CN105670937A - 一种中国被毛孢优质菌株的获取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种中国被毛孢优质菌株的获取方法。该方法从感染中国被毛孢菌的蝙蝠蛾幼虫消化道(主要为肠液)中获取中国被毛孢菌株，这种方法操作简单不会对蝙蝠蛾幼虫造成损伤，收集完消化液(主要为肠液)的幼虫可以继续正常生长，而且可以长成冬虫夏草。且获得的菌株不需经过筛选及诱导直接可作为工业发酵的初始菌株，菌丝产量较高。
Description
技术领域
本发明属于生物科学领域，特别涉及一种中国被毛孢优质菌株的获取方法。
背景技术
冬虫夏草[Ophiocordycepssinensis(Berk.)G.H.Sungetal.]是我国传统名贵中药，与人身、鹿茸齐名，具有多种药理作用，近年来，由于市场需求逐年增加，野生资源难以满足需要，而人工培植冬虫夏草由于技术及成本等方面的原因，产量有限，导致冬虫夏草的价格居高不下。冬虫夏草发酵菌丝体因具有某些方面与冬虫夏草相类似的功效，受到越来越多的青睐，良好的菌种来源是发酵的关键制约因素，多年的研究证实，中国被毛孢为冬虫夏草菌的无性型，获得一株优质的中国被毛孢菌株将对中国被毛孢的发酵工业起着重大的推动作用。
传统的获得中国被毛孢菌株的方式有组织分离(虫体分离、子实体部位分离)、子囊孢子分离和基内分离几种模式，基内分离由于操作的复杂与其有关的内容鲜有报道，组织分离和子囊孢子分离均可以获得较多的中国被毛孢菌株，但是获得的菌株品质良莠不齐，后期需进行大量的筛选工作，筛选出适合用于发酵的少数菌株进行发酵，或通过各种形式的诱导，以消除菌株发酵过程中产徒产黑色素或者菌株在传代较少次数后即发生退化而影响产量的不利因素，但这往往需要较长的周期和繁杂的选育工作。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种不损伤蝙蝠蛾幼虫表皮前提下获取幼虫消化液中(主要为肠液)中国被毛孢菌株的方法，这种方法操作简单不会使蝙蝠蛾幼虫受到损伤，获得菌株的数量较多，且获得的菌株不需经过筛选及诱导直接可作为工业发酵的初始菌株，菌丝体产量较高。
本发明以被中国被毛孢感染后的中华蝙蝠蛾幼虫消化道中(肠液为主)中的虫菌体为分离中国被毛孢菌株的初始材料，鳞翅目幼虫消化道的pH多在8.5-11之间，而属于鳞翅目的蝙蝠蛾幼虫的消化道偏碱性，多次测定的数据显示在9-11之间。作为中华蝙蝠蛾幼虫的专一性寄主-中国被毛孢的最适生长pH值为5.5-7之间，而pH4-5.5及pH7-8之间生长极为缓慢，在pH4与pH8的临界值上几乎不生长，pH4-8之外无在论培养基还是模拟肠液中中国被毛孢菌体均不生长。传统观念上也认为蝙蝠蛾幼虫消化道的pH并不支持中国毛孢任何菌体形态的生长，在实验研究中却发现，蝙蝠蛾幼虫消化道内存在形态饱满且处于增殖中的虫菌体，如附图1所示，且以此虫菌体为试材分离中国被毛孢菌株不仅分离的成功率较高，每次分离培养均可获得较多的菌株外，分离到的菌株在后期的菌种发酵中均表现出了优良的性能，蝙蝠蛾幼虫特有的生理结构维持了中国被毛孢以虫菌体状态在消化道内生长并顺利增殖，同时，在这特殊的生理环境下，中国被毛孢菌体完成了“自然选育”的过程，不再需要后期的诱导和筛选，为工业发酵菌株的选择提供了较大的便利。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种中国被毛孢优质菌株的获取方法，包括如下步骤：
1.收集蝠蛾幼虫消化液(主要为肠液)：
取经过侵染处理的蝙蝠蛾幼虫，做8h-24h饥饿处理，排空嗉囊内食物残渣后，卡住幼虫使其无法前后移动，出于本能，虫子会自然吐出消化液(主要为肠液，pH9-11之间)。将幼虫放回洁净区继续饲养。
2.菌落培养
收集消化液(主要为肠液)并进行稀释，将稀释液涂布于带有培养基的培养皿表面，待菌落长至直径为2-4mm时进行单菌落转管培养，防止菌落长大后交叉生长。待菌落直径为1.5-2.5cm时，即可作为中国被毛孢发酵的初始菌株。
一些实施例中，本发明步骤1所述的蝙蝠蛾幼虫为3-5龄，以保证每只虫的反吐物的排出量大于0.5μL。
一些实施例中，本发明步骤1所述的幼虫饥饿处理所处的环境为：温度8-12℃，相对湿度65-85％，无光照。
一些实施例中，本发明步骤1所述的卡住幼虫为在幼虫胸腹部上方覆盖一块滤纸，露出幼虫的头部及胸部1-2节部位，拇指及食指固定在虫体两边的滤纸上，使得虫子无法前后移动。
一些实施例中，本发明步骤1所述的滤纸的大小为长：宽：10-15cm：7-10cm。
一些实施例中，本发明步骤2所述消化液(主要为肠液)的稀释，优选地稀释至每10μL稀释液中菌体个数为8～12个。
一些实施例中，本发明步骤2所述培养皿培养基的配方为(质量比)：葡萄糖28-32、蛋白胨8-12、酵母提取物8-12、无水硫酸镁0.8-1.2、磷酸二氢钾0.2-0.3、琼脂16-20、抗生素2-3、水800-1200，pH5.5-7，优选的为葡萄糖30、蛋白胨10、酵母提取物10、无水硫酸镁1、磷酸二氢钾0.25、琼脂18、抗生素2.5、水1000，抗生素优选的为庆大霉素、阿奇霉素、青霉素中的一种或多种。
一些实施例中，本发明步骤2所述的转管培养，其中试管培养基的配方为(质量比)：葡萄糖28-32、蛋白胨8-12、酵母提取物8-12、无水硫酸镁0.8-1.2、磷酸二氢钾0.2-0.3、琼脂16-20、水800-1200，pH5.5-7，优选的为葡萄糖30、蛋白胨10、酵母提取物10、无水硫酸镁1、磷酸二氢钾0.25、琼脂18、水1000。
一些实施例中，本发明步骤2菌落培养的环境为：避光、温度15-18℃、相对湿度45％-65％。
此外，本发明通过观察菌落形态、显微观察分生孢子状态，并对获得的中华被毛孢菌株进行了ITS特异性PCR扩增并测序，测序比对结果为冬虫夏草[Ophiocordycepssinensis(Berk.)G.H.Sungetal.]，表明本发明所述的方法得到的菌株为真正的中国被毛孢菌株。
由以上技术方案可知，整个操作过程不会对蝙蝠蛾幼虫造成损伤，收集完消化液(主要为肠液)的幼虫可以继续正常生长，而且可以长成冬虫夏草。
附图说明
图1，荧光显微镜下肠道中出芽增殖的虫菌体；
图2，单菌落分离培养菌落的显微镜检-产孢结构及分生孢子；
图3，转管斜面上的菌落培养；
图4，本发明获得中国被毛孢DNA序列的BLAST对比图。
具体实施方式
本发明实施例公开了一种中国被毛孢优质菌株的获取方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳的实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本发明所述方法进行改动或者适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种中国被毛孢优质菌株的获取方法进行详细说明。
实施例1：本发明所述方法获取优质中国被毛孢菌株
1.收集蝠蛾幼虫消化液
(1)取经过侵染处理的3龄蝙蝠蛾幼虫50条，于无菌环境下用脱脂棉蘸取75％酒精溶液擦拭虫体表面进行消毒。
(2)取一张滤纸平铺于经过灭菌的培养皿表面，在滤纸上喷洒少量无菌水，使滤纸充分润湿，满盈但不溢出水分。将幼虫放在滤纸上，为防止撕咬，每个培养皿内一条虫。于温度8℃、相对湿度65％、无光条件下做8h饥饿处理。
(3)将幼虫平放于桌面，在幼虫胸腹部上方覆盖小块滤纸(长*宽，10*7cm)，露出幼虫的头部及胸部1-2节部位，拇指及食指固定在虫体两边的滤纸上，使得虫子无法前后移动，出于本能，幼虫会自然吐出消化液(主要为肠液，pH值10)。将幼虫放回洁净区继续饲养。
2.菌落的培养
(1)将50条幼虫吐出的消化液(肠液)合并在一起，加入无菌水逐级稀释，至每10μL稀释液中菌体个数为8个。每10μL稀释液涂布于一个直径9cm的带有培养基的平板培养皿中，后将涂布好的平板置于避光、15℃、45％相对湿度条件下培养40d后，得到2589个直径为2-4mm的菌落，所采用的培养基配方为：葡萄糖30、蛋白胨10、酵母提取物10、无水硫酸镁1、磷酸二氢钾0.25、琼脂18、庆大霉素2.5、水1000，pH6.0。
(2)分别转管，进行单菌落培养，60天后获得直径为1.5-2.5cm单菌落2371个，可作为中国被毛孢发酵的初始菌株。试管培养基的配方为：葡萄糖30、蛋白胨10、酵母提取物10、无水硫酸镁1、磷酸二氢钾0.25、琼脂18、水1000，pH5.8。
实施例2：对获得的中国被毛孢菌株进行鉴定
观察菌落形态、显微观察分生孢子状态，并对获得的中华被毛孢菌株进行了ITS特异性PCR扩增并测序。
(1)菌落形态：菌落中央突起，内边缘棕灰色至黑褐色皱褶，外边缘整齐覆薄层气生菌丝，菌落紧实，背面黑色色素向周围扩散，如图2所示。
(2)分生孢子状态显微观察：菌丝粗壮，分隔清晰、初级菌丝出芽生长形成次级菌丝，次级菌丝再次分叉或不分叉。在次级菌丝的顶端形成分生孢子梗，而后分生孢子梗顶端特化，逐渐生长膨胀形成瓶梗结构，瓶梗结构经基部缢缩分裂形成分生孢子，分生孢子单生或双生，肾形，无色，亦有较多的分生孢子掉落下来，散落在菌丝中，如图3所示。
(3)ITS序列分析：取少量菌丝和分生孢子，提取DNA，进行ITS特异性PCR扩增，并进行测序后于Genbank中进行BLAST对比，测序结果为493个碱基，序列见SEQIDNO:1，BLAST对比结果为冬虫夏草[Ophiocordycepssinensis(Berk.)G.H.Sungetal.]，如图4所示。
实施例3：本发明所述方法获取优质中国被毛孢菌株
1.收集蝠蛾幼虫消化液
(1)取经过侵染处理的4龄蝙蝠蛾幼虫50条，于无菌环境下用脱脂棉蘸取75％酒精溶液擦拭虫体表面进行消毒。
(2)取一张滤纸平铺于经过灭菌的培养皿表面，在滤纸上喷洒少量无菌水，使滤纸充分润湿，满盈但不溢出水分。将幼虫放在滤纸上，为防止撕咬，每个培养皿内一条虫。于温度10℃、相对湿度70％、无光条件下做12h饥饿处理。
(3)将幼虫平放于桌面，在幼虫胸腹部上方覆盖小块滤纸(长*宽，12*8cm)，露出幼虫的头部及胸部1-2节部位，拇指及食指固定在虫体两边的滤纸上，使得虫子无法前后移动，出于本能，幼虫会自然吐出消化液(主要为肠液pH值11)。将幼虫放回洁净区继续饲养。
2.菌落的培养
(1)将50条幼虫吐出的消化液(肠液)合并在一起，加入无菌水逐级稀释，至每10μL稀释液中菌体个数为10个，每10μL稀释液涂布于一个直径9cm的带有培养基的平板培养皿中，后将涂布好的平板置于避光、温度17℃、相对湿度55％条件下培养35d后，得到3078个直径为2-4mm的菌落，所采用的培养基配方为：葡萄糖32、蛋白胨8、酵母提取物8、无水硫酸镁0.8、磷酸二氢钾0.2、琼脂20、阿奇霉素3、水800，pH5.5。
(2)分别转管，进行单菌落培养，50天后获得直径为1.5-2.5cm单菌落2793个，可作为中国被毛孢发酵的初始菌株。试管培养基的配方为：葡萄糖32、蛋白胨8、酵母提取物8、无水硫酸镁0.8、磷酸二氢钾0.2、琼脂20、水800，pH5.6。
此外，对本实施例获得的中国被毛孢菌株按实施例2的方法进行了鉴定，其菌落形态及序列的BLAST对比结果为冬虫夏草[Ophiocordycepssinensis(Berk.)G.H.Sungetal.]。
实施例4：本发明所述方法获取优质中国被毛孢菌株
1.收集蝠蛾幼虫消化液
(1)取经过侵染处理的5龄蝙蝠蛾幼虫50条，于无菌环境下用脱脂棉蘸取75％酒精溶液擦拭虫体表面进行消毒。
(2)取一张滤纸平铺于经过灭菌的培养皿表面，在滤纸上喷洒少量无菌水，使滤纸充分润湿，满盈但不溢出水分。将幼虫放在滤纸上，为防止撕咬，每个培养皿内一条虫。于温度8℃、相对湿度65％、无光条件下做16h饥饿处理。
(3)将幼虫平放于桌面，在幼虫胸腹部上方覆盖小块滤纸(长*宽，15*10cm)，露出幼虫的头部及胸部1-2节部位，拇指及食指固定在虫体两边的滤纸上，使得虫子无法前后移动，出于本能，幼虫会自然吐出消化液(主要为肠液pH值10)。将幼虫放回洁净区继续饲养。
2.菌落的培养
(1)将50条幼虫吐出的消化液(肠液)合并在一起，加入无菌水逐级稀释，至每10μL稀释液中菌体个数为12个。每10μL稀释液涂布于一个直径9cm的带有培养基的平板培养皿中，后将涂布好的平板置于避光、温度18℃、相对湿度65％条件下培养30d后，得到3236个直径为2-4mm的菌落，所采用的培养基配方为：葡萄糖28、蛋白胨12、酵母提取物12、无水硫酸镁1.2、磷酸二氢钾0.3、琼脂16、青霉素2、水1200，pH6.5。
(2)分别转管，进行单菌落培养，40天后获得直径为1.5-2.5cm单菌落2974个，可作为中国被毛孢发酵的初始菌株。试管培养基的配方为：葡萄糖28、蛋白胨12、酵母提取物12、无水硫酸镁1.2、磷酸二氢钾0.3、琼脂16、水1200，pH6.7。
此外，对本实施例获得的中国被毛孢菌株按实施例2的方法进行了鉴定，其菌落形态及序列的BLAST对比结果为冬虫夏草[Ophiocordycepssinensis(Berk.)G.H.Sungetal.]。
实施例5：不同菌株来源的中国被毛孢菌株发酵培养
分别取从新鲜冬虫夏草虫体、子实体及本发明所述方法获得的中国被毛孢菌株各100支，进行了工业级发酵(500L发酵罐)对比试验，实验结果如下表：
表1：不同菌株来源的中国被毛孢发酵对比试验
| 菌株来源 | 虫体分离 | 子实体分离 | 侵染虫肠液分离 |
| 一级摇瓶培养周期(天) | 14 | 15 | 14 |
| 二级摇瓶培养周期(天) | 6 | 6 | 6 |
| 发酵罐平均得率 | 15％ | 20％ | 30％ |
备注，发酵罐平均得率为3000rpm10min离心后菌丝体湿重。
Claims (10)
1.一种中国被毛孢优质菌株的获取方法，其特征在于，从感染中国被毛孢菌的蝙蝠蛾幼虫的消化液中获取中国被毛孢菌株。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述感染中国被毛孢菌的蝙蝠蛾幼虫的消化液主要为肠液。
3.根据权利要求1或2所述的方法，包括以下步骤：
1)收集蝙蝠蛾幼虫消化液：取经过中国被毛孢菌侵染的蝙蝠蛾幼虫，做8h-24h饥饿处理后，卡住幼虫使其无法前后移动，出于本能，虫子会自然吐出消化液；
2)菌落培养：收集的消化液进行稀释，将稀释液涂布于带有培养基的培养皿表面，待菌落长至直径为2-4mm时进行单菌落转管培养；待菌落直径为1.5-2.5cm时，即可作为中国被毛孢发酵的初始菌株。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤1)所述的蝙蝠蛾幼虫为3-5龄。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤1)所述的幼虫饥饿处理所处的环境为：温度8-12℃，相对湿度65-85％，无光照。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤1)所述的卡住幼虫为在幼虫胸腹部上方覆盖一块滤纸，露出幼虫的头部及胸部1-2节部位，拇指及食指固定在虫体两边的滤纸上，使得虫子无法前后移动。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的幼虫胸腹部上方覆盖一块滤纸，滤纸的长：宽为：10cm-15cm：7-10cm。
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2)所述消化液的稀释，稀释程度为每10μL稀释液中菌体个数为8-12个。
9.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2)所述培养皿培养基的配方的质量比为：葡萄糖28-32、蛋白胨8-12、酵母提取物8-12、无水硫酸镁0.8-1.2、磷酸二氢钾0.2-0.3、琼脂16-20、抗生素2-3、水800-1200，pH5.5-7，其中抗生素包含庆大霉素、阿奇霉素、青霉素中的一种或多种；
步骤2)所述的转管培养培养基的配方质量比为：葡萄糖28-32、蛋白胨8-12、酵母提取物8-12、无水硫酸镁0.8-1.2、磷酸二氢钾0.2-0.3、琼脂16-20、水800-1200，pH5.5-7。
10.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2)所述的菌落培养的环境为避光、温度15-18℃、相对湿度45-65％。
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