CN109618811B - 产业化冬虫夏草人工培育方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种产业化冬虫夏草人工培育方法，包括将冬虫夏草寄主幼虫置于中国被毛孢Hirsutella sinensis固体发酵物中；寄主幼虫在所述固体培养物中建立隧道，在隧道中生活、取食，被感染后幼虫僵死，僵虫进行产座处理后抽生出子实体，即为冬虫夏草。本发明首次公开了人工培育冬虫夏草产业化的侵染方法，优势在于中国被毛孢固体发酵物侵染寄主幼虫，可以实现机械化操作规模化生产，中国被毛孢菌丝和分生孢子(包裹虫体)全方位侵染寄主蝠蛾幼虫，技术先进，侵染率极高，除少数幼虫生理死亡外，其余幼虫全部侵染，侵染率高达90％。

Description

产业化冬虫夏草人工培育方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种产业化冬虫夏草人工培育方法。

背景技术

冬虫夏草Ophiocordyceps sinensis(Berk.)G.H.Sung et al.)是由冬虫夏草菌寄生蝙蝠蛾科Hepialidae蝠蛾属Hepialus幼虫完成的有性型。

冬虫夏草主产于西藏、青海、云南、四川、甘肃等海拔3500-5000米的高寒草甸地带。冬虫夏草是我国最具特色著名中药材，具有“补肺、强肾、益精气、诸虚百损”等众多功效。现代医学则把冬虫夏草视作天然免疫调节剂。冬虫夏草可产生多种具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗辐射及免疫调节等功能的生理活性物质，在我国传统滋补品市场中占有非常重要的地位，一直被国民推崇和信赖，并在日本、韩国、东南亚国家和西欧国际市场热销。

资源的枯竭、需求的旺盛和政策的保护导致其市场价格飞涨。野生冬虫夏草已被列为国家二级保护物种。冬虫夏草野生资源十分有限，历年来遭受过度采挖，导致产量大幅下降，无法满足大众日益增长的需求。因此，人工培育将成为冬虫夏草产业发展、资源保护和高原生态环境保护的一个重要趋势及途径。

很多学者对中国被毛孢感染寄主蝠蛾幼虫的侵染途径及机制进行了长期、有益的研究。在全人工培育冬虫夏草中，最关键的操作技术是幼虫的侵染。在野生自然环境下，蝙蝠蛾幼虫的侵染率极低。目前，关于冬虫夏草菌感染蝙蝠蛾幼虫的感染机理，尚未见有公认的感染机制相关报道。因此，在研究全人工培育冬虫夏草中，所采用侵染的方式不一，如有利用收集子囊孢子模拟野生环境侵染模式，也有利用无性孢子或菌丝进行拌土或拌饲料、喷淋等方法，采用改良的针刺侵染法进行侵染的相关报道。也有研究报道，对拌入菌土或饲料的方法进行多次试验，其侵染率约为10％(冯繻亿，吴丽娟.全人工培育冬虫夏草产业化技术研究.四川农业技术，2016(1)：27-29.)。有研究报道，采用如下三种方法进行感染试验：(1)饲喂法，即对适龄幼虫饲喂经过喷淋冬虫夏草孢子悬液的食物，使其感染；(2)喷淋法，直接用冬虫夏草孢子悬液对适龄幼虫进行多次喷淋；(3)微枪注射法，用特制的微型注射枪在显微镜下将孢子悬液通过虫体表面的微孔道注入虫体血腔内。结果表明，饲喂法基本无效，微枪注射法效果最好，喷淋法效果不明显。然而，王中等的感染试验表明：用病菌悬浮液涂抹或喷雾虫体均可使幼虫感染，而针刺、喂食、浸泡接种均不感染。(吉岳，永强，杨大荣.冬虫夏草感染蝙蝠蛾幼虫研究进展.中国草地学报，2010-增-0041-03 41-43)。以上相关研究表明，中国被毛孢菌侵染寄主蝠蛾幼虫作为人工培育冬虫夏草的关键性技术尚未有效突破，实施产业化侵染更是难题。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明目的在于提供一种产业化冬虫夏草人工培育方法，通过将冬虫夏草菌固体发酵物侵染寄主蝠蛾幼虫实现人工培育冬虫夏产业化，提高效率。

本发明方法是将冬虫夏草寄主蝠蛾幼虫在中国被毛孢Hirsutella sinensis固体发酵物中建立隧道，寄主幼虫在隧道中生活，并取食菌体，菌体全方位包裹幼虫体表、还通过消化道感染幼虫；该方法侵染速度快，感染率高，可以规模化进行，解决了人工虫草产业化侵染难题。

具体地说，本发明提供一种产业化冬虫夏草人工培育方法，包括：将冬虫夏草寄主蝠蛾幼虫置于中国被毛孢Hirsutella sinensis固体发酵物中；寄主幼虫在所述固体培养物中建立隧道，在隧道中生活、取食，被感染后幼虫僵死，僵虫进行产座处理后抽生出子实体，即为冬虫夏草。

进一步地，所述冬虫夏草寄主幼虫优选为小金蝠蛾Hepialus xiaojinensis。

可采用现有技术方法饲养小金蝠蛾Hepialus xiaojinensis幼虫。小金蝠蛾幼虫在仿生态养虫车间的各养虫室中饲养，仿生态养虫室的洁净度达到国家药品监督管理局规定制药厂GMP-D级标准，操作按GMP规范执行。温度为11-15℃，相对湿度为60-70％，无空气污染。

进一步地，为防治病害，提高成活率，本发明还提供一种人工饲养小金蝠蛾Hepialus xiaojinensis幼虫的方法，具体包括用无机物蛭石作为饲养基质，胡萝卜或珠芽蓼作为饲料在仿生态的养虫车间养虫室中进行人工饲养，蛭石是无机矿物质，细菌和霉菌等病原物不能在无机的蛭石中生长则完全切断病原物的初次侵染源，防止寄主幼虫毁灭性病害的发生，从而大幅度提高幼虫饲养效率。

进一步地，所述中国被毛孢Hirsutella sinensis可分离自产区天然的冬虫夏草子囊孢子或在产区取得冬虫夏草进行组织分离。

在本发明一具体实施方式中，使用中国被毛孢Hirsutella Sinensis Liu，Guo，Yuet Zeng.，保藏号为CCTCC No.M87101。中国专利文献CN1031393A、CN1040391A公开了该菌株，还公开了其培养方法。文献中也已公开了该菌株的菌学特征(参见刘锡琎等，冬虫夏草无性阶段的分离和鉴定，真菌学报，1988，8(1)，35-40)。

可采用现有技术方法制备中国被毛孢固体发酵物，具体方法可参见中国专利公开号CN1513976A。例如，将中国被毛孢菌株从摇床培养逐步扩大到液体发酵培养，将液体发酵培养液以1:10(v/v)的比例接种到固体发酵罐的固体培养基中暗培养45天，固体培养基充满菌丝并产生大量分生孢子，固体发酵培养完成，即可获得中国被毛孢固体发酵物。有关具体培养条件及所有培养基，均可参照现有技术。

研究发现，中国被毛孢固体发酵物的含水量对于在人工饲养寄主幼虫的温度下可以保持中国被毛孢继续生长、提高蝠蛾幼虫成活率及侵染成功率具有显著影响。较佳的方案是控制中国被毛孢固体发酵物的含水量为35％-45％，最佳为35％。在侵染幼虫时可通过加盖滤纸喷水以保持其固体发酵物的含水量。

进一步地，可将中国被毛孢固体发酵物在无菌条件下分装于饲养寄主蝠蛾幼虫的容器例如养虫盒中，使冬虫夏草寄主幼虫在养虫容器中的中国被毛孢固体发酵物中建立隧道，在隧道中生活、取食。养虫盒叠加放置后处于基本密闭的状态。众多的养虫容器可以叠加放置，养虫盒叠加后基本密合无缝隙。养虫容器四面有卡槽，以方便叠加堆放。放入养虫容器(养虫盒)的中国被毛孢固体发酵物厚度为2cm左右为宜。为保持湿度，避免过于干燥，可在中国被毛孢固体发酵物上盖湿润的无菌滤纸，适时的喷雾适当的无菌水。以保持中国被毛孢固体发酵物含水量为35％-45％。一般0.02立方米左右的养虫容器中投入20-30头的冬虫夏草寄主幼虫为佳，既可以提高固体发酵物利用率，还可以提高侵染率和成活率。一般可选择食品级塑料周转箱作为养虫容器。在本发明一具体实施方式中，使用400mm×300mm×160mm的食品级的塑料盒为养虫盒。

较佳地，控制冬虫夏草寄主幼虫生长环境(养虫容器中)温度为8-16℃，更佳为11-15℃。

研究发现，3-6龄的冬虫夏草寄主幼虫均可以被侵染；其中3-4龄幼虫容易被侵染；4-5龄幼虫不仅容易被侵染，且成活率更高。

为进一步促进寄主幼虫生长，提高侵染率，可在养虫容器中投入适量的经消毒的胡萝卜片作为辅助食料。具体可采用0.2％二氯异氰尿酸钠消毒液对胡萝卜片进行消毒。

具体地，上述一种冬虫夏草人工培育方法，包括：将中国被毛孢Hirsutellasinensis固体发酵物放入经消毒的养虫容器中，所述固体发酵物的厚度为2cm左右；按每0.02立方米左右的养虫容器中投入20-30头的比例，向养虫容器中投入4-5龄小金蝠蛾Hepialus xiaojinensis幼虫；在中国被毛孢固体发酵物上盖湿润的无菌滤纸，适时喷雾适当的无菌水，保持中国被毛孢固体发酵物含水量为35％-45％；并在养虫容器中投入适量的经消毒的胡萝卜片作为辅助食料；小金蝠蛾Hepialus xiaojinensis幼虫在所述固体培养物中建立隧道，在隧道中生活、取食，7天左右后被感染，30天左右后幼虫僵死，僵虫进行产座处理后抽生出子实体，即为冬虫夏草。

研究表明，寄主幼虫在中国被毛孢固体培发酵物中生活7天左右后就被感染，15天左右后中国被毛孢菌体充满幼虫体，中国被毛孢侵染虫体后先以芽孢形式生长和发育，中国被毛孢菌体很快侵染幼虫的脂肪体，发育为菌丝，芽孢和菌丝充满虫体后，幼虫逐步僵死，取僵死幼虫经处理长出子实体，即为冬虫夏草。

本发明还包括上述方法培育获得的冬虫夏草。与天然冬虫夏草成份类同，采用本发明方法培育获得的冬虫夏草优点在于生产时间短，从人工饲养寄主蝠蛾幼虫开始一年就完成一个世代，冬虫夏草质量好，条件可控，有具大的经济价值。有利于保护西部高原本来就已脆弱的生态环境，促进藏区及我国国民经济发展，有巨大的社会价值。

本发明首次公开了人工培育冬虫夏草产业化的侵染方法，优势在于中国被毛孢固体发酵物侵染寄主幼虫，可以实现机械化操作规模化生产，中国被毛孢菌体菌丝和分生孢子均可侵染寄主蝠蛾幼虫，技术先进，侵染率极高，除少数幼虫生理死亡外，其余幼虫全部侵染，侵染率高达90％。采用本发明冬虫夏草的人工培育方法，低海拔环境下室内规模化饲养寄主昆虫，从卵孵化到完成冬虫夏草有性阶段只需1年时间，而冬虫夏草寄主昆虫在自然界从1龄到8龄老熟幼虫的历期在4年左右时间；人工条件下饲养幼虫个体大，侵染成功率高。

附图说明

图1为实施例1中国被毛孢的孢梗及其分生孢子显微镜照片。

图2-图3表示寄主幼虫在充满中国被毛孢菌体的固体发酵物上生存与取食。

图4表示感染7天后小金蝠蛾幼虫体内的中国被毛孢芽孢显微镜照片。

图5表示感染15天后中国被毛孢芽孢充满虫体(显微镜照片)。

图6表示小金蝠蛾幼虫体内有的芽孢萌发为菌丝(显微镜照片)。

图7为30天后幼虫僵死成为冬虫夏草僵虫。

图8为所形成冬虫夏草原基(子实体)。

图9为人工虫草和天然虫草的成分对比分析图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。

实施例1中国被毛孢菌的分离培养

中国被毛孢菌分离自产区天然的冬虫夏草子囊孢子，或进行组织分离取得，培养基为PDA+1％蛋白胨。

分离菌株经DNA比对确定为中国被毛孢Hirsutella sinensis，其孢梗及其分生孢子显微镜照片见图1。

中国被毛孢菌是嗜低温真菌，培养温度为15-20℃，生长缓慢，有黑色素渗入培养基内。菌落坚硬、光滑，长有稀疏纤细菌丝体和分生孢子。菌丝体稀疏，表生，有隔，分枝，具微疣。分生孢子梗无色，单生或2-8本簇生，不形成孢梗束，产孢细胞系瓶梗，无色，分生孢子无色，无隔膜，肾形或长椭园形，大多2个为一粘膜包围成长圆或柠檬状。

中国被毛孢的确认

仪器名称：台式冷冻离心机FRESCO17；数显恒温水浴锅HH-4；PCR仪S1000TMThemal Cycler。

通过提取、扩增菌种多基因序列，提取菌株样品1、样品2(编号分别为CHANGXINGZHIYAO-0001-1、CHANGXINGZHIYAO-0001-2)的β-tubulin基因序列、LSU基因序列及TEF－1α基因序列与NCBI数据库收录的真菌β-tubulin基因序列、LSU基因序列及TEF－1α基因序列进行BLAST比对，经比对结果可知：菌株样品1、样品2与中国被毛孢(Hirsutellasinensis)的相似度为99％。可以确定为中国被毛孢(Hirsutella sinensis)。

实施例2冬虫夏草寄主蝠蛾种属的确认

寄主蝠蛾卵于7月份放置于养虫盒的土壤中，人工饲养到12月份下旬的幼虫开始化蛹，经35天左右的蛹期开始羽化，取蛹和成虫进行物种鉴定。

使用的仪器为：PCR仪S1000TM Themal Cycler；采用Sanger测序3730×I测序仪；使用MEGA 7.0，IQ-tree，NCBI，BOLD SYSTEMS分析。

成虫：根据NCBI，BOLD SYSTEMS数据库比对结果，从线粒体COI基因序列和线粒体Cytb基因序列鉴定表明，成虫样品与小金蝠蛾Hepialus xiaojinensis Tu,Ma et Zhang，2009的相似度为99％，可以确定为小金蝠蛾。

蛹样品根据NCBI，BOLD SYSTEMS数据库比对结果可知，与小金蝠蛾Hepialusxiaojinensis Tu，Ma et(Zhang),2009的相似度为99％，可以确定为小金蝠蛾Hepialusxiaojinensis。

上述结果表明，人工饲养的幼虫均为小金蝠蛾Hepialus xiaojinensis，属于冬虫夏草寄主的优势虫种。

实施例3产业化冬虫夏草人工培养

1)中国被毛孢固体发酵物的培养

中国被毛孢菌Hirsutella sinensis通过摇床振荡扩大培养，再扩大到液体发酵罐培养，液体发酵罐以1:10的比例扩大到固体发酵罐进行固体发酵，固体发酵罐暗培养45天，当中国被毛孢菌体充满固体培养基并产生分生孢子后完成固体发酵。保持中国被毛孢固体发酵物含水量为35％-45％。具体发酵可参考CN1513976A公开的方法。

2)中国被毛孢固体发酵菌体侵染寄主幼虫

固体发酵完成后把固体发酵菌体在无菌条件下通过传送带输入养虫盒中，每个养虫盒投入固体发酵菌体2cm厚度，再投放4-5龄小金蝠蛾Hepialus xiaojinensis幼虫20-30头。众多叠加的养虫盒之间处于基本密闭的状态。控制小金蝠蛾幼虫生长环境温度为11-15℃。

在固体发酵菌体上面盖一张湿润的无菌滤纸，适时的喷雾适当的无菌水，防止中国被毛孢菌体干燥，保持其含水量为35％左右。养虫盒中放入胡萝卜片作为寄主幼虫的辅助食料。

寄主小金蝠蛾Hepialus xiaojinensis幼虫在盛有中国被毛孢固体发酵物中建立隧道，在隧道中生活，并取食中国被毛孢菌体，见图2-3。中国被毛孢菌体包裹幼虫全方位的感染虫体，并取食菌体进行消化道感染。

根据对幼虫体液镜检表明，7天后即可侵染(感染7天后小金蝠蛾幼虫体内的中国被毛孢芽孢显微镜照片见图4)，15天后虫体中充满中国被毛孢芽孢(显微镜照片见图5)，有的芽孢萌发为菌丝(显微镜照片见图6，有箭头的芽孢向菌丝转化)，30天后幼虫僵死成为冬虫夏草僵虫(见图7)。取出冬虫夏草僵虫进行完成有性型处理。经处理后的冬虫夏草僵虫形成由幼虫表皮包裹的菌核抽生子实体原基(见图8)，进而抽生形成冬虫夏草子实体。除少数幼虫生理死亡外，其余幼虫全部侵染，侵染率高达90％。

实验例各龄幼虫的侵染试验

分别用寄主小金蝠蛾Hepialus xiaojinensis卵、1-3龄幼虫、4-5龄幼虫进行侵染试验，验证中国被毛孢在卵、低龄(1-3龄)幼虫、大龄(4-5龄)的各个阶段的侵染方法及侵染率。中国被毛孢固体发酵物的培养方法与实施例3相同，其含水量为35％-45％。

1)2015年07月14日，把寄主小金蝠蛾卵放置于有2cm厚度的中国被毛孢固体培养物的组培瓶中，每个组培瓶放50粒卵，共放100个组培瓶(共5000粒卵)，孵化幼虫3875头，其中取1龄幼虫224头和2龄幼虫3651头按常规饲养，记录幼虫死亡率、感染率和僵死率。以冬虫夏草僵虫作为侵染指标，因冬虫夏草僵虫是中国被毛孢侵染冬虫夏草寄主幼虫而僵化的，其成分和冬虫夏草类同，故以其作为感染指标。2015年11月27日记录，冬虫夏草僵虫376头，感染率为不到10％。

2)2015年12月03日，用针刺侵染方法，试验幼虫为4-5龄，共侵染1000条幼虫，侵染幼虫在组培瓶中常规饲养，针刺侵染后第2天开始死亡，7天后死亡率超过50％，对死亡幼虫镜检。镜检表明，死亡幼虫均感染，在寄主幼虫体液中含有大量中国被毛孢芽孢，共取得冬虫僵虫408头，感染率40.8％。

3)2016年9月，用组培瓶固体培养中国被毛孢，当中国被毛孢菌体充满固体培养基后，投入4-5龄幼虫，每瓶投入5头幼虫，共计200个组培瓶(1000头幼虫)。结果死亡452头，未感染40头，取得冬虫夏草僵虫508头，感染率50.8％。

4)2016年9月，组培瓶中的中国被毛孢固体培养物拌入谷壳，当固体培养物充满菌丝后于每个组培瓶投入4龄幼虫5头，共200个组培瓶(1000头幼虫)，结果死亡幼虫531头，未感染77头，取得冬虫夏草僵虫392头，感染率为39.2％。

实验例

分别对天然冬虫夏草及本发明实施例3人工培育冬虫夏草进行成分检，结果表明二者成分近似。结果见图9。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (9)

1.一种产业化冬虫夏草人工培育方法，其特征在于，包括：将冬虫夏草寄主幼虫置于中国被毛孢Hirsutella sinensis固体发酵物中；寄主幼虫在所述固体发酵物中建立隧道，在隧道中生活、取食，被感染后幼虫僵死，僵虫进行产座处理后抽生出子实体，即为冬虫夏草；

所述冬虫夏草寄主幼虫为小金蝠蛾Hepialus xiaojinensis。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，使用中国被毛孢Hirsutella Sinensis Liu，Guo，Yu et Zeng.，保藏号为CCTCC No.M87101。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所用冬虫夏草寄主幼虫为3-6龄。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所用冬虫夏草寄主幼虫为4-5龄。

5.根据权利要求1、2、4任一项所述的方法，其特征在于，控制中国被毛孢Hirsutella sinensis固体发酵物含水量为35%-45%；和/或，

控制冬虫夏草寄主幼虫生长环境温度为8-16℃。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，控制中国被毛孢Hirsutella sinensis固体发酵物含水量为35%；和/或，

控制冬虫夏草寄主幼虫生长环境温度为11-15℃。

7.根据权利要求1、2、4、6任一项所述的方法，其特征在于，每0.02立方米的养虫容器中投入20-30头的冬虫夏草寄主幼虫。

8.根据权利要求1、2、4、6任一项所述的方法，其特征在于，还包括在养虫容器中投入适量的经消毒的胡萝卜作为冬虫夏草寄主幼虫辅助食料。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将中国被毛孢Hirsutella sinensis固体发酵物放入经消毒的养虫容器中，所述固体发酵物的厚度为2cm左右；按每0.02立方米的养虫容器中投入20-30头的比例，向养虫容器中投入4-5龄小金蝠蛾Hepialus xiaojinensis幼虫；在中国被毛孢固体发酵物上盖湿润的无菌滤纸，适时喷雾适当的无菌水，保持中国被毛孢固体发酵物含水量为35%-45%；并在养虫容器中投入适量的经消毒的胡萝卜片作为辅助食料；小金蝠蛾Hepialus xiaojinensis幼虫在所述固体发酵物中建立隧道，在隧道中生活、取食，7天左右后被感染，30天左右后幼虫僵死，僵虫进行产座处理后抽生出子实体，即为冬虫夏草。

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