CN106635829B - 一种桑黄颗粒菌种的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种桑黄颗粒菌种的制备方法,属于食用菌栽培技术领域。本发明的方法,以石膏粉、蔗糖、真菌激发子与熟化谷物的混合物作为培养基质;其特殊之处在于:采用带壳或带皮谷物作为颗粒菌种培养基质的主要材料,添加有真菌激发子。采用带壳或带皮谷物作为颗粒菌种的主要材料,营养丰富全面,可满足桑黄菌丝生长的需求,菌种活力强,接种后萌发点多,能缩短培养时间。相对没有添加真菌激发子的制备方法,在其他条件相同的情况下(培养时间相同的情况下),采用本发明的制备方法所获得的菌种胞外酶的活性明显提高,所得菌种的活性提高。
Description
技术领域
本发明涉及一种桑黄颗粒菌种的制备方法,属于食用菌栽培技术领域。
背景技术
桑黄Sanghuangporus sanghuang是我国最为著名的药用真菌之一,专性寄生于桑属Morus树木上,分类学上隶属担子菌门Basidiomycota,伞菌纲Agaricomycetes,锈革孔菌目Hymenochaetales,锈革孔菌科Hymenochaetaceae,桑黄属Sanghuangporus。 据《药性论》记载:桑黄味微苦,性寒,在我国传统中药中用于治疗痢疾、盗汗、血崩、血淋、脐腹涩痛、脱肛泻血、带下、闭经;《神农本草经》将桑黄描述为“久服轻身不老延年”,还有解毒、提高消化系统机能的作用。一直以来,桑黄野生资源稀缺,且有日益枯竭的危险。面对巨大的市场需求,桑黄人工栽培具有巨大的市场前景和经济效益。
菌种作为桑黄人工栽培生产中的重要一环,至关重要。传统的原种、栽培种培养基材料多以木屑、棉籽壳等材料为主,采用塑料袋、大口罐头瓶或小口盐水瓶等进行封装。该类菌种生产方式,通常存在接种效率低,生长周期长,长满菌丝后结成块状,使用时不易将其捣碎,转接栽培种速度慢,捣碎后的菌种块也常因菌丝部分受损而影响定植速度和吃料效果,以及培养过程中因密封不严或通气过小等造成杂菌污染及菌丝缺氧、生长受抑制等情况发生。
发明内容
本发明的目的在于提供一种培养周期短、菌种活力强的桑黄菌种制备方法。
技术方案
一种桑黄颗粒菌种的制备方法,包括以下步骤:
一、准备原料:带壳/带皮谷物、石膏粉、蔗糖和真菌激发子;其中,带壳谷物96-98%、石膏粉1-2%、蔗糖1-2%,三者的总量为100%,所述%为质量百分数;真菌激发子的质量为带壳谷物、石膏粉和蔗糖总质量的0.001-0.002%;
二、带壳谷物在水中浸泡至吸水充足,然后煮制至无白心时捞出、沥干表面水分,得熟化谷物;
三、将石膏粉、蔗糖、真菌激发子与熟化谷物混合,得培养基质;
四、将培养基质置于培养容器,然后灭菌;所述培养基质占培养容器体积的三分之二;
五、将桑黄液体菌种接种于培养容器中的培养基质,于25-30℃恒温、避光、静置培养至菌丝充满培养容器,即得桑黄颗粒菌种;
所述真菌激发子,其制备方法包括以下步骤:
(1)10g菌株菌丝体用200-400mL质量浓度为70%乙醇浸泡24h后,5000r/min离心20-30min,收集残渣;
(2)向步骤(1)收集的残渣中加入100-200mL蒸馏水,100℃提取1-2h,5000r/min离心20-30min,分别收集上清液、残渣;
(3)步骤(2)收集的残渣按步骤(2)的方法重复1次;
(4)合并步骤(2)和(3)收集的上清液,加入800-1600mL的质量浓度为95%乙醇醇沉24h,5000r/min离心30min后收集沉淀;所得沉淀即为真菌激发子;
所述菌株为T型异担子菌或薄多年卧孔菌。
用薄多年卧孔菌菌株制备的真菌激发子简称P激发子;用T型异担子菌菌株制备的真菌激发子简称H激发子。实验证明,本发明的这两种真菌激发子对桑黄颗粒菌种CMC酶、半纤维素酶和漆酶这三种胞外酶的酶活均有激发作用,即提高酶活。所述漆酶为含铜的多酚氧化酶。
本发明的制备方法,接种2-4天后,菌种萌发并开始吃料;接种10-15天,菌丝充满容器,培养结束。所得颗粒菌种可用于转接栽培种或栽培袋,接种后萌发率可达100%。对于暂时不使用的颗粒菌种或用于菌种保藏的颗粒菌种,可用透明胶带密封瓶盖透气孔后,置4℃冰箱中,避光保藏1-2年,使用时取出即可,接种后萌发率仍可达100%。
相对没有添加真菌激发子的制备方法,在其他条件相同的情况下(培养时间相同的情况下),采用本发明的制备方法所获得的菌种胞外酶的活性明显提高,所得菌种的活性提高。
上述制备方法,真菌激发子的用量变化,会对制备方法及所制备的菌种产生影响。优选的,真菌激发子的质量为带壳谷物、石膏粉和蔗糖总质量的0.0015%。
上述制备方法,所述谷物可以谷子、高粱、大麦、小麦、玉米等。选择不同的谷物,所制备的菌种萌发及菌丝生长速度以及菌种生长状态等均存在差异,优选为谷子。
上述制备方法,桑黄液体菌种以50mL/kg的接种量接种后第5-8天,晃动培养容器,使已长及未长菌丝的谷物颗粒混合均匀,以增加发菌点,促进培养速度。
上述制备方法,所用容器为配有通气滤膜瓶盖的组培瓶。组培瓶身透明,便于随时观察菌种生长情况及有无杂菌污染,瓶盖所带滤膜可有效保证菌种培养过程中对无菌空气的需求,瓶盖为螺旋式上紧,密封性好,相比传统方式操作更加简便、防污染及通气保障更加有效;组培瓶形状规整,可多层摞放,有效增加空间利用率,便于运输及储藏。
有益效果
与传统的桑黄原种生产方式相比,本发明提供了一种简单易操作的桑黄颗粒菌种配方及制备方法,使接种效率、菌种活力及成功率均有效提高,并适宜进行大规模生产。具体来说:
本发明采用带壳或带皮谷物作为颗粒菌种的主要材料,营养丰富全面,可满足桑黄菌丝生长的需求,菌种活力强;本发明中颗粒菌种采用桑黄液体菌种进行接种,接种后萌发点多,能缩短培养时间;
本发明在带壳或带皮谷物中添加有真菌激发子,能激发桑黄颗粒菌种胞外酶的酶活,从而使得菌种活力强,可将传统菌种培养时间从1-3个月缩短到10-15天;
本发明所获得颗粒菌种为分散颗粒状菌种,可有效避免传统菌种使用过程中,因捣碎接种块而造成的菌丝损伤,有效保证菌种活力,另颗粒状分散菌种发菌点多,用于栽培用种量少、成活快、封面早,产量可提高10-20%以上;
本发明颗粒菌种培养所用容器为配有通气滤膜瓶盖的组培瓶,瓶身透明,便于随时观察菌种生长情况及有无杂菌污染,瓶盖所带滤膜可有效保证菌种培养过程中对无菌空气的需求,瓶盖为螺旋式上紧,密封性好,相比传统方式操作更加简便、防污染及通气保障更加有效;
本发明颗粒菌种培养所用组培瓶形状规整,可多层摞放,有效增加空间利用率,便于运输及储藏;
本发明颗粒菌种所用组培瓶可多次循环使用,整体生产成本低,便于推广应用。
具体实施方式
实施例1
桑黄液体菌种的制备:
将桑黄母种无菌操作接种于液体菌种培养基中进行震荡培养,培养条件为:温度26℃、摇床转速150r/min、避光振荡培养5天,即得桑黄液体菌种;液体培养基组成:玉米粉40g/L、葡萄糖25g/L、酵母抽提物10g/L、麸皮20g/L、KH2PO4 1.25g/L、MgSO4·7H2O 0.625g/L、去离子水余量。
实施例2
真菌激发子的制备:
(1)10g菌株菌丝体用200-400mL质量浓度为的70%乙醇浸泡24h后,5000r/min离心20-30min,收集残渣;
(2)向步骤(1)收集的残渣中加入100-200mL蒸馏水,100℃提取1-2h,5000r/min离心20-30min,分别收集上清液、残渣;
(3)步骤(2)收集的残渣按步骤(2)方法重复1次;
(4)合并步骤(2)和(3)收集的上清液,加入800-1600mL的质量浓度为95%乙醇醇沉24h,5000r/min离心30min后收集沉淀;所得沉淀即为真菌激发子;
所述菌株为T型异担子菌或薄多年卧孔菌。用薄多年卧孔菌菌株制备的真菌激发子简称P激发子;用T型异担子菌菌株制备的真菌激发子简称H激发子。
实施例3
桑黄颗粒菌种的制备:
(1)材料的选择:选择带壳谷子作为颗粒菌种的主要材料;
(2)材料预处理:称取98kg带壳谷子,在自来水中浸泡12小时,确保吸水充足;
(3)沸水煮制:将浸泡后吸水充足的谷子转入锅内,加水没过料面3cm,逐渐加温至水沸,谷子煮制熟而不烂,无白心时,即可捞出沥水;
(4)拌料:将沥干表面水分的谷子加入1kg石膏粉、1kg蔗糖和1.5g实施例2制备的H激发子后,搅拌均匀;
(5)装瓶:选用240mL组培瓶,将拌好的料装至总体积的三分之二后,拧上带有通气滤膜的瓶盖;
(6)灭菌:将装料完成后的组培瓶转至高压蒸汽灭菌锅中,121℃,高压蒸汽灭菌2小时;
(7)接种:待料温降至30℃以下时,无菌操作,以5mL/瓶的接种量,接入实施例1制备的桑黄液体菌种;
(8)培养:接种后的组培瓶转入27℃恒温培养箱中,避光静置培养;
(9)摇瓶:接种1天后,菌种萌发并开始吃料,接种后5天时,晃动组培瓶,使已长及未长菌丝的谷物颗粒混合均匀,增加发菌点,促进培养速度;
(10)培养结束:接种后10天,菌丝满瓶,培养结束,即得桑黄颗粒菌种;所得颗粒菌种可用于转接栽培种或栽培袋,接种后成活率可达100%。
实施例4
桑黄颗粒菌种的制备:
(1)材料的选择:选择带壳谷子作为颗粒菌种的主要材料;
(2)材料预处理:称取98kg带壳谷子,在自来水中浸泡12小时,确保吸水充足;
(3)沸水煮制:将浸泡后吸水充足的谷子转入锅内,加水没过料面3cm,逐渐加温至水沸,谷子煮制熟而不烂,无白心时,即可捞出沥水;
(4)拌料:将沥干表面水分的谷子加入1kg石膏粉、1kg蔗糖和1.0g实施例2制备的H激发子后,搅拌均匀;
(5)装瓶:选用240mL组培瓶,将拌好的料装至总体积的三分之二后,拧上带有通气滤膜的瓶盖;
(6)灭菌:将装料完成后的组培瓶转至高压蒸汽灭菌锅中,121℃,高压蒸汽灭菌2小时;
(7)接种:待料温降至30℃以下时,无菌操作,以5mL/瓶的接种量,接入实施例1制备的桑黄液体菌种;
(8)培养:接种后的组培瓶转入27℃恒温培养箱中,避光静置培养;
(9)摇瓶:接种2天后,菌种萌发并开始吃料,接种后5天时,晃动组培瓶,使已长及未长菌丝的谷物颗粒混合均匀,增加发菌点,促进培养速度;
(10)培养结束:接种后11天,菌丝满瓶,培养结束,即得桑黄颗粒菌种;所得颗粒菌种可用于转接栽培种或栽培袋,接种后成活率可达100%。
实施例5
桑黄颗粒菌种的制备:
(1)材料的选择:选择带壳谷子作为颗粒菌种的主要材料;
(2)材料预处理:称取98kg带壳谷子,在自来水中浸泡12小时,确保吸水充足;
(3)沸水煮制:将浸泡后吸水充足的谷子转入锅内,加水没过料面3cm,逐渐加温至水沸,谷子煮制熟而不烂,无白心时,即可捞出沥水;
(4)拌料:将沥干表面水分的谷子加入1kg石膏粉、1kg蔗糖和2.0g实施例2制备的H激发子后,搅拌均匀;
(5)装瓶:选用240mL组培瓶,将拌好的料装至总体积的三分之二后,拧上带有通气滤膜的瓶盖;
(6)灭菌:将装料完成后的组培瓶转至高压蒸汽灭菌锅中,121℃,高压蒸汽灭菌2小时;
(7)接种:待料温降至30℃以下时,无菌操作,以5mL/瓶的接种量,接入实施例1制备的桑黄液体菌种;
(8)培养:接种后的组培瓶转入27℃恒温培养箱中,避光静置培养;
(9)摇瓶:接种2天后,菌种萌发并开始吃料,接种后5天时,晃动组培瓶,使已长及未长菌丝的谷物颗粒混合均匀,增加发菌点,促进培养速度;
(10)培养结束:接种后10天,菌丝满瓶,培养结束,即得桑黄颗粒菌种;所得颗粒菌种可用于转接栽培种或栽培袋,接种后成活率可达100%。
实施例6
(1)材料的选择:选择带壳高粱作为颗粒菌种的主要材料;
(2)材料预处理:称取97kg带壳高粱,在自来水中浸泡18小时,确保吸水充足;
(3)沸水煮制:将浸泡后吸水充足的高粱转入锅内,加水没过料面3cm,逐渐加温至水沸,高粱煮制熟而不烂,无白心时,即可捞出沥水;
(4)拌料:将沥干表面水分的高粱加入1.5kg石膏粉、1.5kg蔗糖和1.5g实施例2制备的H激发子后,搅拌均匀;
(5)装瓶:选用240mL组培瓶,将拌好的料装至总体积的三分之二后,拧上带有通气滤膜的瓶盖;
(6)灭菌:将装料完成后的组培瓶转至高压蒸汽灭菌锅中,121℃,高压蒸汽灭菌2.5小时;
(7)接种:待料温降至30℃以下时,无菌操作,以4mL/瓶的接种量,接入实施例1制备的桑黄液体菌种;
(8)培养:接种后的组培瓶转入27℃恒温培养箱中,避光静置培养;
(9)摇瓶:接种3天后,菌种萌发并开始吃料,接种后7天时,晃动组培瓶,使已长及未长菌丝的谷物颗粒混合均匀,增加发菌点,促进培养速度;
(10)培养结束:接种后14天,菌丝满瓶,培养结束,即得桑黄颗粒菌种;所得颗粒菌种可用于转接栽培种或栽培袋,接种后成活率可达100%。
实施例7
(1)材料的选择:选择带壳谷子作为颗粒菌种的主要材料;
(2)材料预处理:称取96kg带壳谷子,在自来水中浸泡18小时,确保吸水充足;
(3)沸水煮制:将浸泡后吸水充足的谷子转入锅内,加水没过料面3cm,逐渐加温至水沸,谷子煮制熟而不烂,无白心时,即可捞出沥水;
(4)拌料:将沥干表面水分的谷子加入2kg石膏粉、2kg蔗糖和1.5g实施例2制备的H激发子后,搅拌均匀;
(5)装瓶:选用240mL组培瓶,将拌好的料装至总体积的三分之二后,拧上带有通气滤膜的瓶盖;
(6)灭菌:将装料完成后的组培瓶转至高压蒸汽灭菌锅中,121℃,高压蒸汽灭菌2.5小时;
(7)接种:待料温降至30℃以下时,无菌操作,以4mL/瓶的接种量,接入实施例1制备的桑黄液体菌种;
(8)培养:接种后的组培瓶转入27℃恒温培养箱中,避光静置培养;
(9)摇瓶:接种2天后,菌种萌发并开始吃料,接种后6天时,晃动组培瓶,使已长及未长菌丝的谷物颗粒混合均匀,增加发菌点,促进培养速度;
(10)培养结束:接种后12天,菌丝满瓶,培养结束,即得桑黄颗粒菌种;所得颗粒菌种可用于转接栽培种或栽培袋,接种后成活率可达100%。
对比例1
桑黄颗粒菌种的制备:
(1)材料的选择:选择带壳谷子作为颗粒菌种的主要材料;
(2)材料预处理:称取98kg带壳谷子,在自来水中浸泡12小时,确保吸水充足;
(3)沸水煮制:将浸泡后吸水充足的谷子转入锅内,加水没过料面3cm,逐渐加温至水沸,谷子煮制熟而不烂,无白心时,即可捞出沥水;
(4)拌料:将沥干表面水分的谷子加入1kg石膏粉和1kg蔗糖后,搅拌均匀;
(5)装瓶:选用240mL组培瓶,将拌好的料装至总体积的三分之二后,拧上带有通气滤膜的瓶盖;
(6)灭菌:将装料完成后的组培瓶转至高压蒸汽灭菌锅中,121℃,高压蒸汽灭菌2小时;
(7)接种:待料温降至30℃以下时,无菌操作,以5mL/瓶的接种量,接入实施例1制备的桑黄液体菌种;
(8)培养:接种后的组培瓶转入27℃恒温培养箱中,避光静置培养;
(9)摇瓶:接种2天后,菌种萌发并开始吃料,接种后6天时,晃动组培瓶,使已长及未长菌丝的谷物颗粒混合均匀,增加发菌点,促进培养速度;
(10)培养结束:接种后13天,菌丝满瓶,培养结束,即得桑黄颗粒菌种;所得颗粒菌种可用于转接栽培种或栽培袋,接种后成活率可达100%。
对比例2
(1)取木屑85g、麸皮10.5g、玉米粉2g、石膏粉1g、磷酸二氢钾0.5g和蔗糖1g混合均匀,得拌料;拌料与水按照1:1.2的质量比混合均匀,得培养基;
(2)装瓶:选用240mL组培瓶,将培养基装至总体积的三分之二后,拧上带有通气滤膜的瓶盖;
(3)灭菌:将装料完成后的组培瓶转至高压蒸汽灭菌锅中,121℃,高压蒸汽灭菌2小时;
(4)接种:待料温降至30℃以下时,无菌操作,以5mL/瓶的接种量,接入实施例1制备的桑黄液体菌种
(5)培养:接种后的组培瓶转入27℃恒温培养箱中,避光静置培养;;
(6)摇瓶:接种5天后,菌种萌发并开始吃料,接种后9天时,晃动组培瓶,使已长及未长菌丝的谷物颗粒混合均匀,增加发菌点,促进培养速度;;
(7)培养结束:接种后18天,菌丝满瓶,培养结束,即得桑黄菌种;所得菌种可用于转接栽培种或栽培袋,接种后成活率可达99%。
对比例3
(1)取木屑45g、棉籽壳40g、麸皮10g、玉米粉2g、石膏粉1g、磷酸二氢钾1g和蔗糖1g混合均匀,得拌料;拌料与水按照1:1.2的质量比混合均匀,得培养基;
(2)装瓶:选用240mL组培瓶,将培养基装至总体积的三分之二后,拧上带有通气滤膜的瓶盖;
(3)灭菌:将装料完成后的组培瓶转至高压蒸汽灭菌锅中,121℃,高压蒸汽灭菌2小时;
(4)接种:待料温降至30℃以下时,无菌操作,以5mL/瓶的接种量,接入实施例1制备的桑黄液体菌种
(5)培养:接种后的组培瓶转入27℃恒温培养箱中,避光静置培养;;
(6)摇瓶:接种6天后,菌种萌发并开始吃料,接种后11天时,晃动组培瓶,使已长及未长菌丝的谷物颗粒混合均匀,增加发菌点,促进培养速度;;
(7)培养结束:接种后21天,菌丝满瓶,培养结束,即得桑黄菌种;所得二级菌种可用于转接栽培种或栽培袋,接种后成活率可达98%。
效果实验:
分别观察实施例3-7、对比例1接种10天后组培瓶中菌丝的分布状态;分别取实施例3-7、对比例1-3接种10天后的培养产物,检测其胞外酶酶活(采用常规方法检测酶活即可,单位为U/g,即每g培养产物的酶活);结果如表1所示;
表1
CMC酶酶活 | 半纤维素酶酶活 | 漆酶酶活 | |
实施例3 | 19.97U/g | 11.76U/g | 5.31U/g |
实施例4 | 18.79U/g | 10.35U/g | 5.09U/g |
实施例5 | 19.54U/g | 11.29U/g | 5.27U/g |
实施例6 | 19.05U/g | 11.31U/g | 5.18U/g |
实施例7 | 18.93U/g | 10.52U/g | 5.07U/g |
对比例1 | 11.4U/g | 8.49U/g | 2.07U/g |
对比例2 | 3.77U/g | 4.34U/g | 0.99U/g |
对比例3 | 2.95U/g | 1.99U/g | 2.55U/g |
另外,本发明采用实施例1制备的P激发子代替实施例3-7中的H激发子;所获得的培养产物的酶活与实施例3-7的相当。
Claims (4)
1.一种桑黄颗粒菌种的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
一、准备原料:带壳/带皮谷物、石膏粉、蔗糖和真菌激发子;其中,带壳谷物96-98%、石膏粉1-2%、蔗糖1-2%,三者的总量为100%,所述%为质量百分数;真菌激发子的质量为带壳谷物、石膏粉和蔗糖总质量的0.0015%;
二、带壳谷物在水中浸泡至吸水充足,然后煮制至无白心时捞出、沥干表面水分,得熟化谷物;
三、将石膏粉、蔗糖、真菌激发子与熟化谷物混合,得培养基质;
四、将培养基质置于培养容器,然后灭菌;所述培养基质占培养容器体积的三分之二;
五、将桑黄液体菌种接种于培养容器中的培养基质,于25-30℃恒温、避光、静置培养至菌丝充满培养容器,即得桑黄颗粒菌种;
所述真菌激发子,其制备方法包括以下步骤:
(1)10g菌株菌丝体用200-400mL质量浓度为70%乙醇浸泡24h后,5000r/min离心20-30min,收集残渣;
(2)向步骤(1)收集的残渣中加入100-200mL蒸馏水,100℃提取1-2h,5000r/min离心20-30min,分别收集上清液、残渣;
(3)步骤(2)收集的残渣按步骤(2)的方法重复1次;
(4)合并步骤(2)和(3)收集的上清液,加入800-1600mL的质量浓度为95%乙醇醇沉24h,5000r/min离心30min后收集沉淀;所得沉淀即为真菌激发子;
所述菌株为T型异担子菌或薄多年卧孔菌。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述谷物为谷子、高粱、大麦、小麦、玉米。
3.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,桑黄液体菌种以50mL/kg的接种量接种后第5-8天,晃动培养容器,使已长及未长菌丝的谷物颗粒混合均匀。
4.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于,所用容器为配有通气滤膜瓶盖的组培瓶。
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