泛指温度范围,需因应不同的菌种菌株,还有其所选材料,验证合适的温度范围。最后还要确定保藏的时长,在保持菌种菌株活力的前体下,保藏时间越长则其技术越优。
发明内容:
本发明提供了一种适用于多个中国被毛孢菌株的、无需消耗液氮的、保藏时间长的中国被毛孢的菌株保藏方法。
本发明的中国被毛孢的菌株保藏方法,包括以下步骤:
将中国被毛孢(Hirsutella sinensis)接种到保藏培养基上,培养使其长出菌丝体,然后于4-18℃保藏。
优选,所述的保藏培养基,每升培养基包括:马铃薯200g、葡萄糖20g、磷酸二氢钾2g、硫酸镁0.5g、蚕蛹粉10-20g、酵母浸出粉10-20g、琼脂20g,余量为水,pH 6.00-7.00;
将保藏培养基制成斜面,将中国被毛孢接种到保藏培养基斜面上,培养使其长出菌丝体,然后于4-18℃保藏。
优选,所述的将中国被毛孢接种到保藏培养基斜面上,培养使其长出菌丝体,是将中国被毛孢接种到保藏培养基斜面上,于18℃下避光培养约30d长出菌丝体,观察菌落形态,判断菌种是否有污染、菌落特征是否符合中国被毛孢形态,排除菌落畸形、生长缓慢的菌株,得保藏前菌株,将保藏前菌株于4-18℃保藏。
优选,所述的斜面是试管斜面。
进一步优选,将中国被毛孢接种到试管斜面上,于18℃下避光培养约30d长出菌丝体,观察菌落形态,判断菌种是否有污染、菌落特征是否符合中国被毛孢形态,排除菌落畸形、生长缓慢的菌株,得保藏前菌株,用封口膜将试管塞封好,装包装袋中,于4-18℃保藏。
优选,所述的包装袋是密封袋。
本发明的第二个目的是提供一种中国被毛孢的保藏培养基,每升培养基包括:马铃薯200g、葡萄糖20g、磷酸二氢钾2g、硫酸镁0.5g、蚕蛹粉10-20g、酵母浸出粉10-20g、琼脂20g,余量为水,pH 6.00-7.00。
本发明以中国被毛孢长在保藏培养基上的菌丝体为材料,“原位”置于合适的低温条件下,满足一年期的保藏。其优点在于,所用的材料易得、无需消耗液氮、操作简便、低温条件容易实现、保藏期较长、保藏后菌株活力无明显减退。
附图说明:
图1是在4℃保藏前后各菌株的菌落外观(A:菌株Z4保藏前;B:菌株XG保藏前;C:菌株I15保藏前;D:菌株Z4保藏后;E:菌株XG保藏后;F:菌株I15保藏后);
图2是在4℃保藏后各菌株继代的生长情况(A、D、G:菌株Z4;B、E、F:菌株XG;C、F、I:菌株I15);
图3是在18℃保藏前后菌落外观(A:菌株Z4保藏前;B:菌株XG保藏前;C:菌株I15保藏前;D:菌株Z4保藏后;E:菌株XG保藏后;F:菌株I15保藏后);
图4是在18℃保藏后各菌株继代的生长情况(A、D、G:菌株Z4;B、E、F:菌株XG;C、F、I:菌株I15)。
具体实施方式:
以下实施例是对本发明的进一步说明,而不是对本发明的限制。
实施例1:
1、低温保藏温度4℃。
2、保藏培养基配方:马铃薯200g,葡萄糖20g,磷酸二氢钾2g,硫酸镁0.5g,蚕蛹粉15g,酵母浸出粉15g,琼脂20g,水1000mL,以1mol·L-1氢氧化钠溶液调节pH 6.50。具体配置方法是称取200g马铃薯,洗净去皮切碎,加水1000ml煮沸半个小时,纱布过滤,在滤液中加入葡萄糖20g,磷酸二氢钾2g,硫酸镁0.5g,蚕蛹粉15g,酵母浸出粉15g,琼脂20g,然后用水补足1000ml,混匀,以1mol·L-1氢氧化钠溶液调节pH 6.50。
3、保藏培养基斜面制作。采用试管,保藏培养基装量为试管高度1/4,灭菌,冷却后得保藏培养基斜面。
4、取三个不同来源的中国被毛孢菌株,菌株号为Z4、I15和XG,分别接种于灭菌的保藏培养基斜面上,于18℃下避光培养约30d,观察菌落形态,判断菌种是否有污染、菌落特征是否符合中国被毛孢形态,排除菌落畸形、生长缓慢的菌株,得保藏前菌株。
5、取保藏前菌株,使用封口膜将试管塞封好,取密封袋等干净干燥包装袋装入待保藏的试管菌株,然后置于4℃低温环境中保藏。保藏时间为365d。
6、从低温环境中取出保藏菌株,在25℃以下室温中进行正常继代操作,共继代三个培养皿,每个培养皿上接种三点,计算菌落形成比例。
7、保藏结果
从图1可见,4℃保藏365d后,各菌株菌落形态正常。从图2可见,经转接后,各菌株所有接种点都能重新形成菌落,菌落形成比例100%,表明保藏菌株保存了活力。
实施例2:
1、低温保藏温度18℃
2、保藏培养基配方:马铃薯200g,葡萄糖20g,磷酸二氢钾2g,硫酸镁0.5g,蚕蛹粉15g,酵母浸出粉15g,琼脂20g,水1000mL,以1mol L-1氢氧化钠溶液调节pH 6.50。具体配置方法是称取200g马铃薯,洗净去皮切碎,加水1000ml煮沸半个小时,纱布过滤,在滤液中加入葡萄糖20g,磷酸二氢钾2g,硫酸镁0.5g,蚕蛹粉15g,酵母浸出粉15g,琼脂20g,然后用水补足1000ml,混匀,以1mol·L-1氢氧化钠溶液调节pH 6.50。
3、保藏培养基斜面制作。采用试管,保藏培养基装量为试管高度1/4,灭菌,冷却后得保藏培养基斜面。
4、取三个不同来源的中国被毛孢菌株,菌株号为Z4、I15和XG,分别接种于灭菌的保藏培养基斜面上,于18℃下避光培养约30d,观察菌落形态,判断菌种是否有污染、菌落特征是否符合中国被毛孢形态,排除菌落畸形、生长缓慢的菌株,得保藏前菌株。
5、取保藏前菌株,使用封口膜将试管塞封好,取密封袋等干净干燥包装袋装入待保藏的试管菌株,然后置于18℃范围内的低温环境中保藏。保藏时间为365d。
6、从低温环境中取出保藏菌株,在25℃以下室温中进行正常继代操作,共继代三个培养皿,每个培养皿上接种三点,计算菌落形成比例。
7、保藏结果
从图3可见,18℃保藏365d后,各菌落形态正常。由于18℃是中国被毛孢的生长适应温度,可见菌落直径还有一定程度扩大。从图4可见,经转接后,各菌株所有接种点都能重新形成菌落,菌落形成比例100%,表明保藏菌株保存了活力。
Claims (7)
1.一种中国被毛孢的菌株保藏方法,其特征在于,包括以下步骤:
将中国被毛孢(Hirsutella sinensis)接种到保藏培养基上,培养使其长出菌丝体,然后于4-18℃保藏。
2.根据权利要求1所述的菌株保藏方法,其特征在于,所述的保藏培养基,每升培养基包括:马铃薯200g、葡萄糖20g、磷酸二氢钾2g、硫酸镁0.5g、蚕蛹粉10-20g、酵母浸出粉10-20g、琼脂20g,余量为水,pH 6.00-7.00;
将保藏培养基制成斜面,将中国被毛孢接种到保藏培养基斜面上,培养使其长出菌丝体,然后于4-18℃保藏。
3.根据权利要求2所述的菌株保藏方法,其特征在于,所述的将中国被毛孢接种到保藏培养基斜面上,培养使其长出菌丝体,是将中国被毛孢接种到保藏培养基斜面上,于18℃下避光培养30d长出菌丝体,观察菌落形态,判断菌种是否有污染、菌落特征是否符合中国被毛孢形态,排除菌落畸形、生长缓慢的菌株,得保藏前菌株,将保藏前菌株于4-18℃保藏。
4.根据权利要求2所述的菌株保藏方法,其特征在于,所述的斜面是试管斜面。
5.根据权利要求4所述的菌株保藏方法,其特征在于,将中国被毛孢接种到试管斜面上,于18℃下避光培养约30d长出菌丝体,观察菌落形态,判断菌种是否有污染、菌落特征是否符合中国被毛孢形态,排除菌落畸形、生长缓慢的菌株,得保藏前菌株,用封口膜将试管塞封好,装入包装袋中,于4-18℃保藏。
6.根据权利要求5所述的菌株保藏方法,其特征在于,所述的包装袋是密封袋。
7.一种中国被毛孢的保藏培养基,其特征在于,每升培养基包括:马铃薯200g、葡萄糖20g、磷酸二氢钾2g、硫酸镁0.5g、蚕蛹粉10-20g、酵母浸出粉10-20g、琼脂20g,余量为水,pH6.00-7.00。
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PB01 | Publication | ||
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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