CN102845218A - 一种冬虫夏草菌中国被毛孢的原生态分离法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种冬虫夏草菌中国被毛孢的原生态分离法，包括组织分离法和子囊孢子分离法。该方法选用的种源是来自于中国青海玉树地区的新鲜的正在成熟的冬虫夏草，采集时要保留以子实体周围直径10～12cm、深8～12cm的土壤；培养基来源于冬虫夏草的寄主蝙蝠蛾幼虫的活体，选择白润、健壮的，4～5龄期的、活的蝙蝠蛾幼虫，采集时及时用无菌水漂洗并储放；所述冬虫夏草和冬虫夏草的寄主蝙蝠蛾幼虫的活体在采集后的储存温度为0～4℃，储存时间为0～15天；将种源转接于培养基上进行培养，培养时参数控制在温度6～9℃，pH值6～6.5，光照50～100lux，空气湿度55～60%，氧气含量20%。

Description

一种冬虫夏草菌中国被毛孢的原生态分离法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种冬虫夏草无性阶段的真菌—中国被毛孢的原生态分离法。

技术背景

冬虫夏草是药食同源的稀有珍品，数百年一直与天然的人参、鹿茸相媲美，在国内外享有盛誉。它不温不燥，特别适合老、少、病、弱、虚者，可常年服用，具有补肺益肾和返老还童之功效，而无副作用。但是，由于其天然资源匮乏，价格贵过黄金，各种虫草相继充诉于市场，鱼目混珠，真假难辨。

为了解决供求矛盾，国内外许多科学家进行了大量的研究。研究表明，冬虫夏草为麦角菌科虫草属真菌，冬虫夏草菌[Cordyceps Sinensis(berk.)Sacc.]是寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座及幼虫尸体的复合物。简单地说，冬虫夏草就是由昆虫和真菌联合而生。而虫草属真菌发现的有几百种，我国记录的也有68种，因此，有一些学者把凡是由虫草属真菌寄生并产生子实体的菌物结合体通称为虫草。然而，近20年来，通过分子生物学和生物还原法，证明了中医药所论述的冬虫夏草仅分布于青藏高原高海拔的严寒地区。特别是青海玉树的冬虫夏草，更具有代表性。它的生长过程经历了无性阶段到有性阶段。而无性阶段的菌种，只有中国被毛孢与冬虫夏草DNA指纹图谱相似率高达96 %（李增智等，确证冬虫夏草无性型的分子生物学证据，菌物系统，19（1）60-64，2000）。现在，学术界普遍认为中国被毛孢是冬虫夏草菌唯一的无性型（刘锡琎等，冬虫夏草无性阶段的分离和坚定，真菌学报，1988,8（1）,35-40）。而在市面出现的 “人工冬虫夏草”尤其是所谓深层发酵生产的“冬虫夏草”，几乎都不是冬虫夏草菌中国被毛孢。由于冬虫夏草僵虫体及其子座营养丰富，常有多种其他菌类寄生或腐生，如果分离材料选择不当或分离方法不正确，经常可能培养生长出不同种类的真菌。尤其象中国被毛孢菌这样在人工培养基上生长缓慢的菌种，很可能为生长快速的其它真菌所掩盖。所以，要获得纯正的冬虫夏草菌种并采用深层发酵方法生产冬虫夏草是非常困难的。

虽然，自80年代沈南英先生第一个申请中国被毛孢分离法专利（专利号CN85101971A）以来，有很多关于人工培养冬虫夏草和对冬虫夏草菌丝体的液体深层发酵培养的报道和相关的专利出现，但是，迄今为止，所有的公开的中国被毛孢的分离方法都过于复杂，难度大，尤其是人工培养基，与天然的原生态冬虫夏草寄主蝙蝠蛾昆虫相比，存在较多缺陷，再加上培养参数模糊、染菌率高，实际上很难推广。

一般来说，菌种分离有三种方法：子囊孢子分离法、组织分离法、基内菌丝分离法。相对来说，采取前两种分离方法，比较容易得到纯的中国被毛孢。中国被毛孢的子囊孢子分离法是利用冬虫夏草菌成熟的子囊孢子萌发菌丝，来获得中国被毛孢纯种的一种方法。业界所采用的子囊孢子分离法比较复杂（张永杰等，分离自冬虫夏草可培养真菌的多样性研究，2010年，菌物学报），因而多采用组织分离法。中国被毛孢的组织分离法是利用新鲜冬虫夏草的子实体的幼嫩组织，在适宜的培养基和生长条件下，促使它恢复到菌丝生长阶段，长成没有组织分化的菌丝体，从而获得中国被毛孢纯种的一种方法。所谓纯种其实与冬虫夏草的采集地有关，除了少数人采集的是青海玉树的冬虫夏草，大部分的都是四川的。从分子生物学来说，它们相差不大，相似性应该达到96%以上。但从品质上说，它们确实有差别。所以，种源是决定中国被毛孢菌种优劣的重要因素。当然，采用什么培养基，在什么条件下才能培养得到纯种中国被毛孢也是很重要的。到目前为止，所公开的文献包括专利，培养基都是人工合成的，所使用的碳源和氮源不尽一致，比例也各不相同，配制方法相对于天然培养基都比较复杂。在培养条件方面，所述参数范围大，例如，培养温度的控制，有的是5～20℃（沈南英，专利公开号CN85101971A），有的是10℃左右（俞永信专利公开号CN1031393A，）有的是在5.6～9.2℃（杨跃雄等，虫草菌感染虫草蝠蛾幼虫的研究，1989年，动物学研究）。在控制杂菌生长的关键环节上，所述也比较模糊，例如，消毒环节上，沈南英石用0.1%的氯化汞对虫体表面消毒5分钟，而朱佳石的实验则是消毒7～10分钟（冬虫夏草成熟过程中中国被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉DNA共存及竞争增殖力、化学成分变化，2007年，菌物研究），尹定华则采用75％酒精对虫体表面消毒（专利公开号CN102283022A）。然而，大量的实验证明，采用75％酒精表面消毒，2～3天即长出大量杂菌，根本无法汰除，使中国被毛孢菌的生长被掩盖；即使采用浓度0.1％氯化汞对它们进行表面消毒10分钟，仍然有少量杂菌生长，给后续分离工作带来困难。这样且不说是否能真正分离得到中国被毛孢，其菌种质量的优劣也可想而知。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的缺点，提供一种简单易行、培养周期短、可得到青海玉树的冬虫夏草纯菌种 —— 中国被毛孢的原生态分离法。为此，本发明采取了如下具体技术方案：

本发明包括以下步骤及条件：a、种源是来自于中国青海玉树地区的新鲜的正在成熟的冬虫夏草，采集时要保留以子实体周围直径10～12cm、深8～12cm的土壤；培养基来源于冬虫夏草的寄主蝙蝠蛾幼虫的活体，选择白润、健壮的，4～5龄期的、活的蝙蝠蛾幼虫，采集时及时用无菌水漂洗并储放；所述冬虫夏草和冬虫夏草的寄主蝙蝠蛾幼虫的活体在采集后的储存温度为0～4℃，储存时间为0～15天；b、将种源转接于培养基上进行培养，培养时参数控制在温度6～9℃，pH值6～6.5，光照50～100lux，空气湿度55～60%，氧气含量20%（体积百分比）。

作为本发明的一种实施方式，为中国被毛孢子囊孢子分离法，还包括以下步骤及条件:

a、所述种源在采集时应及时用灭过菌的牛皮纸袋套住冬虫夏草子实体部分，将所述种源的子实体正在弹射的子囊孢子进行分离，即当见到牛皮纸上附着有白色、线状子囊孢子时，用无菌剪刀剪取表面线状子囊孢子所在的牛皮纸片，保存于灭过菌的PE盒中备用；

b、将蝙蝠蛾幼虫活体的整条虫浸泡在75度酒精里3分钟，再用无菌水换洗3次；将消毒过的蝙蝠蛾幼虫切去头部、外皮和黑色的肠道，再打浆，用巴马天寿泉天然矿泉水微调pH值至6～6.5，加入1.8～2.2％（wt%）的琼脂，制成试管斜面或平板，凝固作为培养基；

c、培养,用无菌接种环，挑取牛皮纸片上的白色线状子囊孢子，转接于所述培养基试管斜面或平板上，并放入培养箱中培养40～45天。

作为本发明的另一种实施方式，为中国被毛孢组织分离法，还包括以下步骤及条件:

a、将所述种源的虫体部分，首先用9～11℃无菌水清洗掉其表面的膜皮，然后，用浓度0.1％氯化汞对它们进行表面消毒10～15分钟，然后，用无菌水清洗5～7次，保存于灭过菌的试管中；

b、将蝙蝠蛾幼虫活体的整条虫浸泡在75度酒精里3分钟，再用无菌水换洗3次；将消毒过的蝙蝠蛾幼虫切去头部、外皮和黑色的肠道，再打浆，用巴马天寿泉天然矿泉水微调pH值至6～6.5，加入1.8～2.2％（wt%）的琼脂，制成试管斜面或平板，凝固作为培养基；

c、培养：用灭过菌的镊子从试管中取出冬虫夏草，用无菌手术刀从虫体头部切离子实体，再用另一无菌手术刀将菌核（虫体部分）切成1.5～2.0 mm薄片，转接于培养基试管斜面或平板上；将所述虫浆培养基平板放入培养箱中，设置温度6～9℃，光照50～100lux，空气湿度55～60%，氧气含量20%（体积百分比）左右，培养50～55天。

本发明的有益效果：

本发明的方法与现有技术相比，与其他已报道过的分离法不同，种源和培养基都是原生态的，即将新鲜的冬虫夏草作为分离中国被毛孢菌种的材料来源，将冬虫夏草的寄主虫草蝠蛾幼虫的新鲜虫体作为天然培养基；而且培养条件也和玉树的冬虫夏草生长的原生态环境基本相同，即培养时参数控制在温度6～9℃，pH值6～6.5，光照50～100lux（相当于室内的自然光），空气湿度55～60%，氧气含量20%左右。用该方法培养得到的中国被毛孢纯母种的时间相对于其他分离法提前了一个月,而且后续纯化、选育工作更简单，更容易获得高纯度的优良菌种。该方法简单易行，消毒方法更简单，在分离培养过程中，不需要经常去剔除杂菌，特别是子囊孢子分离法，子囊孢子处理简单，培养时间短。

附图说明

下面结合附图对本发明进行进一步阐述：

图1为菌核培养第5天即前期图；

图2为菌核培养第25天即中期图；

图3为菌核培养第45天即后期图

图4为子囊孢子培养第5天即前期图；

图5为子囊孢子培养第25天即中期图。

图6图子囊孢子培养第45天即后期图；

具体实施方式

本发明的分离方法具体的步骤及条件如下：

1、采集新鲜冬虫夏草和冬虫夏草的寄主蝙蝠蛾幼虫活体

a、采集时间分别为每年的立夏以后和立冬前后；采集地分别为我国青海省玉树地区治多县和玉树县的高山牧场，海拔分别为4500米和4000米左右、坡度为20°～30°，都是在草甸中；

b、采集新鲜冬虫夏草时，将围绕其直径10～12cm、深8～12cm的土壤整体一并采挖，并现场将采集到的新鲜冬虫夏草要用已灭过菌的牛皮纸袋套于新鲜冬虫夏草的子实体上，用保鲜袋包好放入有盛有冰袋的保温箱里；

c、采集冬虫夏草的寄主蝙蝠蛾幼虫活体时，现场将采集到的活幼虫用无菌水进行漂洗，并置于试管里，同样放入有盛有冰袋的保温箱里，以便运输。

2、实验室培养前期工作

a、将采集到的采集新鲜冬虫夏草和冬虫夏草的寄主蝙蝠蛾幼虫活体以最快速度带回实验室，并迅速放入0-4℃的冰箱里，时间不超过15天。

b、准备好接种工具及其他无菌操作的必备品，尤其是超净工作台、试管、平板培养皿、多参数控制的自动培养箱和消毒用的酒精、氯化汞等。

c、选择子实体短、虫体粗壮的正在成熟的新鲜的冬虫夏草，以保证中国被毛孢菌健壮，有活力，同时能较好地抵抗0.1％氯化汞较长时间的消毒；选择白润、健壮，4～5龄期的冬虫夏草的寄主蝙蝠蛾幼虫活体，以保证更适合培养中国被毛孢菌，同时也能减少其它杂菌的干扰。

d、对成熟的新鲜的冬虫夏草，先用无菌水洗去膜皮，其次用浓度0.1%氯化汞对它们进行表面消毒10～15分钟（尽可能将表面及附近的寄生或腐生菌杀灭），再用无菌水清洗5～7次，保存于灭过菌的试管中，作为中国被毛孢的组织分离法的种源；对套有牛皮纸袋的新鲜的冬虫夏草见到牛皮纸上附着有白色、线状子囊孢子，则用无菌剪刀剪取表面线状子囊孢子较密集的牛皮纸片，保存于灭过菌的PE盒中，作为中国被毛孢的子囊孢子分离法的种源。

e、对活体蝙蝠蛾幼虫，首先将整条虫浸泡在75度酒精里3分钟，其次用无菌水换洗3次，以防虫体上的杂菌污染。再次，将消毒过的蝙蝠蛾幼虫切去头部、外皮和黑色的肠道，再用巴马天寿泉天然矿泉水收集、打浆，微调pH值至6～6.5，加入1.8-2.2％（重量百分比）的琼脂，制成试管斜面或平板，待凝固即可作为分离中国被毛孢的天然培养基。

3、实验室培养工作

a、在超净台或百级无菌工作室里，将子囊孢子弹射盛期的子实体进行子囊孢子分离：用无菌接种环，挑取牛皮纸片上的白色线状子囊孢子，转接于虫浆培养基试管斜面或平板上。

b、在超净台或百级无菌工作室里，将消毒过的新鲜冬虫夏草进行组织分离：用灭过菌的镊子取出试管中冬虫夏草，用无菌手术刀从虫体头部切离子实体，再用另一无菌手术刀将菌核（虫体部分）切成1.5～2.0 mm薄片（绿豆大小），转接于虫浆培养基试管斜面或平板上，如果是平板，密度为每平板5-6片。

c、将上述试管或平板放入全自动培养箱中，设置温度6～9℃（天然的中国被毛孢侵染蝙蝠蛾幼虫开始在寄主体腔内生长时的土温在5.6～9.2℃之间，在低温下可减少其它杂菌干扰），光照50～100lux（相当于室内的自然光），空气湿度55～60%，氧气含量20%左右，静置培养若干天（组织分离法50～55天，子囊孢子分离法40～45天），肉眼可见菌落。

用本发明分离得到的培养物，从形态上与沈南英所描述的基本一致，即在10～25天看见有凸起平滑的白色菌丝，30天后白色变成棕褐色，形似花朵，其周围有棕黑色素，45天后看见有较长的白色菌丝，并呈不规则的棉花形，菌落凸起，基中呈棕褐或黑色。通过与GenBank中冬虫夏草菌序列号从FJ654206到FJ654259的对比，其相似性达到97.9%，确定为中国被毛孢。

下面通过实施例进一步说明了本发明，但不限制本发明的范围

实施例1

材料来源：作为天然培养基的冬虫夏草的寄主蝙蝠蛾幼虫活体，于2011年11月5日，采自青海省玉树地区玉树县国有牧场，海拔4000米的高山草甸中；作为种源的新鲜冬虫夏草，于2012年5月31日，采自于青海省玉树地区治多县的藏族牧场，海拔4500米的高山草甸中。

中国被毛孢子囊孢子分离法：

1、在采集新鲜冬虫夏草的现场，选择其中一条子实体短（长3cm）、虫体粗壮（长3.5cm、直径6.5mm）、可以肉眼看到子囊孕部有白色子囊孢子溢出，立刻用灭过菌的牛皮纸袋套住其子实体，并置于保温箱；

2、采集的材料运到实验室，立刻放入0-4℃的冰箱，5天后在实验室取出该新鲜冬虫夏草，将牛皮纸上白色、线状子囊孢子取下，即，用无菌剪刀剪取表面线状子囊孢子较密集的牛皮纸片，保存于灭过菌的PE盒中。

3、在实验室选择5条3.5cm的冬虫夏草的寄主蝙蝠蛾幼虫活体，浸泡于75℃酒精3min，用无菌水换洗3次。再将消毒过的蝙蝠蛾幼虫切去头部、外皮和黑色的肠道，再用巴马天寿泉天然矿泉水收集、打浆，微调pH值6～6.5，加入2％（重量百分比）的琼脂，制成试管斜面，待凝固即作为分离中国被毛孢的天然培养基。

4、用无菌接种环，在无菌条件下，挑取线状子囊孢子（不是虫体组织）直接转接于虫浆培养基斜面上，全部置于8℃培养箱进行培养。45天可以看到直径大约2cm的菌落，表面长满不发达灰白色菌丝，基中呈黑色。

中国被毛孢组织分离法：

1、用无菌自来水（约10℃）和无菌刀片将一新鲜冬虫夏草表面的膜皮（被膜，菌丝与土壤的粘结物）剥洗掉，露出乳（米）黄色至棕黄色的虫体。

2、然后将虫草置于一已灭过菌的200ml烧杯，用0.1%氯化汞（重量百分比）进行表面消毒12 min（秒表精确计时），再用灭过菌的镊子将虫草夹出，浸入盛有约100ml无菌水的已灭过菌的200ml烧杯中，洗涤20秒。再用灭过菌的镊子将虫草夹出，浸入盛有约100ml无菌水的已灭过菌的另一200ml烧杯中，上述洗涤步骤重复进行，共用无菌水约1000ml。

3、同子囊孢子分离法3，但不同的是试管换成了平板。

4、将已洗去表面氯化汞的虫草用无菌纱布揩干水分，置于已灭过菌的培养皿中，用灭过菌的镊子夹住，无菌手术刀从虫体头部切离子实体，再用另一无菌手术刀将虫体切成1.8 mm薄片，转接于虫浆培养基平板上，每块平板4片，共三块，全部置于9℃培养箱进行培养。15天可以看到有黑褐色分泌物和少量灰白色菌丝，50～55天可以看见直径大约1cm的菌落，表面长满不发达灰白色菌丝，基中呈棕褐或黑色。

实施例2

材料来源：同实施例1

中国被毛孢子囊孢子分离法：

1、在采集新鲜冬虫夏草的现场，选择其中一条子实体短（长2.5cm）、虫体粗壮（长3.5cm、直径7mm）、可以肉眼看到子囊孕部比较饱满，用灭过菌的牛皮纸袋套住其子实体，并置于保温箱；

2、采集的材料运到实验室，立刻放入0-4℃的冰箱,15天后在实验室取出该新鲜冬虫夏草，可以看到牛皮纸上有白色丝状物，即可将子囊孢子取下，用无菌剪刀剪取表面线状子囊孢子较密集的牛皮纸片，保存于灭过菌的PE盒中。

3、在实验室选择7条3.0cm的冬虫夏草的寄主蝙蝠蛾幼虫活体，浸泡于75℃酒精3min，用无菌水换洗3次。再将消毒过的蝙蝠蛾幼虫切去头部、外皮和黑色的肠道，再用巴马天寿泉天然矿泉水收集、打浆，微调pH值6～6.5，加入2％（重量百分比）的琼脂，制成试管斜面，待凝固即作为分离中国被毛孢的培养基。

4、用无菌接种环，在无菌条件下，挑取线状子囊孢子转接于虫浆培养基斜面上，共两支，全部置于7℃培养箱进行培养。40天可以看到直径大约2cm的菌落，表面长满不发达灰白色菌丝，基中呈黑色。

中国被毛孢组织分离法：

1、同实施例1。

2、然后将虫草置于一已灭过菌的200ml烧杯，用0.1%氯化汞（重量百分比）进行表面消毒10 min（秒表精确计时），再用灭过菌的镊子将虫草夹出，浸入盛有约100ml无菌水的已灭过菌的200ml烧杯中，洗涤20秒。再用灭过菌的镊子将虫草夹出，浸入盛有约100ml无菌水的已灭过菌的另一200ml烧杯中，上述洗涤步骤重复进行，共用无菌水约1000ml。

3、同子囊孢子分离法3，但不同的是试管换成了平板。

4、将已洗去表面氯化汞的虫草用无菌纱布揩干水分，置于已灭过菌的培养皿中，用灭过菌的镊子夹住，无菌手术刀从虫体头部切离子实体，再用另一无菌手术刀将虫体切成1.8 mm薄片，转接于虫浆培养基平板上，每块平板4片，共二块，全部置于8℃培养箱进行培养。15天可以看到有黑褐色分泌物和少量灰白色菌丝，50～55天可以看见直径大约1cm的菌落，表面长满不发达灰白色菌丝，基中呈棕褐或黑色。

以上实施例均采用江苏省金坛实验仪器厂150B_250C数显光照培养箱。该培养箱可以自动控制温度、空气、光照等参数。

Claims (3)

1.一种冬虫夏草菌中国被毛孢的原生态分离法，包括以下步骤和条件：

a、种源是来自于中国青海玉树地区的新鲜的正在成熟的冬虫夏草，采集时要保留以子实体周围直径10～12cm、深8～12cm的土壤；培养基来源于冬虫夏草的寄主蝙蝠蛾幼虫的活体，选择白润、健壮的，4～5龄期的、活的蝙蝠蛾幼虫，采集时及时用无菌水漂洗并储放；所述冬虫夏草和冬虫夏草的寄主蝙蝠蛾幼虫的活体在采集后的储存温度为0～4℃，储存时间为0～15天；

b、将种源转接于培养基上进行培养，培养时参数控制在温度6～9℃，pH值6～6.5，光照50～100lux，空气湿度55～60%，氧气含量20%。

2.根据权利要求1所述的冬虫夏草菌中国被毛孢的原生态分离法，其特征为还包括以下步骤和条件：

a、所述种源在采集时应及时用灭过菌的牛皮纸袋套住冬虫夏草子实体部分，将所述种源的子实体正在弹射的子囊孢子进行分离，即当见到牛皮纸上附着有白色、线状子囊孢子时，用无菌剪刀剪取表面线状子囊孢子所在的牛皮纸片，保存于灭过菌的PE盒中备用；

b、将蝙蝠蛾幼虫活体的整条虫浸泡在75度酒精里3分钟，再用无菌水换洗3次；将消毒过的蝙蝠蛾幼虫切去头部、外皮和黑色的肠道，再打浆，用巴马天寿泉天然矿泉水微调pH值至6～6.5，加入1.8～2.2％（wt%）的琼脂，制成试管斜面或平板，凝固作为培养基；

c、培养：用无菌接种环，挑取牛皮纸片上的白色线状子囊孢子，转接于所述培养基试管斜面或平板上，并放入培养箱中培养40～45天。

3.根据权利要求1所述的冬虫夏草菌中国被毛孢的原生态分离法，其特征为还包括以下步骤和条件：

a、将所述种源的虫体部分，首先用9～11℃无菌水清洗掉其表面的膜皮，然后，用浓度0.1％氯化汞对它们进行表面消毒10～15分钟，然后，用无菌水清洗5～7次，保存于灭过菌的试管中；

b、将蝙蝠蛾幼虫活体的整条虫浸泡在75度酒精里3分钟，再用无菌水换洗3次；将消毒过的蝙蝠蛾幼虫切去头部、外皮和黑色的肠道，再打浆，用巴马天寿泉天然矿泉水微调pH值至6～6.5，加入1.8～2.2％（wt%）的琼脂，制成试管斜面或平板，凝固作为培养基；

c、培养：用灭过菌的镊子从试管中取出冬虫夏草，用无菌手术刀从虫体头部切离子实体，再用另一无菌手术刀将虫体部分切成1.5～2.0mm薄片，转接于培养基试管斜面或平板上，并放入培养箱中培养，设置温度6～9℃，光照50～100lux，空气湿度55～60%，氧气含量20%，培养50～55天。

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